Krooninen sairaus

tiivistelmä

ATP-sitova kasetti (ABC) kuljettajat ovat yhteydessä huonoon vaste kemoterapiaa, ja antaa huono ennuste eri syöpäsairauksia. Kuitenkin yhdistyksen välinen ilmentymä ABC alaryhmä G jäsen 4 (ABCG4) ja ennusteen potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) jää epäselväksi. NSCLC kudosnäytteet (n = 140) ja normaali keuhkojen kudosnäytteistä (n = 90) oli resektoitiin potilailta vaiheen II-IV NSCLC välillä toukokuussa 2004 ja toukokuussa 2009. ABCG4 mRNA ja proteiini ilmaisuja havaittiin RT-PCR, western blot, ja immunohistokemia. Potilaat saivat neljä sykliä sisplatiini- leikkauksen kemoterapiaa ja seurattiin asti 31 toukokuu

st, 2014 ABCG4 positiivisuus oli korkeampi NSCLC kuin normaalissa keuhkojen kudoksissa (48,6%

vs

. 0 %,

P

0,001) ja ABCG4 ilmentyminen merkitsevästi yhteydessä huonoon erilaistumiseen, korkeampi kasvaimen etäpesäke (TNM) vaihe, ja adenokarsinooma histologinen tyyppi (kaikki

P

0,001). Univariate (HR = 2,284, 95% CI: 1,570-3,324,

P

0,001) ja monimuuttuja (HR = 2,236, 95% CI: 1,505-3,321,

P

0,001 ) analyysit osoittivat, että ABCG4 ilme oli itsenäinen tekijä liittyy huonon ennusteen NSCLC. Potilaat, joilla ABCG4-positiivisten NSCLC oli lyhyempi elinajan mediaani kuin ABCG4-negatiivinen NSCLC (20,1

vs

. 43,2 kuukautta,

P

0,001). Prognostisia merkitys ABCG4 ilmaisun näkyi vaiheiden III ja IV ei. Lopuksi korkea ABCG4 ilmentyminen liittyi huonoon ennusteeseen potilailla, joilla on NSCLC sisplatiinia kemoterapiaan.

Citation: Yang G, Wang XJ, Huang LJ, Zhou YA, Tian F, Zhao JB, et al. (2015) Korkea ABCG4 ilmentyminen liittyy huonoon ennusteeseen Non-Small-Cell Lung Cancer Potilaat sisplatiinia kemoterapiaan. PLoS ONE 10 (8): e0135576. doi: 10,1371 /journal.pone.0135576

Editor: Gergely Szakacs, Unkarin tiedeakatemian, Unkari

vastaanotettu: 29 lokakuu 2014; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2015; Julkaistu: 13 elokuu 2015

Copyright: © 2015 Yang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tätä työtä tuki National Natural Science Foundation of China (avustus nro 81172224). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

noin 1,5 miljoonaa uutta keuhkosyöpää diagnosoidaan vuosittain maailmanlaajuisesti, ja noin 85% heistä ovat ei-pienisoluinen keuhkosyövässä (NSCLCs) [1]. Vuonna 2012 noin 58% tapauksista NSCLCs esiintyi vähemmän kehittyneissä maissa [2]. Leikkaus pidetään paras hoitovaihtoehto, mutta resektio on vain potentiaalisesti parantava 20-25% kasvainten [1]. Useimmat potilaat esiintyä parantumaton sairaus ja kasvot 5 vuoden suhteellinen eloonjäämisaste 17% nykyisen standardin hoitojen [3]. Leikkauksen jälkeiset kemoterapian kanssa tai ilman sädehoitoa, eloonjäämistä 4% absoluuttisena 5 vuoden pysyvyys, kuten on osoitettu meta-analyysi [4].

Tällä hetkellä sisplatiini-pohjainen yhdistelmä kemoterapiahoitojen ovat kaikkein tehokas ensilinjan terapiat NSCLC, mukaan National Kattava Cancer Network (NCCN) ohjeet (versio 4,2014) [5]. Teho kuitenkin kemoterapia on rajallinen, ja vaste (RRS) 20-35%, ilman taudin etenemistä (PFS) on 3,1-5,5 kuukausi, ja kokonaiseloonjääminen (OS) +7,4-+11,3kuukautta [6,7]. Siten parannetaan tuloksia kemoterapian jälkeen on ollut yksi haastavimmista kysymyksistä onnistuneen hoidon keuhkosyövän [8]. Tämä johtuu pääasiassa lääkeresistenssi, joka esiintyy lähes kaikissa syöpien ja on vakava este menestyksen kemoterapiaa [6,7]. On yhä tunnustetaan, että ensisijainen ja toissijainen huume vastusten kehittää syöpäsoluja ovat perimmäinen syy taustalla kemoterapian epäonnistumisen [6,7].

Lääkeaineresistenssi on yleensä seurausta yli-ilmentyminen ATP-sitova kasetti (ABC) kuljettajat [9,10]. ABC transporter proteiinit ovat optimaalisia ehdokkaita biomarkkereina ennustamiseen kemoterapian resistenssin ja ennuste kemoterapian jälkeen [11,12]. ABC kuljettajat ovat transmembraaniproteiineja, jotka helpottavat translokaatio heterogeenisiä aineita poikki solukalvoissa hyödyntämällä energiaa ATP hydrolyysi [13]. Tähän mennessä ainakin 48 ihmisen ABC transporter geenejä on tunnistettu, ja ne on jaettu seitsemään alaperheisiin (ABCA kautta ABCG) [14]. Näistä ABCA2, ABCB1 (tunnetaan myös nimellä P-glykoproteiinin tai monilääkeresistenssiin 1 (MDR1)), ABCB4, ABCB11, ABCC1-6, ABCC10, ABCC11 ja ABCG2 (tunnetaan myös BCRP tai MXR) ovat kaikki osoittautuneet liittyvä ulosvirtausta ja kuljetus sytotoksisten lääkkeiden (rakenteellisesti monipuolinen kemoterapia-aineiden ja niiden aineenvaihduntatuotteiden) keuhkosyövän soluista, mikä vähentää solunsisäisiä lääkeainepitoisuudet [15]. ABCA1 on myös todettu välittäjinä lääkeresistenssin keuhkosyövän ja lääkkeille vastustuskykyisiä keuhkosyövän solulinjat [16]. Tällä hetkellä P-gp (ABCB1), MRP1 (ABCC1), ja ABCG2 pidetään päähuumausaineen kuljettajat niiden roolit monilääkeaineresistenssi havaittu monissa kasvaimissa ja solulinjat [17]. Vaikka löytö ja käyttö estäjien ABC kuljettajat on tutkittu viime vuosina, nämä inhibiittorit eivät olleet täysin onnistunut voittamaan lääkeresistenssin [18]. Tämän seurauksena yksilöimään uudet ABC huumeiden transporter proteiineja ja tutkii niiden mekanismien ja inhibiittorit ovat erittäin perusteltuja ja erittäin tärkeää arvioida uusien tavoitteiden voittamiseksi lääkeresistenssin.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että jäsenet ABCG ( tai valkoinen) subfamily liittyy solujen lipidikuljetukseen ja lääkeresistensseihin [19-21]. ABCG5 ja ABCG8 ovat erittäin ilmaistaan ​​epiteelisolujen suolistossa ja todennäköisesti toimii heterodimeeri; ne on yhdistetty ulosvirtausta kasvisterolien ja kolesterolin sappeen [22,23]. Yli-ilmentyminen ABCG2 johtaa vastus eri syöpäsolulinjat anti-kasvain huumeet [24]. ABCG4 on neljäs jäsen ”G” perhe, ja sijaitsee kromosomissa 11q23.3. Tämä geeni koodaa 3874 bp: n transkripti, ja sen ilmentyminen on pääasiassa solunsisäinen [25], mutta tarkka solunsisäinen sijainti on vielä esitetty. [26] Itse asiassa eri ABC kuljettajat voidaan paikallistaa solukalvon puolesta mitokondriot, on Golgin laitteessa, on Endoplasmakalvostoon tai tumakalvoa, jossa he osallistuvat eri soluprosesseissa [26]. Lisäksi mukaan aikaisempien tutkimusten [27-30], ABCG4 ilmaisun NSCLC jää epäselväksi. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ABCG1 ja ABCG4 ovat vastuussa kuljetuksesta kolesterolin päälle high density lipoprotein (HDL) hiukkaset [31,32], ja yli-ilmentyminen ABCG4 myös resistenssin alkyyli-fosfolipidi-analogit (miltefosiinin, edelfosiini, ja perifosine ) in

Leishmania

[33]. Kuitenkin myös ABCG4 on merkittävä rooli ennusteeseen kemoterapian jälkeen, ja onko sillä potentiaalifunktio välittäjinä lääkeresistenssin keuhkosyövän myös jää epäselväksi. Siksi tässä tutkimuksessa keskityttiin ymmärtämään ilmaisun ja post-kemoterapian ennustetekijöiden arvo ABCG4 NSCLC.

Tässä retrospektiivisessä tutkimuksessa selvitimme ilmaus ABCG4 in NSCLC. Olemme myös arvioineet arvo ABCG4 proteiinin ennustamiseen selviytymisen pienisoluista keuhkosyöpää sisplatiinia-pohjainen yhdistelmä kemoterapiaa.

Materiaalit ja menetelmät

Potilaat ja näytteet

Yhteensä 140 NSCLC kudosnäytteet (74 keuhkosyöpää okasolusyöpä ja 66 tapausta keuhkoadenokarsinooma) ja 90 normaalin keuhkokudoksen kudosnäytteitä (sijaitsee 5 cm primäärikasvaimissa) saadaan kirurginen resektio laitoksella Torakaaliikirurgia, Tang Du sairaala Affiliated neljännen Military Medical University (Xi’an, Kiina) välillä toukokuussa 2004 ja toukokuussa 2009 tutkittiin tässä tutkimuksessa. Kasvain ja normaali keuhkojen kudokset kerättiin käyttäen steriilejä kirurgisia instrumentteja.

Potilaat olivat iältään 45-76 vuotta (keskiarvo ± SD: 60,76 ± 6,88 vuotta). Kaikki näytteet tarkastelleet patologien, ja histologinen luokitus kasvainten suoritettiin Maailman terveysjärjestön kriteerit. Kasvaimet luokitellaan vaiheessa II (n = 42), III (n = 56), tai IV (n = 42) mukainen NCCN suuntaviivojen (Version 4,2014) [5]. Kliinis ominaisuudet kaikki potilaat kirjattiin. Yksikään potilas ei saanut kemoterapiaa, sädehoitoa, biotherapy tai muuta toimintaa ennen keuhkosyöpään leikkausta. Kaikkia potilaita hoidettiin sisplatiinilla-pohjainen yhdistelmä solunsalpaajahoitojen pidetään vakiona leikkauksen jälkeisiä hoito-NSCLC [5]. Kaikki potilaat saivat neljä sykliä sisplatiini- yhdistelmä solunsalpaajahoitojen (sisplatiini 75 mg /m

2 päivää 1 + gemsitabiini 1250 mg /m

2 päivää 1, 8, joka 21. päivä /pemetreksediin 500 mg /m

2 päivää 1 21 päivän välein /doketakselin 75 mg /m

2 päivää 1 21 päivän välein). Seuranta sensuroitiin 31. toukokuuta

st, 2014, joiden yhteenlaskettu seuranta-aikana 60 kuukauden. Päivä, jolloin kemoterapia alkoivat pidettiin lähtökohtana arvioitaessa postoperatiivisen selviytymisen.

Kaikki näytteet jaettiin kahteen osaan: ensimmäinen osa sijoitettiin 0,1% dietyylipyrokarbonaatti (DEPC) vesi-käsitellyn jäädyttämistä putki ja varastoidaan -80 ° C: ssa; Toisessa osassa kiinnitettiin 10% neutraaliin puskuroituun formaliiniin ja sitten kuivattu parafiiniupotusta.

tutkimusprotokolla hyväksyi alueellinen eettinen komitea Clinical Research neljännen Military Medical University. Kaikki potilaat kunhan kirjallinen lupa käyttöön niiden potilastiedot ja kudosnäytteiden tutkimustarkoituksiin.

käänteistranskriptaasi-polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) B

Jäädytetyt kudosnäytteet (100 mg) kerättiin ja jauhettiin hienoksi jauheeksi. A549-soluja transfektoitiin stabiilisti pcDNA3.1 vektorilla, joka sisältää ABCG4 (Takara Bio, Otsu, Japani) käyttämällä Lipofectamine 2000 (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA, USA), mukaisesti valmistajan protokollaa. Solut siirrostettiin 6-kuoppaisille levyille, ja DNA-plasmidit ja transfektioreagenssia lisättiin 24 tuntia myöhemmin. Transfektoidut A549-soluja viljeltiin, kun läsnä oli G418: aa (400 mg /ml; Life Technologies Co., Grand Island, NY, USA). G418-resistentit solut (A549-ABCG4) poimittiin RT-PCR-analyysi.

RNA suoritettiin käyttäen Total RNA Kit I (Omega, Norcross, GA, USA). Pitoisuus ja puhtaus RNA-näytteet määritettiin käyttämällä absorbanssia 260 ja 280 nm (A260 /280) spektrofotometrisesti (Beckman DU800, Beckman Coulter Inc., Brea, CA, USA).

cDNA-synteesi suoritettiin käyttäen käänteistranskriptioreaktiossa kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) käyttäen Random Hexamer Primer, ja RevertAid M-MuLV käänteistranskriptaasia. PCR-monistus suoritettiin käyttäen 2 x Taq Mastermix (CWBio, Peking, Kiina). Alkudenaturaatio suoritettiin 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 30 sykliä denaturointi 95 ° C: ssa 35 s, pariutuminen 51 ° C: ssa 35 s, ja pidennys 72 ° C: ssa 35 s, ja lopullinen laajennus 72 ° C 5 min (taulukko 1). PCR-tuotteet analysoitiin 2% agaroosigeeleillä käyttäen geeliä Imager (Alpha Innotech, Santa Clara, CA, USA).

Western blot-analyysi

Jäädytetyt kudosnäytteet (100 mg) leikattiin pieniksi paloiksi ja homogenoitiin radioimmunosaostuskokeella (RIPA) puskuri [1 x PBS, 0,1% natriumdodekyylisulfaattia (SDS), 1% Nonidet P-40, 0,5% natriumdeoksikolaattia, 10 ug /ml leupeptiiniä, 100 ug /ml p-aminophenylmethylsulfonyl fluoridi (p-APMSF) ja 10 ug /ml aprotiniinia] jäissä 1 h, ja sentrifugoitiin 14000 x

g

30 min. A549-ABCG4 solut lyysattiin RIPA-puskurilla jäissä 1 h ja sentrifugoitiin 14000 x g 30 minuuttia. Sitten supernatantti kerättiin ja proteiinipitoisuus määritettiin käyttäen bikinkoniini- happoa (BCA) proteiinin määritystä. Proteiini lysaatit (50 ug) erotettiin 12% SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesilla (PAGE) ja siirrettiin polyvinylideenifluoridi (PVDF), 2,5 mA /cm

3: ssa 30 min. Membraanit blokattiin 5% rasvatonta maitojauhetta, 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (anti-ABCG4 kanin polyklonaalinen vasta-aine, 1: 1000, Proteintech, Chicago, IL, USA, ja anti-β-aktiini-kanin monoklonaalista vasta-ainetta , 1: 1000, CW Bio, Peking, Kiina) 4 ° C: ssa, yön yli. Tämän jälkeen kalvot pestiin TBST-puskurissa (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl: a ja 0,1% Tween-20), ja sen jälkeen inkuboitiin sekundäärisen vasta-aineen (vuohen anti-kani-vasta-aineita, 1: 5000, CW Bio, Beijing , Kiina) 37 ° C: ssa 1 h, jonka jälkeen värin kehittyminen käyttäen Millipore kromogeenista pakki western blotit (Billerica, MA, USA) ja havainnon alla kemiluminesenssimittaus analysaattori (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

immunohistokemia

parafinoidut kudokset leikattiin 3-5 um osiot vahanpoisto ja nesteytyksen. Immunohistokemia suoritettiin sen jälkeen, kun mikroaaltouuni lämmitys-pohjainen antigeenin haku 0,1 M sitraattipuskurissa (pH = 6,0), jota seurasi inkubaatio 3% H

2O

2 huoneenlämpötilassa 30 min, 10% vuohen seerumia huoneenlämmössä 30 min, primaarinen vasta-aine (anti-ABCG4 kanin polyklonaalista vasta-ainetta, 01:40, Proteintech, Chicago, IL, USA) yön yli 4 ° C: ssa biotiini-leimattua sekundaarista vasta-ainetta (CW Bio, Peking, Kiina) huoneenlämpötilassa 30 min , ja juuri valmistettua 3,3′-diaminobentsidiiniä (DAB) värin kehittämiseksi 5 min. Sitten leikkeitä huuhdeltiin vedellä perusteellisesti uudelleen värjättiin hematoksyliinillä, kuivattu, kirkastettiin ksyleenissä ja asennettu peitelevy. Spesifisyys anti-ABCG4-vasta testattiin ABCG4-esto peptidejä (1: 200, sc-34874; Santa-Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). Takertumisen peptidit lisättiin dioja ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa. Sitten primaarista vasta-ainetta lisättiin ja paljasti kuten edellä on kuvattu.

Näytteet luokiteltiin ”positiivinen”, kun solukalvon ja /tai solulimassa värjäytyivät ruskeiksi. Viisi suuritehoiset kentät (400 x) valittiin sattumanvaraisesti, ja kukin dia arvioitiin riippumattomasti kaksi kokenutta patologit sokaissut kliiniset tiedot. Fosfaattipuskuroitu suolaliuos (PBS), sen sijaan, että ensisijainen vasta-aine, käytettiin nollakoe.

Näytteet sijoitettiin mukainen värjäytymisen intensiteettiä ja positiivisten solujen prosenttiosuuden. Tulokset pisteytettiin perustuvat seuraavat kriteerit: a) positiivisten solujen prosenttiosuuden (≤5%: 0; 6-25%: 1, 26-50%: 2; 51-75%: 3, ja 75% : 4); b) värjäytymisintensiteettiä (ei väriä: 0; keltainen: 1, ruskea: 2; ja tan: 3); ja c) kaksi laadut kerrottiin yhteen ja näytteet luokitellaan johonkin 4 tasoa: 0: negatiivinen (-); 1-4: heikosti positiivinen (+); 5-8: kohtalaisen positiivinen (++); 9-12: voimakkaasti positiivinen (+++) [34]. Sillä monimuuttujamenetelmin ja vertailu eloonjäämiskäyrien, -was määritellään negatiiviseksi, ja +, ++ ja +++ olivat kaikki määritellään positiivisina.

Tilastollinen

Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen SPSS 18,0 (IBM, Armonk, NY, USA). Associations välillä immunohistokemiallinen ilmaisun ja kliinisiä muuttujia arvioitiin Mann-Whitneyn U tai Kruskal-Wallisin H testi tarvittaessa. Kokonaiselossaoloaika mitattiin alusta kemoterapiaa kuolinpäivä mistä tahansa syystä tai päivämäärän potilas oli viimeinen katsotaan elossa. Survival käyrät arvioitiin Kaplan-Meier menetelmällä, ja verrattiin käyttäen log-rank-testi. Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin yhden ja usean analyysejä. Korrelaatiot arvioitiin käyttäen Spearmanin analyysi. Sijoitus korrelaatiokertoimet ilmaistiin

r

s. 0.0≤

r

s

0,1 katsottiin korreloimattomia; 0.1≤

r

s

0,3 pidettiin korreloivat heikosti; 0.3≤

r

s

≤0.5 pidettiin kohtalaisen korreloivat;

r

s

0,5 pidettiin korreloivat voimakkaasti. Kaksipuolinen

P

-arvot 0,05 katsottiin olevan tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

ABCG4 mRNA ja proteiini ilmaisuja NSCLC ja normaali keuhkojen kudoksia

tutkimiseksi ABCG4 mRNA: n ekspression NSCLC ja normaalin keuhkokudoksen kudosnäytteitä, RT-PCR suoritettiin eristetty mRNA NSCLC kudoksista (n = 14) ja normaaleille keuhkokudoksissa (n = 2). Detection of a 383-bp: n PCR-tuotteen, joka vastaa ABCG4 mRNA havaittiin NSCLC kudoksissa (kuvio 1B), kun taas mitään tällaisia ​​juova havaittiin normaaleissa keuhkojen kudoksiin (kuvio 1A). Monistuminen β-aktiini (416 bp) havaittiin selvästi sekä kudostyypeissä (kuvio 1).

β-aktiini käytettiin sisäisenä referenssinä. M: merkki. (A) Kaista 1: positiivinen kontrolli (A549-ABCG4). Kaistat 2-3: normaali keuhkojen kudoksia (NORM) (n = 2); (B) NSCLC kudokset (NSCLC) (n = 14, kaistat 1-14).

tutkimiseksi ABCG4 proteiinin ilmentymistä NSCLC ja normaali keuhkojen kudoksia, western blot-analyysi suoritettiin näytesarja käytetään RT-PCR: llä. ABCG4 proteiinin ekspressio (60 kDa) havaittiin NSCLC kudoksissa (kuvio 2B ja S1 kuviossa), mutta ei normaalissa keuhkojen kudoksiin (kuvio 2A). β-aktiinin (43 kDa) käytettiin normalisoinnin ohjaus ja havaittiin molemmissa kudostyypeissä (kuvio 2 ja S1 kuviossa).

Koko blotteja esitetty S1 kuviossa β-aktiini (43 kDa) oli käytettiin sisäisenä viitteenä. (A) Kaista 1: positiivinen kontrolli (A549-ABCG4). Kaistat 2-3: normaali keuhkojen kudoksia (NORM) (n = 2); (B) NSCLC kudokset (NSCLC) (n = 14, kaistat 1-14).

Nämä tulokset osoittivat, että ABCG4 mRNA ja proteiini ilmaisut olivat ilmeisesti erilaiset NSCLC ja normaalin keuhkojen kudoksia.

ilmentäminen ABCG4 proteiinin NSCLC ja normaali keuhkojen kudoksia immunohistokemiallisesti

tutkimiseksi edelleen ilmentymisen ABCG4 proteiinin NSCLC, immunohistokemia suoritettiin NSCLC (n = 140) ja normaali keuhkojen kudosnäytteistä (n = 90) (kuvio 3). Ei ABCG4 ekspressio nähtiin normaalin kudoksen näytteissä (kuvio 3A). Jotkut NSCLC näytteet myös osoittanut mitään ekspressiota (-) (kuvio 3B), kun taas muut näytteet olivat heikosti positiivisia (+) (kuvio 3C), kohtalaisen positiivinen (++) (kuvio 3D), tai voimakkaasti positiivinen ABCG4 (++ +) (kuvio 3E). ABCG4-negatiivinen värjäys osoitti, että NSCLC kudosnäytteistä (++) käyttäen ABCG4 estävän peptidin (kuvio 3F). Perustuu immunohistokemia, ABCG4 ekspressiota havaittiin 48,6%: NSCLC tapauksista (68/140, 40 +, 23 ++, ja 5 +++), ja ei havaittu missään 90 normaalin keuhkokudoksen kudosnäytteitä (

P

0,001) (taulukko 2).

(A) Normaali keuhkokudoksen; (B) Negatiivinen (-) värjäys ABCG4 NSCLC kudoksessa; (C) Heikosti positiivinen (+) värjäys ABCG4 NSCLC kudoksessa; (D) Kohtalaisen positiivinen (++) värjäys ABCG4 NSCLC kudoksessa; (E) Vahvasti positiivinen (+++) värjäys ABCG4 NSCLC kudoksessa; (F) immunohistokemia osoittaa ABCG4-negatiivinen värjäytymisen NSCLC kudoksissa (++) käyttäen ABCG4 estävän peptidin. Suurennus: 200 x.

Nämä tulokset viittaavat siihen, ABCG4 ilmentyi NSCLC kudoksissa, ja että sitä ei ole ilmaistu normaaleissa keuhkojen kudoksia.

välisestä assosiaatiosta ABCG4 ilmaisun ja kliinis ominaisuudet potilailla, joilla NSCLC

Koska havaittiin, että ABCG4 yliekspressoitui lähes puolet NSCLC kudosnäytteitä, yhdistyksen välillä ABCG4 ilmaisun ja potilaiden ominaisuuksiin tutkittiin. Ei ollut mitään merkittävää korrelaatiota sukupuoleen, ikään, tai tupakointi (kaikki

P

0,05). Kuitenkin, korkean ABCG4 ekspressio korreloi merkitsevästi keuhkojen adenokarsinooma (53,0%) kuin keuhkojen okasolusyöpä (44,6%) (

P

0,001), heikosti (55,2%) kuin hyvin /kohtalaisesti ( 42,5%) eriytetty NSCLC (

P

= 0,008), ja yhä kasvaimen etäpesäke (TNM) vaihe II, III ja IV (31,0%

vs

. 53,6%

vs

. 59,5%, vastaavasti) (

P

0,001) (taulukko 3). Lisäksi ABCG4 ilmentymistasot heikosti korreloi positiivisesti yhä TNM (

r

s

= 0,210,

P

= 0,013) (tuloksia ei ole esitetty) .

Nämä tiedot osoittivat, että ABCG4 ilmentyminen liittyi kasvaimen erilaistumiseen, TNM ja histologinen tyyppi, ja että ABCG4 ekspressiotasoja positiivisesti liittyvät TNM.

Association between ABCG4 ilme ja selviytyminen NSCLC potilaiden sisplatiinia kemoterapian

Tutkiakseen suhdetta ABCG4 ilmaisun ja kliininen tulos pienisoluista keuhkosyöpää sisplatiinia-pohjainen yhdistelmä kemoterapiaa, yhden ja usean analyysit suoritettiin käyttäen Coxin suhteellisten riskien malli onko prognostinen arvo ABCG4 oli riippumaton muista tekijöistä. Vuonna univariate analyysi, sukupuoli, tupakointi tapana, ikä, ja histologia ei vaikuttanut ennustetta (kaikki

P

0,05). ABCG4 lauseke (riskisuhde [HR]: 2,284), korkea TNM (HR: 3.124), ja huono eriyttäminen (HR: 1,869) olivat merkitsevästi yhteydessä huonoon ennusteeseen (taulukko 4). Lisäksi tekijät, jotka liittyvät

P

-arvo 0,05 vuonna yhden muuttujan analyysiin, sisällytettiin osaksi monimuuttujamenetelmin. Tulokset osoittivat, että lisäksi TNM (HR: 3,098) ja eriyttäminen (HR: 1,811), ABCG4 ilme oli itsenäinen ennustetekijä selviytymisen potilaiden NSCLC. ABCG4-positiivinen arvo OS tuotti HR 2,236 (taulukko 4). Nämä tulokset osoittivat, että ABCG4 ilmentyminen oli haitallisia ennustetekijä potilailla, joilla on ei-pienisoluinen keuhkosyöpä sisplatiinia kemoterapiaan.

OS käyrät on esitetty kuviossa 4, mukaan ABCG4 ilmentymisen tila. Mediaani elinaika oli 43,2 ja 20,1 kuukautta potilailla, joilla ABCG4-negatiivisia ja ABCG4-positiivisia NSCLC, vastaavasti (

P

0,0001, kuvio 4A). Mediaani elinaika oli 54, 32, ja 14,15 kuukausi potilailla vaiheiden II, III, ja IV ei vastaavasti (

P

0,0001, kuvio 4B). Mediaani elinaika oli 39,5 ja 25,2 kuukautta potilailla, joilla on hyvin /kohtuullisesti ja huonosti eriytetty NSCLC, vastaavasti (

P

= 0,0008, kuvio 4C). Mediaani selviytyminen ABCG4-negatiivisten ryhmässä oli 39,5 kuukautta, kun se +21,05kuukausi vuonna ABCG4-positiivinen ryhmä vaiheessa III (

P

= 0,0002, kuvio 4E). Lisäksi mediaani selviytyminen ABCG4-negatiivisten ryhmässä oli 31,9 kuukautta, verrattuna 13,8 kuukautta ABCG4-positiivisten ryhmää IV vaiheessa (

P

= 0,0226, kuvio 4F). Kuitenkin mediaani selviytyminen ABCG4-negatiivisten ryhmässä oli 54,2 kuukautta, verrattuna 50,1 kuukautta vuonna ABCG4-positiivinen ryhmä II vaiheessa, ja ei ollut merkitsevää eroa käyttöjärjestelmän suhteen ABCG4 lauseke (

P

= 0,8127, kuvio 4D).

(A) Kaplan-Meier -käyrät piirrettiin määrittämään kumulatiivinen eloonjäämisaste NSCLC potilaiden perustuu ABCG4 ilme (negatiivinen

vs

. positiivinen). (B) Kaplan-Meier -käyrät piirrettiin määrittämään kumulatiivinen eloonjäämisaste NSCLC potilaiden perustuu kasvaimen etäpesäke (TNM) vaiheen (II

vs

. III

vs

. IV). (C) Kaplan-Meier -käyrät piirrettiin määrittämään kumulatiivinen eloonjäämisaste NSCLC potilaiden perustuu erilaistumiseen (huonosti

vs

. Kohtalaisen /kuoppa). (D) Kaplan-Meier -käyrät piirrettiin määrittämään kumulatiivinen eloonjäämisaste NSCLC potilaalla on TNM II perustuu ABCG4 ilme (negatiivinen

vs

. Positiivinen). (E) Kaplan-Meier -käyrät piirrettiin määrittämään kumulatiivinen eloonjäämisaste NSCLC potilaalla on TNM III perustuu ABCG4 ilme (negatiivinen

vs

. Positiivinen). (F) Kaplan-Meier -käyrät piirrettiin määrittämään kumulatiivinen eloonjäämisaste NSCLC potilaalla on TNM IV perustuu ABCG4 ilme (negatiivinen

vs

. Positiivinen). Negatiivinen: -; Positiivinen: +, ++ ja +++.

Keskustelu

On jo osoitettu, että ABC kuljettajat ovat mukana MDR ja vaikuttaa tehoon solunsalpaajahoitojen [ ,,,0],11,12]. Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia ABCG4 ja sen ilmaisun NSCLC, jotta voidaan arvioida, onko yhdistyksen välillä ABCG4 ilmaisun ja potilaiden tuloksista kemoterapian jälkeen. Tässä tutkimuksessa olemme esittänyt luotettavia todisteita ABCG4 mRNA ja proteiini ilmaisun joitakin näytteitä NSCLC kudoksen mutta ei normaalin keuhkojen kudoksia. Lisäksi ABCG4 ilmentyminen liittyvät eri eriyttäminen, TNM vaiheessa ja histologinen tyyppi. Yhden ja usean analyysissä todettiin, että TNM, erilaistumiseen ja ABCG4 ilme olivat riippumattomia tekijöitä ennusteeseen tässä potilasryhmässä NSCLC potilaiden sisplatiinia kemoterapiaan. Nämä tulokset ehdotti elinajan potilailla, joilla ABCG4-positiivisten NSCLC sisplatiinia kemoterapiaan.

ABCG4 ilme oli huomattavasti korkeampi NSCLC kudosnäytteistä verrattuna normaalin keuhkokudoksen kudosnäytteitä. Lisäksi ABCG4 ilmentyminen liittyvät eri eriyttäminen, TNM vaiheessa ja histologinen tyyppi. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että huolimatta samankaltaisuuksia järjestyksessä, rakenne ja toiminta MDR välillä ABCG2 (BCRP) ja ABCG4, ABCG2 ei liity sukupuoleen, tupakointi historia, suorituskyky (PS), histologinen tyyppi, ja TNM NSCLC [35 36], kun taas havaitsimme assosiaatiot ABCG4 ja histologinen tyyppi, erilaistumista laatu, ja TNM-luokitus. Yksi selitys voi olla, että erityisluonne ja monimuotoisuus sekvenssin ja rakenteen välillä ABCG subfamily kuljettaja geenejä edistää tätä ristiriitaa. Lisäksi ilmaus ABC subfamily kuljettajan proteiinit vaihtelevat kliininen muuttujia; Esimerkiksi ABCB1 ilme on huomattavasti suurempi naisilla kuin miehillä, ja suurempi kuin okasolusyöpä kuin okasolusyöpä in NSCLC. Kuitenkin ABCC2 ilme on huomattavasti korkeampi vaiheessa IV ei verrattuna IIIB, kun ei ole merkittävää korrelaatiota ABCC1 /ABCC3 ilmaisun ja kliinisten muuttujien NSCLC [35]. Tämä ristiriita on tutkittava tarkemmin. ABCG4 myös jakaa joitakin yhtäläisyyksiä ABCG1. Kuitenkin, pohjapinta ATPaasin aktiivisuus ABCG4 on pienempi kuin ABCG1, ja ABCG4 ei ole estetty samalla huumeiden ABCG1 [37]. Kuitenkin tarkka vuorovaikutus ja rooli tämän vuorovaikutuksen ABCG1 ja ABCG4 vielä selvittämättä [38].

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että ABCG4 välittää ulosvirtausta endogeenisten steroidien soluissa ja siirtää ne korkea- lipoproteiinien (HDL), mikä auttaa säilyttämään kolesterolin homeostaasin [30,39]. Kuitenkin Castanys-Munoz et ai. ovat havainneet, että yli-ilmentyminen ABCG4 on mukana myös alkyyli-fosfolipidin vastineita (miltefosiinin, edelfosiini, ja perifosine) resistenssi

Leishmania

[33]. Tulokset Tämän tutkimuksen ehdottaa lyhyempää selviytymisen potilailla, joilla ABCG4-positiivisten NSCLC sisplatiinia kemoterapiaan. Me spekuloida, että potilailla, joilla on ABCG4-positiivinen NSCLC voi vastustuskykyisiä sisplatiini-kemoterapiaan. Ehdotamme, että ABCG4 voi toimia molekyyli- tavoitteen vähentää lääkeresistenssin NSCLC. Suhde ABCG4 ja lääkeresistenssi, ja erityisesti monilääkeresistenssi, on tarkemmin käsitellä tulevissa tutkimuksissa.

Toisaalta, tämä oli ensimmäinen tutkimus tutkimaan suhdetta ABCG4 ilmaisun ja ennusteen potilasta NSCLC. Perustuen OS kaarteissa, ABCG4 positiivisten potilaiden oli lyhyempi keskimääräinen eloonjäämisaika kuin ABCG4-negatiivisten potilaiden paitsi vaiheen II NSCLCs (

P

= 0,8127). Eloonjäämismediaani ei ollut merkitsevästi erilainen II vaiheessa NSCLCs, mikä voi johtua ABCG4 ekspressiotasot olivat suhteellisen alhaiset vaiheessa II NSCLCs, ja että määrä ABCG4 positiivisten potilaiden vaiheen II NSCLC oli suhteellisen pieni (n = 13). Siksi tämä tulos on tulkittava varoen. Yksiulotteista ja monimuuttuja analyysit osoittivat, että lisäksi TNM ja erilaistumista, ABCG4 oli itsenäisesti liittyy OS NSCLCs sisplatiinia-pohjainen yhdistelmä kemoterapiaa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ABCG4 ilmentyminen olla itsenäinen riskitekijä ennusteen ja ennakoivan biomarkkereiden potilailla NSCLC sisplatiinia-pohjainen yhdistelmä kemoterapiaa. Tuloksemme ovat samansuuntaisia ​​kuin Yoh et al. ja Ota et al., jotka tukevat ennakoiva rooli ABCG2 ennusteessa NSCLC potilaiden sisplatiinia perustuva yhdistelmä kemoterapiaa [35,36]. Lisäksi olemme spekuloida, että ABCG4 mRNA ilmaisua voidaan käyttää suunnitella yksilöllisiä kemoterapiaa pienisoluista keuhkosyöpää.

Tämä tutkimus oli joitakin rajoituksia. Todellakin, otoskoko oli pieni, ja suuremman otoksen koko olisi parempi. Meillä ei myöskään ollut terveiden verrokkien koska keuhkojen resektio terveillä henkilöillä on hyvin invasiivisia ja epäeettistä. Kuitenkin kontrollisilkkipaperia potilailta NSCLC olivat histologisesti eroaa kasvain kudosten ja 5 cm: n etäisyydelle kasvaimia, joten oletetaan tämä on tehokas valvonta näissä olosuhteissa. Lopuksi, solunsisäinen lokalisaatio ABCG4 arvioidaan tulevassa työssä. Lisätutkimukset ovat suorittaa eri NSCLC solulinjoilla jotka yli-ilmentävät ABCG4 yksin tai yhdessä muiden ABC kuljettajat, jonka pitäisi auttaa selvittämään tarkka asema ja tehtävä ABCG4 NSCLC.

Johtopäätökset

Tämä tutkimus viittaa vahvasti siihen, että korkea ABCG4 ilmentyminen liittyy huonon ennusteen potilailla NSCLC sisplatiinia kemoterapian, ja potilaille, joilla ABCG4-positiivinen NSCLC voi vastustuskykyisiä sisplatiini-kemoterapiaan. Lisäksi nykyinen tutkimus on ensimmäinen, joka osoittaa mahdollinen rooli ABCG4 ilmaisun itsenäisenä ennustava tekijä huonon ennusteen pienisoluista keuhkosyöpää sisplatiinia-pohjainen yhdistelmä kemoterapiaa. Kuitenkin lisätutkimuksia suurempia otoskoko ja soluja tarvitaan vahvistaa nämä tulokset, ja erityinen polku ja käyttävä mekanismi tämän vaikutuksen on vielä tutkittava. Nämä voivat johtaa uusi lähestymistapa käänteinen resistenssin kemoterapiaa huumeita ymmärtämällä ABCG4 ja sen mekanismi NSCLC.

tukeminen Information

S1 Kuva. Täysi western blot ABCG4 proteiinia (60 kDa) ilmentymistä.

Β-aktiini (43 kDa) käytettiin sisäisenä referenssinä.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0135576.s001

(PDF)

S1 tiedosto. Raakadata Coxin suhteellisen vaarat mallin analyysi ja Kaplan-Meier -käyrät.

Huom: Sukupuoli: 0, miespuolinen; 1, naispuolinen. Tapahtuma: 0, kuolema; 1, sensuroitiin tiedot. Ikä: 0, ≥60; 1, 60.