Krooninen sairaus

tiivistelmä

Eturauhasen syöpä on yleisin syöpä miehillä harvoja, mitattavissa, biomarkkerit. Eturauhassyöpä biomarkkereiden löytö on haitannut vuoksi subjektiivista analyysiä proteiinin ilmentymistä kudosleikkeiden. Puolueeton, kvantitatiivinen immunohistokemiallinen lähestymistapa ehdolla tähän, diagnosointiin ja kerrostuminen eturauhassyövän voisi ratkaista tämä ongelma. Vasta-aineita neljä proteiineja BTF3, HINT1, NDRG1 ja ODC1 käytettiin eturauhasen kudoksen array ( 500 yksittäisen kudoksen porausnäytteistä 82 potilasta, 41 tapauksessa paria sovitettu yhdelle potilaalle kummassakin pari oli biokemiallisten uusiutuminen). Proteiinin ilmentyminen, määrällisesti puolueettomasti käyttämällä automaattista analyysiä protokollaa ImageJ ohjelmisto, korotettiin pahanlaatuinen vs ei-pahanlaatuinen eturauhasen (2-2,5-kertaiseksi, p 0,0001). Käyttöominaisuudet osoittavat herkkyyttä välillä 0,68-0,74; yhdistelmä merkkiaineiden logistiikkaregressiomallin osoittaa edelleen parantaa diagnostisen voima. Triple-leimattua immunofluoresenssilla (BTF3, HINT1 ja NDRG1) kudokseen array osoittivat merkittävää (p 0,02) muutos kolokalisaation kertoimia BTF3 ja NDRG1 koekspressoimalla biokemiallisten uusiutuminen vs ei-uusiutumisen syöpä epiteelin. BTF3, HINT1, NDRG1 ja ODC1 voitaisiin kehittää epiteelin erityisiä biomarkkereita kudoksessa diagnosointiin ja kerrostuminen eturauhasen syöpä.

Citation: Symes AJ, Eilertsen M, Millar M, Nariculam J, Freeman A, Notara M, et al. (2013) kvantitatiivinen analyysi BTF3, HINT1, NDRG1 ja ODC1 Protein Yli-ilmentäminen ihmisen eturauhassyöpä Tissue. PLoS ONE 8 (12): e84295. doi: 10,1371 /journal.pone.0084295

Editor: Domenico Coppola, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 elokuu 2013; Hyväksytty 13 marraskuuta 2013 Julkaistu: 27 joulukuu 2013

Copyright: © 2013 Symes et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus rahoittivat Eturauhassyöpä tutkimuskeskuksen hyväntekeväisyyteen ja Pietarinkirkon Trust. Kirjoittajat ovat kiitollisia Mike Millar, Sheila MacPherson ja Nancy Evans Edinburghin yliopiston apua värjäystä ja Daniel Ciantar, UCL Huygens ohjelmistojen käyttöön. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhasen karsinooma on sairaus epiteelin, yleisin syöpä miehillä ja aiheuttaa huomattavaa sairastuvuutta ja kuolleisuutta [1]. Vuosittain yli 30000 miehet ovat diagnosoitu eturauhassyöpä ja yli 10000 kuolee tautiin Isossa-Britanniassa. Vuonna 2010 217730 uutta tapausta eturauhassyövän diagnosoitiin Yhdysvalloissa, jossa 32050 amerikkalainen miehet kuolevat tautiin [2].

Diagnoosi ja ennusteen eturauhassyövän perustuu kudosmorfologia biopsioista (~ 1 miljoona menettelyjä Yhdysvalloissa ja ~ 70000 UK /vuosi). Ensimmäisen kerran koepaloja tunnistaa syövän 38% tapauksista taas epäselvä diagnoosi tai vääriä negatiivisia muodostavat ~ 25-30% tapauksista [3]. Kuvaajat aggressiivisuus (esim Gleason grade) määrittää syövän hallintaan ja hoitoon, mutta on merkittäviä haittoja ja korkea varianssi, erityisesti huono laatu syöpiä. Immunohistokemiallinen (IHC) käytetään ratkaisemisessa moniselitteisiä diagnoosi, mutta useimmat IHC biomarkkerit on tunnistettu käyttäen subjektiivinen (pisteytys) analyysi käyttöön suuri vaihtelu [4]. Uruille rajoittunut tauti eturauhasen koepalan yhä merkittävä kliininen työkalu on kuitenkin olemassa tarve ratkaista väärien negatiivisten ja tarkentaa diagnoosin. Tunnistamalla syöpiä, jotka ovat hyvää ennustetta yli-hoitoa voidaan vähentää, mutta ei ole määrällisiä proteiinimarkkereita laadun parantamiseksi diagnoosin. Monistettavissa, määrällinen lähestymistapa helpottaisi huomattavasti tätä prosessia.

Discovery IHC markkereita, pitkälti, ja niiden analyysi, suoritetaan semi kvantitatiivisia lähestymistapoja (esim pisteytystä kudosleikkeiden värjätään kromo- tai fluorofori) suurten välisten tarkkailija virheet [4,5]. Pisteytys voimakkuudesta kromofori (tai fluoroforin) liittyy silmämääräinen tarkastus seuraa pisteet ennalta määrätyllä alueella, jonka kokeen. Lähestymistapa perustuu visuaalisen tarkkailun kuviollinen esineitä, kuten nisäkkään kudosta, jossa on erillinen arkkitehtuuri, tai visuaalinen assesment of intensiteetti valomerkin tehty IHC pisteytyksen, merkitsee Vaikeaa rajoituksia käsitys valaistusvoimakkuutta ja tuomion, yleensä [6] ja arvioitavaksi eturauhasen syöpä, erityisesti [7]. Lisäksi haittana subjektiivista pisteytys lähestymistapa on, että valinta kohdeproteiinien on tutkittava hakeutuu kohti ääripäät (joko ilmentyy suuresti syövän (esim EZH) tai poissa syövän (esim sytokeratiineja 5 ja 6). Tämä merkitsee sitä, että suuri useita merkittäviä biologisia muutoksia, jotka väistämättä tapahtuvat näiden ääripäiden ei kyytiin eikä sitä voida käyttää mekanismien ymmärtämistä syövän tai kehitetään biomarkkereita diagnoosin, tai kerrostuminen tai prognoosi syövän. Quantitative IHC [8] voidaan tunnistaa uusien biomarkkereiden puolueettomasti, toistettavalla tavalla, ja yhdessä fluoresoivien koettimien voisi olla hyödyllistä, että jälkimmäinen. on todennäköistä, että ei vain ilmaisua vaan kolokalisaation kahden tai useamman proteiinit voivat myös muuttua seurauksena tauti tai hoito [9, 10]. edellytyksenä varten taudin ennusteen perusteella molekyylien sijaan morfologiset kriteerit edellyttää myös vahvaa ja toistettavissa oleva toteaminen proteiinin ilmentymisen IHC kohdat, jotka voisivat seurata määrällisesti kolokalisaation muutoksia immunofluoresenssilla [10].

Aikaisemmassa tutkimuksessa kehitimme puoliautomaattinen, kvantitatiivinen tapa mitata ilmentymisen Wnt5A eturauhaskudoksessa [8] on eturauhasen kudoksen array ( 500 kudos porausnäytteistä 82 potilasta, 41 tapauksessa paria Hyväksytty yhdellä potilaalla kussakin parissa oli biokemiallisten uusiutuminen). Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia palkata määrälliset IHC lähestymistapa arvioida, tätä menetelmää voitaisiin käyttää tunnistamaan otaksuttu syövän markkereita diagnostisiin tarkoituksiin. Valitsimme neljä geenejä BTF3, NDRG1, HINT1 ja ODC1 joita säädellään ylöspäin prostatakarsinoomassa (oncomine.org; valintakriteerit: p = 0,0001, 2 kertainen muutos ja top 10% geenien yli-ilmaistu yleinen aineisto) in vähintään neljä normaalia vs syöpä eturauhasen geeniekspressioanalyysissä aineistot [11-14]. Käytimme määrällinen immunohistokemia [8] osoittaa, että ilmaus BTF3, HINT1, NDRG1 ja ODC1 proteiinien lisääntyy eturauhassyöpäkudoksen ja voisi toimia otaksuttu tavoitteet tutkinnan syövän tai biomarkkereita taudin. Sitten palveluksessa kvantitatiivisen immunofluoresenssilla lähestymistapa ositusta eturauhaissyöpää kolokalisaation kertoimet BTF3, HINT1 ja NDRG1.

Tulokset

kvantitatiivinen immunohistokemiallinen analyysi proteiinien yli-ilmentynyt eturauhassyöpäkudoksen

Expression of BTF3, HINT1, NDRG1 ja ODC1 oli suurelta osin epiteeli- ja lisääntynyt pahanlaatuisten verrattuna hyvänlaatuisia tai ei-pahanlaatuinen eturauhas- ytimet (kuvio 1). Kvantitoimme harmaasävy- DAB-etiketti (kuva 1 ja kuva S1), puolueettomasti, käyttämällä toistettavissa, puoliautomaattista partikkelianalyysimallia (Analysoi hiukkaset) protokolla [8] avulla harmaasävykuvat värjättyä kudosta yli 450-500 yksittäisiä eturauhasen kudosta sydämiä kunkin biomarker (kuva 2). Laskelmat kokonaispinta-alasta ja alueen osa on esitetty taulukossa 1. integrointi AUC paljasti lisääntyminen ilmaus BTF3, HINT1, NDRG1 ja ODC1 pahanlaatuisissa ytimiä, diagnosoitu histopatologisesti, verrattuna ei-pahanlaatuinen ytimet (p 0,0001, Mann Whitney U-testi). Nämä tulokset tunnistaa BTF3, HINT1, NDRG1 ja ODC1 kuten proteiinit, jotka ovat yli-ilmentynyt eturauhasen syöpä.

(yli 500 kudoksen ytimet värjättiin kullekin vasta-aineelle) ihmisen eturauhasen taulukot. Nämä ovat edustajia yli 450-500 kudoksen ydin kuvat analysoitiin kullekin biomarkkerin vasta-käyttäen automatisoitua kuva-analyysi-protokollan (katso materiaalit ja menetelmät – Image partikkelianalyysimallia). Jokainen ydin kuvioitiin käyttämällä Leica pystyssä mikroskooppi (10x) ja tallentaa jpg-tiedosto. Jokainen kuva käytettiin laskemiseen proteiinin ilmentymisen (DAB etiketti, ruskea, pitkälti rakkulasoluissa). Värilliset RGB-kuvat (A-H) muutettiin vastaaviin harmaasävykuvat (I-P) kvantifiointiin DAB-signaalin avulla Analysoi Particle protokollan ImageJ ohjelmisto saada Yhteensä Area värjätään, vuonna pikselin. Proteiinin ilmaus BTF3, HINT1, NDRG1 ja ODC1 nostettiin pahanlaatuisten v hyvänlaatuista ytimet (p 0,0001).

Puolueeton, automatisoitu protokollaa käytettiin laskemiseen Kokonaispinta-ala värjätty (pixel) standardoitu määrä kudosta kussakin ytimessä (katso menetelmät). TA muunnetaan Area Fraction (kokonaispinta-ala jaettuna kuvan pikselien). Jokainen bin on tietoja yksittäisen, pahanlaatuinen (punainen) tai ei-pahanlaatuinen kudos (vihreä) ydin. On huomattava kasvu AUC-proteiinin ilmentymisen pahanlaatuinen v hyvänlaatuisen eturauhasen kudoksen (p 0,0001).

Protein

kunto (

n

) B Pinta-ala

Area Fraktio

*

kertaisti

BTF3Benign ( 236) 22301 ± 16971,66 ± 0.12Malignant (228) 54750 ± 35884,09 ± 0,27

2.5HINT1Benign (214) 28564 ± 18822,13 ± 0.14Malignant (225) 67173 ± 39774,93 ± 0.292.3NDRG1Benign (230) 27752 ± 18752,07 ± 0.14Malignant ( 223) 72297 ± 43805,4 ± 0.332.6ODC1Benign (261) 38621 ± 41842,80 ± 0.31Malignant (243) 65428 ± 53894,88 ± 0.41.8Table 1. kvantitointi proteiinin ilmentymistä pahanlaatuiset ja ei-pahanlaatuiset ihmisen eturauhasessa arryas avulla ImageJ ohjelmistoa.

DAB etiketti, joka edustaa proteiinin ilmaus BTF3, HINT1, NDRG1 ja ODC1 kvantitoitiin puolueettomasti, käyttämällä toistettavissa, puoliautomaattista partikkelianalyysimallia (Analysoi hiukkaset) protokollan ImageJ ohjelmisto. Yli 500 yksittäistä eturauhasessa ytimet (katso menetelmät) RGB-kuvat muunnettiin 16-bittinen harmaasävy. Tulokset ovat keskiarvoja ± SE laskettua parametrien kokonaisala ja ala jae. Näitä tietoja standardoitu määrä kudosta jokaiseen ytimeen käyttämällä käänteistä protokollaa ImageJ (katso menetelmät). Kertainen ekspression lisääntymisen proteiinin pahanlaatuisten verrattuna ei-pahanlaatuinen (hyvänlaatuinen) ytimet vahvistettiin AUC laskelmiin tietojen Kuva 2. (n) = lukumäärä käyttökelpoisia sydämiä mukaan analyysiin.

*

Tilastollinen analyysi: lauseke, sillä kaikki proteiinit, on merkittävästi erilainen pahanlaatuinen verrattuna ei-pahanlaatuinen eturauhas- P 0,0001 käyttäen Mann Whitneyn U-testi. CSV Lataa CSV

tutkimiseksi hyödyllisyys proteiinien putatiivisiksi biomarkkereita eturauhassyövän diagnoosia, laskimme todellisen positiivisten määrä (herkkyys) ja väärien positiivisten määrä (1-spesifisyys) ROC-käyrän (kuva 3). Alueella jae data muuttui probit ja varustettu Gaussin funktio. AUC-arvot 1,0 ROC käyrä edustaa korkea selektiivisyys ja herkkyys, kun taas 0,5 viittaa siihen, että testattujen markkeri ei pysty erottamaan ei-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen luokkia. Piste käyrät muunnetulle datalle on esitetty kuviossa S2. Herkkyys ja 1-spesifisyys laskettiin alueen osa-arvot NDRG1, BTF3, HINT1 ja ODC1 (taulukko S1). Kiinteä kynnysarvo (kriteerit ) arvot luulotellun biomarkkereita diagnoosin välillä 0,68 ja 0,74 (taulukko S1), mikä osoittaa korkea herkkyys NDRG1, BTF3 ja HINT1, kuten diagnostisia markkereita tunnistamiseksi eturauhassyövän kudoksen ytimiä puolueeton, kvantitatiivinen immunohistokemia. Positiivinen todennäköisyys suhde (LR +) kunkin biomarkkerin nimetyssä kriteerit (taulukko S1) vaihteli 1,7-2,4. Todennäköisyys suhde on suurempi kuin 1 osoittaa, että tulos liittyy taudin esiintyminen [15]. NDRG1, BTF3 ja HINT1 osoitti myös LR + of 10 eri kriteerejä katkaista pistettä; LR + s yli 10, diagnostista testiä, katsotaan tarjoavan vahvaa näyttöä hallitsemaan sairauden [15,16]. Diagnostinen teho tehostettiin liittämällä tietoja kahdesta biomarkkerit osaksi logistiikkaregressiomallin (taulukko 2). Gleason laadut 4 + 3 ja 3 + 4 koostuu 80% pahanlaatuisten kudosnäytteiden puettu kudoksen array (välillä 221-241 kudoksen ytimet, katso taulukko S2). Ei ollut merkittävää eroa ilmaisun neljästä biomarkkereita, kun erillisiä analysoitavaksi perustuvat Gleason asteen (4 + 3 ja 3 + 4, kuva S3).

ROC-käyrä osoittaa erotteleva suorituskyky proteiinin ilmentymistä eriyttäminen pahanlaatuinen ja ei-pahanlaatuinen kudos ydintä käyttäen alueella jae (probit) tiedot BTF3, HINT1, NDRG1 ja ODC1. Lennosta ominaisarvot on esitetty taulukossa S1. Kiinteä viiva edustaa ROC-alueella 0,5.

proteiini-yhdistelmä

% tapauksista oikein identfied *

BTF 3 ja HINT172BTF3 ja NDRG178BTF3 ja ODC193HINT1 ja NDRG181HINT1 ja ODC185NDRG1 ja ODC197Table 2. Logistinen regressiomalli tunnistaa yhdistelmä markkereita, jotka voivat parantaa diagnostista tehoa.

logistiikkaregressiomallin käytettiin käyttäen MedCalc ohjelmistoa analysoida suhdetta yksi dikotominen riippuva muuttuja (ei-pahanlaatuinen v pahanlaatuinen) ja yhden tai useamman riippumattoman muuttujat (kaksi biomarkkerit). Lopputulos (Tapauksia tunnistettu oikein) ehdottaa, että saman kohortin näytteiden Tässä tutkimuksessa käytetyt, diagnostinen teho tunnistaa pahanlaatuinen tapauksissa lisääntyy yhdistelmällä BTF3 ja ODC1 ja NDRG1 ja ODC1. * Merkitys kokonaistaso mallin soveltuvan analyysin kaikkien yhdistelmien on p 0,0001. CSV Lataa CSV

Disease kerrostuminen käyttämällä useita markkereita ja immunofluoresenssivärjäyksen

On arvioitu, että noin 30% potilaista, joille tehdään eturauhasen kliinisesti paikallinen tauti kokevat biokemialliset uusiutumisen (määritelty havaittavissa PSA ≥ 0,2 ng ml

-1 2 vuoden kuluessa leikkauksesta). Kohortin potilaista käyttää kudoksen array tässä tutkimuksessa, olivat olleet biokemiallisten uusiutuminen [17]. Oletimme, että ei vain muutos ilmaus mutta myös kolokalisaation tunnistettujen biomarkkereita muutokset eturauhassyövän epiteelissä. Tämä tutkittiin multi-leimattu immunofluoresenssivärjäyksen käyttäen BTF3, HINT1 ja NDRG1 vasta-aineita (kuvio 4). 3 proteiinit ilmentyvät differentiaalisesti ei-pahanlaatuinen (kuvio 4A) verrattuna pahanlaatuinen (kuvio 4B) ytimet ja sen havaittiin olevan suurelta osin eturauhasen epiteelin, joka vahvistaa tiedot yksittäiset vasta-aineet värjäystä käyttämällä 3,3-diaminobentsidiiniä-piparjuuriperoksidaasi ( DAB-HRP, kuvio S1 ja kuvio 1). Nämä tulokset osoittavat, paitsi että ilmentymistä näiden proteiinien biomarkkereita, yksittäin, on kasvanut eturauhassyövässä (kuvio 2), mutta ilmaisu on suurelta osin epiteeli- ja siten spesifinen sairaus (kuvio 4).

ilmentäminen rinnakkain kolmen proteiinin BTF3 (FITC-vihreä), HINT1 (Cy3- sininen) ja NDRG1 (Cy5-punainen) ei-pahanlaatuinen (A) ja pahanlaatuinen eturauhasessa ytimet (B); kuvat ovat edustavia kudosta ytimiä kudoksesta array yli 200 näytettä. Kolme vasta inkuboitiin samanaikaisesti ja merkitty kolme Cy5 -punainen eri fluoroforeilla käyttäen Bond automatisoitua värjäystä järjestelmään. Koko kudoksen ytimet kuvattiin käyttäen Leica konfokaali järjestelmä ja 4×4 laatoitus täsmälleen samat asetukset vertailuun. Kuvat otettiin zoomataan 3x digitaalisella zoom ImageJ. Asteikko bar = 100 pm.

kolokalisaation BTF3, HINT1 ja NDRG1 oli ensi tutkittu usean leimattu immunofluoresenssilla kudosta porausnäytteistä uusiutuneen ja ei-uusiutunut potilaita komposiitti loisteputki kuvia (kuvio 5; BTF3, HINT1 ja NDRG1, vihreä, sininen ja punainen, vastaavasti), jotta määritetään tämän menettelyn hyödyllisyyden eturauhassyövän kerrostumista. On ilmeistä ja mitattavissa rakenteen muutos värjäytymisen näiden proteiinien biomarkkereita biokemiallisten uusiutuminen kudoksen ytimet: BTF3 ilme näkyy vähemmän uusiutunut, verrattuna ei-uusiutunutta näytteistä, kun taas HINT1 ja NDRG1 ekspressio näyttää hallitseva uusiutunutta kudosnäytteistä (edustaja kudos porausnäytteistä biokemiallisten uusiutuminen ja verrokeilla on esitetty kuvassa 5A ja B); kvantitatiivinen rinnakkaispaikantumisen analyysi korkean suurennuksen dekonvuloidaan kuvia (kuvio 5C ja D) osoittivat, että suurin osa havaittavaa muutosta rakenteessa ilmaisun, usean leimattu kudosleikkeiden ulkopuolisissa uusiutunut vs uusiutunut näytteitä, oli muutoksen vuoksi yhteistyössä ilmaisun of BTF3 (fluoreseiini-isotiosyanaatti, FITC, vihreä) ja HINT1 (syaniini 3, Cy3, sininen). Laskettu Pearson kertoimet rinnakkaispaikantumisen ei-uusiutumisen vs uusiutumisen olivat 0,73 ± 0,02 vs. 0,60 ± 0,07 (keskiarvoja ± SD, n = 4, merkitys ero p 0,02). Quantitative kolokalisaation osoittaa, että multi-merkinnät lähestymistapaa voitaisiin käyttää kerrostuneisuus eturauhassyövän kudoksen sydämiä.

ilmentäminen rinnakkain kolmen proteiinin BTF3 (FITC-vihreä), HINT1 (Cy3- sininen) ja NDRG1 (Cy5 -punainen) in pahanlaatuinen eturauhas- kudoksen ytimet (A-D). Composite micrographs immunofluorescently värjättyä eturauhasessa ytimet sairastavien potilaiden biokemiallinen uusiutumisen (määritelty PSA ≥ 0,2 ng /ml 2 vuoden kuluessa eturauhasen). Tissue porausnäytteistä 4 potilaalla (pareittain varten Gleason ja PSA), ei-uusiutunut (A) ja biokemialliset uusiutumisen (B) edustavat kuvat käytettiin kvantitatiivista kolokalisaation analyysi (katso menetelmät) esitetään. Kuvaus suoritettiin käyttämällä Leica -konfokaalimikroskoopilla; A ja B ovat pieni suurennus; C ja D suurennettuna; E on esimerkki ekspression kolme merkkiä ei-pahanlaatuinen kudos myös suurennettuna. Ilmentyminen BTF3 (vihreä), esimerkiksi näkyy ei-uusiutunut näytteistä kun se ei ole kovin ilmeistä porausnäytteistä uusiutunut potilaista. Kuvaus suoritettiin käyttämällä Olympus -konfokaalimikroskoopilla (40x laatoitettu (A ja B) tai 40x digitaalinen zoom 3,5-4 (C, D ja E). Voimakas suurennos kuvia (C, D ja E) on deconvolved käyttäen Huygens Ammatti ohjelmistoa. 16bit tif tiedostot jokaiselle fluoroforin (FITC, Cy3 ja Cy5) tuotiin ImageJ ja pseudo värillinen (FITC, vihreä, Cy3, sininen ja Cy5, punainen). Z-ennusteet jopa 27 kuvaa näkyvät kunkin kudoksen ydin. Mittakaava = 100gm A ja B ja 20 pm C ja D. kvantitatiivinen rinnakkaispaikantumisen analyysi kuvien (esim kuvio 5C ja D) osoitti, että merkittävin muutos rakenteessa ilmaisun, ei-uusiutunut vs uusiutunut näytteitä, johtui muutoksesta koekspressoimalla BTF3 (FITC, vihreä) ja HINT1 (Cy3, sininen) Pearson kertoimia rinnakkaispaikantumisen ei-uusiutumisen vs uusiutumisen = 0,73 ± 0,02 vs. 0,60 ± 0,07 (keskiarvoja ± SD, n = 4, merkitys ero p 0,02).

keskustelu

käyttämällä globaalin geeniekspressioanalyysissä, valtavaa edistystä on tapahtunut tunnistamisessa säädeltyyn geenien eturauhassyöpä viime vuosikymmenen aikana. Mikä on puuttunut on käännös näiden geenien kliinisesti käyttökelpoinen biomarkkereita diagnosointiin ja kerrostuminen taudin. Ihmisen eturauhasen oli yksi ensimmäisistä kudosten tutkittava maailmanlaajuisia muutoksia geenien ilmentyminen in tauti lähes vuosikymmen sitten. Muuten, hyväksymään uusia merkkiaineita Food and Drug Administration, USA, erityisesti proteiinimarkkereita, on vähentynyt viime vuosikymmenen aikana. Tämä väheneminen voi johtua kolme suurta ongelmaa tunnistamisessa ja kehittämisessä kudosten pohjainen proteiini biomarkkereita diagnoosi ja ennusteen eturauhassyövän: 1. Puute erityisyyttä, eli ei epiteelin erityisiä (paikalle aloittamisesta sairauden) 2. Lack puolueettoman, automatisoitu, kvantitatiivinen analyysi proteiinin ilmentymisen jotka voivat tunnistaa vankka, reprdoucible tiedot luulotellun biomarkkerit 3. puute määrällisiä, proteomiikka lähestymistapoja varten molekyyliperustan eturauhassyövän ennustetta.

immunohistokemiallinen markkereita voivat olla erittäin käyttökelpoinen ensisijainen tai diagnoosin vahvistamista tueksi histopatologia, mutta koska vaikeudet tunnistamiseen tai validointi [18] vain kourallinen tällaisia ​​markkereita on olemassa. Lisäksi näyttää todennäköiseltä, että histopatologista analyysiä pysyy parraslaitaa eturauhassyövän diagnoosia lyhyellä tai keskipitkällä tulevaisuudessa. Niinpä sen lisäksi, jatkuvasti etsitään tunnistamista ei-invasiivisia biomarkkerit, jotka voitiin havaita kehon nesteiden, on tärkeää pitää hiomaan ja parantamaan immunokemiallinen kudos biomarkkerit, jotka voivat helpottaa diagnoosin, parantaa ennustetta ja antaa hyödyllistä ennakoivaa kerrostuminen eturauhassyöpää. Koska kasvu laskentateho viime vuosikymmenen aikana kaksi teknologiaa ovat kypsyneet, jotka voivat auttaa saavuttamaan nämä tavoitteet. Näistä keskustellaan jäljempänä.

morfologinen analyysi rutiininomaisesti käytetään diagnosoida eturauhassyövän, vaikka IHC käytetään apuna morfologisia diagnoosin, etenkin moniselitteisiä tapauksissa esim. in kudosnäytteitä neulabiopsiat, höyläysleikkaus yksilöitä ja etäpesäkekasvainten näytteitä [19]. Tilannetta hankaloittaa kysymys haittaavat löytämään uusia biomarkkereita diagnosointiin ja sairauksien kerrostuminen eturauhasen (ja muut) syöpä (t) koepalanäytteistä, on ollut niukasti puolueeton, kvantitatiivisia menetelmiä havaita merkittäviä muutoksia IHC kokeita biomarkkereiden tunnistamiseen. On kuitenkin joitakin poikkeuksia tähän lähestymistapaan. Rubin ja työtovereiden [20] kehitetty kvantitatiivinen lähestymistapa tunnistaa α-methylacyl-CoA rasemaasi (AMACR). Alustavat tutkimukset osoittivat lähes yhdenmukainen tämän proteiinin ilmentymisen syöpäkudoksessa vaan myöhempää analyysia ilmaisua havaittiin olevan vähemmän ja, jossa on varaus, tämä proteiini käytetään diagnostisen markkerin.

käsitellä bias ja riippuvuus subjektiivisesta arvioinnista ilmaisun tietyn biomarkkereiden kehitimme menetelmän, vapaa kokeilija harhaa, määrällisesti proteiinin ilmentyminen eturauhassyövässä [8] käyttäen vapaasti saatavilla oleva ohjelmisto [21]. Toisin kuin tavanomaisten, pisteytys menetelmiä (esim. DAB-värjäys) arvioida ilmentymistä kudosmatriisien, meidän lähestymistapamme sallii puolueeton kvantitointiin koko DAB-signaalin. Vaikka määrällisesti yhteensä DAB-signaali ei ehkä ole ihanteellinen, standardoimalla signaalin mittaus ja poistamalla mielivaltaisesti pisteytys tunnistimme BTF3, NDRG1, HINT1 ja ODC1 proteiinin tasot olevan yli-ilmentynyt eturauhassyöpä, määrien ja toistettavasti, vahvistaa geenin yli-ilmentyminen havaita alustavien geeni lista. Käyttöominaisuudet (kuva 3 ja taulukko S1) varten BTF3, HINT1 ja NDRG1 osoittaa AUC 0,71-0,76; AUC 0,7 pidetään hyväksyttävänä diagnostisen markkerin [22] osoittaa, että erikseen, nämä ovat riittäviä biomarkkereita taudin. Diagnostinen teho voidaan edelleen parantaa, kun nämä merkit analysoidaan aggregoiduista diagnostinen teho (taulukko 2). Lisäksi BTF3, NDRG1 ja HINT1, määrällisesti kolokalisaation tutkimukset (kuva 5) pitäisi voida kohdella eri biokemiallisten uusiutuminen ja ei-uusiutumisen eturauhassyöpä. Biomarkkerit tunnistettu tässä, ovat uusia niiden käyttöä diagnosoinnissa ja myös kuvattujen yhdistelmien biokemiallisia uusiutumisen eturauhassyövän. Mahdollisia mekanismeja, joilla näiden oletettujen eturauhassyövän biomarkkerit voivat edistää karsinogeneesiä käsitellään alla.

BTF3 on 27kDa proteiini, joka muodostaa stabiilin kompleksin RNA-polymeraasi II B, jota tarvitaan transkription aloittamisen [23], ja tiedetään olla yli-ilmentää soluissa haiman duktaalikarsinooma sekä

in vitro

ja

in situ

[24]. NDRG1 (aiemmin tunnettu nimellä

Cap43

), stressivastetta geeni, on ollut mukana erilaisissa solujen prosesseissa terveyden ja sairauden. Toisin kuin ilmaus muiden biomarkkerit esitetään tässä, ilmaus NDRG1 on tutkittu eturauhasen kudosta, mutta on kiistelty raportteja, että se on kasvanut [25] ja laski [26] eturauhassyövässä. On kuitenkin tärkeää huomata, että yksikään näistä tutkimuksista palveluksessa puolueetonta tekniikka ja siksi ilmaisu analyysi voi olla syynä näiden erojen.

Olemme aiemmin osoittaneet, että Wnt-signalointireitin tärkeä rooli eturauhassyövän [8,27]. NDRG1 on myös osoitettu vaikuttavan Wnt signalointi ja on

alustavaa

tapauksessa osallistumisen NDRG1 säätelyssä Wnt signaloinnin eturauhassyövän solulinjoissa [28]. NDRG1 geeni on myös ETS-perheen fuusioproteiinin ERG ilmentävä eturauhassyöpä mutta toisin TMPRSS2-ERG ja SCL45A3-ERG fuusioita, vallalla eturauhasen syöpiä, The NDRG1-ERG fuusio ajatellaan koodaavat kimeeristä proteiinia [29]. Tietoa ei ole olemassa koskien NDRG1 proteiinin ilmentyminen eturauhassyövässä; onko havaittu fuusioitua ERG tai ei, NDRG1 voisi olla hyödyllinen proteiinin biomarkkeri eturauhasen syöpä.

HINT1 kuuluu histidiini kolmikko (HIT) perheen ja proteiinikinaasi C: n kanssa vuorovaikutuksessa proteiini [30]. Ei tietoa olemassa HINT1 ilmentymistä tai toimintaa eturauhassyövässä vaikka se voi toimia tuumorisuppressoriproteiinia hiirissä [31]. Vuonna hepatoomasolulinjassa, HINT1 estää aktiivisuus Wnt /SS-kateniinin signalointi ja geenin transkription kautta TCF4 [32]. Olemme osoittaneet aikaisemmin, että on olemassa suppressio ß-kateniinin /TCF4 välitteistä geenin transkription TCF4 transkription tavoitteet [8]. On houkuttelevaa spekuloida, että HINT1 voivat edistää esto Wnt /SS-kateniinin signalointi eturauhassyövässä [8].

L-ornitiinidekarboksylaasia 1 (ODC1) on entsyymi polyamiini synteesireitti [33] avaintekijä normaalissa solujen lisääntymisen ja neoplastisen kasvun. ODC1 on tunnistettu geneettinen markkeri paksusuolen syöpä [34] ja yli-ilmentyminen ODC1 on yhdistetty suuri riski varhaishermosolukasvaimesta [35] ja peräsuolen ja rintasyöpiä [36]. Nämä tiedot korreloivat

in vivo

kokeissa ODC1 knock-out hiiristä, joita kehittyi vähemmän kasvaimia vastauksena erilaisiin karsinogeeninen promoottoreita mukaisesti alennettu geenikopiomäärä [37].

Tuloksemme viittaavat siihen, että käyttämällä puolueetonta, kvantitatiivinen lähestymistapa tunnistaa epiteelin erityisiä biomarkkereita yhdistettynä immunofluoresenssilla voivat osoittautua hyödyllisiksi diagnosointiin, kerrostuminen ja ennusteen eturauhasen syöpä.

Materiaalit ja menetelmät

eturauhasessa array

Patient valinta, sairauden tila ja rakentaminen yksityiskohdat kudosblokeista annetaan muualla [8,17]. Lyhyesti, kudosblokeista rakennettiin käyttäen arkistointia formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotetut eturauhasen yksilöitä 82 potilaalla on patologinen vaiheessa PT3A tai b ja ennen leikkausta PSA vaiheessa 3. 41 tapauksessa paria sovitettiin seuraaviin ryhmiin: patologinen vaiheessa, Gleason laatu ja ennen leikkausta eturauhasen antigeenin (PSA) pitoisuus. Yksi potilas kussakin parissa oli biokemiallisten uusiutuminen (määritelty PSA ≥ 0,2 ng ml-1 2 vuoden kuluessa leikkausta) ja toinen jäi biokemiallisesti tautivapaita (määritellään havaita PSA vähintään 3 vuoden kuluttua leikkauksesta). Ytimet diagnosoitiin (hyvänlaatuinen tai ei-pahanlaatuinen ja pahanlaatuinen) ja leimaa patologi ja 5-6μm osat leikattiin kudosmatriisien pinnoitetulle dioja. Poistaa bias, kokeilijat sokeita värjäystä, kuvantaminen ja analyysi, jossa jälkimmäinen automatisoitu (katso alla). Kliiniset tiedot kudosnäytteitä käytetty on esitetty taulukossa S2 ja [17]; patologit sijoitettiin suurin osa näytteistä ( 80%) Gleason asteen 4 + 3 ja 3 + 4. Näyte koon laskenta tehtiin erotella yli-ilmentyminen käyttäen DAB-IHC; Näytteen koko proteiinin ekspressio laskettiin ennen rakentamista kudoksen array (jossa on α ja ß 0,05 ja odotettu ero 2,5 taittuu välineiden välillä pahanlaatuisten ja ei-pahanlaatuisten näytteitä on 41 potilasta ryhmää kohti).

eettisen hyväksynnän

Eettinen hyväksyntä antoivat yhteisen UCL /UCLH komiteoiden etiikkaa ihmisen tutkimusta. Tarkastelu lauta (RB) luvan käyttää ihmiskudoksen eturauhassyövän tutkimukseen, noudattaen kansainvälisen komitean yhdenmukaistaminen hyvän kliinisen (ICH GCP). Kudosten array rakentaminen näytteet anonymisoidaan aikana rakentamisen kudosmatriisien [17] ja käytetään erilaisiin Immunohistokemiallisten tutkimusten projektissa hyväksymän UCL /UCLH eettinen komitea. RB luopua tarvetta tietoisen suostumuksen koska näytteet käytetään solukon array olivat arkistointia patologisia näytteitä.

3,3-diaminobentsidiinitetrahydrokloraattia-piparjuuriperoksidaasi (DAB-HRP) värjäys

Kaikki värjäytyminen oli suoritettiin käyttäen Bond automaattista järjestelmää [8] mukaan valmistajan protokollia. Tiedot värjäyksen menettelyn IHC käyttäen DAB ja vasta-aineet (BTF3, HINT1, NDRG1 ja ODC1), joita käytetään esitetään Methods S1.

immunofluoresenssi käyttäen 3-vasta-aineiden eturauhasen kudosmatriisien

protokolla immunofluoresenssivärjäyksen oli samanlainen kuin on kuvattu DAB värjäystä, edellä, paitsi että BTF3, HINT1 ja NDRG1 vasta-aineita inkuboitiin samanaikaisesti ja värjättiin FITC, Cy5 ja Cy3 vastaavasti mukaan valmistajan protokollaa. Kuvat otettiin käyttäen Leica 710 -konfokaalimikroskoopilla jota EY Plan-Neofluar (40x) tavoite.

Kuva partikkelianalyysimallia käyttäen ImageJ ohjelmistoa

Puolueeton, toistettavissa, automatisoitu hiukkasten analyysimenetelmä [8] käytettiin määrällisesti DAB-signaali ei-pahanlaatuinen (hyvänlaatuinen) ja pahanlaatuinen ihmisen eturauhasessa sydämiä käyttämällä ImageJ ohjelmistojen [21]. Makrot kirjoitettiin suorittaa seuraava tapahtumasarja varten hankittujen jpeg kuvia: 1. Avaa kuva 2. Muunna 16-bittinen kuva 3. Aseta kynnys 4. Analysoi hiukkasten (koko 0.5- Infinity, kehämäisyys 0,00-1,00) 5. Tallenna kuva 6. Save hiukkanen tiedot (count, kokonaispinta-ala, keskimääräinen koko ja alue murto) excel-taulukon (rsb.info.nih.gov/ij/docs/pdfs/examples.pdf). Yksiköt ovat oletuksena ImageJ asetus (pikseliä). Standardointi määrä kudosta ydintä kohti kvantitoitiin myös käyttämällä käänteisfunktio (EditInvert kuva) in ImageJ kanssa edellä kuvattua protokollaa. Määrälliset DAB-signaali ilmaistaan ​​signaali /määrä kudosta kussakin kudoksessa ydin. Vuokaavio DAB-signaali kvantitoimiseksi on kuvassa S1. Kaikkien testattujen vasta-aineiden ilmentyminen havaittiin olevan suurelta osin epiteeli- ja analyysi rajoitettiin myös epiteelin ilmaisu; asetetun raja parametrit valittiin jälkeen manuaalinen analyysi satunnaisten ytimien myöhemmän kvantitoimiseksi signaalin. Yhtenäinen taulukkolaskenta kaikkien käytettävissä ytimet (välillä 211 ja 260 ydintä) ei-pahanlaatuinen vs pahanlaatuinen vertailua varten eri vasta rakennettiin.