Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA ovat pieniä ei-koodaavat RNA: t, jotka moduloi fysiologisesti proteiinien ilmentyminen, ja säännellä lukuisia solumekanismeja. Muuttaminen mikroRNA ilmentyminen on kuvattu syövän ja liittyy kasvaimen taudin alkamisen ja etenemisen. MicroRNA 148a (miR-148a) on usein alassäädetty syövässä. Olemme aiemmin osoittaneet, että sen alassäätöä DNA hypermetylaation on varhainen tapahtuma haiman adenokarsinooma (PDAC) Karsinogeneesin viittaa kasvaimen ehkäisevästä funktio. Täällä me tutkimme mahdollista roolia miR-148a yli-ilmentyminen PDAC terapeuttisena välineenä. Ensin raportoivat seuraukset miR-148a yli-ilmentyminen PDAC solulinjoissa. Osoitamme, että miR-148a over-ilmentyminen ei ole dramaattinen vaikutus soluproliferaatioon ja solujen Chemo-herkkyys neljässä hyvin kuvattu PDAC solulinjoissa. Tutkimme myös modulaatioon proteiinin ilmentymisen globaali proteomic lähestymistapa (2D-DIGE). Osoitamme, että huolimatta massiivinen yli-ilmentyminen, miR-148a heikosti moduloi proteiinin ilmentymisen, mikä estää tunnistamista proteiinin tavoitteet PDAC solulinjoissa. Vielä tärkeämpää on,

in vivo

tiedot osoittavat, että moduloiva miR-148a ilmentymisen joko epiteeli kasvainsoluissa ja /tai kasvaimen mikroympäristössä ei estä kasvaimen kasvua. Yhdessä osoitamme tässä, että miR-148a ei vaikuta PDAC lisääntymistä sekä

in vitro

ja

in vivo

mikä viittaa jossain määrin potentiaalia terapeuttisena välineenä.

Citation : Delpu Y, Lulka H, ​​Sicard F, Saint-Laurent N, Lopez F, Hanounin N, et al. (2013) Rescue of miR-148a Expression in Haimasyöpä: Sopimaton Terapeuttinen Tool. PLoS ONE 8 (1): e55513. doi: 10,1371 /journal.pone.0055513

Editor: Guenter Schneider, Technische Universität München, Saksa

vastaanotettu: 06 tammikuu 2012; Hyväksytty: 02 tammikuu 2013; Julkaistu: 31 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Delpu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ rahoittivat Institut National de la Santee et de la Recherche Medicale (INSERM, www.inserm.fr) ja Association pour la Recherche sur le Cancer (ARC, www.arc-cancer.net). Proteomiikka tutkimukset tukivat Toulouse proteomiikan Infrastructure kanssa taloudellisella tuella «Association pour la Recherche sur le Cancer» (ARC-Arecan Program). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDAC) on neljänneksi yleisin kuolinsyy syöpä länsimaissa taas se edustaa vain 3% uusista tapauksista vuosittain [1]. PDAC ennuste on usein selittää puute varhaisen erityisiä diagnostisia markkereita ja puuttuminen tehokkaan hoitoja. Tähän mennessä leikkaus on ainoa parantava lähestymistapa PDAC hallintaan vaan koskee pienessä määrässä potilaista johtuen PDAC aggressiivisuutta ja invasiivisia fenotyypin. Jäljellä potilailla diagnosoitiin paikallisesti levinnyt tai metastaattinen PDAC, gemsitabiini kemoterapia standardi palliatiivinen hoito vähäinen vaikutus eloonjäämiseen [2]. Näin ollen merkittäviä tutkimuksia ei ole tehty selvittämään merkittävät tapahtumat ajo haiman syövän synnyn, tunnistaa uusia tavoitteita ja kehittää kasvaimeen kohdennettua hoitomuotojen [3], [4]. Geneettinen ja epigeneettiset muutokset on kuvattu varhainen tapahtuma kehittämisessä PDAC [5]. Viime vuosikymmenen aikana, merkittävä teoksia osoitti, mikä vaikutus näiden molekyylien aiheuttanut muutoksia MikroRNA ilmaisun PDAC. MikroRNA ovat pieniä kuin koodaavat RNA: t, jotka estävät käännös niiden kohde mRNA: iden. Niillä on tärkeä merkitys syövän kehitykseen, invasiivisuus ja kestävyys chemotherapies [6].

aiemmin osoitettu, että microRNA-148a ilmaisu (miR-148a) säätyy alas varhaisessa vaiheessa PDAC kehitystä hypermetylaatiota sen genomista DNA sekvenssi [7]. Muut tutkimukset raportoivat alas-säätely miR-148a ilmaisunvapautta muissa syövissä (

so.

: Peräsuolen, ruokatorven, mahalaukun syöpiin ja syövän etäpesäkkeiden) [8], [9], [10], [11]. Useita miR-148a mRNA tavoitteet kuvattiin eri syöpätyyppien. Nämä tavoitteet koota solusyklin, apoptoosin tai DNA: n metylaatio efektoreja.

Aikaisemmat tutkimukset herätti kasvain estävä vaikutus tämän perusteella yli-ilmentyminen miR-148a peräsuolen ja mahasyövän solulinjat [8], [10 ]. Näin ollen esillä Tutkimuksen tavoitteena oli selvittää palauttamiseksi miR-148a ilmentymisen vaikutukset PDAC lisääntymistä sekä

in vitro

ja

in vivo

ja siksi voitaisiin esittää terapeuttisena välineenä.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Ihmisen PDAC Capan-2 ja IMIM-PC2 solulinjoja kasvatettiin RPMI 100 ml /l naudan sikiön seerumia, L-glutamiinia (2 mM ) (Life Technologies), antibiootti ja antimykoottia cocktail (Life Technologies) ja Plasmocin® (5 ug /ml) (InvivoGen). MIA PaCa-2 ja PANC-1 PDAC solut ja ihmisen sikiön munuaisen HEK-293FT-soluja kasvatettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 4,5 g /l glukoosia (Life Technologies), 100 ml /l naudan sikiön seerumia, L-glutamiinia, antibiootteja, Fungizone® ja Plasmocin® (InvivoGen). Ihmisen PDAC johdettu BxPC-3-soluja kasvatettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 1 g /l glukoosia (Life Technologies), 100 ml /l naudan sikiön seerumia, L-glutamiinia, antibiootti ja antimykoottinen cocktailit. Ihmisen haiman nestiinifenotyypin positiivinen epiteelisolut (HPNE) kasvatettiin 75% DMEM 4,5 g /l glukoosia (Life Technologies), 25% Medium M3 Base (Incell Corp.), naudan sikiön seerumia 5%, 10 ng /ml ihmisen rekombinantti-EGF: ää ( Sigma-Aldrich) ja 750 ng /ml gentamysiiniä (Life Technologies). Kaikki solulinjat saatiin American Type Culture Collection (ATCC) lukuun ottamatta ja HDPE-solujen ja HPNE soluja, jotka ovat sellaisia ​​lahja Dr M.S. Tsao (University of Toronto, Kanada) ja tohtori M. Ouellette (University of Nebraska Medical Center, Omaha, USA), vastaavasti [12], [13]. IMIM-PC2 solut saatiin tri FX Real (Spanish National Cancer Research Centre, Madrid, Espanja).

Solun transfektio

Kaikille

in vitro

kokeissa asennuspalveli- 148a pre-miR ™ miRNA esiasteita (Ambion) 25 nM ja 50 nM, transfektoitiin käyttämällä SIPORT ™ NeoFX ™ Transfection Agent (Ambion) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Cy ™ 3 dye-leimattua Pre-miR käytettiin negatiivisena kontrollina ja transfektoitiin käyttäen samoja olosuhteita.

Solusyklianalyysiä virtaussytometrialla

Transfektoituja Capan-2 solut kerättiin, huuhdeltiin kerran fosfaatti-puskuroidulla suolaliuoksella (PBS) ja kiinnitettiin jääkylmällä 70% etanolilla yön yli 4 ° C: ssa. Solut kerättiin sentrifugoimalla 1,000 g ja huuhdeltiin PBS: lla. Solut leimattiin propidiumjodidilla (Life Technologies) ja noudattamalla valmistajan suositusten mukaisesti. Solusyklin jakelu arvioitiin käyttämällä BD FACS Calibur laite (Becktonin Dickinson) ja Cell Quest pro ohjelmisto (Beckton Dickinson) kuvaamalla tavalla Hanounin

et al.

[14].

2D-DIGE elektroforeesi

solulyysi suoritettiin Urea 8M, Tiourea 2M, CHAPS 4%, pH 8,5. Sen jälkeen kun puhdistus sateeseen (2D Clean Up Kit, GE Healthcare), proteiinit suspendoitiin uudelleen 2D-DIGE näytepuskuria (urea 8 M, Tiourea 2M, CHAPS 4%, pH 8,5). Proteiinipitoisuus määritettiin 2D Quant Kit (GE-Healthcare). Viisikymmentä mikrogrammaa proteiinien leimattiin 400 pmol CyDye DIGE Fluor Vähäinen Väriaineet (GE Healthcare) ja inkuboitiin jäillä pimeässä 30 min mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 1 ui 10 mM lysiiniä ja inkuboitiin jäillä 10 min. Differentiaalisesti Cy-3 ja Cy-5 leimattuja näytteitä sekoitettiin Cy-2 leimattua sisäistä standardia (näyte koostuu yhtä eriä kunkin näytteen koe) ja isoelektrisellä fokusoinnilla (IEF) uudelleen hydrataation puskuriin (8 M urea, Tiourea 2M , CHAPS 2%, 10 mM DTT, 1,2% IPG (immobilisoidut pH gradient), pH 4-7, GE Healthcare) lisättiin 350 ui. 2D-DIGE analyysi, IEF suoritettiin käyttäen IPGPhor 2 laite (GE Healthcare) mukaan valmistajan suositusten immobilisoidulla pH-gradienttia (IPG) pH 4-7, 18 cm. Liuskoja inkuboitiin ensin tasapainotuspuskurissa (6 M ureaa, SDS 2%, Tris-HCI 50 mM pH 8,6, glyseroli 30%, bromifenolisinistä trace), joka sisälsi 1% DTT: tä 15 minuutin ajan, ja sen jälkeen samaa puskuria, jossa 4,5% jodiasetamidi, 15 min pimeässä. Liuskat lastattiin yläosassa 12,5% akryyliamidia geelejä ja juoksi 1 W /h 1,5 h ja 15 W /h, kunnes bromofenolisininen saavuttaa alhaalta geelin lopusta. Geelit skannattiin käyttäen Typhoon trio Imager (GE Healthcare) 100 um resoluutio kanssa Aex /em of 488/520, 532/580 ja 633/670 nm Cy-2, Cy-3 ja Cy-5, vastaavasti. Kuva-analyysi suoritettiin käyttäen DeCyder 6,5 ohjelmistoa (GE Healthcare).

Plasmidit

pLVMND-SLuc koodaava plasmidi eritetyn Gaussia Luciferase (Gluc) luovutti ystävällisesti Cayla-InVivoGen (Toulouse, Ranska ). Lentiviraalinen ekspressiovektori koodaa miR-148a ja copGFP (pMIRNA1-miR148a) tai copGFP yksinään (pMIRNA1-GFP) saatiin Biovalley (Marne-la-Vallée, Ranska). Plenti6-TR, joka koodaa TET-repressori, saatiin Life Technologies. Jotta indusoituvan ilmentymisen miR-148, kaksi osittain komplementaaristen oligonukleotidien vastaavat kypsyä miR-148a tai ohjaus salattu miR (miR-CT) hybridisoitiin ja kloonattiin pcDNA6.2-GW /emGFP-miR vektori (Life Technologies) ennen rekombinaatiota osaksi pLenti4 /TO /V5 DEST vektorin (Life Technologies) käyttäen Gateway® strategiaa. Sillä lentivectors tuotannon, pakkaamisen plasmidit pHCMV-G, joka koodaa VSV-G-proteiinin, ja pCMVΔ8.91, joka koodaa HIV-1 lisäproteiineja, ystävällisesti lahjoitti Dr. A. Dubart-Kupperschmitt (Pariisi, Ranska).

Lentivirusvektori tuotanto

Kaikki replikaatioviallinen, self-inaktivoivan lentivirusvektoreita kertyi on BSL-3 laitos (Vectorology alustalla, INSERM U1037 Cancer Research Center of Toulouse, Toulouse, Ranska) ovat aikaisemmin kuvanneet Torrisani

et al.

[15]. Lyhyesti, lyhytaikaista transfektiota HEK-293FT solujen pakkaus ja lentivirusvekto- plasmidit tehtiin kalsiumfosfaattisaostuksella. pLenti4 /TO /GFP-miR-148a, pLenti4 /TO /GFP miR-CT käytettiin saamiseksi lentiviraalinen hiukkasten koodaavat indusoituvaa miR-148a tai miR-CT (nimittäin, LV-TO-miR-148a tai LV-TO-asennuspalveli- CT, vastaavasti). Toisaalta, pMIRNA1-miR148a ja pMIRNA1-GFP käytettiin saamiseksi lentivirus- partikkeleita konstitutiivisesti koodaa miR-148a tai miR-CT (LV-miR-148a tai LV-GFP, tässä järjestyksessä). Plenti6-TR ja pLVMND-SLuc plasmideja käytettiin saamiseksi lentivirus- partikkeleita, joka koodaa Tet-repressorin tai erittää lusiferaasi (LV-TR tai LV-Gluc, vastaavasti). Kaikki erät todennettiin Replikoitumattoman viruksia. Viruksen tiitterit määritettiin HT-1080-soluja ja ilmaistaan ​​transduktio yksikköä /ml (TU /ml), kuten muualla on kuvattu. Lisäksi vektori pitoisuudet kvantitoitiin p24 ELISA (INNOTEST, Ingen, Pariisi).

Generation of MIA PaCa-2 vakaa solulinjasta yliekspressoivissa miR-148a

MIA PaCa-2-soluissa inkuboitiin LV-TR lentivirus- partikkeleita (multiplicity of infection = 5) 24 tunnin ajan ja sen jälkeen valitaan blastisidiinia (Invivogen, Toulouse, Ranska) 100 ug /ml 2 viikkoa ja kloonattiin sarjalaimennuksella saada MIA PaCa-2 TR-solut. MIA PaCa-2 TR-solut edelleen transduktoi- LV-Gluc (multiplicity of infection = 5), ja kloonattiin sarjalaimennuksella antaa MIA Pac-2 TR-Gluc-soluja. Jälkimmäinen soluja inkuboitiin LV-TO-miR-148a tai LV-TO-miR-CT (multiplicity of infection = 5) 24 tunnin ajan ja on valittu zeosiinin kanssa (Invivogen) 100 ug /ml 3 viikkoa ja kloonattiin sarjanumero laimennus tuottaa MIA PaCa-2 TR-Gluc miR-148a ja MIA PaCa-2 TR-Gluc miR-CT solulinjoissa, vastaavasti. Optimaalinen doxycyclin konsentraatio 1 ug /ml määritettiin aiheuttaa maksimaalisen ekspression miR-148a. Eri stabiileja solulinjoja sitten jatkuvasti kasvatettu tai puuttuminen doxycyclin.

mittaaminen miR-148a ilmentyminen qRT-PCR

Ensin soluja transfektoitiin ohimenevästi tai stabiilisti transduktoi- kuvatulla edellä. Kokonais-RNA eristettiin solulinjoista kanssa TRIzol reagenssia (Life Technologies) mukainen toimittajan ohjeiden mukaisesti. RNA-pitoisuus mitattiin NanoDrop ND-1000 spektrofotometrillä (Thermo Scientific). MiScript PCR System (Qiagen) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden määrittää kypsä MikroRNA 1 ug kokonais-RNA: ta. U6 ja 5S RNA: ta käytettiin sisäisen valvonnan. cDNA laimennettiin 1: n 100 microRNA havaitsemista tai U6 ja 1 osaksi 10.000 5S RNA havaitsemiseen. Monista qRT-PCR määritykset suoritettiin StepOnePlus ™ Real-Time PCR System (Applied Biosystems) kanssa SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen). Suhteelliset määrät miRNA laskettiin vertaileva kynnyksen syklin (CT) menetelmää 2-ACt, jossa ACt = CTmiRNA – CT geometrinen keskiarvo U6 ja 5S.

Proliferaatiomääritys

MiR-148a esiaste tai Cy ™ 3 dye-leimattua negatiivinen kontrolli esiaste transfektoidut solut ympättiin 6 x 10

3 solua per kuoppa 96-kuoppaisen lautasen ja kasvatettiin täydellisessä elatusaineessa. Elävien solujen määrä määritettiin kolorimetrisellä menetelmällä käyttämällä CellTiter 96® vesiliuosta Non-Radioactive Cell Proliferation Assay (Promega) valmistajan ohjeiden päivänä 4. leviämisen mittaus, solut ympättiin 5 x 10

4 solua per kuoppa 35 mm ruokia. Soluja kasvatettiin täydellisessä elatusaineessa, jota oli täydennetty 1 ug /ml doksisykliiniä. Viisisataa nanogrammaa doksisykliini lisättiin 48 tunnin estää sen rappeutuminen viljelyväliaineessa. Solut laskettiin Coulter-laskimella malli ZM (Beckman Coulter) jälkeen 24 h, 48 h, 72 h ja 96 h kulttuurin.

Gemsitabiini herkkyyden määritys

Kaksikymmentä viisi tuhatta eksponentiaalisesti kasvava MIA PaCa -2-solut, jotka ekspressoivat stabiilisti miR-148a tai ohjata microRNA kasvatettu tai ilman doksisykliini maljattiin 35 mm ruokia. Kaksikymmentä neljä tuntia myöhemmin solut käsiteltiin gemsitabiinin (Eli Lilly) eri annoksina, jotka vaihtelevat välillä 1 x 10

-9 M 1 x 10

-4 M. 72 tunnin kuluttua hoidon solut laskettiin käyttäen Coulter laskuri malli ZM (Beckman Coulter). Gemsitabiini ”tappava pitoisuus 50” (LC

50) on konsentraatio gemsitabiinin, jossa 50% käsiteltyjä soluja kuoli suhteellisen käsittelemättömiin soluihin 96 tuntia. Mittaamiseen gemsitabiinin herkkyyttä solujen lyhytaikaisesti yli-ilmentävät miR-148a, 1000 eksponentiaalisesti kasvavia PDAC-soluihin tilapäisesti yli-ilmentävät miR-148a tai ohjaus microRNA (miR-CT) maljattiin 96-kuoppaiselle levylle. -Soluja käsiteltiin eri annoksilla gemsitabiinin välillä 1 x 10

-9 M 1 x 10

4 M 72 tuntia. Kutakin solulinjaa, solujen elinkelpoisuus arvioitiin kolorimetrisellä menetelmällä, verrattuna elinkelpoisuus mitattiin 1 x 10

-9 M käsitelty kaivoja ja edusti prosentteina eloonjääneiden solujen.

Muuttoliike ja invaasio määritykset

satatuhatta eksponentiaalisesti kasvavat solut yli-ilmentävät miR-148a tai GFP toimittaja proteiinin seerumin puutteessa 24 tuntia ja ympättiin 24 hyvin levyn kokoinen insertit (8 um huokoista 24 kuopan kokoisen insertit muuttoliike määrityksiä ja BIOCAT Matrigel hyökkäys kammiota invaasio määrityksiä, BD Falcon) valmistajan ohjeiden mukaisesti. 15 tunnin kuluttua siirtyneet solut värjättiin 1% kristallivioletilla 20% metanoli liuos, hajotettiin ja solujen tiheys määritettiin optinen tiheys toimenpide solulysaattien 560 nm. Tulokset ilmaistaan ​​prosentteina muuttaa tai tunkeutuvat miR-148a yli-ilmentäviä soluja verrattuna GFP ekspressoivien solujen.

Orthotopic solusiirre

Kahdeksan viikkoa vanhoja SCID /beige CB 17 vuotavat hiiriä ( TAKONIC) käytettiin solujen siirteen kokeissa. Jokainen hiiri sai 12 x 10

6 eksponentiaalisesti kasvavia MIA PaCa-2-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät miR-148a 100 ui PBS: ää injektoitiin pyrstö haima. Injektiot suoritettiin 29 gaugen lymfografiassa katetri asetettu 29 mittari insuliini neulan. Hiiret oksastettu miR-148a ilmentävien solujen saivat vettä

halun

täydennetty sakkaroosia (25 g /l) ja doksisykliini (2 g /l). Ohjaus hiiret saivat vettä

halun

täydennetty sakkaroosia vain (25 g /l). Kolmekymmentä päivää sen jälkeen, kun ksenografti, hiiret uhrattiin ja tuumorit poistettiin, punnittiin ja mitattiin. Kasvaimen tilavuus määritettiin kaavalla ((kasvain pituus) x (tuumorin leveys

2)) /2. Tämä tutkimus suoritettiin tiukasti mukaisesti suosituksia kaavioon hoito ja käyttö Laboratory Animals on INSERM. Kaikki Leikkaus suoritettiin isofluraanianestesiassa, ja jokainen pyrittiin minimoimaan kärsimystä. Kaikki protokollia kuten eläimet hyväksynyt ANEXPLO etiikan komitea. Makroskooppinen havainto kasvainten suoritettiin ammattitaitoisen patologi.

In vivo

kasvain transduktion MIA PaCa-2 kasvaimia

Orthotopic kasvaimia perustettiin SCID CB17 hiirissä haiman injektiona 12 x 10

6 eksponentiaalisesti kasvavien MIA PaCa-2-Gluc (kuten edellä on kuvattu). Kasvaimet kasvatettiin 15 päivän ajan ennen injektiota 250 ng p24 LV-miR148a lentivector käyttäen 29 gaugen lymfografiassa katetri asetettu 29 mittari insuliini neulan. LV-GFP ruiskutettiin hallinnassa hiirillä. Kasvainprogression ennen ja jälkeen transduktio seurattiin mittaus on Gluc tason hiirillä seerumin (kuten alla on kuvattu) ja vatsan tunnustelu.

Lusiferaasiaktiivisuutta hiirillä seerumin

Lusiferaasiaktiivisuus mitattiin hiirten seerumista . Verta kerättiin silmäkuopan näytteenotto käyttäen Pasteur kapillaari-pipettiä (VWR) esitäytetty 10 ui 20% EDTA-liuosta. Verinäytteet pidettiin jäissä, kunnes sentrifugoimalla. Näytteet sentrifugoitiin 3,000 g 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja seerumin kerättiin ja säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. Lusiferaasiaktiivisuus määritettiin 5 ui seerumia ja 45 ui 50 uM koelenteratsiini liuokseen (Fluka analyyttinen) on Luminoskan nousun laitteen (Thermo Scientific).

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan keskiarvo ± keskivirhe. Tilastollinen merkitys eroja mitattiin Mann-Whitneyn ei parametrinen testi, jossa on

p

arvo 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä. Symboli * osoittaa

p

arvo 0,05, ** osoittaa

p

arvo 0,01 ja *** osoittaa

p

arvo 0,005.

tulokset

vaikutus ohimeneviä miR-148a over-lausekkeen PDAC solulinjan kasvua

aiemmin raportoitu että miR-148a ilmentyminen on tukahdutettu DNA hypermetylaatiota sen genomisen sekvenssin in PDAC solussa linjat ja kasvaimet [7]. Voitaisiin otaksua, että menetys miR-148a ilme on ratkaisevaa PDAC kehittämiseen. Arvioimiseksi tuumoria tukahduttavan vaikutuksia miR-148a in PDAC, Capan-2, PANC-1, MIA PaCa-2 ja BxPC-3 PDAC solulinjat transfektoitiin jonka miR-148a oligonukleotidi esiaste (miR-148a) tai kontrolli esiaste ( miR-CT). HPNE soluja, jotka ovat ihmisen haiman soluja, näyttää normaali fenotyyppi käytettiin ”ei-syöpä” kontrollisoluja. Solulisääntyminen mitattiin kolorimetrisellä menetelmällä 4 päivää transfektion jälkeen. MiR-CT transfektoituja soluja käytettiin sisäisenä viitteenä kussakin solulinjassa (kuvio 1A). Transfektiotehokkuuden arvioitiin kullekin solulinjassa Cy3 fluoresenssin mittaus- ja saavutti 90-100% (tuloksia ei ole esitetty). Tuloksena miR-148a ilmentyminen mitattiin qRT-PCR (Kuva S1A). MiR-148a yli-ilmentyminen HPNE haiman normaaleissa soluissa ei aiheuttanut merkittäviä muutoksia solujen lisääntymisen. Vastaavasti mitään merkittävää muutosta soluproliferaatiota havaittiin neljällä PDAC solulinjoissa verrattuna Cy3 kontrollitransfektoidut soluja. Samanaikaisesti, solusyklin jakautumisen Capan-2-soluissa määritettiin FACS-analyysillä (kuvio 1 B). Mukaan ei ole vaikutusta koskevat solujen lisääntymisen, mitään muutosta solusyklin jakautuminen havaittiin miR-148a transfektoiduissa soluissa verrattuna miR-CT-soluja. Nämä tulokset osoittavat, että ohimenevä miR-148a yli-ilmentyminen ei ole erityistä vaikutusta soluproliferaatioon neljä PDAC solulinjoissa.

(A) Capan-2, PANC-1, MIA PaCa-2 ja BxPC-3 PDAC -johdannainen solulinjoja ja ei-syöpä HPNE solulinja transfektoitiin ohimenevästi miR-CT tai miR-148a esiasteita. Neljä päivää transfektion jälkeen solujen elinkelpoisuus arvioitiin kolorimetrisellä menetelmillä. Kunkin solulinjan miR-148a-solujen elinkelpoisuus verrattiin miR-CT solujen elinkykyä (100%). Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta (± SEM), ja ne ilmaistaan ​​prosentteina solujen elinkelpoisuuden kontrollisoluja. (B), Cell cycle jakelu mitattiin propidiumjodidivärjäys seuraa FACS-analyysillä 72 tuntia transfektion jälkeen ja Capan-2-solujen miR-CT tai miR-148a esiasteita.

Vaikutus vakaa asennuspalveli- 148a yli-ilmentyminen on PDAC solulinjassa käyttäytyminen

lisäksi ohimenevä transfektiokokeis-, me syntyy Tet-oN-pohjainen lentiviraalinen hiukkasten stabiilin ilmentymisen miR-148a estää nopean oligonukleotidin hajoaminen ja mahdollistaa pitkän aikavälin seuranta -up of cellular tapahtumista PDAC solulinjoissa. Me transduktoi- MIA PaCa-2-soluissa johtuen niiden alhaisesta ilmentymistaso endogeenisen miR-148a [7]. Näissä soluissa, doksisykliinikäsittely johtaa viiden-kertainen miR-148a ilmentymisen, verrattuna miR-CT yli-ilmentäviä soluja (kuvio S1B). Kuitenkin, stabiili ekspressio miR-148a ei johda merkittäviin muutoksiin solujen proliferaatiota näissä soluissa verrattuna kontrollisoluihin (kuvio 2). Lisäksi, siirtymän ja invaasion mahdollisten solujen yli-ilmentävät miR-148a mitattiin ja sitä verrataan kontrolliarvoihin soluihin (kuvio S2). Täällä, havaitsimme, että miR-148a yliekspressio ei muuta näitä kahta solutoiminnoille meidän MIA PACA-2 solulinjassa malli. Yhdessä me osoittavat, että samalla lyhytaikaisiin yli-ilmentyminen, pitkäkestoinen ilmauksia miR-148a on tehoton inhiboimiseksi PDAC soluproliferaation ja ei vaikuta solun käyttäytymistä

in vitro

.

MIA PaCa-2-soluja inkuboitiin indusoituvan lentivirusvektoreita koodaava sekoituskoodin microRNA (miR-CT) tai miR-148a (miR-148a). MIA PaCa-2 miR-CT tai miR-148a proliferaationopeus arvioitiin läsnä ollessa tai poissa ollessa doksisykliini viljelyalustassa. Kunkin ehdon, solujen luku- määrä laskettiin joka 24. tunti, ja verrattuna Tarttuvien solujen lukumäärä päivänä 1. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta (± SEM).

Gemsitabiini herkkyys PDAC solulinjoissa, jotka yli-ilmentävät miR-148a

on ehdotettu aiemmin, että MikroRNA voi vaikuttaa kemosensitiivisyys kohdistamalla lääkkeiden kantaja tai rajoittavan solun reitin ratkaisevaa lääkeainemetaboliaan tai solujen eloonjäämistä [16]. Kuten edellä on kuvattu, gemsitabiini on viittaus kemoterapiaa PDAC. Olemme arvioineet miR-148a ottaa osaa PDAC solujen herkkyys vasten tätä lääkettä. Ensin huomanneet mitään merkittävää korrelaatiota miR-148a endogeenisen tason (kuvio 3A) ja gemsitabiinia herkkyys useilla PDAC solulinjoissa (kuvio 3B). Samanaikaisesti, arvioimme gemsitabiini herkkyyttä MIA PaCa-2-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät miR-148a tai miR-CT (kuvio 3C). Tulokset, jotka saatiin kolmesta itsenäisestä määritykset osoittavat, ei vähentynyt merkittävästi tappava pitoisuus 50-arvo (LC50) gemsitabiinin läsnä ollessa miR-148a kontrolliin verrattuna soluihin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun ohimenevän transfektion miR-148a useita PDAC solulinjoissa (kuvio S3). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että miR-148a ei vaikuttaa huomattavasti PDAC solulinjat herkkyys vastaan ​​gemsitabiinia.

(A) miR-148a endogeenisen ilmentymisen määrä mitattiin qRT-PCR useissa PDAC solulinjoissa sekä HDPE ja hPNE normaalin haiman solulinjat. (B) Solujen herkkyys gemsitabiinin mitattiin 72 h-hoito useissa PDAC solulinjoissa ja normaaleissa hPNE haiman soluja. Elossa solun osa edustaa lukumäärää käsiteltyjen solujen aikana 72 h verrattuna määrä käsittelemättömien solujen (edustettuina 100%). Tappava pitoisuus 50 (LC50) edustaa gemsitabiinin annos on riittävä saamaan 50% eloonjääneiden solujen verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta (± SEM). (C) Cell herkkyys gemsitabiinia mitattiin MIA PaCa-2-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät miR-148a (LV-TO-miR-148a) tai kontrolli miR (LV-TO-miR-CT) ja gemsitabiinin läsnäollessa doksisykliini jälkeen 72 h-hoitoa. Elossa solun osa edustaa lukumäärää käsiteltyjen solujen aikana 72 h verrattuna määrä käsittelemättömien solujen (edustettuina 100%). Tulokset ovat keskiarvoja kolmesta itsenäisestä kokeesta (± SEM).

Proteiinin ilmentyminen profiilin analyysi jälkeen ohimenevän miR-148a yliekspressio

Jokainen microRNA saattavat vaikuttaa käännös kymmeniä mRNA tavoitteiden mukaisesti säilyttämiseen sen kohdesekvenssin [6]. Puuttuminen soluvaikutuksensa jälkeen miR-148a over-ilmentyminen voitiin selittää sekä heikko muutos proteiiniekspressiossa profiilin, riitä tuottamaan solun vaikutus, tai ylös-säännöksen mukaisesti pelastamiseen rakenteisen, tämän perusteella miR-148a tavoite rappeutuminen. Näin ollen teimme suuren mittakaavan analyysiin proteiinin ilmentymisen profiilien 2D-DIGE jälkeen ohimenevän miR-148a yli-ilmentyminen Capan-2-soluissa. Capan-2-solut, jotka on transfektoitu miR-CT käytettiin kontrollina. Fluoresenssi analyysi 2D-geelit osoittivat, että miR-148a yli-ilmentyminen johtaa vain heikko modulaatio on noin 2200-proteiinin ilmentymisen verrattuna kontrollisoluihin (kuvio S4). Mikään näistä vaihteluista saavuttanut raja-arvo (1,5-kertainen muutos verrattuna kontrolliin transfektoitujen solujen) huolimatta massiivinen yli-ilmentyminen miR-148a (kuvio S1A). Näin ollen, ei ole proteiinia lajit tunnistettiin massaspektrometrialla.

Nämä tulokset osoittavat, että miR-148a ei merkittävästi vaikuta proteiinin ilmentymisen profiilit Capan-2-soluissa, jotka voivat selittää ilman biologisten vaikutusten seurauksena sen yli -ilmaisu.

in vivo

vaikutuksia miR-148a yliekspressio

Voit selvittää miR-148a voi vaikuttaa kasvaimen kasvua

in vivo

, me tuotetaan potilaalle tehdä PDAC kasvaimia SCID CB17 hiiriin käyttäen MIA PaCa-2-soluissa stabiilisti yli-ilmentävät miR-148a 5 kertaiseksi (kuvio S1B). Nämä solut ekspressoivat konstitutiivisesti Gaussia lusiferaasi (Gluc) ei-invasiivisia seuranta kasvaimen kasvua. Kuten ovat kuvanneet Chung ja työtoverit, Gluc kvantifiointiin seerumin kuvaa tarkasti, että käyttökelpoista syöpäsolujen ksenograftikasvaimissa [17]. Sillä

in vivo

tutkimuksissa Gluc otettiin näytteitä 5 päivän välein ja hiiret tapettiin 33 päivää, mukaan kasvaimen koon arvioitu vatsan tunnustelu. Korrelaatio kasvaimen painon ja Gluc signaali (R

2 = 0,79) varmistui kasvaimen resektion ja vertailu Gluc annos seerumin otokseen leikkauspäivänä (kuva S5).

aikana tämän kokeilu, huomasimme, että Gluc tasot eivät muuta miR-148a ilmaisu osoittaa, että miR-148a ei estä PDAC syövän etenemiseen

in vivo

(kuvio 4A). Yhdenmukaisesti näiden havaintojen analyysi kasvaimia leikkauksen jälkeen ei voitu todeta miR-148a estovaikutusta kasvaimen paino (Dox: 0,368 g ± 0,16 g

vs

Hoitamaton: 0,348 g ± 0,22 g) (kuvio 4B). Lisäksi histologiset tutkimus kasvainten osoittaa eroa kudoksen organisaation eri ryhmien välillä (kuvio S6). Nämä havainnot eivät paljasta dramaattisia vaikutuksia miR-148a ilme kasvaimen kasvuun tai kasvainkudoksen kehitys

in vivo

.

(A)

In vivo

seuranta ksenograftin syövän etenemiseen: MIA PaCa-2 solut, jotka ilmentävät miR-148a ja erittävät Gaussia lusiferaasin (Gluc) injektoitiin haimassa SCID-hiirillä. Hiiret saivat juomavettä (käsittelemätön, n = 10) tai vettä täydennetty doksisykliini (doksisykliini, n = 12) miR-148a ilmentymisen induktio lopettamiseen asti. Gluc mitattiin hiirillä seerumista. Tulokset ovat keskiarvo Gluc toiminnan (± SEM), ja ne ilmaistaan ​​mielivaltaisia ​​Light Unit (A.L.U.). (B) Kasvaimet poistettiin ja painotettu leikkauspäivänä. Tulokset ovat keskiarvo (± SEM) kasvaimen paino hoitamattomassa ryhmässä (n = 10) ja doksisykliini hoidetussa ryhmässä (n = 12) (C)

In vivo

seuranta ksenograftin taudin etenemiseen: MIA PaCa-2 solut, jotka ilmentävät erittyy Gaussia lusiferaasin injektoitiin haimassa SCID-hiirten (n = 10). Viisitoista päivää myöhemmin, lentivirusvektorit, jotka koodaavat miR-148a (miR-148a, n = 7) tai GFP vain (GFP, n = 3) injektoitiin kasvaimissa (nuoli osoittaa lentiviruksen hiukkasia injektio). Määrä Gluc mitattiin hiirillä seerumissa ja verrattuna Gluc määrä mitattiin päivänä lentivector injektio (päivä 0). Tulokset ovat keskiarvo Gluc tason suhteen kussakin ryhmässä (± SEM) ja ilmaistaan ​​mielivaltaisesti valoyksikkö suhde. (D) Kasvaimet vastaanottamiseksi miR-148 (miR-148a, n = 7) tai GFP (GFP, n = 3) poistettiin 10 päivää sen jälkeen, kun lentiviruksen injektion ja punnittiin. Kaavion vertailu kasvaimen painon ilmentävien miR-148a (n = 7) tai GFP (n = 3). Tulokset ovat keskiarvo kasvaimen paino kussakin ryhmässä (± SEM).

In vivo

mittauksessa miR-148a terapeuttista potentiaalia

arvioimiseksi anti -tumor potentiaali akuutti miR-148a yli-ilmentymisen sekä kasvainsoluissa ja mikroympäristön, me ruiskutetaan lentivirus- partikkeleita, jotka koodaavat miR-148a (LV-miR-148a) ennalta vahvistettu MIA PaCa-2-Gluc kasvaimia Siirto tehty haima SCID-CB17 hiirillä. Lentivirus- partikkeleita koodaa GFP reportteri-proteiinia (LV-GFP) käytettiin kontrollina. MiR-148a yli-ilmentyminen LV-miR-148a-ruiskutetaan kasvaimia varmistettiin qRT-PCR (Kuva S7). Syövän etenemistä seurattiin Gluc näytteitä hiirillä seerumin. Pieneneminen Gluc signaali havaittiin 5 päivän kuluessa kasvaimen transduktion sekä hiukkasten (kuvio 4C). Päivästä 5 päivään 10, Gluc tasot olivat tiukasti samanlaiset miR-148a ja valvonta-transduktoi- kasvaimia, jotka osoittavat eroa kasvaimen elinkelpoisuuden seuraavissa lentivirusvektoreita injektion. Mukaisesti Gluc annostus, resektoitiin kasvaimen painot päivänä 10 ovat samanlaisia ​​LV-miR-148a ja LV-GFP-transduktoi- ryhmät (LV-miR-148a: 1,77 g ± 0,30 g

vs

LV-GFP: 1,97 g ± 0,63 g) (kuvio 4D). Nämä tulokset osoittavat, että miR-148a geeninsiirto sekä kasvainkudoksessa ja mikroympäristölle ei vaikuta kasvain elinkelpoisuutta ja paljastaa mitään erityistä terapeuttista potentiaalia.

Keskustelu

MiR-148a ilmentyminen muuttunut useita syöpä ja sen alas-asetus on kuvattu hyvin erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia, kuten kolorektaalisen, munasarja-, eturauhas- ja mahasyöpä [8], [11], [18], [19].