Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kemokiinireseptori CCR6 on äskettäin osoitettu liittyvän peräsuolen syöpä (CRC) eteneminen. Kuitenkin suora todiste siitä CCR6 kasvaimissa on ennustetyövälineenä markkeri selviytymisen sairastavien potilaiden CRC ja onko sillä on ratkaiseva merkitys CRC etäpesäkkeitä

in vivo

puuttuu. Tässä osoitamme, että tasot CCR6 ilmentyivät CRC solulinjoissa ja ensisijainen CRC kliinisistä näytteistä. CCR6 kiihdytyssäätely oli tiiviisti korreloivat sairauden vaiheet ja elinaika CRC potilaista. Knockdovvn CCR6 esti muuttoa CRC solujen

in vitro

. N yli-ilmentyminen CCR6 CRC soluissa kasvattivat proliferaatiota, migraatiota, ja pesäkkeiden muodostuminen

in vitro

ja edistettävä metastasoituneeseen potentiaali

in vivo

. CCR6 aktivoitu Akt signalointi, ilmen- tymisen lisääntymisen etäpesäke geenit ja vaimentua etäpesäkkeitä synnyssä. Valikoiva kohdentaminen CCR6 kasvaimissa dramaattisesti esti kasvua CRC hiirillä. Siten kasvain ilmaus CCR6 on keskeisessä asemassa CRC etäpesäkkeitä, upregulated CCR6 ennustaa huono hengissä CRC potilaille, jotka kohdentavat CCR6 ilmentyminen kasvaimissa voi olla potentiaalinen terapeuttinen strategia CRC.

Citation: Liu J, ke F, Xu Z, Liu Z, Zhang L, Yan S, et ai. (2014) CCR6 Onko Prognostiset Marker varten Kokonaiselossaoloaika potilailla, joilla on peräsuolen syövän, ja sen yli-ilmentyminen Parantaa Etäpesäke

In Vivo

. PLoS ONE 9 (6): e101137. doi: 10,1371 /journal.pone.0101137

Editor: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kiina

vastaanotettu 26. tammikuuta 2014; Hyväksytty: 3 kesäkuu 2014; Julkaistu: 30 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Liu et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukevat avustuksia National Natural Science Foundation of China ja 973 Program (nro: 91029730, No: 81202304, No: 2012CB917100, No: 2010CB529700 ja nro: 30972787), jonka ohjelma professori Special nimeäminen (Eastern Scholar) Shanghai korkeakouluissa, tiede- ja teknologianeuvoston komissiolle Shanghai kunta (nro: 09140902600), jonka johtava Academic Kuri projekti Shanghai Municipal Education komissio (nro: J50208 ja nro: J50207), Shanghai Pujiang Program (No: 10PJ407300 ), ja Shanghai komitean Science and Technology (11DZ2260200). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on merkittävä terveysongelma kaikkialla maailmassa. Vaikka huomattavaa edistystä on tapahtunut viime vuosikymmenellä, haasteet hoitoon CRC ja sen etäpesäkkeitä pysyvät valtava [1]. Tällä hetkellä, vaikka käyttö erityisten aktiivisten lääkkeiden metastaattisen CRC suosiotaan, hoito on alhainen ja taustalla molekyylitason mekanismit elimen suuntautunut etäpesäke CRC ei täysin ymmärretä.

Kemokiinit ovat 8 – 12-kDa peptidejä, jotka toimivat kemoatrak- sytokiinien ja saavat aikaan biologiset vaikutuksensa vuorovaikutuksessa G-proteiinin sidottu transmembraaninen kemokiinireseptorit. Useita kemokiinit ja niiden vastaavien reseptorien tiedetään olevan tärkeä rooli leukosyyttiliikenteen ja itseohjautuva, erityisesti tulehduskohdissa, kudosvaurion ja pahanlaatuisten solujen vaeltaminen [2], [3]. Mielenkiintoista on, että vaikka useimmat kemokiinin reseptorit sitovat useita kemokiinien, kemokiinireseptori CCR6 on vain yksi kemokiini ligandi, CCL20 (aiemmin tunnettu nimellä makrofagin tulehduksellinen proteiini-3α tai MIP-3α) [4].

CCR6 on ensisijaisesti ilmaistaan valkosoluissa, jossa ilme kypsillä lymfosyyttien, erityisesti muistisolujen [4], epäkypsiä dendriittisoluja (DC) erityisen suvusta [5] ja vaeltavat säätelijä-T-solujen [6]. Useimmissa tapauksissa, CCR6 puuttuu granulosyyttien (paitsi aktivoitujen neutrofiilien), monosyyttisoluilla, epäkypsien lymfosyyttien, ja kypsillä DC: [7] – [9]. CCL20 näkyy sekä konstitutiiviset ja indusoituvat ilmaisun, lähinnä limakalvoon liittyvä imukudoksissa ja maksassa [10], ja perusekspression nostetaan alle tulehdustiloja [11]. Pohjapinta ekspressiotaso CCL20 sen ajatellaan säätelevän muuttoa CCR6 ilmentävien epäkypsiä DC ja muisti lymfosyyttien verestä varten homeostatic valvontaan. Ylössäätelyyn CCL20 tulehduksen aikana voi parantaa siirtymistä näiden molempien solutyyppien kudokseen [12] – [14]. Sillä ihmisen syövissä, kertynyt data tarkoita välisestä assosiaatiosta kemokiinin kemokiinireseptorin järjestelmä ja metastaattisen potentiaalin syöpäsoluja. Esimerkiksi kasvainsolut ainakin 23 erilaista ihmisen syöpien epiteelisolujen mesenkymaaliset ja hematopoieettisten alkuperää ilmaista CXCR4 [15], [16]. CCR7- todettiin myös rinta-, maha- ja ruokatorven suomuinen syöpä, ja sen ilmentyminen korreloi huonon ennusteen [15], [17], [18]. Kaikki nämä tutkimukset osoittavat, että ilmentyminen kemokiinireseptoreiden syövän etäpesäkkeiden ei ole satunnaista.

Kemokiinireseptori CCR6 on erityisen kiinnostava maksassa etäpesäke paksusuolen syöpä. Sen ainutlaatuinen kemokiini ligandi CCL20 ilmenee pääosin imukudosmääriä ja maksassa [19]. Poikkeavaan ilmentyminen kemokiinireseptori CCR6 CRC soluissa on tiettävästi mukana elimessä-selektiivisiä tuumorietäpesäke [20], [21]. Kuitenkin suora

in vivo

todisteita rooli CCR6 että etäpesäkkeiden CRC puuttuu. Tässä tutkimuksessa olemme huomanneet, että ilmen- tymisen lisääntymisen CCR6 ilmaisu metastaattisessa CRC solulinjoissa ennustettu huono eloonjäämisen CRC potilaille. Yli-ilmentyminen CCR6 riitti edistää CRC solujen etäpesäke sekä

in vitro

ja

in vivo

. Salpaamalla valikoivasti CCR6 toiminto dramaattisesti esti kasvua CRC hiirillä. CCR6 osoittaa välitön asema etäpesäke ihmisen CRC, mahdollisesti säätelemällä etäpesäkkeiden liittyviä geenejä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Tutkimus hyväksyi Ethics komiteat sairaalan Shanghai Jiao Tong-yliopiston School of Medicine, Kiina.

Kaikki hiiret pidettiin erityinen-taudinaiheuttajista vapaat (SPF) olosuhteissa noudattaen National Institutes of Health Guide for Care ja käyttö Laboratory Eläimet ja hyväksynnän (SYXK-2003-0026) tieteellisen tutkintalautakunta Shanghain Jiao Tong-yliopiston School of Medicine, Shanghai, Kiina. Lievittävät kärsimystä hiirien havaittu nämä kokeelliset tutkimukset, hiiret tapettiin CO

2 hengitettynä.

kudos mikrosiru lukien 191 paksu- ja peräsuolisyövän sekä vastaavat para-kasvainnäytteestä hankittiin National Engineering Centerin for biosiruja Shanghai. Kirjallinen suostumus luovuttajalta saatiin käyttöön niiden näytteiden tutkimustarkoituksiin. Kukaan potilaista ei saanut kemoterapiaa tai sädehoitoa ennen kirurgista resektiota. Viereisen ei-syöpä paksusuolen kudokset saatiin vähintään 2 cm: n päässä kasvaimen sen varmistamiseksi, että nämä kudokset olivat vapaita syöpäsoluja. Näytteet rutiininomaisesti kiinnitettiin 10% formaliinilla välittömässä leikkauksen jälkeen ja parafiiniin 24 tunnin kuluessa poistosta.

Hiiret

C57BL /6J, Balb /c ja B6.129P2-Ccr6tmlDgen /J (nimetty CCR6

– /-) hiiret hankittiin Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME).

CRC Solulinjat ja soluviljelmät

immortalisoitu ihmisen alkion munuais- solu linja, HEK293T-, viljeltiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa (DMEM, Hyclone), 10% naudan sikiön seerumia (FBS). Hiiren peräsuolen solulinjan CMT93 pidettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää. Toinen hiiren peräsuolen solulinjan, CT26, pidettiin RPMI-1640-väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää. HEK293T-, CMT93, CT26 ja seitsemän ihmisen CRC solulinjoissa, Caco-2, SW480, HT-29, HCT116, SW1116, SW620 ja LoVo, olivat kaikki saatu Cell Bank valiokunnan Type Culture Collection Kiinan tiedeakatemia (Shanghai, Kiina), joissa ne oli tyypillistä DNA-sormenjälkien, mycoplasma havaitseminen, ja solujen elinvoimaisuus. Caco-2-soluja kasvatettiin Eaglen Minimum Essential Medium (Gibco), 20% FBS: ää. HT-29 ja HCT116-soluja kasvatettiin McCoyn 5a Medium (Gibco), jossa oli 10% FBS: ää. SW1116, SW480 ja SW620-soluja kasvatettiin Leibovitzin L-15-elatusaineessa (Gibco), jossa oli 10% FBS: ää. LoVo kasvatettiin F-12K Medium (Gibco), jossa 10% FBS. Kaikki solut kasvatettiin kosteassa ilmakehässä, 5% CO

2 ja 95% ilmaa paitsi SW1116, SW480 ja SW620, jotka kasvatettiin 100% ilmaa 37 ° C: ssa.

Immunohistokemia

immunohischemistry, kudosleikkeiden (5

um) leikattiin rutiini lohkot, de-paraffinized ksyleenillä, vedettömät, ja altistetaan lämmölle-epitooppisup- haku (HIER) menetelmät ennen inkubointia sopivan vasta-aineita. Osiot upotettiin 10

mM natriumsitraattia, pH 6,0 ja sittemmin kuumennettiin painekattila 10

min. Huuhtelun jälkeen juoksevalla vedellä ja PBS, leikkeitä inkuboitiin TBST /5% normaalia vuohen seerumia blokkausliuoksessa 0,5 tuntia huoneen lämpötilassa ja sitten inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa, jossa on monoklonaalinen anti-ihmis-CCR6-vasta-ainetta (1:50 laimennus; R 1, 1-24%; 2, 25-49%; 3, 50-74%; ja 4, 75-100%. Immunovärjäys intensiteetti arvioitiin seuraavasti: 0, ei mitään; 1, heikko; 2, väli; ja 3, voimakas. Jaoimme kaikki näytteet (n = 191) kahteen ryhmään (matala tai korkea CCR6 lauseke) mukaan mediaani periaatteeseen. Vertailla ero CCR6 ilmaisua syöpä- paksusuolen kudoksiin ja vastaaviin normaaleihin viereisten kudosten kussakin kliinisessä vaiheessa määrällisesti erityisten CCR6 immunovärjäyty- intensiteetti suoritettiin käyttäen kuva geeliä ohjelmistoa (IPWIN60). Lyhyesti, CCR6 immunovärjäykseen kaikkien syövän paksusuolen kudoksiin ja sovitettu viereisen ei-syöpä paksusuolen kudoksiin kudokseen array siru valokuvattiin mikroskoopilla 100-kertainen suurennus (Carl Zeiss). Kuva geeli ohjelmisto (IPWIN60) käytettiin laskemiseen OD arvot kaapattu kuvia. Mediaani OD-arvo kolmesta kuvia kunkin ytimen päälle kudos array dioja käytettiin, ja ero CCR6 ilmaisua kasvain ja vastaaviin normaaleihin viereisten kudosten kussakin kliinisessä vaiheessa verrattiin.

haavan paraneminen Assay

HCT116

Ctr, HCT116

CCR6, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr, SW1116

CCR6, SW480

shCtr, SW480

shCCR6, LoVo

shCtr ja LoVo

shCCR6 solut erikseen ympättiin kuuden kuoppalevyillä viljeltyjä asti lähes 80% konfluentteja, ja seerumia 24

tuntia. Keinotekoinen haavat luotiin raaputtamalla yksisolukerrosten steriilillä 10

μ

l kärki, ja solut pestiin PBS: lla useita kertoja poistaa kelluvat soluihin. Edustavia kuvia liikkuvien solujen haavoihin vangittiin jälkeen 0 tuntia ja 24 tuntia mikroskoopilla (20 x).

TranswellTM migraatiokokeessa

TranswellTM jaostojen 8 um huokoskoon kalvosuodattimella insertit (Corning, USA) käytettiin määrittämään solujen vaeltamiseen kyky. FBS käytettiin kemoatrak-. Lyhyesti, HCT116

Ctr, HCT116

CCR6, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr, SW1116

CCR6, SW480

shCtr, SW480

shCCR6, LoVo

shCtr ja LoVo

shCCR6 solut kerättiin ja suspendoitiin uudelleen seerumittomassa alustassa. Tietty määrä 3 x 10

4 solut lisättiin ylempään kammioon ja inkuboitiin 24

tuntia 37 ° C: ssa. Solut, jotka olivat vaeltaneet kalvon läpi alapintaan kiinnitettiin kylmällä metanolilla 10

min, värjättiin 0,1% kristalliviolettia 30

min, pesty, ilmakuivattuina, valokuvataan ja osuus .

pesäkemuodostusta

HCT116

Ctr, HCT116

CCR6, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr ja SW1116

CCR6 solut erikseen siirrostettiin kuuteen-kuoppaisille levyille tiheydellä 600 solua /kuoppa. Alustat vaihdetaan kahdesti viikossa, ja sen jälkeen 14 päivää, solut kiinnitettiin metanolilla 10 minuutin ajan, värjättiin 0,5% kristallivioletilla 15 minuutin ajan, huuhdeltiin kolme kertaa PBS: llä ylimääräisen väriaineen poistamiseksi, valokuvataan ja laskettiin.

Western blot -analyysi

seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin Western blot: ihmisen CCR6 (# 14-1969, eBioscience ™ San Diego, USA), hiiren CCR6 (# ab78429, Abcam), β-Actin ( CP01, Calbiochem), Akt (pan) (C67E7) Rabbit mAb (# 4691, Cell Signaling Technology), fosfo-Akt (Ser473) Rabbit mAb (# 4060, Cell Signaling Technology), fosfo-Akt (Thr308) (C31E5E) Rabbit mAb (# 2965, Cell Signaling Technology), p44 /42 MAPK (Erk1 /2) (137F5) Rabbit mAb (# 4695, Cell Signaling Technology), fosfori-p44 /42 MAPK (Erk1 /2) (Thr202 /Tyr204) ( 20G11) Rabbit mAb (# 4376, Cell Signaling Technology). FXYD5 (# AP14909c, Abgent), SYK (# 626201, Biolegend), uPAR (# sc-10815, Santa Cruz Biotechnology), CDH1 (# 3195P, Cell Signaling Technology), KISS-1 (# sc-18134, Santa Cruz Biotechnology ), ja TIMP2 (# 635401, Biolegend). Western blot -analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on julkaistu [22].

Vector Hakemisto Rakentaminen

lentivirusvektori PGC-FU-Luc rakennettiin tuomalla tulikärpäsen lusiferaasi-geeni (Luc) alavirtaan CMV-promoottorin in plasmidivektorin PGC-FU kuljettaa neomysiiniresistenssigeeni. Lentiviruksen sukkulavektori pLVX-IRES-ZsGreen1-CCR6 rakennettiin stabiilisti yli-ilmentää CCR6 Luc-HCT116. Lyhyesti, 1125 bp: n koodaavan sekvenssin ihmisen CCR6 (NM_004367) monistettiin cDNA-templaattia ihmisen PBMC: illä ja subkloonattiin Xhol ja BamHI-kohtiin pLVX-IRES-ZsGreen1 vektoriin (Clontech Laboratories, USA). Lentiviruksen sukkulavektori pLVXshRNA2 (Clontech Laboratories, USA) käytettiin ilmaisemaan shRNAs päässä U6-promoottori. Lisäksi ilmaisemiseen shRNAs, pLVX-shRNA2 ilmaisee myös vihreän fluoresoivan proteiinin ZsGreen1. Sillä knockdovvn CCR6, neljä kohdesekvenssien suunniteltiin. Kohdesekvenssien käytetään olivat seuraavat: shCCR6-1, 5′-TCGACTCCAGTGAAGATTATT-3 ’; shCCR6-2, 5’-GGTCTATGACAGACGTCTATC-3 ’; shCCR6-3, 5’TTTGTAGCTCTAGGGTATATA-3 ’; shCCR6-4, 5’GACCAGTGAGACCGCAGATAA-3 ’. Sekoitetun ohjaus, 5’TGTTCGCATTATCCGAACCAT-3 ’. Lyhyesti, komplementaarinen DNA-oligonukleotidit, joka koostui sekvenssi-spesifisen 21 nukleotidin, jota seuraa loop-sekvenssi (CTCGAG) ja lopuksi käänteinen komplementti kohdentavan sekvenssin syntetisoitiin, hehkutettu, ja lisätään pLVX-shRNA2 vektorin (Clontech) välillä BamHI ja EcoRI alavirtaan U6 promoottori. Neljä pLVX-shRNA2-CCR6 shuttle-plasmidi oli ohimeneviä transfektoimiseksi osaksi HEK 293-T-solujen kanssa Lipofectine, RT-PCR: llä seulottiin tehokkain CCR6 mRNA: n ekspression pudotus, yksi ShCCR6-1 plasmidi osoittaa lähes 75% vähentynyt CCR6 mRNA: n SW480 soluja poimia seuraavan vakaan CCR6 pudotus CRC solulinjan rakentamisen.

lentivirustartunnat Production ja transduktio

Lentiviruksiin tuotettiin ja korjattu 72 tuntia transfektion jälkeen 293 T-solujen kanssa Lentiviruksiin ja pakkaus plasmidit pMD2.G ja psPAX2 käyttäen Profection Mammalian Transfection System (Promega). Suodatuksen jälkeen 0,45 um: n vähän proteiinia sitovan polysulfonic suodattimen (Millipore), supernatantti otettiin talteen erikseen ja sentrifugoidaan 10 minuutin ajan 2000 x g, 4 ° C: ssa ennen suodattamalla 0,45 um: n huokoskoon suodattimen uudelleen. Läpivirtausta käytettiin suoraan transduktion ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän soluja. Sillä Knockdown kokeilu, kuusi kloonilinjoissa seulottiin CCR6 ilmentymisen Western-blottauksella. Pysyvästi transfektoitujen SW480 ja LoVo solulinjat osoittavat tehokkaasti laskenut CCR6 proteiinia seulottiin ja puhdistettiin edelleen fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelua varten alavirtaan kokeita. Saat yli-ilmentyminen kokeilun, kaksi transdusoitu HCT116 solulinjoja: HCT116 yliekspressoivat ZsGreen1 (HCT116

Ctr) ja HCT116 yli-ilmentävät bisistroninen CCR6-ZsGreen1 geenit (HCT116

CCR6). ZsGreen1

+ HCT116-solut tai ZsGreen1

+ CCR6

+ HCT116-solut puhdistettiin edelleen fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelua ja laajeni elatusaineet. Samoin Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr ja SW1116

CCR6 soluja myös syntyy. Lisäksi kolme transdusoitu HCT116 solulinjat tuotettiin

in vivo

kokeet: HCT116 vakaasti yli-ilmentävät Luc-geenin (Luc-HCT116) G418 valinta, HCT116 kanssa yli-ilmentävät Luc-geenin ja ZsGreen1 geeni (Luc-HCT116

Ctr), ja HCT116 kanssa yli-ilmentävät Luc-geenin ja bisistroninen CCR6-ZsGreen1 geeneistä (Luc-HCT116

CCR6). ZsGreen1

+ Luc-HCT116-solut tai ZsGreen1

+ CCR6

+ Luc-HCT116-soluja puhdistettiin edelleen fluoresenssilla aktivoitujen solujen lajittelua ja laajennettu elatusaineet.

Human kasvainmetastaasin PCR Array

HCT116

Ctr tai HCT116

CCR6 solut hajotettiin suoraan TRIzol reagenssia, ja kokonais-RNA uutettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen, Carlsbad, CA). Myöhemmin Super Script III synteesi järjestelmä (Invitrogen) käytettiin cDNA-synteesiä varten. Reaaliaikainen PCR suoritettiin kullekin näytteelle käyttäen Human tuumorietäpesäke RT

2 Profiler PCR Array (Super Array Bioscience, USA) ABI 7900HT nopea reaaliaikainen PCR-järjestelmä (Applied Biosystems, USA). Ihmisen β-Actin käytettiin normalisoinnin jonka ΔΔCt menetelmällä.

Kokeellinen

in vivo

maksametastaasin Model

Maksa metastaattinen kapasiteetti määritettiin ruiskuttamalla 1 x 10

6 solua per hiiri perna BALB /c-nude-hiirissä. Lyhyesti, BALB /c-nude-hiiret nukutettiin i.p. injektio Pelltobarbitalum Natricum, ja 1 x 10

6 HCT116

Ctr tai HCT116

CCR6 kasvainsolujen 25 ui injektoitiin exteriorized perna insuliiniruiskul- (BD yhtiö) jälkeen vatsan viilto. Viisi minuuttia sen jälkeen, kun solujen injektion, perna verisuonet sidottiin, ja perna poistettiin. Lopuksi, vatsan haava suljettiin niiteillä. Jälkeen 5 viikkoa, hiiret tapettiin ja maksat poistettiin sitten ja valokuvattiin.

Kokeellinen

in vivo

Lung Metastasis Malli

Seven 7 viikkoa vanhoja BALB /c- nude hiirtä kussakin ryhmässä injektoitiin Luc-HCT116

Ctr tai Luc-HCT116

CCR6 soluja. Lyhyesti, 5 x 10

6 solua suspendoitiin 200 ul: aan PBS: ää injektoitiin häntälaskimoon kunkin BALB /c-nude-hiiri. Jälkeen 6 viikkoa, eläimet uhrattiin ja tutkittiin makroskooppisesti ja mikroskooppisesti etäpesäkkeiden. Jotta koko kehon pieneläinten kuvantamisen hiirille annettiin 150 ug /g D-lusiferiini alustan steriiliin PBS injektiona vatsaonteloon ja sitten nukutettiin isofluraanilla. Bioluminesenssi kuvat otettiin kiinni kanssa CCD-kenno (Xenogen IVIS 200 System, Xenogen Inc., Hopkinton, MA, USA) 15 minuutin kuluessa alustalle injektion.

Syngeeninen Graft CRC malli ja anti-CCR6 Therapy

CMT93 solua 100 ul: ssa PBS: ää injektoitiin ihon alle (sc) tulee 6 viikon ikäisiä urospuolisia CCR6

– /- hiirissä (1 x 10

6 solua /hiiri) tai CT26 solua 100 ul: ssa PBS: ää injektoitiin sc osaksi 7 viikkoa vanhoja BALB /c-hiirten (1 x 10

6 solua /hiiri). Kymmenen päivää tuumorisolujen inokulaation jälkeen, kun kasvaimen solut muodostivat kiinteän kasvaimen kudokset, oksastettu CCR6

– /- hiirissä tai BALB /c-hiiret jaettiin satunnaisesti kahteen ryhmään, joiden käsittely IgG ohjaus- tai anti-CCR6. Kaksikymmentä mikrogrammaa IgG

2A (R 0,05, **

p

0,01 ja ***

p

0,001.

tulokset

lisääntymisen merkkejä CCR6 korreloi syövän etenemiseen

tutkimiseksi kliinistä merkitystä ilmen- tymisen lisääntymisen CCR6 CRC, keräsimme 191 parafinoidut ensisijainen CRC kudosnäytteistä (taulukko S1), ja CCR6 ilmentymistasot tutkittiin kaikki nämä näytteet käyttäen immunohistokemia. Korrelaatio CCR6 ilmaisutapoja kliinis ja selviytymisen CRC potilasta yhteenvetona (taulukko S2). Tilastolliset analyysit paljastivat, että CCR6 ilmentyminen korreloi merkitsevästi kliiniseen vaiheeseen (

p

= 0,0117), N luokittelu (

p

= 0,0309), M luokittelu (

p

= 0,0334) ja elintärkeä asema (

p

= 0,0019) potilailla, joilla CRC (taulukko S2). Lisäksi olemme havainneet, että CCR6 ilmentyminen oli merkittävästi yläreguloituja kaikissa määritettiin kliinisissä CRC näytteet, mutta oli havaittavissa vain vähäisinä määrinä paratumor kudoksessa (kuvio 1A), ja yhden muuttujan analyysi paljasti vahvan yhteyden CCR6 värjäytymisen voimakkuuden ja kasvaimen vaiheet (n = 14,

p

= 0,0039, n = 104,

p

0,0001; n = 57,

p

0,0001; n = 16,

p

= 0,0005) (kuvio 1 B). Nämä tiedot viittaavat siihen, että CCR6 säätelyä liittyy vahvasti kliinisen etenemisen ihmisen CRC.

(A) immunohistokemiallinen värjäys CCR6 perusterveydenhuollossa CRC peräisin 191 CRC potilaalla on kliinisessä vaiheessa I-IV. (B) Digitaalinen kuva-analyysi suoritettiin laskea värjäystä intensiteetin CCR6 alueen murto (CCR6-AF) arvot pariksi para-kasvain /kasvainnäytteestä kussakin kliinisessä vaiheessa, Wilcoxonin testi.

voimistunut CCR6 Osoittaa huono ennuste CRC Potilaat

tärkeää, olemme osoittaneet, että CCR6 ilmentyminen korreloi käänteisesti elinaika (

p

0,001) (kuvio 2A). Lisäksi CCR6 ilmentyminen korreloi eloonjäämisaste alaryhmää potilaiden eri kliinisessä vaiheessa merkittävästi vaiheessa IV (

p

0,05) (kuvio 2B-E). Lisäksi yhden ja usean analyysit paljastivat, että M luokittelu ja CCR6 ilmentyminen kukin itsenäisinä ennustettaessa CRC (taulukko S3). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että CCR6 on mahdollinen kliininen merkitys kuin ennustavan biomarkkeri taudin tulos CRC potilailla.

(A) Kaplan-Meier käyrät CRC potilailla, joilla on alhainen verrattuna korkea ilmentymisen CCR6 (n = 191,

p

0,001, log-rank-testi). (B) Kaplan-Meier käyrät CRC potilailla, joilla on alhainen verrattuna korkea ilmentyminen CCR6 kliinisen vaiheen I (n = 14,

p

= 0,0679, log-rank-testi). (C) Kaplan-Meier käyrät CRC potilailla, joilla on alhainen verrattuna korkea ilmentyminen CCR6 kliinisissä vaiheen II (n = 104,

p

= 0,0738, log-rank-testi). (D) Kaplan-Meier käyrät CRC potilailla, joilla on alhainen verrattuna korkea ilmentyminen CCR6 kliinisen vaiheen III (n = 57,

p

= 0,1749, log-rank-testi). (E) Kaplan-Meier käyrät CRC potilailla, joilla on alhainen verrattuna korkea ilmentyminen CCR6 kliinisessä vaiheessa IV (n = 16,

p

= 0,0429, log-rank-testi).

knockdovvn CCR6 Estää Migration CRC Solut

in vitro

havaitut CCR6 yli-ilmentyminen oli vahva yhdessä CRC etenemiseen, mikä sai meidät tutkimaan vaikutusta CCR6 CRC solujen migraatiokykyä . Kaksi CRC solulinjat, SW480 ja LoVo, joka ilmaisi korkein CCR6 ilmentymä peräsuolen solulinjojen analysoimme, käytettiin luomaan alilinjat kanssa CCR6 vakaasti tippuu alas shRNA (kuvio 3A, B). On silmiinpistävää, tulokset osoittivat, että knockdovvn CCR6 aiheutti merkittävän tukahduttaminen soluvaelluksen sekä SW480 ja LoVo solulinjoja on arpeutumisprosessit määritys (

p

0,05, kuvio 3C). Käytimme myös toinen klassisen siirtokuoppaan määritys arvioimaan osuutta CCR6 solun muuttoliikettä. Olemme osoittaneet, että ablaatio CCR6 vähensi huomattavasti muuttoliike sekä SW480 ja LoVo solulinjoissa (

p

0,01, kuvio 3D). Yhdessä meidän data osoitti, että erityinen knockdovvn CCR6 CRC solulinjoissa voisi merkittävästi vähentää solujen vaeltamiseen

in vitro.

(A) Western blotting-analyysi CCR6 tasojen 7 viljellyissä CRC cell linjat. Arvot ilmaistiin kertaisesti muutoksia suhteessa Caco-2, ja normalisoidaan P-aktiini. (B) Western-blottaus-analyysi knockdovvn CCR6 on SW480 ja LoVo-soluja, β-aktiini toimi latauskontrollina. Arvot ilmaistiin kertaiseksi muutoksia suhteessa kontrolleihin (ShCtr), ja normalisoidaan p-aktiini. (C) haavan paranemista määritykset motiliteettia CCR6-vaiennettu SW480 ja LoVo solut ja valvonta soluja. Edustavia kuvia yhden kentän alussa (t = 0 tuntia) (ylempi paneeli) ja lopussa tallennuksen (t = 24 tuntia) (alempi paneeli) kussakin kunnossa esitetty. Suhteellinen solujen vaeltamiseen in ShCtr ja shCCR6 ryhmät näkyvät oikeassa paneelissa. (D) edustaja kuvia siirtokuoppaan siirtynyt solujen CCR6-vaiennetaan SW480 ja LoVo soluja (alempi paneeli) tai kontrolli soluja (ylempi kuva) soluja. Lukumäärät siirtynyt solujen ShCtr ja shCCR6 ryhmät näkyvät oikeassa paneelissa. Arvot edustavat keskiarvoa kolminkertaisista kuopista, ± S.D. *

p

0,05, **

p

0,01, Wilcoxonin testi. Tiedot edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen.

CCR6 Edistää aggressiivisuus CRC Solut

in vitro

Sen tutkimiseksi, kohdunulkoinen yliekspressio CCR6 voisi tehostaa aggressiivisuus CRC-solujen, HCT116, Caco-2- ja SW1116 solulinjoja, jotka ekspressoivat stabiilisti ektooppinen CCR6 määritettiin (kuvio 4A). Silmiinpistävän, sekä haavan paranemista ja muuttoliike kammion määritykset paljastivat, että CCR6 yliekspressio korostuneen parannettu solumigraation verrattuna kontrolliryhmiin (

p

0,05 tai

p

0,01) (kuvio 4B, C) . Lisäksi prosessin aikana luoda CCR6 stabiileja solulinjoja, huomasimme, että siellä oli enemmän pesäkkeenmuodostusta CCR6-transfektoiduissa soluissa kuin kontrolli transfektoiduista soluista. Siksi suoritettiin pesäkkeiden muodostumisen määritykset käyttämällä stabiilisti transfektoituja HCT116

CCR6, HCT116

Ctr, Caco-2

Ctr, Caco-2

CCR6, SW1116

Ctr ja SW1116

CCR6 soluja . Jälleen olemme huomanneet, että kontrolliin verrattuna (Ctr) soluja, koko ja pesäkkeiden lukumäärä muodostuu CCR6 yliekspressoivat HCT116, Caco-2 ja SW1116 solut huomattavasti (

p

0,05) (kuvio 4D) . Yhdessä meidän data osoittaa, että kohonnut ilmentyminen CCR6 on keskeisessä asemassa aggressiivinen fenotyypin CRC solujen

in vitro

.

(A) Western blotting-analyysi kohdunulkoisen ilmentymisen CCR6 in HCT116

Ctr ja HCT116

CCR6 soluja tai Caco-2

Ctr ja Caco-2

CCR6 tai SW1116

Ctr ja SW1116

CCR6 soluja. β-aktiini toimi latauskontrollina. Arvot ilmaistiin kertaiseksi muutoksia suhteessa kontrolleihin (Ctr) ja normalisoidaan p-aktiini. (B) haavan paranemista määritys motiliteettia HCT116

Ctr ja HCT116

CCR6 tai Caco-2

Ctr ja Caco-2

CCR6 tai SW1116

Ctr ja SW1116

CCR6 soluja . Edustavia kuvia yhden kentän alussa (t = 0) (ylempi paneeli) ja lopussa tallennuksen (t = 24 h) (alempi paneeli) kussakin kunnossa esitetty. Suhteellinen solujen vaeltamiseen in CCR6 ja kontrolliryhmien näkyvät oikeassa paneelissa. (C) edustavat kuvat siirtokuoppaan siirtynyt solujen pysyvästi transfektoitu HCT116

Ctr, Caco-2

Ctr, SW1116

Ctr (ylempi kuva) tai HCT116

CCR6, Caco-2

CCR6, SW1116

CCR6 (alempi kuva) soluja. Keskimäärin siirtynyt solujen HCT116

Ctr ja HCT116

CCR6 tai Caco-2

Ctr ja Caco-2

CCR6 tai SW1116

Ctr ja SW1116

CCR6 solut näkyvät oikeassa paneelissa. (D) edustaja kuvaa pesäkkeenmuodostusta HCT116

Ctr, Caco-2

Ctr, SW1116

Ctr (ylempi kuva) tai HCT116

CCR6, Caco-2

CCR6, SW1116

CCR6 soluja (alempi kuva). Arvot edustavat keskiarvoa kolminkertaisista kuopista, ± S.D. *

p

0,05, **

p

0,01, Wilcoxonin testi. Tiedot edustavat ainakin kolmen erillisen kokeen.

yli-ilmentyminen CCR6 Helpottaa Etäpesäke CRC Solut

in vivo

Maksa on yleisin sivusto peräsuolen syövän etäpesäkkeiden. Sen määrittämiseksi, ovatko CCR6 nimenomaan tärkeä rooli maksassa etäpesäke CRC perustimme kokeellisen

in vivo

maksan etäpesäke mallin ruiskuttamalla ihmisen kasvainsoluja pernat BALB /c-nude-hiirissä ja seuraa niiden kykyä hyökätä porttilaskimon kautta maksaan muodostaa etäpesäkkeitä. Määritellä suhde CCR6 ja CRC maksan etäpesäke

in vivo

, kuusi 7 viikkoa vanhoja BALB /c-nude-hiirtä kussakin ryhmässä injektoitiin HCT116

Ctr tai HCT116

CCR6 solujen perna ennen pernan poistoa. Jälkeen 5 viikkoa, hiiret tapettiin, ja metastaattisen kasvaimen kyhmyjä, että muodostuu maksassa tutkittiin. Silmiinpistävän, etäpesäkekasvainten kyhmyt olivat useammin löytyy maksa että HCT116-

CCR6 ryhmä kuin HCT116

Ctr ryhmä (kuvio 5A, merkitty valkoisilla nuolilla). Nämä tulokset viittaavat siihen, että CCR6 yli-ilmentyminen syöpäsoluissa voi parantaa maksan etäpesäkkeiden CRC. Lisäksi käytimme koko kehon pieneläinten fluoresenssikuvantamisella järjestelmä (IVIS) seurata kasvainsolujen vaeltamista

in vivo

. Ensin rakennetaan stabiilisti ilmentäviä lusiferaasin solulinja, lusiferaasia-HCT116 transfektoimalla HCT116-solujen kanssa lusiferaasin lentivirus, ja valitut nämä solut G418.