Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Syöpä /kivesantigeenien (CTA: t) löydettiin ensimmäisen immunogeenisinä tavoitteita normaalisti ilmaistu ituradan soluissa, mutta ekspressoituu differentiaalisesti erilaisia ​​ihmisen syövissä. Tässä tutkimuksessa käytimme integroiva epigenetic seulontaan tunnistamiseksi coordinately ilmaistu geenien ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC), jonka transkriptiota ohjaa promoottori demetylaation.

Menetelmät /Principal Havainnot

Meidän seulontaan löytyi 290 merkittäviä geenejä yli 47000 selostukset sisällytetty Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 ilmaisun array. Top 55 ehdokasta, 10 osoitti sekä ero yli-ilmentymisen ja promoottorialue hypometylaatio NSCLC. Yllättäen 6 10 geenien löysi tämän lähestymistavan olivat Toimintakehotukset. Käyttää erillistä kohortin primaarituumorin ja normaali kudos, me validoitu NSCLC promoottori hypometylaatio ja lisääntyneen ilmentymisen kvantitatiivisella RT-PCR kaikille 10 geenit. Totesimme merkittävä, koordinoitu -parin useiden kohdegeenien, sekä koordinoitua promoottori demetylaation, suuri joukko yksittäisiä kasvaimia, jotka oli mukana SCC alatyypin NSCLC. Lisäksi tunnistimme 2 uusia kohdegeenien että esiintyi kasvua edistäviä vaikutuksia useissa solulinjoissa.

Johtopäätökset /merkitys

Coordinated promoottori demetylaatio NSCLC liittyy poikkeava ilmentymä Toimintakehotukset ja potentiaalia, novel ehdokas esisyöpägeenien voidaan tunnistaa käyttämällä integroiva löytö tekniikoita. Nämä havainnot ovat merkittäviä vaikutuksia löytö uusien Toimintakehotukset ja CT antigeenin suunnattu immunoterapian.

Citation: Glazer CA, Smith IM, Ochs MF, Begum S, Westra W, Chang SS, et al. (2009) Integrative Discovery of epigeneettiseltä derepressoida Cancer kivesantigeenien NSCLC. PLoS ONE 4 (12): e8189. doi: 10,1371 /journal.pone.0008189

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 18 syyskuu 2009; Hyväksytty: 16 marraskuu 2009; Julkaistu: 04 joulukuu 2009

Copyright: © 2009 Glazer et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Dr. Califano tukee Clinical Innovator Award lentoemäntä Medical Research Institute, ja National Cancer Institute SPORE (5P50CA096784-05) ja EDRN U01CA084986. Dr. Glazer rahoitetaan osittain NIH T32 Research Training Grant. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

on hyvin tunnettua, että CTA: t ovat yli-ilmentynyt eri kasvaintyypeissä, joilla on vain vähän tai ei lainkaan ekspressiota normaaleissa ihmisen kudoksessa; kuitenkin, mekanismi tätä ero ilmaisua ei ymmärretä hyvin [1]. Epigeneettiset muutoksia myös muutoksia promoottori metylaatio on yhdistetty syöpään ekspressio eroja ihmisen maligniteettien, mukaan lukien ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [2], [3], [4], [5], [6], [7]. Promoottori hypermetylaation on ensisijaisesti pidettävä mekanismi tuumorisuppressorigeenin inaktivoimiseksi; kuitenkin, globaali genominen hypometylaatio on raportoitu lähes kaikissa kasvaimissa [2], [4], [8], [9]. On myös tunnettua, että CTA: t, erityisesti ne, joita koodaavat X-kromosomi (CT-X antigeenejä), ilmaistaan ​​yhdessä promoottorin demetylaatio tai koko genomisen hypometylaatio [10], [11], [12].

keuhkosyöpä on johtava syy syöpään liittyvien kuolemien maailmanlaajuisesti yli 213000 uutta tapausta ja 160000 kuolemantapausta raportoitu vuonna 2007; NSCLC vastaa noin 75% näistä tapauksista [13]. Korkea kuolleisuus NSCLC johtuu diagnoosi edennyt pitkälle, korkea toistumisen huolimatta lopullisen Paikallista hallintaa, ja se, ettei hoitomuotoja toistuvat keuhkosyöpään on liittynyt parannettu pysyvyyttä [6].

Yksi lähestymistapa parantaa NSCLC kuolleisuus on ollut syövän kehittymisen rokotteita, joiden tarkoituksena on indusoida isännän immuunivasteen kasvainsoluja vastaan. CTA: t ovat houkuttelevia kohteita kasvaimen immunoterapiaa koska niiden rajoitettu ilmentymismalleja normaalissa ihmisen kudoksessa. Esimerkiksi NY-ESO-1 ja MAGEA3 ovat parhaillaan kliinisissä kokeissa eri ihmisen maligniteettien, mukaan lukien NSCLC. Tutkijat ovat ehdottaneet, että yhdistettyä käyttöä coordinately ilmaisi Toimintakehotukset ja muut liittyviä antigeenejä voisi tukea suunnittelussa tehokkaampaa, moniarvoisia immunotherapeutic protokollat ​​NSCLC ja muissa elimissä; kuitenkin, siellä on tällä hetkellä hyvin vähän tiedetään samanaikaista ilmentymistä malleja näiden geenien [14], [15], [16].

Toistaiseksi kattava, genomin laajuinen lähestymistapa tunnistaa coordinately ilmaisi Toimintakehotukset ja muut ilmentyvät eri geenit aktivoituvat promoottori demetylointi NSCLC ei ole tehty. Tässä tutkimuksessa käytimme romaani, integroiva epigeneettiset seulontaan yhdistyvät 5-atsa-deoksisytidiinin ja trikostatiini A (5-atsa /TSA) käsittely normaalien keuhkojen solut ja mRNA microarray ilmaisun analyysi ensisijaisen kudoksen tunnistaa geenejä, jotka molemmat aktivoidaan DNA hypometylaatio ja differentiaalisesti yliaktiivista koordinoidusti in NSCLC. Pystyimme määrittelemään coordinately ilmaisi Toimintakehotukset ja uusia, kasvua edistäviä geenejä, jotka aktivoituvat yhdessä koordinoidun promoottori demetylaatio. Nämä tiedot vaikuttavat mekanismin aktivoinnin Toimintakehotukset, suunnittelu immunoterapeuttista strategioista, sekä määritellä mahdollisia esisyöpägeenien ja uusia biologinen tavoitteet geeni suunnattu hoitoja NSCLC.

Materiaalit ja menetelmät

histopatologia

Kaikki näytteet analysoitiin patologian osaston Johns Hopkins Hospital. Kudokset saatiin kautta Johns Hopkins Institutional Review Board hyväksyi protokollan NA_00001911. Kirjallinen suostumus saatiin kultakin kohteelta ennen käyttöä niiden kudoksen tieteelliseen tutkimukseen. Kasvain ja normaali keuhkojen kudoksia kirurgisista näytteistä jäädytettiin nestemäisessä typessä välittömästi kirurgisen resektion ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti. Normaali näytteet microdissected ja DNA valmistettiin normaalista keuhkoparenkyymistä. Kasvainnäytteet varmistettiin olevan NSCLC ja sen jälkeen microdissected, jolloin saatiin vähintään 80%: kasvainsoluja. Tissue DNA: n ja RNA uutettiin, kuten on kuvattu alla.

5Aza-dC ja TSA hoito Solut

käsitelty normaalia ihmisen keuhkojen solulinjoissa (NHBE ja SAEc, Lonza, Walkersville, MD) kolmena kappaleena 5-atsa-deoksisytidiini (sytosiinin analogia, joka voi olla metyloitu) ja trikostatiini A (a histonideasetylaasi-inhibiittori), kuten aiemmin on kuvattu [17]. Lyhyesti, solut jaettiin alhaisen tiheyden (2,5 x 10

5 solua ja 6 x 10

5/100 mm astia SAEC ja NHBE vastaavasti) 24 tuntia ennen käsittelyä. Kantaliuoksia 5Aza-dC (Sigma, St. Louis, MO) ja TSA (Sigma) liuotettiin 50% etikkahappoa ja 100% etanolia, vastaavasti. Soluja käsiteltiin 5 uM 5Aza-deoksisytidiinin 72 tuntia ja 300 nmol /l TSA viimeisen 24 tunnin aikana. Perustason ilmentyminen määritettiin mock-käsitellyt solut, joilla on sama tilavuus etikkahapon tai etanolin kolmena kappaleena.

RNA uuttaminen ja Oligonukleotidi Microarray Analysis

Solun kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol (Life Technologies, Gaithersburg, MD) ja RNeasy-kittiä (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Suoritimme oligonukleotidi mikrosiruanalyysi käyttäen GeneChip- U133 Plus 2.0 Affymetrix ilmaisun microarray (Affymetrix, Santa Clara, CA). Näytteet muutettiin merkitty, hajanainen, cRNA kohti Affymetrix protokollan käytettäväksi ilmaisun microarray. Signaalin voimakkuus ja tilastollinen merkitsevyys määritettiin kunkin transkriptio käyttäen dChip versio 2005 aluksi analysoida ja normalisoida array data ja sitten merkitys analyysi mikrosirujen (SAM) [18]. SAM tuotos laskettiin d-arvo 1.126 saadaan väärä löytö korko ja d-pisteet cutoff 5,065% ja 1,885. Tämä havaintojen mukaan yhteensä 12132 voimistunut kandidaattigeenejä jälkeen 5Aza-dC /TSA hoitoa. Kaikki microarray data on MIAME yhteensopiva ja raaka tiedot on talletettava MIAME yhteensopiva tietokanta, GEO, yksityiskohtaisena jonka MGED Society.

Public Tietoaineistot

julkiset tietokannat Tässä tutkimuksessa käytetty olivat Kalifornian yliopiston Santa Cruz (UCSC) Human Genome referenssijaksoa ja merkintä tietokanta maaliskuussa 2006 freeze (hg18). Saimme 40 normaali keuhko ja 111 NSCLC ilmaisun mikrosiruja Expo aineistot (kaikki suoritetaan Affymetrix U133 Plus 2.0 mRNA ilmaisu platform) saatavilla verkossa osana Gene Expression Omnibus (GEO /NCBI). Liittyminen numerot nämä paneelit ovat GSE1643 ja GSE3141 vastaavasti. Mikrosiruissa normaalista kudoksesta ja kasvaimen olivat ensin normalisoitiin COPA analysoinnin dChip versio 2005.

Syöpä Outlier Profiili Analyysi (COPA) B

sovellettu COPA meidän kohortin 151 kudosten (111 kasvaimia, 40 normaalit), jossa kukin geenien ilmentyminen tietoja sisältävän sarjan 54613 koetinsarjojen päässä Affymetrix U133 Plus 2.0 mRNA ilmaisun alustalla. Lyhyesti, geenien ilmentyminen arvot mediaani keskitetty, jossa kukin geeni keskiviivan ilmentyminen nollaan. Mediaani absoluuttinen poikkeama (MAD) laskettiin ja skaalataan 1 jakamalla jokainen geeniekspressiota arvoa sen MAD. Huomattavaa on, että mediaani ja MAD käytettiin transformaatio vastakohtana keskiarvo ja keskihajonta jotta harha ilmaisua arvot eivät vaikuta liikaa jakelu arvioiden ja Näin turvataan jälkeisen normalisointi. Lopuksi, 75., 90., ja 95. prosenttipisteet transformoidun ilmaisun arvot lasketaan kullekin geenin ja sitten geenien sijoitus-määräsi niiden prosenttipiste tulokset, joka tarjoaa priorisoitu luettelo poikkeavien profiileja. Varten meidän listalla-luettelossa, 90 persentiiliä kasvainten valittiin perustuen näytteen koon analyysi (111 kasvaimia, 40 normaalit). Normaali kudos että oli 95. prosenttipiste 2 poistui meidän listalla luettelosta. Kaikkiaan 35764 selostukset täytti edellä mainitut kriteerit ja rankattiin. Yksityiskohtaiset tiedot menetelmän viittaavat Tomlins et. al [19].

Integratiiviset Epigenetiikka

sijalla kohdegeenien päässä Affymetrix U133 Plus 2.0 mRNA: n ilmentymisen alustan COPAn kiihdytyssäätely klo 90

persentiili (111 kasvaimista ja 40 normaali kudokset). U133 Plus 2.0 mRNA ilmaisu alustan (Affymetrix, Santa Clara California) on noin 55.000 koetinsarjojen. Toinen sijoitus lista tuotettiin ranking geenien alenevassa järjestyksessä niiden d-pisteet laskemat SAM seuraavien 5-atsa /TSA hoitoon normaalien keuhkojen solulinjojen (NHBE ja SAEC). Kolmas listalla lista laskettiin käyttäen 111 NSCLC ja lisäksi expo aineisto on 79 ylimääräistä NSCLC primaarikasvaimen kudosten myös ajaa Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 mRNA ilmaisun alustalla. Näissä 190 ensisijainen NSCLC näytteitä, me korreloi BORIS ekspressiokuvioiden kunkin kasvaimen ilmaus kaikkien transkriptien sisällytetty U133 Plus 2.0 array laskemalla korrelaatiokerroin Excelillä. Kaikki geenit sitten sijoittui perustuvat vahvuus korrelaatio niiden ilmaisun ja että Boris ilmaisun kaikissa 190 näytettä. Nämä kolme tietolähteitä (geeniperimä osoittavat ilmentymisen lisääntyminen 5-atsa, COPA pisteet, Boris korrelaatio) yhdistettiin käyttäen sijoitus tuotetta (x * y * z). Nämä kolme rankingissa yhdistettiin listalla kaikki tavoitteet ja permutaatio tietoja käytettiin luomaan merkitys, jonka kynnys on α = 0,005, jolloin saatiin 290 merkittäviä geenejä. Genomiset sekvenssit saatiin 122 Näiden geenien avulla UCSC genomin selain, ja läsnäolo CpG saarten promoottorit tai ensimmäisen intronin näiden geenien määritettiin MethPrimer joka perustuu GC-pitoisuus 50%, 100 bp, 0,6 havaittiin odotettavissa CG: n [20].

DNA Extraction

Näytteet sentrifugoitiin ja hajotettiin liuoksessa, pesuaineen (natriumdodekyylisulfaattia) ja proteinaasi K, poistamiseksi, proteiineja, sitoutuneen DNA: ta. DNA puhdistettiin fenoli-kloroformi-uutolla ja etanolisaostuksella. DNA jälkeen uudelleensuspendoitiin 500 ui LOTE (EDTA 2,5 mmol /L ja Tris-HCI 10 mmol /l) ja säilytettiin -80 ° C: ssa käyttöön asti.

bisulfiittikäsittelyn ja sekvensointi

2 ug DNA: ta 28 NSCLCs ja 11 normaalin keuhkojen kudoksia tehtiin vetysulfiittikäsittelyä käyttäen EpiTect® bisulfiittimodifiointi Kit (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Tämä bisulfiitti-modifioitu DNA säilytettiin sitten -80 ° C: ssa. Sen jälkeen, bisulfiitti-käsitellyn DNA monistettiin käyttämällä alukkeita suunnitteli MethPrimer span alueilla CpG-saarekkeiden, että promoottori tai ensimmäisen intronin [20]. Alukesekvensseissä suunniteltiin ole CG dinukleotideja. Primer sekvenssit ovat saatavilla taulukossa S1. Laskeutua PCR suoritettiin ja tuotteet puhdistettiin geelissä käyttäen QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Valencia, CA), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kukin monistettu DNA-näyte on sovellettu sisäkkäisiä alukkeita Applied Biosystems 3700 DNA Analyzer käyttämällä BD-terminaattorin väriainetta (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Kvantitatiivinen RT-PCR

Kokonais-RNA uutettiin kuten edellä kuvattu ja pitoisuus jokaisesta näytteestä mitattiin. 1 ug RNA: ta käytettiin sitten cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen oligo-dt kanssa SuperScript Etu- Strand Synthesis Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA). Lopullinen cDNA tuotteita käytettiin templaatteina myöhemmissä RT-PCR: llä alukkeilla on suunniteltu erityisesti kunkin ehdokkaan geenin. 18s rRNA tutkittiin varmistaa tarkat suhteellinen kvantitointi määrällisesti RT-PCR. Kukin koe suoritettiin kolmena rinnakkaisena käyttäen Taqman 7900 (ABI) reaaliaikainen PCR-laite ja QuantiFast SYBR Green PCR Kit (Qiagen, Valencia, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Primer sekvenssit ovat saatavilla taulukossa S1.

Quantitative Unmethylation-Specific PCR (QUMSP) B

täydennetystä demetyloiduksi promoottorialueiden kiinnostavissa geeneissä, alukkeet suunniteltiin käyttämällä dataa bisulfiitti sekvensointi primaarikasvainten jotka täydentävät vain bisulfiitti-muunnetaan sekvenssejä tiedetään demetyloida kasvaimia. Primer yhdistelmät validoitiin käyttäen

in vitro

metyloitu ja demetyloitunut valvontaa. Nämä kokeet suoritettiin kolmena kappaleena käyttäen Taqman 7900 (ABI) reaaliaikainen PCR kone Standardikäyrien ja normalisoinnin Beta-Actin alukkeita, jotka eivät sisällä CpG: n järjestyksessä kvantitoimiseksi. Primer sekvenssit ovat saatavilla taulukossa S1.

transfektointi ihmisen Ekspressiovektorit ja AD Growth Pitoisuus

täyspitkän ORF cDNA SBSN ja NY-ESO-1 saatiin lyhytaikaisissa transfektioissa maasta Origene joka pCMV6-Entry vektori (Rockville, Maryland). Solulinjat maljattiin 5 x 10

5 solua /kuoppa käyttämällä 6-kuoppalevyille ja transfektoitiin joko tyhjällä vektorilla tai vektorin, joka sisältää kiinnostuksen kohteena olevan geenin käyttämällä FuGene 6 Transfection Reagent (Roche, Basel, Sveitsi) mukaan valmistajan protokollaa. Cell Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo, Rockville, Maryland) absorbanssi mitattiin Spectramax M2e 96-fluoresenssilevylukijaa Molecular Devices (Sunnyvale, Kalifornia). Kaikki AD kasvu kokeet suoritettiin kolmena kappaleena kaikkien solulinjojen ja vektorit.

riippumattomaan kasvuun määritys

Soft agar testit suoritettiin seuraavasti solujen transfektio nisäkkään pCMV6-Entry ekspressiovektorit, jotka sisältävät G418 resistenssin kasetti (Origene). Solut laskettiin ja noin 5000 lisättiin kuhunkin 6-kuoppaiselle levylle. Pohjakerros koostui 0,5% agaria, RPMI + 10% FBS, ja solut suspendoitiin pintakerros 0,35% agaria, RPMI + 10% FBS: ää ja G418: aa (300 ug /ml). Pehmeä agar määritykset inkuboitiin 37 ° C asteessa 12 päivää. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena kappaleena kaikkien solulinjojen ja vektorit.

Tilastollinen analyysi

Etsimme yhtäläisyyksiä metylaation välinen geenien suorittamalla analyysi korrelaatioita QUMSP lukemien geenejä poikki kaikki näytteet. Spearmanin korrelaatio permutaatio testaus käytettiin 1000 permutaatioista näytteiden luoda merkitystä, jossa α = 0,05. Ilmentämistä varten tietojen, me log-transformoitujen normalisoitu data ja suoritettava korrelaatio analyysi kaikkien näytteiden kunkin geenien tutkimuksessa. Merkittävyys määritettiin olettaen normaalijakaumaa in logaritmiasteikolla ekspressiotasot ja soveltamalla Studentin t-jakauma alfa 0,05. Kaikki analyysit suoritettiin käyttäen Matlab.

Tulokset

romaani Integratiiviset Epigeneettiset Approach seulomiseksi Toimintakehotukset ja Related epigeneettiseltä geenien

Kehitimme integroiva, suurikapasiteettisten lähestymistapa näyttö Toimintakehotukset ja muiden coordinately ilmaisi geenien perustuu kolmeen aiemmin julkaistu tekijät: (1) CTA: t ilmentyvät ituradan soluissa ja monia kasvaimia, mutta ei normaalissa somaattisten kudoksessa [1], [21], (2) CTA: t ovat promoottori CpG saaret, jotka on metyloitu ja vaiennettu normaalissa somaattisten kudosten, mutta kokeellisesti, voidaan ilmaista promoottori demetylaation [1], [10], [11], [12] ja (3) transkriptiotekijän BORIS on osoitettu indusoivan de -repression useiden Toimintakehotukset NSCLC ja muissa elimissä /kudosten tyypit (kuvio 1A) [22], [23], [24], [25].

(A) Kaavamainen pääpiirteet integroiva epigeneettiset seulontastrategia tässä tutkimuksessa käytettiin joka yhdistää farmakologinen demetylaation normaalien solulinjojen, vertaileva COPA anaylsis perusterveydenhuollossa kudosten ja korrelaatio geeniekspression kanssa epigeneettiset säädin BORIS perusterveydenhuollossa kudoksessa. (B) edustaja COPA kuvaaja

MAGEA12

osoittaa tilastollista lähestymistapaa käytetään löytää ehdokas yliekspressoidaan Toimintakehotukset ja liittyviä geenejä. Ero kasvaimen ja normaalissa ilme oli merkittävä, p-arvo 0,00001 mitattuna U-testi. (C) Upfold sääntely mRNA: n ilmentymisen käsitellyissä normaaleissa keuhkoissa solulinjat, NHBE ja SAEC mitattuna Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 mRNA: n ilmentymisen alustalla.

Ensimmäinen varsi meidän seulontaan mukana farmakologinen demetylaation 2 normaali keuhkojen solulinjoissa, Normal Human keuhkoputken epiteelisolujen (NHBE) ja Human Pieni hengitystie-epiteelin (SAEC) soluja (Lonza, Walkersville, MD), käyttäen 5-atsa /TSA hoitokäytäntö, joka on aiemmin onnistunut määriteltäessä ehdokas tuumorisuppressorigeeneille demetyloimalla tuumorisolulinjoissa. Ymmärtäen, että CTA vaiennetaan metylaation normaalissa kudoksessa, käytimme normaalia solulinjojen tunnistaa geenejä, jotka tyypillisesti tukahdutettu normaaleissa kudoksissa, mutta sitä voidaan uudelleen ilmaistaan ​​farmakologinen manipulointi. Kaksi normaalia keuhkojen solulinjat, NHBE ja SAEC, käsiteltiin 5 uM 5-atsa deoksisytidiinideaminaasia 72 tuntia ja Trichostatin A 24 tuntia ennen sadonkorjuuta kokonais-RNA ilmentämiseen erilaisia ​​analyysi käyttäen Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 ilme alustalla. Nämä tulokset analysoitiin sitten käyttäen dChip ja merkitys analyysi mikrosirut (SAM) [17], [18]. Geenit rankattiin perustuu niiden SAM pisteet (d). SAM myös raportoitu taitteen muutos tarkoittaa ilmentymistä kohde- geenien 5-atsa /TSA hoitoryhmässä verrattuna kontrolliryhmään (kuvio 1 B).

samanaikaisesti analysoida dataa 40 normaalin keuhkokudoksen ja 111 NSCLC ilmaisun mikrosirut alkaen Expo aineistot (kaikki ajaa Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 mRNA ilmaisu platform) julkisesti saatavilla verkossa osana Gene Expression Omnibus (GEO /NCBI). Meidän analyysi näistä 151 ensisijainen kudosekspressiotutkimuksen array aineistoja, käytimme tekniikkaa kutsutaan Cancer Outlier Profiili Analyysi (COPA). COPA on menetelmä etsiä merkittyjä yliekspressio tiettyjen geenien, joita esiintyy vain osajoukko tapauksissa taas perinteiset analyysimenetelmät perustuu standardiin tilastolliset menetelmät eivät löydä geenejä tämäntyyppisen mentymisprofiili [19]. COPA oli erityisen käyttökelpoinen menetelmä meitä etsimään Toimintakehotukset ja geenien vastaavia ekspressioprofiileja perustuu aiempiin tutkimuksiin, jotka osoittavat, että CTA: t ovat heterogeenisesti ilmaistaan ​​sekä laajalla potilasryhmää yksittäisissä Tuumorinäytteet [26], [27], [28] . Geenit, joilla on normaali kudos COPA ilmaisu skaalattu pisteet 2 klo 95. prosenttipiste poistettiin listalla luettelosta. Kaikki jäljellä olevat geenit sitten paremmuusjärjestykseen perustuvat niiden COPA pisteet klo 90

persentiili; tilastollista merkitystä ilmaisun eroja COPA kaaviot mitattiin U-testi (kuvio 1 C).

Jos lopullinen käsi meidän seulontaan, käytimme edellisessä datan asetettu 111 NSCLC ja ylimääräinen Expo aineisto 79 ylimääräisiä NSCLC primaarikasvaimen kudosten myös ajaa Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 mRNA ilmaisun alustalla. Näissä 190 ensisijainen NSCLC näytteitä, me korreloi BORIS ekspressiokuvioiden kunkin kasvaimen ilmaus kaikkien transkriptien sisällytetty U133 Plus 2.0 array laskemalla korrelaatiokerroin Excelillä. Kaikki geenit sitten sijoittui perustuvat vahvuus korrelaatio niiden ilmaisun ja että Boris ilmaisun kaikissa 190 näytettä.

kolme listalla luettelot tuottanut ranking geenien SAM pisteet (d) seuraavat 5-atsa /TSA hoito normaalissa keuhkojen solulinjoissa, COPA pisteet ensisijainen kudoksessa, Boris korrelaatio perusterveydenhuollossa kudoksessa. Nämä 3 sijoitus luettelot yhdistettiin käyttämällä sijoitus tuotetta (x * y * z). Käyttämällä merkitys kynnys (α = 0,005) ja myöhemmin satunnainen permutaatio meidän listalla-listoja, tunnistimme 290 geeniä, jotka olivat merkittävästi eri tavoin voimistunut perustuu epigeneettisellä seulonta ja kudosten microarray ilmaisun kuvioita (taulukko S2) [29].

Aluksi, joka on

in silico

jossa hyödynnetään MethPrimer käytettiin vahvistaa läsnäoloa CpG saarten promoottorialueissa meidän top ehdokkaita [20]. Top 100 290 merkittäviä geenejä sekä 22 geenit valitaan sen perusteella, biologista merkitystä syöpään liittyvissä väyliä valittiin seulottava kautta tätä lähestymistapaa, ja 101 havaittiin sisältävän 1 tai useampi promoottori CpG-saarekkeiden.

sitten käytetään erillistä kohortin 11 normaalin keuhkojen kudoksia potilailta ilman syövän diagnoosia vahvistaa epigeneettiset äänenvaimennusjärjestelmän kautta promoottori metylaatio normaalissa keuhkojen limakalvolla potilailta, joilla keuhkojen kasvain. Bisulfiitti sekvensointi CpG saarten promoottorialueiden 55 valittujen geenikohteet CpG saaria käytettiin määrittämään metylaatiostatuksen. Vain 17/55 promoottorialueet osoitti täydellisen metylaatio kaikissa sekvensoitiin CpG sivustot kaikki tai lähes kaikki normaaleissa kudoksissa (taulukko S2). Nämä tavoitteet sittemmin bisulfiitti sekvensoitiin erillisessä kohortin 28 ensisijaisen NSCLC etsiä esiintymisen promoottorin hypometylaatio. Näistä jäljellä tavoitteet, 10/17 osoitti promoottori demetylaatio joissakin osa kasvaimia mukaan lukien:

MAGEA3

(13/28, p = 0,0067),

MAGEA12

(19/28, p = 0,0001 ),

MAGEA4

(9/27, p = 0,0378),

MAGEA1

(21/27, p = 0,0001),

SBSN

(13/28, p = 0,0067),

TKTL1

(5/27, p = 0,2949),

MAGEA5

(9/23, p = 0,0172),

ZNF711

(21/24, s = 0,0001),

NY-ESO-1

(14/20, p = 0,0002),

G6PD

(17/18, p = 0,0014), (Fisherin testiä, kaksipuolinen ) (taulukko 1 ja kuva 2).

Näkyy ovat bisulfiitti sekvensointi tulokset liittyvät p arvoja 28 NSCLC kasvain näytteet ja 11 normaali keuhkojen kudoksia:

MAGEA3

(13/28, s = 0,0067),

MAGEA12

(19/28, p = 0,0001),

MAGEA4

(9/27, p = 0,0378),

MAGEA1

(21/27, p = 0,0001),

SBSN

(13/28, p = 0,0067),

TKTL1

(5/27, p = 0,2949),

MAGEA5

(9/23 , p = 0,0172),

ZNF711

(21/24, p = 0,0001),

NY-ESO-1

(14/20, p = 0,0002),

G6PD

(17/18, p = 0,0014). Suluissa ovat suhde demetyloituneen promoottorien kasvaimissa ja p-arvot laskettuna Fisherin testiä vertaamalla demetylaatio kasvaimissa vs. normaalit. Varjostetut laatikot edustavat metyloitu promoottorit, ND = metylaatiostatus ei määritetty bisulfiitti sekvensoimalla.

transkription säätelyä kohdegeenien jälkeen 5-atsa /TSA hoito meidän solulinjassa järjestelmä varmistettiin käyttämällä kvantitatiivista RT -PCR on 5-atsa /TSA-käsiteltyjen normaalien solujen verrattuna valehoidettujen solujen näille 10 geenien (kuvio S1). Kukin geeni lukuun ottamatta

MAGEA12

osoitti merkittävää voimistumista 5-atsa /TSA käsittely ainakin yhdessä solulinja tukevat funktionaalinen geeni sääntelyä promoottori hypometylaatio.

Toimintakehotukset ja Associated geenit ovat coordinately demetyloitunut ja Expression korreloi promoottori demetylaatio

sen vahvistamiseksi bisulfiitti sekvensointi tulokset meidän kohdegeenien ja tarjota aineisto on jatkuvia muuttujia ilmaista tilan promoottorin demetylaatio, me kehittäneet nopea, kvantitatiivinen määritys nimenomaan mittaamiseksi metyloitumattomien promoottorit, jota kutsutaan Quantitative Unmethylation-Specific PCR (QUMSP). Me analysoitiin DNA uutetaan meidän kohortin 28 ensisijaisen NSCLC kasvain näytteet ja 11 normaalin keuhkojen näytettä kuin syöpäpotilailla (kuvio 3A). Merkittävät kasvainspesifisiä demetylaatio löydettiin

MAGEA3

(p 0,005),

MAGEA12

(p 0,025),

MAGEA4

(p 0,018),

MAGEA1

(p 0,001),

TKTL1

(p 0,025) ja

MAGEA5

(p 0,007). Kaksi muuta tavoitteet hieman jäi merkitsevyystaso α 0,05,

SBSN

(p 0,07) ja

NY-ESO-1

(p 0,09) (2 tailed Studentin t-testiä olettaen että varianssi on erisuuruinen ).

(A) QUMSP toteutettiin meidän kohortissa 28 NSCLC ja 11 normaalin keuhkojen kudoksia. Kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena, keskiarvot esitetään edustavat prosenttiosuutta metyloitumattoman promoottorien logaritmisella asteikolla. Tilastollisesti merkitsevä kasvainspesifisiä demetylaatio löydettiin

MAGEA3

,

MAGEA12

(p 0,025),

MAGEA4

(p 0,018),

MAGEA1

(p 0,001),

TKTL1

(p 0,025) ja

MAGEA5

(p 0,007). Kaksi muuta tavoitteet hieman jäi merkitsevyystaso α 0,05,

SBSN

(p 0,07) ja

NY-ESO-1

(p 0,09) (2 tailed Studentin t-testiä olettaen epätasainen varianssit ). (B) Promoottori hypometylaatio (QUMSP) korrelaatio p-arvo matriisin NSCLC (n = 28; Spearmanin korrelaatio permutation testi). Viivoitus edustavat merkittävää p-arvot.

Koska kasvainspesifistä demetylaatio kuvio nähty meidän kohdegeenien, halusimme seuraavaksi onko demetylaation promoottorialueissa näiden geenien tapahtui koordinoidusti sisällä tuumorinäytteessä. Hyödynsimme Spearmanin korrelaatio permutaatio testaus määrätä merkitykselliset koordinoitu demetylaation avulla QUMSP tulokset meidän kohortin 28 NSCLC (kuvio 3B). P-arvo matriisin Spearmanin korrelaatiokertoimen osoittaa, että mille tahansa kohdegeenien, demetylaatio yleensä coordinately tapahtuu vähintään 6 muiden geenien. Viivoitus edustavat merkittävää p-arvot. Tämä tarjoaa todisteita siitä, että demetylaatio on erittäin liittyy koordinoitua sääntelyä näiden Toimintakehotukset ja niihin liittyviä kohdegeenien NSCLC, ja viittaa vahvasti siihen epigeneettisestä aktivoitumismekanismi.

Jotta voitaisiin vahvistaa kasvaimen erityinen ilmaisu meidän kohdegeenien, käytimme kvantitatiivinen RT-PCR määrittää mRNA ilmaisun meidän kohortissa NSCLC ja normaalin keuhkokudoksessa (kuvio S2A-J). Kuusi geenit olivat lisääntyneet voimakkaasti ilmentyminen kasvaimissa

MAGEA12

(p 0,02),

SBSN

(p 0,002),

TKTL1

(p 0,02),

ZNF711

(p 0,008),

NY-ESO-1

(p 0,001),

G6PD

(p 0,006). Kolme geeniä hieman jäi merkitys on α 0,05 taso:

MAGEA3

(p 0,09),

MAGEA4

(p 0,06) ja

MAGEA1

(p 0,08) (2 tailed Studentin t-testiä olettaen että varianssi on erisuuruinen).

halusimme seuraavaksi onko demetylaatio vastasi derepressioon että CTA: t ja niihin liittyvien geenien NSCLC. Neljä kohdegeenien oli merkitsevä positiivinen korrelaatio mRNA: n ilmentymisen (kvantitatiivinen RT-PCR) ja promoottori hypometylaatio (QUMSP):

MAGEA12

(p = 0,024),

MAGEA4

(p 0,004),

SBSN

(p = 0,004) ja

NY-ESO-1

(p 0,004) (Kuva S3A-D) (Spearmanin korrelaatio permutation testi).

TKTL1

(p = 0,1),

MAGEA5

(p = 0,104) ja

MAGEA3

(p = 0,2) osoitti myös positiivinen korrelaatio demetylaation ja ilme, mutta jäi merkitys (taulukko S3). Nämä tiedot viittaavat siihen demetylaation promoottorialueiden on osittain vastuussa sääntelystä suurin osa kohdegeenien.

Toimintakehotukset ja Associated Target geenit ovat coordinately ilmoitettuna

Ottaen huomioon päätelmät edellisen analyysit meidän kohortti ensiarvoisen kudos, joka osoittaa näiden kohdegeenien ilmentyvät differentiaalisesti kasvaimet, niiden promoottori alueiden coordinately demetyloitunut kasvaimiin ja ilmaisun korreloi demetylaation, tutkimme alkuperäistä kohortin 111 kasvaimia analysoitiin käyttämällä Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 mRNA ilmaisu platform onko tavoitteemme geenit coordinately ilmaistut kasvainnäytteestä tässä suuressa vedostulostus. Kuvio 4A esittää karttaa, joka transkriptin ilmentyminen mitattuna U133 Plus 2.0 matriisia 40 normaalin keuhkojen näytettä ei-syöpäpotilasta ja 111 NSCLC ensisijainen kudosnäytteitä. Tämä luku visualisoi suhdetta ilmaisun välillä 10 kohdegeenien normaalissa ja kasvaimen näytteitä. Tiedot normalisoitiin ensin asettamalla keskiarvo ja keskihajonta kunkin geenin 0 ja 1 vastaavasti kaikkien 151 näytteen. Sitten aineisto ryhmittyneet näytteessä domain käyttäen hierarkkinen klusterointi keskimääräinen sidos ja euklidinen etäisyys metristä. Tämä edellyttäen, kolmeen ryhmään: 1) kaikki 40 normaalia näytettä, 2) 43 111 tuumorin näytteissä osoittaa voimakasta ilmentymistä useimmissa geenien ja vahva korrelaatio niiden välillä (kasvain 1), ja 3) 52 111 tuumorinäytteet esittää pienempi ilmentyminen, mutta Expression edelleen yli normaalien (kasvain 2). Loput 16 111 kasvain näytteet eivät klusterin yhdessä tai näissä ryhmissä. Tämä analyysi ei ole vain, jos vahvistus, että ilmaus kohdegeenien on rajoitettu osajoukko kasvaimia, joilla on vähän tai ei lainkaan ilmentymistä normaalissa kudoksessa, mutta myös, että nämä tavoitteet näyttävät koordinoidusti ilmaistaan ​​suuri osajoukko, 38,7%, näistä kasvaimia.

(A) Heat kartta transkriptin ilmentyminen mitattuna Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 mRNA ilmaisun alustalla.