Krooninen sairaus

tiivistelmä

Viimeaikaiset epidemiologiset tutkimukset mikä erot syövän uusiutumiseen perustuu anestesia hoito esiin mahdollisuuden, että mu-opioidireseptorin (MOR) voi vaikuttaa syövän etenemisessä. Perustuen aiemmat havainnot, että yliekspressio MOR ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin lisäsi kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden, tämä tutkimus tutki MOR säätelee kasvutekijän reseptorin signalointi ja epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) ihmisen NSCLC soluissa. Me käytetään erityisiä siRNA, shRNA, kemialliset estäjät ja yli-ilmentyminen vektoreita ihmisen H358 NSCLC-soluja, jotka olivat joko käsittelemättömiä tai niitä käsiteltiin eri pitoisuuksilla DAMGO, morfiini, fentanyyli, EGF: n tai IGF: n. Solutoiminnan määrityksiä, immunoblot ja immunosaostusmäärityksissä suoritettiin sitten. Tuloksemme osoittavat MOR säätelee opioidien ja kasvutekijän aiheuttaman EGF-reseptorin signalointia (Src, Gab-1, PI3K, Akt ja STAT3 aktivointi), joka on ratkaisevan tärkeää seurauksena ihmisen NSCLC-solujen lisääntymisen ja muuttoliike. Lisäksi ihmisen NSCLC-soluja opioidihoitoa, kasvutekijöiden tai MOR yliekspressio näytteille kasvu etana, etana ja vimentiinistä ja pienentää ZO-1 ja klaudiini-1-proteiinin tasot, tulokset sopusoinnussa EMT fenotyyppi. Edelleen, nämä vaikutukset olivat päinvastainen hiljentämiseen (shRNA) tai kemiallisia esto MOR, Src, Gab-1, PI3K, Akt ja STAT3 (p 0,05). Tuloksemme viittaavat siihen, että välitön vaikutus MOR on opioidien ja kasvutekijä-signalointia ja siitä jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja EMT siirtymisen aikana keuhkosyöpä etenemisen. Tällainen vaikutus tarjoaa uskottava selitys epidemiologinen havainnoista.

Citation: Lennon FE, Mirzapoiazova T, Mambetsariev B, Poroyko VA, Sal ia R, Moss J, et al. (2014) MU opioidireseptorin Edistää Opioidien ja kasvutekijäindusoitunutta leviämisen, Migration ja epiteelikasvaimet mesenkymaalitransitioon (EMT) Human Lung Cancer. PLoS ONE 9 (3): e91577. doi: 10,1371 /journal.pone.0091577

Leikkaus: Olivier de Wever, Gentin yliopisto, Belgia

vastaanotettu: 16 syyskuu 2013; Hyväksytty: 13 helmikuu 2014; Julkaistu: 24 maaliskuu 2014

Copyright: © 2014 Lennon et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tuki oli edellyttäen institutionaalisille ja /tai osastojen lähteiden ja National Institutes of Health myöntää CTSA UL1 TR000430. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Metyylinaltreksonin kehitettiin University of Chicago ja lisensoitu Progenics Pharmaceuticals, sittemmin sub alaista ja Salix Pharmaceuticals. Tohtori Moss oli maksettu konsultti Progenics Pharmaceuticals ja tällä hetkellä on maksettu konsultti Salix Pharmaceuticals. Hän saa rojalteja kautta Chicagon yliopistossa. Ei ole patenttia (t) tai patenttihakemukset aineellisia merkitystä tässä artikkelissa. Tämä ei muuta tekijöiden sitoutumista kaikkiin PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

rooli anestesian ja analgesian toistumisen ja metastasoituneen maligniteettien on viime aikoina saanut paljon huomiota [1], [2], [3], [4]. Takautuva tutkimukset ovat osoittaneet heikentynyt syövän uusiutumista puudutus pienemmillä opioideja leikkauksen jälkeen rintasyövän, eturauhassyövän, paksusuolen syöpä ja melanooma, vaikka muut tutkimukset eivät ole havaita merkittäviä eroja [5], [6], [7] , [8]. Jotkut hypoteeseja selittämään näitä eroja uusiutumisen hinnat sisältävät immunosuppressivisia vaikutukset ja suoria vaikutuksia kasvainsolujen kasvua [9], [10], [11]. Tutkimuksemme on keskittynyt mu-opioidireseptorin (MOR) ja sen rooli säänteleviä solumuutoksia johtavat kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden [4], [12], [13].

Tehokas hoitostrategioita keuhkosyövän , suurin syy syöpään liittyvien kuolleisuus kaikkialla maailmassa, ovat erittäin rajoitettu esimerkkinä tarve varhaiseen diagnosointiin ja uudet terapeuttiset interventiot [14], [15]. Olemme aiemmin raportoitu, että MOR on yliaktiivista useita erilaisia ​​ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) [12]. Lisäksi olemme osoittaneet, että yliekspressio MOR ihmisen NSCLC kasvaa primaarikasvaimen kasvun ja etäpesäkkeiden ksenograftimalleissa [13]. Kuitenkin tarkka solumuutoksia säädellään MOR NSCLC ovat epätäydellisesti määritelty [4]. Syöpäsoluja kasvaa ja etäispesäkkeitä, siellä täytyy olla menetys solu-soluadheesiota (ominaista väheneminen epiteelisolujen adheesioproteiineja myös tiiviin liitoksen proteiinit, ZO-1 ja klaudiini-1) ja sen jälkeen hankinnan mesenkymaaliset ominaisuuksiin, mukaan lukien menetys Baso-apikaalisella polarisaatio, solun tukirangan remontin ja lisääntynyt solun liikkuvuus (tyypillistä nousu erityisten solun tukirangan proteiinit (eli vimentiinista) ja transkriptiotekijöiden (eli Slug ja etana) [16], [17], [18], [19] . Tämä organisoidusta kasvaimia synnyttävän prosessia kutsutaan epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22].

Growth tekijä reseptoreita, kuten epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR), usein yli-ilmennetään ja /tai mutatoitunut NSCLC ja säädellä onkogeenisten prosessien kuten kasvainsolujen lisääntymisen, migraation ja EMT siirtyminen [23], [24], [25], [26] , [27]. Monet hoitojen kohdistaminen EGFR NSCLC olemassa myös tyrosiinikinaasin estäjät (gefitinibi, erlotinibi) ja monoklonaalisia vasta-aineita (setuksimabi) [28], [29], [30], [31]. Kuitenkin yleinen eloonjäämisaste NSCLC edelleen alhainen [32], [33], [34]. Äskettäin Fujioka et al., Ovat osoittaneet, että morfiini voi stimuloida EGFR signalointipolkujen myös seriini /treoniinikinaaseja Akt ja MAP-kinaasin in NSCLC viittaa rooli MOR esto mahdollisena terapeuttinen strategia NSCLC [35].

Perustuu hiljattain kiinnostusta vaikutusten anestesian ja analgesian hoito toistumista ja metastaattisen potentiaalin eri syöpiä [1], [2], [3], [4], aiempien julkaistujen tietojen osoittaa MOR ylössäädellään keuhkossa kudosta potilailta NSCLC [12], yliekspressio MOR edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden ihmisen NSCLC ksenograftimalleissa [13] sekä tietojen Fujioka et al., mikä osoittaa MOR sääntely EGF aiheuttama signalointi tapahtumia NSCLC [35], tässä tutkimuksessa selvitettiin toiminnalliset vaikutukset MOR on perustavanlaatuinen onkogeenisiä prosessit opioidien ja kasvutekijän indusoima ihmisen keuhkon solujen vaeltamiseen, lisääntymistä ja epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT) [16], [17], [18], [19], [ ,,,0],20]. Koska tällä hetkellä hyvin vähän tietoa opioidi ja /tai MOR sääntelyn EMT ja molekyylitason mekanismeja integroida syöpäsolujen lisääntymistä, muuttoliike ja EMT, tässä tutkimuksessa selvitettiin yksityiskohtaisesti molekyylitason mekanismeja näihin tapahtumiin, jotka voivat olla potentiaalisia kliinistä hyötyä.

menetelmät

Soluviljely ja reagenssit

ihmisen NSCLC solu H358 saatiin ATCC (Walkersville, MD) ja viljeltiin Roswell Park Memorial Institute täydelliseen alustaan ​​(Cambrex, East Rutherford, NJ) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO2, 95% ilmaa, ja kanavat 6-10 käytetään tutkimukseen. Ellei toisin mainita, reagenssit saatiin Sigmalta (St. Louis, MO). Reagenssit SDS-PAGE-elektroforeesilla ostettiin Bio-Rad (Richmond, CA) ja Immobilon-P siirto kalvo hankittiin Millipore (Millipore Corp., Bedford, MA). Kanin anti-MOR-vasta ostettiin GeneTex (San Antonio, TX). Kanin anti-EGFR, kanin anti-fosfotyrosiini-EGFR (pY

845, pY

992, pY

1045, pY

1068), kanin anti-Grb-2, kanin anti-Gab-1 , kanin anti-fosfotyrosiini-Gab-1 (pY

307, pY

627), kanin anti-Src, kanin anti-fosfotyrosiini-Src (pY

416), kanin anti-p85 PI3 kinaasi, kani anti-p55 PI3 kinaasi, kanin anti-fosfotyrosiini-p85 /p55 PI3 kinaasi (pY

458, pY

199), kanin anti-STAT3, kanin anti-fosfotyrosiini-STAT3 (pY

705), kani anti-vimentiinin, kanin anti-ZO-1, kanin anti-klaudiini-1, kanin anti-Snail ja kanin anti-Slug-vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technologies (Danvers, MA). Hiiren anti-β-aktiini-vasta-aine hankittiin Sigma (St. Louis, MO). Toissijainen piparjuuriperoksidaasi-leimattujen vasta-aineiden hankittiin Amersham Biosciences (Piscataway, NJ). N-Metyylinaltreksonibromidin tai metyylinaltreksonin ostettiin Mallinckrodt Specialty Chemicals (Phillipsburg, NJ). PI3-kinaasi-inhibiittori LY294002, Akt Inhibitor X, Src-inhibiittori PP2 ja STAT3 inhibiittorin Stattic hankittiin EMD Biosciences (Billerica, MA).

immunoblottauksella

Immunoblottaus suoritettiin kuten me on aikaisemmin kuvattu. Cellular materiaaleja käsiteltyä tai käsittelemätöntä ihmisen NSCLC-soluja inkuboitiin lyysipuskuria (50 mM HEPES (pH 7,5), 150 mM NaCl, 20 mM MgCl

2, 1% Triton X-100, 0,1% SDS, 0,4 mM Na

3Vo

4, 40 mM NaF, 50 uM okadahapon, 0,2 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 1:250 laimentaminen Calbiochem proteaasinestäjä seosta 3). Näytteet ajettiin sitten SDS-PAGE 4-15% polyakryyliamidigeeleillä, siirrettiin Immobilon ™ kalvot, ja jossa määritetään ensimmäisen ja toisen vasta-aineita. Visualisointi immunoreaktiivisia nauhojen saatiin aikaan käyttämällä tehostettua kemiluminesenssia (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). Joissakin tapauksissa immunoreaktiivisia vyöhykkeitä kvantitatiivisesti käyttäen tietokoneavusteista densitometrian.

Sirna Transfektio Human NSCLC Solut

Vakaa Ohjaus ja joko MOR, Gab-1, tai Src siRNA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) transfektoitiin H358-soluja, kuten olemme aiemmin kuvattu [12]. Solut (-40% konfluentteja) oli seerumia 1 tunti sen jälkeen inkuboitiin siRNA 6 tuntia seerumittomassa alustassa. Seerumia sisältävässä väliaineessa lisättiin sitten (10% seerumia lopullinen pitoisuus) 42 tunnin ajan. Proteiinikinaasien ilmentyminen varmistettiin immunoblottausanalyysillä spesifisten vasta-aineiden.

Vakaa Ohjaus ja MOR Pieni hiusneula-RNA Transfektio Human NSCLC Solut

Vakaa Ohjaus ja MOR shRNA (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA) transfektoitiin stabiilisti osaksi H358-soluja, kuten olemme aiemmin kuvattu [12]. Solut (-40% konfluentteja) olivat ilman seerumia 1 tunnin ajan ja sen jälkeen inkuboitiin shRNA 6 tuntia seerumittomassa alustassa. Seerumia sisältävässä väliaineessa lisättiin sitten (10% seerumia lopullinen pitoisuus) 42 tunnin ajan ja puromysiiniselektion reagenssia lisättiin. Proteiinikinaasien ilmentyminen varmistettiin immunoblottausanalyysillä anti-MOR-ainetta (GeneTex, San Antonio, TX).

Vakaa vektoriohjaus ja MOR1 yliekspressio Human NSCLC Solut

Myc-DDK-koodattu ORF klooni Homo sapiens opioidireseptorin, mu 1 (OPRM1), transkripti variantti MOR-1 (Origene Technologies Inc, MD) monistettiin käyttämällä Platinum Taq-DNA-polymeraasia hifi-entsyymin (Invitrogen, CA) ja sen jälkeen kloonattiin pCR8 /GW /Topo merkintä (Invitrogen, CA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Plasmidi-DNA uutettiin valittu klooneista QIAquick Plasmidi Mini Kit (Qiagen, CA). ORF eheys ja fragmentti suunta vahvistettiin sekvensoimalla. MOR1-Myc fuusion tuote siirrettiin sitten pcDNA3.2 /V5 DEST-vektoriin (Invitrogen, CA) LR reaktiolla. Saatu rakenne (pcDNA3.2-MOR1-Myc) transfektoitiin H358-soluihin käyttämällä FuGENE HD ™: transfektioreagenssi (Roche Applied Sciences) protokollan mukaisesti, jonka Roche olemme aiemmin kuvattu. Solut (-40% konfluentteja) olivat ilman seerumia 1 tunnin ajan, jota seuraa inkubointi pcDNA3.2-MOR1-Myc 6 tuntia seerumittomassa alustassa. Seerumia sisältävässä väliaineessa lisättiin sitten (10% seerumia lopullinen pitoisuus) 42 tunnin ajan ja neomysiini valinta reagenssia lisättiin. Yliekspressio varmistettiin immunoblottausanalyysillä anti-MOR-ainetta (GeneTex, San Antonio, TX).

Human NSCLC proliferaatiomääritystä

mittaus

in vitro

NSCLC solujen kasvua suoritettiin kuten olemme aiemmin kuvattu. Ohjaus- tai siRNA esikäsitellyt H358-soluja (5 x 10

3 solua /kuoppa) inkuboitiin 0,2 ml: lla seerumitonta väliainetta, joka sisälsi joko vehikkeliä (kontrolli), metyylinaltreksoni (MNTX, 100 nm) PI3-kinaasi-inhibiittori LY294002 (10 uM), Akt Inhibitor X (5 uM), Src-inhibiittori PP2 (100 nM) tai STAT3-inhibiittori Stattic (10 uM) 72 tunnin ajan 37 ° C: ssa 5% CO2 /95% ilmaa, 96-kulttuuri levyt.

in vitro

solujen lisääntymisen määrityksessä analysoitiin mittaamalla solujen määrä käyttämällä CellTiter96 ™ MTS-määritys (Promega, Madison, WI) ja se luettiin 492 nm: ssä. Kukin määritys perustettiin kolmena kappaleena ja toistettiin ainakin viisi kertaa.

Human NSCLC Cell migraatiokokeessa

mittaus

in vitro

NSCLC solujen vaeltamiseen suoritettiin olemme aikaisemmin on kuvattu. Kaksikymmentäneljä siirtokuoppaan yksiköihin 8 uM huokoskoko (Millipore, Billerica, MA) käytettiin seurantaan

in vitro

solujen vaeltamiseen kuten olemme aiemmin kuvattu [12]. Ohjaus- tai siRNA esikäsitellyt H358-soluja (5 x 10

3 solua /kuoppa) inkuboitiin 0,2 ml: lla seerumitonta väliainetta, joka sisälsi joko vehikkeliä (kontrolli), metyylinaltreksoni (MNTX, 100 nm) PI3-kinaasi-inhibiittori LY294002 (10 uM), Akt Inhibitor X (5 uM), Src-inhibiittori PP2 (100 nM) tai STAT3-inhibiittori Stattic (10 uM) maljattiin ylempään kammioon ja media seerumin lisättiin alempaan kammioon. Solujen annettiin kulkeutua huokosiin 18 tuntia. Soluja ylemmän ja alemman kammion kvantitoitiin käyttäen CellTiter96 ™ MTS-määritys (Promega, San Luis Obispo, CA) ja se luettiin 492 nm: ssä. % Muuttoliike määriteltiin # solujen alemmassa kammiossa jaettuna solujen lukumäärä sekä ylemmän ja alemman kammio. Kukin määritys perustettiin kolmena kappaleena ja toistettiin vähintään viisi kertaa.

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta kolmesta itsenäisestä kokeesta. Data-analyysin, kokeellinen näytteitä verrattiin valvonnan parittomia Studentin t-testiä. Usean ryhmä vertailuja, yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) ja post hoc monivertailuja testejä käytettiin. Erot ryhmien välillä katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun

P

arvo oli pienempi kuin 0,05. Kaikki tilastolliset analyysit suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism-ohjelma (GraphPad Software Inc., USA).

Tulokset

Tuloksemme kuviossa 1 osoittavat, että estämällä MOR kanssa reuna-MOR antagonisti MNTX vaimentaa EGF- indusoitua proliferaatiota (kuvio 1-A) ja kulkeutuminen (kuvio 1-B) ihmisen H358 NSCLC-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Nämä tiedot viittaavat siihen, välisen yhteyden MOR ja EGFR H358-soluissa. Jotta mekaanisesti arvioida roolin MOR on EGF aiheuttama EGFR dynamiikka, käsittelimme H358-solujen EGF eri aikoina ja immunosaostettiin EGFR määrittämiseksi mahdollisten MOR -alueella. Kuvio 2-A osoittaa, että EGF saa aikaan kompleksin muodostuminen EGFR ja MOR, joka on huipussaan 5-15 minuutin kuluttua EFG haaste. Tutkimustulosten perusteella, että MOR /EGFR kompleksi voi esiintyä EGF stimulaation H358-solujen, me seuraavaksi tutkittava, MOR voi säädellä EGFR fosforylaatiota. Hyödyntämällä paneelin anti-fosfo-EGFR-vasta-aineita, Kuvio 2-B osoittaa, että esikäsittely H358 ihmisen NSCLC-solujen perifeerisen MOR antagonisti MNTX epäonnistui vaimentamaan EGF aiheuttamaa EGFR tyrosiinifosforylaation.

Paneeli A: Human H358 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin analysoitiin metyylinaltreksonin (MNTX) EGF-välitteisen proliferaation käyttäen MTS proliferaatiomääritys. Soluja kasvun läsnä oli 100 ng /ml EGF: n ja /tai 0-250 nM MNTX 72 tuntia. MNTX On tilastollisesti merkittävä ero (p 0,05, merkitty tähdellä) välissä ohjaus ja MNTX (10, 50, 100, 250 nM) käsittely n = 3 per kunnossa ja virhepalkkeja = keskihajonta. Katso Menetelmät jaksossa kokeen yksityiskohtien. Paneeli B: Ihmisen H358 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin analysoitiin metyylinaltreksonin (MNTX) EGF-välitteisen siirtolaiskysymyksen transwell määritystä (8 uM huokoskoko). Solujen annettiin kulkeutua läsnä ollessa 100 ng /ml EGF: n ja /tai 0-250 nM MNTX 18 tuntia. On tilastollisesti merkitsevä ero (p 0,05, merkitty tähdellä) välissä ohjaus ja MNTX (50, 100, 250 nM) käsittely n = 3 per kunnossa ja virhepalkkeja = keskihajonta. Katso Menetelmät jaksossa kokeen yksityiskohtien osalta.

Paneeli A: Ihmisen H358 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluja käsiteltiin ilman (kontrolli) tai 100 ng /ml EGF: ää 5, 15, tai 30 minuuttia. Solulysaatit saatiin ja immunosaostettiin anti-EGFR-vasta-aine. Immunoblotit tehtiin kokosoluliuotteista (vasemmalla) ja immunosaostettiin materiaalia (oikealla) käyttäen anti-MOR (a) ja anti-EGFR (b) vasta-aineita. Mu-opioidireseptorin rekrytoimista EGFR kanssa EGR stimulaatiota. Paneeli B: Ihmisen H358 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin olivat joko käsittelemättömiä (kontrolli) tai käsiteltiin 100 nM MNTX yksin, 10 ng /ml EGF: ää 5, 15 tai 30 minuuttia, tai 100 nM MNTX ja 10 ng /ml EGF: ää 5, 15 tai 30 minuuttia. Solulysaatit saatiin ja immunoblotattiin käyttäen anti-pY

845 EGFR (a), anti-pY

992 EGFR (b), anti-pY

1045 EGFR (c), anti-pY

1068 EGFR (d), anti-EGFR (e) ja anti-aktiini (e) vasta-aineita. MNTX ei estä EGF aiheuttamaa EGFR tyrosiinifosforylaation.

seuraava tutki MOR voi säädellä EGFR loppupään signalointi molekyylejä. Ensin tarkasteltiin sovitin proteiini, kasvutekijän reseptorin sitoutunut proteiini 2 (Grb-2), joka sisältää SH2 domain ja kaksi SH3 domeenit ja voivat suoraan sitoa EGFR [36]. Tulokset Kuvio 3-A osoittaa, käyttäen immunosaostus EGFR ja immunoblottaus anti-Grb-2-vasta-aine, joka EGF indusoi EGFR /Grb-2 kompleksin muodostumista, joka on heikennetty esikäsittely H358-solujen kanssa MNTX. Rekrytointi Grb-2 EGFR on tärkeää solukalvon rekrytointia ja siitä tyrosiinifosforylaation rakennustelineiden proteiinin Grb2 liittyvä sitovan proteiinin 1 (Gab-1) [37]. Kuva 3-B osoittaa, että EGF stimulointi H358-solujen indusoi tyrosiinifosforylaatiota Gab-1 (Tyr307 ja Tyr627), joka on huipussaan -5 minuuttia ja vaimennetaan MOR eston kanssa MNTX.

Paneeli A: Human H358 non -pieni keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin olivat joko käsittelemättömiä (kontrolli) tai käsiteltiin 100 nM MNTX (1 tunti esi-inkubaatio), 10 ng /ml EGF: ää 15 minuutin ajan, tai 100 nM MNTX ja 10 ng /ml EGF: ää. Solulysaatit saatiin ja immunosaostettiin anti-EGFR-vasta-aine. Immunoblotit tehtiin kokosoluliuotteista ja immunosaostettiin materiaalia käyttäen anti-Grb-2 (a, c) ja anti-EGFR (b, d) vasta-ainetta. MNTX estää EGF aiheuttaman rekrytointi Grb-2 EGFR. Paneeli B: Ihmisen H358 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin olivat joko käsittelemättömiä (kontrolli) tai käsiteltiin 100 nM MNTX yksin, 10 ng /ml EGF: ää 5, 15 tai 30 minuuttia, tai 100 nM MNTX ja 10 ng /ml EGF: ää 5, 15 tai 30 minuuttia. Solulysaatit saatiin ja immunoblotattiin käyttämällä anti-pY

627 Gab-1 (a), anti-pY

307 Gab-1 (b) ja anti-aktiini (c) vasta-aineita. MNTX vaimentaa EGF-indusoitu Gab-1 tyrosiinifosforylaation.

Koska tyrosiinifosforylaatiota Gab-1 erilaisilla tyrosiinikinaaseja lukien Src edistävää sitoutumista molekyylejä kuten fosfatidyyli 3-kinaasien (PI3K), joka tuottaa PIP3 ja aktivoida alavirran efektorit, kuten Akt ja STAT3 [37], [38], [39], [40], [41], [42], tutkimme seuraavaksi, onko MOR inhibitio voi vaikuttaa myös Gab-1: een sitoutuvien /efektorimolekyylejä. Kuvio 4-A esittää, että kuin Gab-1, EGF haaste H358-solujen indusoi tyrosiinifosforylaatiota Src (Tyr416), sääntely PI3K alfa-alayksiköt p85 ja p55 (Tyr458 /Tyr199), ja transkriptiotekijä STAT3 (Tyr705), joka huippu at -5 minuuttia ja vaimennetaan MOR inhibitio MNTX tilastollisesti merkittävällä tavalla (kuvio 4 B).

paneeli A: Ihmisen H358 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin olivat joko käsittelemättömiä (kontrolliryhmä ) tai käsiteltiin 100 nM MNTX yksin, 10 ng /ml EGF: ää 5, 15 tai 30 minuuttia, tai 100 nM MNTX ja 10 ng /ml EGF: ää 5, 15 tai 30 minuuttia. Solulysaatit saatiin ja immunoblotattiin käyttäen anti-fosfo-Src (pY

416) (a), anti-fosfo-p85 /p55 PI3 kinaasi (pY

458 /pY

199) (b, c) anti-fosfo-STAT3 (pY

705) (d) ja anti-aktiini (e) vasta-aineita. Paneeli B: graafinen kvantitoimiseksi immunoreaktiivisuuden kokeita suoritetaan kuvattu kuviossa 3-B ja paneeli A normalisoinnin kokonais-spesifistä proteiinia, ja n = 3 itsenäistä koetta per ehto. Tähdellä (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) kontrollista. Virhepalkit = keskihajonta.

vieressä tutkittiin mekanismia, jolla EGF: n ja DAMGO ([D-Ala2, N-MePhe4, Gly-ol] enkefaliini), synteettinen opioidi peptidin spesifisyys for MOR) indusoivat proliferaatio ja migraatio. Kuvio 5 havainnollistaa, että siRNA ja /tai kemiallisten esto MOR, Gab-1, Src, PI3K, Akt ja STAT3 merkittävästi vähentää EGF: n ja DAMGO-indusoitua proliferaatiota (kuvio 5-A) ja kulkeutuminen (kuvio 5 B).

paneeli A: Human H358 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin analysoitiin EGF ja DAMGO välittämä leviämisen käyttäen MTS runsaudenmäärityksessä. H358 ihmisen NSCLC-soluja ei joko käsitelty (kontrolli) tai käsiteltiin 100 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF) tai 100 nM DAMGO 72 tuntia tai ilman solujen esikäsittely perifeerisen MOR antagonisti, metyylinaltreksoni (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, The PI3 inhibiittori LY294002 (10 uM), Akt Inhibitor X (5 uM), Src-inhibiittori PP2 (100 nM) tai STAT3 estäjän Stattic (10 uM). On tilastollisesti merkitsevä ero (p 0,05, merkitty tähdellä) välissä ohjaus ja hoitoryhmien n = 3 itsenäistä koetta kohti kunnossa ja virhepalkkeja = keskihajonta. Katso Menetelmät jaksossa kokeen yksityiskohtien. Paneeli B: Ihmisen H358 ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) soluihin analysoitiin EGF ja DAMGO välittämä siirtolaiskysymyksen transwell määritystä (8 uM huokoskoko). H358 ihmisen NSCLC-soluja ei joko käsitelty (kontrolli) tai käsiteltiin 100 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF) tai 100 nM DAMGO: ssa 18 tuntia tai ilman solujen esikäsittely perifeerisen MOR antagonisti, metyylinaltreksoni (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, The PI3 inhibiittori LY294002 (10 uM), Akt Inhibitor X (5 uM), Src-inhibiittori PP2 (100 nM) tai STAT3 estäjän Stattic (10 uM). On tilastollisesti merkitsevä ero (p 0,05, merkitty tähdellä) välissä ohjaus ja hoitoryhmien n = 3 itsenäistä koetta kohti kunnossa ja virhepalkkeja = keskihajonta. Katso Menetelmät jaksossa kokeen yksityiskohtien.

Koska hyvin vähän tiedetään MOR sääntely epiteelin mesenkymaaliset muunnos (EMT) ja molekyylitason mekanismeja integroida syöpäsolujen lisääntymistä, muuttoliike ja EMT, me seuraavaksi tutki MOR1 yli-ilmentyminen säätelee keuhkosyöpä EMT. Kuviossa 6-A, B, havaitsimme, että MOR yli-ilmentyminen ihmisen H358 NSCLC-solujen indusoimaa muutosta EMT markkeri ilmaisu, joka on sopusoinnussa epiteelin mesenkymaalitransitioon [19]. Koska MOR on tärkein reseptori tiettyjen opioidien [4], [43], me seuraavaksi arvioitava, ovatko opioidit voivat aiheuttaa EMT ihmisen H358 NSCLC soluja. Kuva 6-C osoittaa, että DAMGO, morfiini ja fentanyyli kaikki aiheuttaa EMT NSCLC annoksesta riippuvaisella tavalla.

Paneeli A: ohjaus (ei-transfek-) (C), vakaa vektorisäätö (VC) ja MOR1 yli-ilmentävät (O /E) H358 solulinjoja, solulysaateista saatu ja immunoblotattu EMT markkereita anti-vimentiinista (a), anti-Snail (b), anti-Slug (c), anti-klaudiini-1 (d), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) ja anti-aktiini (g) vasta-aineita. Nostamalla vimentiinista, Snail ja Slug ilmaisun ja lasku klaudiini-1 ja ZO-1 ilmentymisen viittaavat epiteelin mesenkymaalitransitioon. Paneeli B: graafinen kvantitoimiseksi immunoreaktiivisuus suoritetuissa kokeissa kuvattu paneelissa A n = 3 itsenäistä koetta kohti kunnossa. Tähti (*) tarkoittaa tilastollisesti merkitsevää eroa (p 0,05) välillä ohjaus virhejanat = keskihajonta. Paneeli C: H358 ihmisen NSCLC-soluja ei joko käsitelty, käsiteltiin 100 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF), 100 nM DAMGO, morfiinin tai fentanyylin tai 100 ng /ml insuliinia kasvutekijän (IGF) 96 tunnin ajan, solulysaateista saatu ja immunoblotattiin EMT markkereita anti-vimentiinista (a), anti-Snail (b), anti-Slug (c), anti-klaudiini-1 (d), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) ja anti-aktiini (g) vasta-aineita. Väheneminen vimentiinista, Snail ja Slug ilmaisun ja lisätä klaudiini-1 ja ZO-1 ilmentymisen viittaavat esto epiteelin mesenkymaalitransitioon. Paneeli D: Ohjaus shRNA tai MOR shRNA H358 solulinjoja, solulysaateista saatu ja immunoblotattu EMT markkereita anti-vimentiinista (a), anti-Snail (b), anti-Slug (c), anti-klaudiini-1 (d ), anti-ZO-1 (e), anti-MOR (f) ja anti-aktiini (g) vasta-aineita. Nostamalla vimentiinista, Snail ja Slug ilmaisun ja lasku klaudiini-1 ja ZO-1 ilmentymisen viittaavat epiteelin mesenkymaalitransitioon.

Kun otetaan huomioon nämä H358 ihmisen NSCLC-solut ilmentävät pohjapinta tasoja MOR ja vastata opioidihoitoa, me tutki hiljentäminen (shRNA) Mor vaikuttaisi opioidien ja kasvutekijän aiheuttamaa EMT. Kuva 6-D osoittaa MOR hiljentämisen estää opioidi ja EGF /IGF aiheuttamiin muutoksiin EMT merkki ilme. Kuva 7-A osoittaa, että H358-solut kasvavat pesäkkeitä hyvin rajatut rajoja ja vahva solu-solu kiinnikkeistä. Sen sijaan, morfiinia tai IGF-käsiteltyjen H358-soluissa osoittaa tappiota solu-solu-kiinnikkeistä ja muutos cuboidal pitkänomaiseen fenotyyppi, jossa on useita solun ennusteiden näkyvissä. Nämä muutokset ovat yhdenmukaisia ​​epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT).

Paneeli A: H358 ihmisen NSCLC-soluja joko hoidettu (kontrolli), hoidettiin 100 nm morfiinin tai 100 ng /ml insuliinia kasvutekijän (IGF) varten 96 tuntia ja brightfield kuvat saatiin (20 x). H358-solut kasvavat pesäkkeitä hyvin rajatut rajoja ja vahva solu-solu kiinnikkeistä. Sen sijaan, morfiinia tai IGF-käsiteltyjen H358-soluissa osoittaa tappiota solu-solu-kiinnikkeistä ja muutos cuboidal pitkänomaiseen fenotyyppi, jossa on useita solun ennusteiden näkyvissä. Nämä muutokset ovat yhdenmukaisia ​​epiteelin mesenkymaalitransitioon (EMT). Paneeli B: H358 ihmisen NSCLC-soluja ei joko käsitelty, käsiteltiin 100 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF), 100 nM DAMGO, morfiinin tai fentanyylin tai 100 ng /ml insuliinia kasvutekijän (IGF) 96 tuntia tai ilman esikäsittelyn reuna MOR antagonisti, metyylinaltreksoni (MNTX, 100 nM), Src-inhibiittori PP2 (100 nM) tai STAT3 estäjän Stattic (10 uM). Solulysaatit saatiin sitten ja immunoblotattu EMT markkereita anti-vimentiinista (a, c, e) tai anti-klaudiini-1 (b, d, f) vasta-aineita. Lisääntyminen vimentiinista ilmaisun ja lasku klaudiini-1 ilmentymisen viittaavat epiteelin mesenkymaalitransitioon.

Seuraava tarkasteltiin mahdollisten signaalitransduktion proteiineja, jotka voisivat mahdollisesti säätelevät opioidien ja kasvutekijän aiheuttamaa EMT. Kuvio 7-B osoittaa esikäsittelyn reuna MOR antagonisti, metyylinaltreksoni (MNTX), Src-inhibiittori PP2 tai STAT3-inhibiittori Stattic kääntää opioidien ja kasvutekijän aiheuttamat muutokset vimentiinista ja klaudiini-1 ilmentymisen. Lisäksi, kuviossa 8 osoittaa, siRNA ja /tai kemiallisten esto MOR, Gab-1, Src, PI3K, Akt ja STAT3 dramaattisesti estää EMT (määritettynä inhibition opioidien ja kasvutekijän indusoima lisääntyminen vimentiinista ilmaisun ja lasku claudin- 1 lauseke). Sekä MNTX ja MOR estäjän naloksonia vaimennettu opioidien ja kasvutekijän aiheuttamaa EMT osoitus yleinen vaikutus MOR antagonistien tähän prosessiin (kuviot 7 ja 8 ja asiaa tukevat tiedot, kuva S1). Yhdessä meidän tiedot viittaavat MOR on keskeinen rooli prosesseissa jakaantumiseen, kulkeutumiseen ja epiteelin mesenkymaalitransitioon yksin ja yhdessä opioidien ja kasvutekijöiden.

Paneeli A: Graafinen esitys% valvonnan vimentiinista ilme. H358 ihmisen NSCLC-soluja ei joko käsitelty, käsiteltiin 100 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF), 100 nM DAMGO, morfiinin tai fentanyylin tai 100 ng /ml insuliinia kasvutekijän (IGF) 96 tuntia tai ilman solujen esikäsittely kanssa perifeerinen MOR antagonisti, metyylinaltreksoni (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, The PI3 inhibiittori LY294002 (10 uM), Akt Inhibitor X (5 uM), Src-inhibiittori PP2 (100 nM ) tai STAT3 estäjän Stattic (10 uM). Solulysaatteja saatiin sitten ja immunoblotattu EMT merkki anti-vimentiinista vasta-aine. Kokeet toistettiin kolmena kappaleena ja immunoreaktiivisia nauhat analysoitiin käyttämällä tietokoneavusteista densitometria. On tilastollisesti merkitsevä ero (p 0,05 merkitty tähdellä (*)) välillä ohjaus ja Hoitoryhmien virhejanat = keskihajonta. Nostamalla vimentiinista ilmaisu on viittaavia epiteelin mesenkymaalitransitioon. Paneeli B: graafinen esitys% kontrolli klaudiini-1 ilme. H358 ihmisen NSCLC-soluja ei joko käsitelty, käsiteltiin 100 ng /ml epidermaalista kasvutekijää (EGF), 100 nM DAMGO, morfiinin tai fentanyylin tai 100 ng /ml insuliinia kasvutekijän (IGF) 96 tuntia tai ilman solujen esikäsittely kanssa perifeerinen MOR antagonisti, metyylinaltreksoni (MNTX, 100 nM), MOR siRNA, Gab-1 siRNA, Src siRNA, The PI3 inhibiittori LY294002 (10 uM), Akt Inhibitor X (5 uM), Src-inhibiittori PP2 (100 nM ) tai STAT3 estäjän Stattic (10 uM). Solulysaatit saatiin sitten ja immunoblotattu EMT-markkerin anti-klaudiini-1-vasta-aine. Kolmen erillisen kokeen per ehto tehtiin ja immunoreaktiivisia nauhat analysoitiin käyttämällä tietokoneavusteista densitometria. On tilastollisesti merkitsevä ero (p 0,05 merkitty tähdellä (*)) välillä ohjaus ja Hoitoryhmien virhejanat = keskihajonta. Väheneminen klaudiini-1 ilme on viittaavia epiteelin mesenkymaalitransitioon.

Keskustelu

NSCLC, jonka osuus -80% kaikista keuhkosyövässä, on sairaus, jossa korkea kuolleisuus ja muutaman hoitovaihtoehtoja [44], [45]. Olemme aiemmin raportoitu, että MOR ylössäädellään keuhkokudoksessa potilaiden NSCLC [12] ja että yliekspressio MOR edistää kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden ihmisen NSCLC ksenograftimalleissa [13].