Krooninen sairaus

tiivistelmä

Menetys genominlaajuisten metylaatio on yhteinen piirre syöpä, ja aste hypometylaatio on korreloitu genomin epästabiilisuuden. Global metylaatio toistuvia elementtejä mahdollisesti syntyi puolustusmekanismi vastaan ​​loisten DNA-elementtejä, kuten retrotransposoneja ja viruspatogeeneja. Koska muutokset globaalien metylaation sekä virusinfektion ja syöpä, tutkimme genominlaajuisten metylaatiotasoilla pään ja kaulan levyepiteelisyöpä (HNSCC), syövän syy-yhteydessä ihmisen papilloomavirus (HPV). Me testattiin globaali hypometylaatio tasot 26 HNSCC näytteissä, verrattuna niiden vastaaviin normaaleihin vieruskudos käyttäen pyrosekvensointi perustuvia metylaatio määrityksiä LINE toistoja. Lisäksi tutkimme johdetut solulinjat erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia varten LINE ja SINE (

Alu

) toistuu. Aste LINE ja

Alu

hypometylaatio vaihteli eri syöpäsolun linjat. Oli vain kohtalainen korrelaatio LINE ja

Alu

metylaatiotasoilla, jossa vaihteluvälin metylaatiotasoilla ollessa suurempi LINE elementtejä. LINE hypometylaatio oli selvempi HPV-negatiivisia kuin HPV-positiivisia kasvaimia. Lisäksi genomin epästabiilisuuden, mitattuna genominlaajuisten menettämisestä Heterotsygoottisuuden (LOH) yhden nukleotidin polymorfismi (SNP) analyysi, oli suurempi HNSCC näytteiden selvempi LINE hypometylaatio. Global hypometylaatio oli vaihteleva HNSCC. Sen korrelaatio sekä HPV asema ja aste LOH korvikkeena genomista saattaa heijastua vaihtoehtoisia onkogeenisten väyliä HPV-positiivisten vs. HPV-syöpäkasvain.

Citation: Richards KL, Zhang B, Baggerly KA, Colella S , Lang JC, Schuller DE, et al. (2009) Genome-Wide hypometylaatio pään ja kaulan syöpä on voimakkaampi HPV-syöpäkasvain ja liittyy perimän epävakaisuuden. PLoS ONE 4 (3): e4941. doi: 10,1371 /journal.pone.0004941

Editor: Sebastian D. Fugmann, National Institute on Aging, Yhdysvallat

vastaanotettu: 17 syyskuu 2008; Hyväksytty: 13 helmikuu 2009; Julkaistu 18 maaliskuuta 2009

Copyright: © 2009 Richards et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Kleberg Foundation, Texasin osavaltiossa Tobacco Research Funds, institutionaalisen tutkimus avustusta Texas Tobacco Settlement Funds (University of Texas MD Anderson Cancer Center), ja puolustusministeriön W81XWH-05-2-0027 RK. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

DNA: n metylaatio on epigeneettisestä DNA muutos, joka tapahtuu toiminnan välityksellä DNA metyylitransferaasien CpG- dinukleotideissä. Metyloitua alueet DNA liittyy kromatiinin remodeling, jotka tapahtuvat yleensä alueilla suppeampi chromatin ja laski transkriptioaktiviteettia [1], [2]. Uutta kiinnostusta tähän prosessiin jälkeen syntyneet todettiin, että kahden poikkeava metyloinnin kuviot ovat läsnä syöpäsoluissa [1], [3]. Ensimmäinen on geenispesifisiä hyper-metylaation, jossa CpG-saarilla promoottorialueet geenien skannata lisääntynyt metylaatio, yleensä mikä vähentää ilmentymistä myötävirran geenin. Toinen on genomin laajuinen hypo-metylaatio, suuri osa, joka esiintyy toistuvia DNA-elementtejä. Vuonna maligniteetti, globaali metylaatio usein poikkeavasti vähennetään, kun taas geenispesifiseen metylaatio usein poikkeavasti lisääntynyt. Vaikka vaikutuksia geenispesifisestä hypermetylaation (

esim

, vähentää geenin ilmentymistä, joka on tärkeä kasvulle ohjattu) ovat helposti ymmärretään, vaikutukset vähensi globaaleja metyloinnin ovat epämääräisiä [1], [3].

on oletettu, että DNA: n metylaatio aluksi kehittynyt puolustusmekanismi vastaan ​​virus ja muut DNA taudinaiheuttajia keinona vaientaa vieraiden DNA-sekvenssien [4] – [6]. Tämä on johdonmukaista sen havainnon kanssa, että LINE ja SINE (

Alu

) elementtejä, jotka ovat peräisin siirrettävistä elementeistä, ovat voimakkaasti metyloitu normaaleissa soluissa. Metylointi HPV virusgenomin kun integroitumisen isännän genomiin on raportoitu, ja muutokset metylaation HPV-DNA on liittynyt kasvaimen kehittymisen [7], [8].

Global metylaatio on myös kliinisesti merkittävää, koska osoittaa assosiaatiot kliinisen tuloksen ja maailmanlaajuisesti metylaatiotasoilla useissa syöpätyyppien [9] – [11]. Vuodesta mekanistinen näkökulmasta, maailmanlaajuinen metylaatio näyttää liittyvän syövän etenemisessä, koska menetys globaalin metylaation on taipumus tulla voimakkaampia kuin syövän esiaste edistystä [12], [13]. Lisäksi koolonkarsinoomasoluissa, menetys LINE metylaatio korreloi käänteisesti mikrosatelliittien epävakaus ja korreloi suoraan kromosomi epävakauden [14], [15].

Oletimme, että maailmanlaajuinen metylaatiotasoilla syövän, jota edustaa tasot LINE ja SINE (

Alu

) metylaatio, voidaan korreloida virusinfektio. Me siis tutkittu LINE metylaatio suhteessa HPV asema pään ja kaulan syövät. Toisin kuin kohdunkaulan syöpiä, jotka ovat lähes kaikki HPV-infektio, HNSCC on viruksen välittämää vain osajoukko tapauksista (25-30%) [16]. Voit selvittää vaikutukset virusinfektion maailmanlaajuisten metylaatiotasoilla vuonna HNSCC kehitimme pyrosekvensointi perustuvia metylaatio määrityksissä toistuvaan DNA-elementtejä ja verrattiin HPV-positiivisia HPV-negatiivinen syöpiä. Edelliset julkaisut ovat ehdottaneet, että LINE metylaatio on muuttuja HNSCC, mutta ei löytänyt yhdistyksen välillä HPV-DNA-aseman ja LINE metylaatiotasoilla [17], [18]. Tässä osoitamme, että globaali hypometylaatio on muuttuja HNSCC ja korreloi sekä HPV asema ja perimän epävakaisuuden.

Tulokset

LINE /SINE (

Alu

) määritykset ovat tarkkoja ja toistettavissa , mutta näyttää vain kohtalainen korrelaatiota LINE-1 ja

Alu

metylaatiotasoilla

määrittämään maailmanlaajuinen metylaatiotasoilla, me sopeutimme pyrosekvensointi perustuva metylointianalyysi (PMA) määritys [19] arvioida metylaatio toistuvia LINE ja SINE (

Alu

) elementtejä, samanlainen genominlaajuisten metylaatio määrityksissä raportoitu aiemmin [20]. Validoida määritykset, teimme sarjan testejä: (1) sekoitetaan kokeiluja tunnetuilla määriä metyloitua /metyloitumattoman DNA; (2) metylaatio tutkimuksia eri syöpäsolulinjojen verrata Line SINE metylaatio ja kartoittaa maailmanlaajuisten metylaatio yli laajan maligniteetit; ja (3) metylaatio näytteitä eri ikäisten ja eri sukupuolta poistaa nämä tekijät mahdollisimman sekoittavien tekijöiden globaalin metylaation mittauksia.

Stepwise välein metyloitua DNA valmistettiin sekoittamalla yleisesti metyloimatonta (U2M.L) DNA yleismaailmallisesti denaturoidulla (UM.L) DNA eri suhteissa. Sekoitetut Sitten näytteet bisulfiitti käsiteltiin ja alistettiin meidän PMA LINE-1 (LINE) ja

Alu

(SINE) määritykset. Lineaarinen regressioanalyysi osoitti, että LINE-1 ja

Alu

metylaatiotasoilla olivat erittäin tiiviisti tasot ennustivat panos osa metyloitua DNA: ta (

r

= 0,995,

p

– arvo 0,0005 varten LINE-1, ja

r

= 0,980,

p

-arvo 0,0005 varten

Alu

; Kuva S1). On syytä huomata, että jopa silloin, kun tulo-DNA oli täysin metyloitu, suurin maailmanlaajuinen metylaation prosentteina mitattuna PMA kokeessa on hieman yli 50%, ei ole 100%. Tämä johtuu yksittäisten toistuvia elementtejä ovat eriytyneet järjestyksessä ajan; ja CpG dinukleotideissä, jos mutaatio TpG- dinukleotideille voi erottaa metyloitumattomia CpG: t jälkeen bisulfiittikäsittelyn. Tämän tason taustamelua otetaan huomioon normalisoimalla kunkin tuloksen yleisesti metyloitu ohjaus (

eli

, raportointi prosenttia metyloitu viite, tai PMR).

neljä altaat normaalin DNA-näytteitä ( alkaen ääreisverivalkosolut) tuli arvioida vaikutuksen iän ja sukupuolen LINE-1 ja

Alu

metylaatiotasoilla. Jokainen allas (naaraita ≤40 vuotias, urokset ≤40 vuotias, naaraat 40 vuotias, miehet 40 vuotias) sisälsi DNA vähintään viisi henkilöä. Ei ollut sukupuolihormoneja tai ikäriippuvainen erot altaat LINE-1 tai

Alu

metylaatiotasoilla (tuloksia ei ole esitetty).

Jokaisessa LINE-1 ja

Alu

metylaatiomääritystä testattiin paneelia 23 syöpäsolun linjat. Eri CpG sivustoja verrattiin avulla kolme erillistä LINE-1 määrityksissä ja kolme erillistä

Alu

määritykset, kukin johdettu eri alueiden LINE-1 ja

Alu

konsensus-sekvenssit, vastaavasti (taulukko 1). Kontrollina testasimme myös seitsemän normaali lymfoblastisolulinjoissa, joka osoitti normaalin metylaation (kaikki 80% meidän LINE-1 määritykset). Sitä vastoin, kuten odotettavissa aikaisempien raporttien [12] – [14], [21], monet kasvainsolulinjojen osoitti globaalin hypometylaatio, joka oli voimakkainta LINE-1 määrityksissä (kuvio 1). Voit tarkistaa johdonmukaisuus LINE ja SINE metylaatiotasoilla (edustaja meidän LINE-1 ja

Alu

määrityksissä, vastaavasti), vertasimme korrelaatio tulosten välillä kolmen LINE-1 määrityksissä, välillä tulokset kolme

Alu

määrityksiä, ja eri LINE-1 ja

Alu

määrityksissä. Lineaarinen regressioanalyysi osoitti, että yksittäiset LINE-1 määrityksen tulokset korreloivat voimakkaasti keskenään, esimerkiksi

r

= 0,93 ja korrelaatio L1-2 ja L1-3 määrityksen tulokset (kuvio S2A). Sama suuri korrelaatio välissä oli seurausta

Alu

määrityksiä, esimerkiksi

r

= 0,82 varten korrelaatio Alu-1 ja Alu-3 määrityksen tulokset (kuvio S2B) . Kuitenkin LINE-1 määritys tulokset olivat vain kohtalaisen korreloivat

Alu

määrityksen tulokset, esimerkiksi

r

= 0,33 verrattaessa L1-1 ja Alu-1; Kuva S2C). Vastaava taso kohtalainen korrelaatio LINE-1 ja

Alu

määrityksissä oli raportoitu aiemmin neuroumpieritteisissä kasvaimissa [22].

.

Alu

metylaatio käyttäen Alu-3 määritys. B. LINE-1 metylaation käyttäen L1-3 määritystä. Tulokset raportoidaan PMR (prosenttia metyloitu viite) normalisoitu yleisesti metyloitua viite DNA. Universaali metyloimatonta (U2M), yleismaailmallisesti metyloitu (UM) valvontaa, ja normaali kontrolli DNA PBL: istä on myös esitetty.

LINE-1 hypometylaatio HNSCC potilasnäytteeseen

Vastaavat normaali, primäärikasvain, ja jos mahdollista, imusolmukemetastaaseja pään ja kaulan potilaan näytteet (taulukko S1) testattiin käyttämällä PMA LINE-1 määrityksissä (kuvio 2). Koska suurempi dynaaminen alue LINE-1 määrityksessä ja rajoitettu näytemääriä, vain LINE-1 määritykset suoritettiin jäljellä tämän tutkimuksen. Yleensä HNSCC primaarikasvaimista ja metastaattinen imusolmukkeet hypometyloidut verrattuna niiden vastaavia viereisistä normaaleista kudoksista. Kun LINE1-1 määrityksen keskimääräinen primaarikasvaimen PMR oli 65,5%, kun taas keskimääräinen normaali PMR oli 90,0% (

p

-arvo = 6,7 × 10

-8 käyttämällä pariksi

t

-testi). Oli kuitenkin melko vähän vaihtelua primäärikasvaimissa, jotka vaihtelevat 31,2% (vakava hypometylaatio) 90,8% (normaali). Keskimääräinen PMR imusolmukemetastaaseja (73,8%; välillä 31,8% -93,8%) oli myös erittäin vaihteleva, jopa suhteessa vastaavaan primaarikasvaimen, joskus alhaisempi ja joskus korkeampia kuin PMR primaarikasvaimen kanssa, johon se liittyy.

Pariksi kasvain ja normaali näytteitä ja, jos saatavilla, imusolmukemetastaaseja analysoitiin LINE-1 metylointi. PMR arvot piirretään käyttäen normaalissa näytteessä PMR x-arvo ja primaarikasvaimen (ympyrät) tai etäpesäkkeiden (kolmio) PMR kuin y-arvo. Vaaka viivat edustavat PMR arvoja yleisesti metylaation (UM) ja metyloitumaton (U2M) valvonta, normaali lymfosyytit (vihreä) ja neljälle HNSCC solulinjoja (keltainen). Rasiakuvaajien oikealla näyttää keskiarvo ja jakelun ensisijainen kasvaimia ja etäpesäkkeitä alaryhmässä näytteiden jossa Hyväksytty etäpesäkkeitä ja ensisijainen kasvaimia olivat saatavilla.

HPV-positiivisia kasvaimia säilyttää enemmän LINE-1 metylointi kuin HPV -negatiivinen kasvaimet

Koska ei ollut niin paljon vaihtelua HNSCC kasvain PMR, me arveltu, että taso maailmanlaajuisen hypometylaatio saattavat vaihdella eri alaryhmiä HNSCC. Tutkia suhdetta menetys LINE-1 hypermetylaation ja HPV- statuksesta, vertasimme keskimääräinen LINE-1 metylointi tason kolme ryhmää, jotka erosivat niiden HPV tila. Ensimmäinen ryhmä (n = 8) oli HPV negatiivinen (- /-); Toinen ryhmä (n = 8) sisälsivät HPV-DNA, mutta olivat kopiointia hiljaa suhteen E6 viruksen onkogeeni, mikä osoittaa puute ilmaus tästä onkoproteiini (+/-). Kolmas ryhmä kasvain (n = 8) oli positiivisia HPV-DNA ja E6 lauseke (+ /+). Keskimääräinen metylaatio taso kolmesta kasvainten tilastollisesti erilainen, jossa on

p

-arvo = 0,011 varten suuntaus (kuva 3).

Rasiakuvaajat of metylaatiotasoilla (PMR) ja HNSCC primaarikasvaimille (oikea kunkin parin) ja normaalin viereisen kudoksen (vasen kussakin parissa) esitetään mukaisesti HPV- statuksesta. + /+, HPV-positiiviset ja ilmentävät E6- viruksen mRNA; +/-, HPV-positiivisia mutta kopiointia hiljainen; ja – /-, HPV negatiivinen.

Myös verrattuna globaalin metylaatiotasoilla sisään vastaaviin normaaleihin viereisten kudosten samasta kolmeen ryhmään. Toisin kuin tulokset primaaristen kasvainten, ei ollut eroja maailmanlaajuisen metylaation tasot vastaavat normaaleissa kudoksissa, ja näin ollen ei korreloi HPV aseman (kuvio 3). Perustuen aiemmin raportoitu yhdistyksen välillä LINE-1 metylointi ja TNM-luokitus [18], etsimme tällaisen yhdistyksen meidän vedostulostus, mutta ei löytänyt (

p

-arvo = 0,31).

tasot LINE-1 hypometylaatio ja LOH in HNSCC kasvaimissa korreloivat

koolonsyöpäsolulinjaa kanssa selvempi LINE hypometylaatio aiemmin raportoitu olevan korkeampi LOH [14], [15]. Tutkimaan, onko tämä korrelaatio pätenyt meidän HNSCC potilaan näytteitä, suoritimme maailmanlaajuisen LOH-analyysi käyttäen 10K SNPChip tiedot. Genotyypit verrattiin normaalin vieruskudos ja sovitetun kasvainnäytteestä; informatiivinen lokuksille ne, jotka olivat heterotsygoottinen normaalissa kudoksessa. Kuvio 4 esittää käyrää prosenttiosuuden informatiivinen loci kunkin primaarikasvaimen kanssa Loh vs. aste LINE-1 metylointi samassa näytteessä. Me mahtuu lineaarisen trendin tietoihin, jotka osoittivat Pearsonin korrelaatio -0,494, joiden

p

-arvo = 0,017. Koska tarkastus kestävyys, myös laskettuna Spearman (rank-pohjainen) korrelaatio, joka oli myös merkittävä. Spearman korrelaatiokerroin tämä suhde oli -0,428 (

p

-arvo = 0,042), todetaan, että LOH todellakin korreloi merkitsevästi asteen LINE hypometylaatio.

LINE-1 metylaatio on piirretty kuten PMR ja LOH on osa 10K SNP loci jotka osoittavat LOH suhteessa kaikkiin informatiivinen loci. Pearsonin korrelaatiokerroin on -0,494 (

p

-arvo = 0,01) ja korrelaatio kahden arvon.

Keskustelu

Olemme kehittäneet useita LINE (LINE- 1) ja SINE (

Alu

) metylaatio testeissä, joissa PCR-alukkeiden suojelluissa alueilla näiden toistuvia elementtejä. Nämä määrityksissä käytetään useita CpG sivustoja (3-6) määrittää metylaatiotasoilla ja mahdollistavat samanaikaisen monistamisen monien yksittäisten LINE ja SINE elementit koko ihmisen genomin edustavan genomista maamerkkejä maailmanlaajuisen metylointianalyysi. Kuten odotettua, tulokset yksittäisistä LINE-1 määritykset hyvin korreloivat tuloksia muiden LINE-1 määrityksissä, vaikka mittaus metylointi eri alueilla LINE-1-sekvenssin. Sama pätee

Alu

määrityksiä, joilla on korkea korrelaatio tulokset kolmesta eri määrityksissä. Kuitenkin, kun LINE-1 ja

Alu

metylaatiotasoilla verrattiin keskenään, korrelaatio oli vaatimaton, vain noin 40%. Syyt tähän pienempi korrelaatio voi liittyä yksinkertaisesti eroihin määrityksen herkkyys: LINE-1 määrityksissä vaihteli 0-50% metyloitu sekoituksen tutkimuksissa, kun taas

Alu

määrityksissä oli vähemmän amplitudi, joka vaihtelee 0-30% metyloitu, mahdollisesti toissijainen korkeamman yksilöiden välisiä taustamelua vuoksi sekvenssivariaatiolle yksittäisten

Alu

elementtejä (kuva S1). Toinen mahdollisuus on, että on olemassa toiminnallista tai biologinen ero kahden toistuvan DNA: n metylaatio ylläpitoon. LINE toistot ovat yleisempiä geeni-köyhiä alueita genomin, kun taas

Alu

elementit ovat yleisempiä geeni-rikkaita alueita [23]. Koska globaali metylaatio voidaan mitata erilaisilla menetelmillä, nämä määritysten välinen erot tulisi harkita verrattaessa tuloksia käyttämällä erilaisia ​​määrityksiä ja tutkimuksia.

Tuloksemme osoittavat pienenemistä globaalissa metylaatio solulinjoissa useista syöpä solutyypeissä (kuvio 1), joka on samanlainen aiemmin julkaistu tuloksia erilaisten kasvaintyyppien [12] – [14], [21]. On syytä huomata, että syöpä solulinjoja yleensä ollut alhaisempi metylaation kuin HNSCC näytteet heijastaen ehkä pitempään kerääntyä metylaatio menetys tai klonaalisen luonne näistä solulinjoista. Kuitenkin jotkut solulinjat (esim RKO) oli vähän, jos menetys metylaation. Tämä merkitsee, kuten ensisijaisen HNSCC kasvaimia, että vaihtelua taustalla biologian. Lisätutkimuksia mikä aiheuttaa tämän vaihtelevuus voisi tarjota tärkeää tietoa polkuja ja rooli epigeneettiset muutokset syövän etenemiseen.

Tuloksemme osoittavat positiivista korrelaatiota normaaleista LINE metylaation ja HPV-positiivisuuden. Lisäksi normaaleista LINE metylaation myös korreloi vähemmän LOH tai genomin epävakautta. Jos LOH nähdään korvike kromosomin epävakaus (CIN), tämä tulos on sopusoinnussa aiemmin raportoitu seurauksena paksusuolen syövät myös yhdistyksen välillä CIN ja tappio LINE hypermetylaation [14], [15]. Siten on houkuttelevaa spekuloida, että LINE metyloinnin ja CIN ovat kausaalinen, kenties kautta metylointi tunnetuista yhdessä tiheämmin kromatiinin pakkaus, joka voi kääntää enemmän Fidelity aikana kromosomi eriytymistä ja siten vähemmän LOH. Kuitenkin meidän tulokset ja aiemmin raportoitujen tulosten puhtaasti korrelatiivisten; toiminnalliset tutkimukset ovat tarpeen ennen tätä syy-yhteys voidaan muodostaa.

Romaani toteamus tuloksemme on, että HPV-positiivisuus korreloi ylläpitoon LINE metylaation. Tuore epidemiologinen tutkimus tunnistaa riskitekijöitä LINE-1 hypometylaatio ilmoiteta mitään merkittävää yhdistyksen välillä HPV-DNA-aseman ja LINE-1 metylaatiotasoilla [17]. Kuitenkin oli menetelmästä eroja, jotka ja Tutkimuksessamme lukien käyttö HPV E6 DNA ja RNA asema määräytyvät HPV tila, käyttö eri metylaatiomääritystä ja käyttö metylaation tason jatkuvana muuttujana analyysi. Vaikka Furniss ja kollegat eivät osoittaneet suoraa yhteyttä, he osoittivat, että tulokset vaihtelivat LINE-1 metylaatiotasoilla HPV-syöpäkasvain [23]. Lisätutkimuksia tarvitaan selvittämään yhdistyksen välillä HPV- statuksesta ja LINE metylaatio. Yksi mahdollinen hypoteesi on, että yritetään vaientaa HPV-virus, tartunnan saaneiden solujen aiheuttaa enemmän elämäniloinen metylaation vastaus, harkening takaisin alkuperää Metylointia virusperäisen puolustusmekanismi. Vaikka tämä taas edellyttää mekaaniset tutkimukset tai kenties tutkimuksia uudentyyppisten viruksen välittämän syöpien (esim Hepatiitti B ja C välittämän HCC verrattuna ei-viruksen aiheuttama HCC tai EBV + lymfooma vs. EBV- lymfooma) perustaa syy, tuloksemme pitkin niiden kanssa Furniss ja työtovereiden [17] varmasti antaa enemmän tukea olettamusta, että HPV-positiiviset HNSCC ja HPV-negatiiviset HNSCC edustavat erillisiä biologinen yhteisöjä, jotka syntyvät erillisellä onkogeenista polkuja.

Yhteenvetona kehitimme useita uusia LINE (LINE-1) ja sine (

Alu

) koko genomin metyloinnin määritykset, jota käytettiin määrittämään metylaatiostatuksen eri syöpäsolulinjoissa ja HNSCC primaarikasvaimen näytteitä. Huomaamme, että syöpä solulinjoja yleensä ovat laskeneet metylaatiotasoilla toistuvia elementtejä. Vielä vaihtelua LINE-1 metylaatio huomattiin sisällä HNSCC näytteitä. Mikä tärkeintä, huomasimme korrelaatiota HPV-negatiivisuutta, lisääntynyt genomin epävakautta, ja menetys genomin metyloinnin. Tämä korrelaatio vahvistaa käsitystä, että HPV-positiiviset ja HPV-negatiiviset syövät ovat biologisesti erillisiä ja tarjoaa perustan tuleville tutkimuksille määritellä tarkemmin biologinen mekanismi taustalla näitä havaintoja.

Materiaalit ja menetelmät

Patient näytteiden ja solulinjojen

Hyväksytty kasvain /viereisistä normaaleista kudosnäytteistä, ja kun käytettävissä kohdunkaulan imusolmukemetastaaseja päässä HNSCC potilaista kerättiin Ohio State University, kuten on kuvattu aikaisemmin (taulukko S1) [24]. Genomi-DNA uutettiin DNA-proteiini-vaiheen TRIZOL-uutettu kudoksista mukaan valmistajan ehdotusten (Invitrogen). DNA eristettiin käyttäen Puregene Kit (Gentra) solujen pelletit neljästä HNSCC solulinjojen (SCC-4, SCC-9, SCC-15: n ja SCC-25), viisi keuhkosyövän solulinjat (H1395, H520, H2170, SK- MES-1 ja SW-900), yksi rintasyöpäsolulinja (MCF7), yksi kohdunkaulan syövän solulinja (HeLa), kolme aivojen syöpäsolulinjoissa (U251, SK-N-AS: n ja M059K), yksi kohtusyöpä solulinja ( AN3CA), yksi sarkoomasolulinja (HT1080), yksi munuaissyöpä solulinja (HEK293), ja kuusi koolonsyöpäsolulinjoissa (LoVo, SW48, HCT-15, DLD-1, COLO 320DM ja RKO), mukaisesti valmistajan ehdotuksia. Lisäksi DNA lymfoblastoidisolulinjassa BL1395 käytettiin vastaava ohjaus H1395. Kaikki solulinjat ovat saatavissa ATCC (Manassas, VA).

Normal-altaat ja metyloidut valvonta

neljä altaat normaalien näytteiden kertyi edustavat eri sukupuolia ja kaikenikäisille. DNA-näytteet saatiin anonyymi verenluovuttajien ja oli lahja Dr. Michael J. Siciliano (University of Texas M. D. Anderson Cancer Center). Kolme allasta (naisilla yli 40-vuotiaita, naaraat ikä 40 tai alle, ja urokset ikä 40 tai alle) olivat kukin koostuu viisi henkilöä kohti altaan. Neljäs allas (miehillä yli 40-vuotiaat) muodostui kuusi henkilöä. Kaupallisesti valmistetaan yleisesti metyloitu ja yleisesti metyloitumattoman DNA (UM.C ja U2M.C, vastaavasti) saatiin Chemicon. UM.L (yleisesti metyloitua DNA) synnytettiin positiivisena kontrollina käsittelemällä normaalin perifeerisen veren leukosyyttien (PBL) DNA CpG-metylaasin

M.Sss

I (New England Biolabs) [25]. U2M.L (yleisesti metyloitumaton DNA) synnytettiin negatiivisena kontrollina vahvistamalla saman DNA käyttää tuottamaan positiivisen kontrolli-DNA käyttäen GenomiPhi kit (GE Healthcare), kuten valmistaja on kuvannut.

Alukkeet ja PCR-olosuhteita

PCR-alukkeita ja sekvensoimalla alukkeet suunniteltiin käyttämällä PSQ Pitoisuus Suunnitteluohjelmistot (Biotage) [26]. Kolme määritykset SINE (

Alu

) elementtejä ja kolme määrityksiä LINE-1 elementtien suunniteltiin (taulukko 1). PCR suoritettiin 25 ul: reaktiossa, joka sisälsi Qiagen HotStart Taq master mix (Qiagen) käyttäen 1 ui vetysulfiitilla käsitellyn DNA: n (10 ng DNA: ta ekvivalenttia). Alentaa määritystä kohti, vahvistus-protokolla on kehitetty käyttäen biotinyloitua yleispohjamaaliksi lähestymistapaa. Lopulliset alukekonsentraatiot olivat 10 nM aluketta pyrstö kanssa yleispohjamaaliksi, 100 nM untailed pohjamaali, ja 90 nM yleispalvelun biotinyloitua aluketta kussakin reaktiossa [19]. Monistus suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: denaturaatio 95 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 45 sykliä 95 ° C 30 sekuntia, 45 ° C (SINES) tai 53 ° C (linjat) 1 min, 72 ° C 45 sekuntia, ja lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 7 min. [19]

PyroMethA (PMA) ja metylaation arviointi

Bisulfiittikonversio genomista DNA: ta tehtiin, kuten on raportoitu aikaisemmin [ ,,,0],19]. Lyhyesti, 0,5-1,0 ug genomista DNA: ta käsiteltiin käyttäen CpGenome DNA muutos Kit (Chemicon), mukaan lukien DNA sulfonointi, deaminaatio, suolan poisto, Desulfonaatiota ja hyödyntämistä. Ui bisulfiittikäsiteltyä DNA: ta säilytettiin -20 ° C: ssa käyttöön asti. PMA on pyrosekvensointi-pohjainen tekniikka, joka voi analysoida CpG metylaation useita sivustoja yhdessä määrityksessä. Sen jälkeen PCR-monistus käyttäen bisulfiitti käsitellyn DNA, pyrosekvensointi suoritettiin käyttäen PSQ96HS järjestelmä (Biotage) mukaan valmistajan protokollan mukaan lukien yhden lohkon sitova proteiini (PyroGold reagenssit). Tulokset analysoitiin käyttäen Q-CpG-ohjelmisto (Biotage), joka laskee metylointi prosenttiosuus (

mC /(

mC + C)) kunkin CpG-sivuston, jonka avulla kvantitatiivinen vertailuja. Metylointi indeksi (kutsutaan MI) laskettiin keskiarvo

mC /(

mC + C) kaikille tutki CpG sivustoja määrityksessä. Yleisesti ottaen oli erittäin hyvä sopimus metylaatiotasoilla keskuudessa yksittäisten CpG sivustoja samassa määrityksessä. Bisulfiitti-käsitelty UM.L käytettiin yleisesti metyloitua varten. PMA tiedot näiden maailmanlaajuisten metylaation määritykset ilmoitetaan prosentteina metyloitu viite (PMR) arvo, normalisoi MI kunkin näytteen MI on yleisesti metyloitu viite (UM.L) DNA [25].

kaupalliset yleisesti metyloitua DNA (UM.C) ja yleismaailmallisesti metyloitumattoman DNA (U2M.C) (Chemicon) käytettiin myös suorittaa tämän analyysin, ja tulos oli lineaarinen (

r

= 0,983,

p

-arvon 0,0005 varten LINE-1, Kuva S1). Kuitenkin kaupallisesti saatavilla U2M ollut täysin metyloitumaton, koska puhdas U2M.C näyte oli jäljellä metylaatio noin 26%, eroaa U2M.L valmistettu meidän lab, joka oli odotettu 0% metylaatio. Siksi käytetään omaa yleisesti metyloitumattoman DNA (U2M.L) kaikille lisätutkimuksia.

havaitseminen HPV16 E6 DNA: n ja E6 RNA määrittää HPV- statuksesta

Quantitative real-time PCR suoritettiin havaita joko HPV16 E6 DNA tai E6 cDNA käyttämällä samaa aluketta /koetin asetettu molemmille. Alukkeet suunniteltiin käyttäen HPV16 serotyyppi, jonka osuus ≥90% kaikista HPV-positiivisten HNSCC tapauksissa [27]. Kontrolloida mahdollisimman genomisen DNA-kontaminaation cDNA monistukset cDNA DNAasi-käsitellyn RNA, joka oli valmistettu käyttäen SuperScript First Strand Synthesis System (Invitrogen) sekä ilman lisäämällä käänteiskopioijaentsyymin verrattiin. PCR suoritettiin 25 ul: reaktiossa, joka sisälsi iQ SuperMix master mix (Biorad) käyttäen 25 ng genomista DNA: ta tai 5 ui cDNA: ta. Forward-aluke (5′-CTGCAATGTTTCAGGACCCA-3 ’), ja reverse-alukkeen (5′-TCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT-3′) lisättiin lopulliseen konsentraatioon 200 nM kutakin. Texas Red merkitty reaaliaikaisen koetin (5’-TR-AGGAGCGACCCAGAAAGTTACCACAGTT-3 ’) lisättiin lopulliseen konsentraatioon 320 nM. Fluoreseiini lisättiin kuhunkin reaktioon lopulliseen konsentraatioon kaksikymmentäkaksi. Jokainen reaktio suoritettiin kolmena kappaleena. Monistus suoritettiin seuraavissa olosuhteissa: denaturaatio 95 ° C: ssa 8,5 minuutin ajan, jota seurasi 50 sykliä 95 ° C 15 sekuntia, 60 ° C 1 min ja analysoidaan reaaliaikaisesti käyttämällä iCycler PCR laitteen ja ohjelmiston ( Biorad). Näytteitä, jotka eivät täydentää pisteytettiin negatiivisiksi, ja kaikki näytteet ryhmiteltiin 3 ryhmään perustuu näihin tuloksiin: (+ /+), positiivinen sekä E6 DNA ja E6 RNA; (+/-), Positiivisia E6 DNA, mutta kopiointia hiljainen; ja (- /-), negatiivinen E6 DNA: n ja RNA: ta. HPV tila onnistui määritettiin 24 26 HNSCC näytteitä, ja näitä käytettiin myöhemmin analyysejä käyttämällä HPV-tila.

10K SNPChip LOH-analyysi

HNSCC genomiset DNA: t uutettiin käyttämällä standardi TriZol- louhinta-protokollaa; ne puhdistettiin edelleen etanolisaostuksella ennen ja jälkeen koko genomin monistamisen käyttäen GenomiPhi kit (GE Healthcare). Affymetrix 10K

Xba

131 array sisältää noin 11500 SNP joiden keskimääräinen väli 210 kb. Standard Affymetrix protokollat ​​seurattiin näiden määritysten. Lyhyesti, noin 250 ng genomista DNA: ta pilkottiin

Xba

I ja ligoitiin sitten sovittimia. Seuraavaksi yksi pohjamaali vahvistus kuljetettiin käyttämällä GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Sen jälkeen kun puhdistus Qiagen MinElute 96 UF, yhteensä noin 20 ug PCR-tuote hajanainen ja leimattu biotiinilla. Hybridisaatio suoritettiin Affymetrix GeneChip hybridisaatio Uuni 48 ° C: ssa 16-18 tunnin ajan. Taulukot pestiin ja värjättiin Affymetrix GeneChip- Fludics Station 400 ja skannattiin Affymetrix GeneArray 2500 Scanner. Kuvankäsittely suoritettiin GCOS 1.0 ohjelmistojen ja genotyypit tuotettu GTYPE 2.0 tai uudempi ohjelmisto.

Tilastollinen

Jotta voidaan arvioida yhdistyksen tasojen metylaation ja tasojen HPV kuorman (a samanlainen analyysi oli myös arvioitaessa yhdistyksen tasojen metylaation ja TNM-luokitus), me eteni seuraavasti. Kaikki näyte metylaatio arvot muutettiin riveissä. Yksi puuttuva arvo LINE1-1 määritystä varten näyte P2, luettiin käyttäen P2 arvon LINE1-3 (korrelaatio LINE1-1 ja LINE1-3 määritykset on 0,98). Nämä riveissä Sitten skaalattu (painotettu) HPV kuorman, jossa painot 0, 1 ja 2 – /-, +/-, ja + /+, vastaavasti. Lopullinen yhdistys ”pisteet” oli näiden summa painotettuna riveissä. Null jakelu tälle pisteet arvioitiin simulaatiot, jossa me toistuvasti kohdistettu näytteitä HPV ryhmiin satunnaisesti. Ajoimme miljoona simulaatioita, ja määrittelimme

p

-arvo kuin kaksi kertaa osuus tapauksista, joissa simuloinnin pistemäärä oli yhtä suuri tai suurempi kuin se, jota me itse nähnyt. Meidän simuloitu

p

-arvo oli 0,011.

tukeminen Information

Taulukko S1.

Kliiniset ja molekyylitason ominaisuuksia HNSCC näytteistä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0004941.s001

(0,12 MB DOC) B Kuva S1.

Dynamiikka PMA LINE-1 ja Alu määritykset. Sekoitus suoritettiin kokeita sen määrittämiseksi PMA metylaatiotasoja jossa on vaihteleva määrä yleisesti metyloitua ja metyloitumaton DNA. UM.C ja U2M.C edustavat kaupallisesti saatavissa (Chemicon) yleismaailmallisesti metyloitu ja metyloitumaton DNA: t, vastaavasti. UM.L ja U2M.L muodostettiin samasta DNA: sta in vitro muutos laboratoriossamme.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0004941.s002

(0,10 MB TIF)

Kuva S2.

korrelaatio analyysi SINE ja LINE maailmanlaajuinen metylointi määrityksiä.