Krooninen sairaus

tiivistelmä

muuttuneita ilmauksia klaudiini proteiineja on raportoitu tumorigeneesin paksusuolen syöpä. Kuitenkin molekyylimekanismeja jotka säätelevät näiden tapahtumien tässä syöpätyypin tunnetaan huonosti. Tässä me raportoimme, että epidermaalisen kasvutekijän (EGF) lisää ekspressiota klaudiini-3 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen adenokarsinooma HT-29-soluja. Tämä kasvu liittyi lisääntynyt solujen vaeltamiseen ja muodostumista kiinnittymisestä riippuvaisen ja kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeitä. Me osoitti lisäksi, että ERK1 /2 ja PI3K-Akt reittejä olivat mukana säätelyssä näiden vaikutusten vuoksi erityinen farmakologinen esto estää näitä tapahtumia. Geenimanipuloinnilla klaudiini-1 ja klaudiini-3 HT-29-solujen osoitti, että yli-ilmentyminen klaudiini-1 alensivat solumigraatioon; kuitenkin, maahanmuutto ei muuttunut soluissa, jotka yli-ilmentynyt klaudiini-3. Lisäksi yli-ilmentyminen klaudiini-3, mutta ei, kun klaudiini-1, lisäsi tiiviin liitoksen liittyvät parasellulaarista flux makromolekyylien. Lisäksi lisääntynyt muodostuminen kiinnittymisestä riippuvaisen ja kiinnittymisestä riippumatonta pesäkkeitä havaittiin soluissa, jotka yli-ilmentynyt klaudiini-3, kun taas mitään tällaisia ​​muutoksia ei havaittu, kun klaudiini-1 yliekspressoitui. Lopuksi klaudiini-3 hiljentäminen yksin huolimatta aiheuttaa kasvun lisääntymistä, ja muodostumista anchoragedependent ja riippumattaman pesäkkeitä, se pystyi estämään EGF aiheuttama lisääntynyt pahanlaatuisten potentiaalia. Lopuksi tuloksemme osoittavat uudenlainen rooli klaudiini-3 yli-ilmentyminen edistämisessä pahanlaatuistumisriskin peräsuolen syövän soluja, jotka on mahdollisesti säätelee EGF-aktivoitu ERK1 /2 ja PI3K-Akt reittejä.

Citation: de Souza WF, Fortunato-Miranda N, Robbs BK, de Araujo WM, de-Freitas-Junior JC, Bastos LG, et al. (2013) Claudin-3-ilmentymän Kasvattaa pahanlaatuistumisriskin peräsuolen syövän solut: Roolit ERK1 /2 ja PI3K-Akt modulaattoreina EGFR signalointi. PLoS ONE 8 (9): e74994. doi: 10,1371 /journal.pone.0074994

Editor: Jung Weon Lee, Seoul National University, Korean tasavalta

vastaanotettu: 03 tammikuu 2013; Hyväksytty: 9. elokuuta 2013. Julkaistu: 19 syyskuu 2013

Copyright: © 2013 de Souza et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus sponsoroi Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnologico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçõamento de Pessoal de nivel Superior (CAPES), Ministério da Saúde – Brasilia, Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo á Pesquisa do Estado de Rio de Janeiro (FAPERJ) ja Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia em syöpä (573806 /2008-0 ja 170,026 /2008). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Tight liittymissä (TJS) ovat tärkeitä rakenteellisia komponentteja apikaalisella junktionaalinen monimutkainen epiteelin, jossa ne säätelevät erilaisia ​​solunsisäisiä prosesseja, kuten perustamalla apikaalisella-pohjapinta napaisuus ja aineiden virtaa poikki solujen väliseen tilaan [1 ]. Claudins ovat tärkeimmät, jotka säätelevät toimintoja TJs ja luokitellaan perhe tetraspan kiinteä kalvo proteiineja, joka kuuluu tällä hetkellä 27 jäsentä [2]. Lukemattomia sairauksien, kuten syövän, on liittynyt muutoksia ilmaisua, vakautta ja solunosasijaintia klaudiini perheenjäsenten [3], [4], [5], [6]. Kuitenkin tarkka molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät ilmentymistä ja toimintaa näiden proteiinien, erityisesti paksusuolen syövän, ovat huonosti tunnettuja.

epidermaalisen kasvutekijän reseptori (EGFR) on dimerisoidaan, ja aktivoidaan sen ekstrasellulaarisen ligandia, EGF, joka laukaisee signalointikaskadin, joka johtaa aktivaation sytoplasmisten reittejä, kuten MAPK ja PI3K-Akt [7], [8]; Näiden reittien tiedetään moduloivan proliferaatiota, erilaistumista ja kestävyys solukuolemaa [9], [10]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että nämä reitit ovat mukana liittyvät tapahtumat karsinogeenisia prosesseja hiiren orvaskeden ja ihmisen mahalaukun syöpäsoluja [11], [12], sekä lisääntynyt muuttavien ja invasiivisia potentiaali aikana epiteelin-mesenkymaalitransitioon ihmisen munasarjan soluihin [13]. EGF-välitteisen signalointireittien tiedetään myös tärkeitä rooleja järjestämisessä TJs, jossa ne säätelevät ilmentymistä ja lokalisointia klaudiini proteiineja. Esimerkiksi EGF: n on raportoitu indusoivan ylössäätelyyn claudins 1, 3 ja 4, ja EGF-indusoitu downregulation klaudiini-2 lisää voimaa solujen välisen esteen, määritettynä kasvaa epiteelin sähkövastus (TER) in MDCK- II-solujen [14], [15]. Kuitenkin käyttää samaa mallia (MDCK-soluissa), muut kirjoittajat ovat raportoineet, että downregulation klaudiini-2 indusoi korkeamman solun liikkuvuus, vaikka lisääntynyt TER [16]. Äskettäin EGFR /ERK /c-Fos polku osoitettiin säätää ylös klaudiini-2, kasvua, joka korreloi lisääntynyt solujen väliset läpäisevyys ja soluvaelluksen ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasolua [17], [18].

vähän tietoja tiedetään molekyylitason mekanismeista muutoksia klaudiini ilmaisua, jotka liittyvät paksu- ja peräsuolen kasvaimien syntyyn. Olemme osoittaneet, että potilailla, joilla on paksusuolen ja peräsuolen syövän esitti lisääntyneen ilmentymisen tasoja claudins 1, 3 ja 4, jotka muuttivat barrieerifunktiota TJs [19]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet kiistanalainen rooli klaudiini-1 aikana peräsuolen syövän synnyn; lisääntynyt klaudiini-1 ilmentymisen havaittiin maksan etäpesäkeleesioita paksusuolen syövän, mutta tämä ilmaus oli vähentynyt imusolmukemetastaaseja of paksusuolikarsinoomat [20], [21]. Lisäksi ERK1 /2 ja PI3K polkuja on raportoitu välittävän kasvaa EGF-indusoitu klaudiini-2: n ilmentymisen paksusuolen syöpäsoluissa; tämä tapahtuma oli mukana nousu leviämisen ankkurista riippumaton kasvu ja kasvaimen kasvu

in vivo

[22]. Siksi on tärkeää ymmärtää molekyylitason mekanismeja, jotka säätelevät ilmentymistä muiden klaudiini perheenjäsenten ja seurauksista klaudiini yli-ilmentymisen peräsuolen syövän etenemiseen.

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että EGF-välitteisen lisääntynyt ekspressio of klaudiini-3 liittyy lisääntynyt solujen vaeltamiseen ja muodostumista kiinnittymisestä riippuvaisen ja kiinnittymisestä riippumaton siirtomaat paksu- adenokarsinoomaa HT-29-soluja. Lisäksi osoitamme, että nämä tapahtumat välittyy ERK1 /2 ja PI3K-Akt reittejä. Olemme myös osoittaneet, että pakko yliekspressio klaudiini-3 HT-29-soluissa geenimanipulaation kasvatti pahanlaatuinen potentiaalia, kun taas yli-ilmentyminen klaudiini-1 laski solumigraation. Tärkeintä on, tuloksemme osoittavat, että klaudiini-3: lla on rooli kasvaimen promoottori kun sen ilmentymistä epätasa ja syytöstä ERK1 /2 ja PI3K-Akt signalointireiteissä modulaattoreina klaudiini-3 ylösajon liittyvät syövän etenemisen peräsuolen syövän soluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

anti-klaudiini-1 (Cat. no. 51-9000) ja anti-klaudiini-3 (Cat. no. 34-1700) kanin polyklonaalisia vasta-aineita sekä anti-α-tubuliinin hiiren monoklonaalinen vasta-aine (Cat. no. 32-2500) saatiin Invitrogen Inc. (Carlsbad, CA, USA). Anti-Akt (Cat. No. 4691) ja anti-p-Akt (Cat. No. 4058), kanin monoklonaalisia vasta-aineita sekä anti-ERK hiiren monoklonaalinen (Cat. No. 9107), vasta-aine hankittiin Cell Signaling (Beverly , MA, USA). Anti-uvomorulin /E-kadheriinin rotan monoklonaalisia (Cat. No. U3254) ja anti-p-ERK1 /2 hiiren monoklonaalista (Cat. No. M8159) vasta-aineet saatiin yhtiöltä Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Anti-E-kadheriinin hiiren monoklonaalinen vasta-aine (klooni 36, Cat. No. 610182) hankittiin BD Biosciences (San Diego, CA, USA). Piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani-anti-hiiri-IgG hankittiin GE Healthcare (Chalfont St Giles, UK). Alex-fluor-488 anti-kani (Cat. No. A11008) ja Alex-fluor-546 anti-rotta (Cat. No. A11010) saatiin Molecular Probes (Eugene, Oregon, USA). 2- (4-morfolinyyli) -8-fenyyli-1 (4H) bentsopyran-4-oni LY294002 (PI3K-estäjä) (Cat. No. L9908) saatiin Sigma-Aldrich, 2- (2-amino- 3-metoksifenyyli) -4H-1-bentsopyran-4-oni PD98059 (MEK1-inhibiittori) (Cat. no. 9900) saatiin Cell Signaling, ja EGF: n (Cat. no. PHG0311) ostettiin Invitrogen Inc.

Cell Culture

ihmisen kolorektaalisen adenokarsinooman solulinjoja Caco-2 (Cat. no. HTB-37) ja HT-29 (Cat. no. HTB-38) sekä ihmisen alkion

munuaisen

solulinja HEK-293 (Cat. no. CRL-1573) saatiin the American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Caco-2-solujen läsnä on vaihtelevia fenotyyppi yksikerroksista vaiheessa ja niillä on alhainen invasiivisia ja metastaattista potentiaalia [23], [24], [25], kun taas HT-29-solujen läsnä erittelemätön fenotyyppi ja korkea Tuumorigeenisuustutkimuksissa [ ,,,0],26]. Soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), joka oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (FBS), penisilliini G (60 mg /l), ja streptomysiinillä (100 mg /l) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä 5% CO

2 /ilma. Koetarkoituksiin solut ympättiin elylevyillä tai päälle lasipeitinlevyille.

hoito EGF ja farmakologiset inhibiittorit

Soluviljelmät käsiteltiin 20 ng /ml EGF keskittymä, joka meillä ovat käyttäneet aikaisemmassa tutkimuksessa [27]. Vaikutukset EGF-hoidon klaudiini-1 ja klaudiini-3: n ekspressio in Caco-2 ja HT-29-soluja arvioitiin kasvavien solujen DMEM-alustassa, jota oli täydennetty 10% FBS: ää sen jälkeen, kun 6, 24 ja 48 tuntia. Farmakologisen inhibition, soluja seerumia yli yön ja selektiivisiä estäjiä lisättiin soluviljelmiin 1 h ennen EGF hoitoa estämään luontainen kinaasiaktiivisuutta. Soluja inkuboitiin sitten tuoreella viljelyalustalla, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, joka sisältää EGF: n ja selektiivisten estäjien, jotka säilyivät koko kokeissa. Inhibiittorit laimennettiin DMSO: hon ja säilytetään -20 ° C: ssa. Kukin konsentroitu liuos laimennettiin välittömästi ennen kutakin koetta, jolloin saatiin lopulliset pitoisuudet 50 uM (PD98059) ja 8 uM (LY294002).

plasmidin muodostaminen, rekombinantin retrovirukset ja Infektio HT-29-solut

Constructs jotka sisältävät klaudiini-1 ja klaudiini-3 hiiren cDNA on kuvattu aiemmin [28], [29] ja ystävällisesti Dr. Mikio Furuse (Division of Cell Biology, Department of Physiology and Cell Biology, Koben yliopisto , Japani). CDNA: näissä konstruktit subkloonattiin pBabe-Puro selkäranka retroviruksen plasmidi tuottaa pBabe-Cld1 (BamH1-Xho1) ja pBabe-Cld3 (Bgl2-Xho1 rakenteet). HEK-293-soluja käytettiin retroviruksen pakkaus solujen jälkeen ohimenevän kotransfektiolla kalsiumfosfaattisaostuksella 24 h PCL-Ampho retroviruspakkauksen vektori (Cat. No. 10046P; IMGENEX, CA, USA) ja yksi seuraavista konstruktien : pBabe-Cld1, pBabe-Cld3 tai tyhjiä retrovirusvektoreita. Soluton supernatantti, joka sisälsi viruksen kerättiin 48 h transfektion jälkeen, sekoitetaan 1:01 tuoreella väliaineella, jota oli täydennetty 8 ug /ml polybreeniä (Cat. No. 107689; Sigma-Aldrich), ja välittömästi käytetään spin- infektio (2 x 45 minuutin ajan 400 x g huoneen lämpötilassa) 5 x 10

4 HT-29-soluja. Infektoituja soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa vielä 24 h, trypsinoitiin ja käytettiin kuten on osoitettu.

HT-29

Cld1 ja HT-29

Cld3 Cell Hakemisto Rakentaminen

HT -29

Cld1, HT-29

Cld3 tai tyhjä vektori (HT-29

pBabe) solut syntyvät transdusoimalla HT-29 villityypin solujen pBabe-Cld1, pBabe-Cld3 tai tyhjiä vektoreita ja valit- semalla onnistuneesti transdusoidut solut 7,5 ug /ml puromysiiniä (Cat. no. P8833, Sigma-Aldrich) vähintään 5 päivää. Kloonit eristettiin ja yli-ilmentyminen claudins 1 ja 3 on vahvistanut immunoblottauksella.

Claudin-3 hiljentäminen

HT-29-solut transfektoitiin joko ei-kohdistuksen ohjaus siRNA (siRNA negatiivinen ohjaus # 1, Cat. nro. 4390844; Ambion, TX, USA), sekoituskoodin kontrollina ei-sekvenssi-spesifinen vaikutus, tai klaudiini-3-spesifinen siRNA-sekvenssin (Äänenvaimennin, ennalta siRNA CLDN3, Cat. no. SI03101623; Qiagen, MD, USA). Solut (10

6) suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan 1SM puskuria [30], jonka toimitti ystävällisesti Dr. Martin Bonamino (pisteytetty, Brasilia), jotka sisältävät joko salattu tai CLDN3 erityisiä duplex. Solut siirrettiin 0,2 cm: n kyvetissä (Cat. No. MIR 50121; Mirus Biotech, Madison, WI, USA) ja elektroporaatiolla käyttäen W-17 ohjelma Lonza Nucleofector II elektroporaatio järjestelmä HT-29-solut (Lonza Ltd , Basel, Sveitsi). Sitten solut suspensoitiin varovasti uudelleen DMEM 10% FBS: ää lopulliseen siRNA-pitoisuus on 25 tai 45 nM. Vaimennus CLDN3 ilmentyminen varmistettiin immunoblottauksella solulysaateista ja tutkimalla ne vasta-aine klaudiini-3.

Cell Extraction ja immunoblottauksella

Caco-2 (3 x 10

5) ja HT-29 (2 x 10

5) soluissa ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin konfluenssiin asti. Solun molayers sitten kaavittu ja homogenisoitiin lyysipuskurissa (1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,2% SDS, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 10 mM HEPES, pH 7,3), joka sisälsi 20 mM NaF, 1 mM tiiniinia ja proteaasiestäjäseostabletit (1:100 laimennus) saada kokosoluliuotteista. Homogenoitu lysaatit sentrifugoitiin 10000 x g 10 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantit kerättiin ja säilytettiin -20 ° C: ssa myöhempää analyysia varten. Yhtä suuret määrät proteiinia (30 ug /kaista) per näyte erotettiin SDS-PAGE-elektroforeesilla 13% geeleissä ja siirrettiin nitroselluloosa-arkkeja. Membraanit blokattiin ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla vastaan ​​klaudiini-1 (1:500), klaudiini-3 (2 ug /ml), tai α-tubuliinin (1:1000). Pesun jälkeen kalvoja inkuboitiin piparjuuriperoksidaasi-konjugoidulla anti-kani tai anti-hiiri-vasta-aineita. Proteiinit visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssin kit (GE Healthcare, Chalfont St Giles, UK). Bändit kvantitoitiin niiden optiset tiheydet käyttäen Labworks 4,6 (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA).

Immunofluoresenssikoe

Caco-2 (2 x 10

5) ja HT -29 (10

5) solua siirrostettiin lasipeitinlevyille 24-kuoppalevyille ja inkuboitiin konfluenssiin asti. Yksisolukerrokset pestiin sen jälkeen PBS: llä ja kiinnitettiin metanolilla 10 minuutin ajan -20 ° C: ssa. Seuraavaksi soluja blokattiin 0,2% BSA: ta PBS: ssä 1 h ja läpäiseviksi 0,1% Triton X-100. Soluja inkuboitiin yön yli anti-klaudiini-1, anti-klaudiini-3 (01:40), anti-E-kadheriini (1:300) vasta-aineita, jota seurasi 1 h inkubaatioiden sopivan Alexa 488-konjugoidulla sekundaarisella vasta-aineita ( 1:500). Jälkeen Inkubaatioiden solut kiinnitetään käyttäen n-propyyli-gallate mahdollistaa visualisoinnin joko Axio Observe.Z1 mikroskoopilla, joka oli varustettu AxioCam HRc ja AxioVision Release 4.8 digitaalinen kuvankäsittely ohjelmistot (Carl Zeiss Inc., Jena, Saksa) tai konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi

FV10i-O

, josta kuvat analysoitiin käyttämällä FV10-ASW ohjelmisto (Olympus, Tokio, Japani).

haavan paraneminen Assay

HT-29-soluja (2 x 10

5) ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin konfluenssiin asti. Suorittamaan arpeutumisprosessit määrityksissä yksisolukerrokset manuaalisesti haavoittui raaputtamalla pipetinkärjet. Erilaisten käsittelyjen jälkeen solut sallitaan kulkeutumaan paljaaksi alueilla ja valokuvattiin välittömästi haavoittamisen jälkeen (0 h) ja 6 h tai 24 h haavoittamisen jälkeen. Välinen etäisyys kahden reunojen paljaaksi alueen kvantitoitiin kolmena kappaleena ja toistettiin itsenäisesti kolme kertaa. Muuttoliike on edustettuna prosenttiosuus solujen vaeltamiseen ja graafisesti.

soluproliferaatiomäärityksissä

Suhteellinen elävien solujen määrä määritettiin käyttäen kristalliviolettia tai trypansininen väriaineita. Kristallivioletti- menetelmä suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [31]. Lyhyesti, HT-29-solut (10

4) ympättiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin elatusaineessa tai ilman EGF: ssa 24 ja 48 tuntia ennen etanolia kiinnitys 10 min. Kristalliviolettimäärityksessä liuosta (0,05% kristalliviolettia ja 20% metanolia) lisättiin soluihin 10 min. Solut pestiin ja liuotetun metanolilla. Absorbanssit 595 nm: ssä mitattiin Spectra Max 190-spektrofotometrillä (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Sillä trypaanisinistä menetelmä, transdusoidut HT-29-soluja (2 x 10

5) ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja niitä inkuboitiin viljelyväliaineessa 6 tuntia. Inkubaatioiden solut trypsinoitiin (0,05% trypsiiniä /0,02% EDTA: a PBS-liuosta) ja laskettiin koskevasta Axio Observe.Z1 mikroskooppia (Zeiss), jossa on Neubauer kammion hemasytometriä ja trypaanisinisen väriaineen (0,4% trypaanisinisellä PBS-liuos) .

Anchorage riippuvaisia ​​ja riippumattaman Colony Formation

kiinnittymisestä riippuvaisia ​​pesäkkeiden muodostumisen määritykset, HT-29-solut ympättiin alhainen tiheys (2,5 x 10

2) 4 h 12-kuoppalevyille ja käsitelty EGF 5 päivää tai ne jätetään hoitamatta. 5 päivän jälkeen solut kiinnitettiin etanolissa 10 minuutin ajan ja värjättiin kristalliviolettiliuoksella (0,05% kristalliviolettia ja 20% metanolia). Solut pestiin kahdesti vedellä ja liuotetaan metanoliin. Pesäkkeet joko laskettiin kanssa Axio Observer.Z1 mikroskoopilla (Zeiss) tai absorbanssit mitattiin 595 nm: ssä Spectra Max190 spektrofotometrin (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA).

kiinnittymisestä riippumaton colony muodostumisen määritykset, 12-kuoppaisia ​​levyjä päällystettiin kasvualustaan, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, joka sisälsi 0,6% agaroosia, jotta vältetään solun tarttuvuus alustaan. HT-29-soluja (5 x 10

2) suspendoitiin sen jälkeen uudelleen viljelyalustaan, joka sisälsi 10% FBS: ää plus 0,3% agaroosia, ympättiin alustalle edellä kuvataan, ja toimitetaan erilaisia ​​hoitoja varten 11 päivää (kuten on osoitettu). Päätepisteessä, pesäkkeet laskettiin kanssa Axio Observer.Z1 (Zeiss).

mittaus epiteelin Electrical Resistance (TER) B

TJ toimivuus arvioitiin myös mittaamalla TER kohteeseen arvioida parasellulaarisen vuon ioneja, kuten aiemmin on kuvattu Contreras ja kollegat [32] pienin muutoksin. Lyhyesti, transdusoidut HT-29-solut (10

4) ympättiin yhtymäkohdassa päälle TranswellTM polyesteri kalvo soluviljelmissä lisää kanssa 0,4 um huokoskoon ja 0,33 cm

2 pinta-ala (Cat. No. CLS3470; Sigma-Aldrich ). TER-arvot määritettiin käyttäen Millicel-ERS-järjestelmä (Millipore Co., Billirica, MA, USA). Arvot piirrettiin kuvaaja normalisoitiin alueelle insertin ja tyhjä arvo (kylpy liuos inkuboitiin insertti ilman soluja) vähennettiin. TER oli siis mitattiin ohmia × cm

2 (Ω · cm

2).

makromolekyylipitoisuus Läpäisevyys Pitoisuus

edelleen testata TJ toiminnallisuus, makromolekyläärisestä läpäisevyys arvioitiin käyttäen vasta-ainetta läpäisevyyden määritys, kuten aiemmin on kuvattu [33]. Transdusoidut HT-29-solut (10

5) ympättiin lasipeitinlevyille 24-kuoppalevyille ja inkuboitiin konfluenssiin asti. Yksisolukerrokset kiinnitettiin sitten 2% paraformaldehydillä, ja inkuboitiin anti-uvomorulin /E-kadheriinin vasta-aineen 2 h nonpermeabilization olosuhteissa, jota seurasi 1 h inkubointi vastaavan sekundaarisen vasta-aineen 37 ° C: ssa. Uvomorulin /E-kadheriinin värjäys tehtiin näkyväksi kanssa Axio Observer.Z1 (Zeiss).

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin yksisuuntainen ANOVA, jota seurasi Dunnettin post -testaukset tai t-testiä käyttäen GraphPad Prism 4,02 ohjelmisto (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Kuvaajat ovat keskiarvo ± keskivirhe (SEM) kolmen erillisen kokeen. Erilainen p 0,05 pidettiin tilastollisesti merkittävänä.

Tulokset

EGF Lisäykset Protein tasot Claudin-3 HT-29-solut, mutta ei Caco-2-solut

Aluksi tutkimme muutokset ekspressiotasot klaudiini-1 ja klaudiini-3 jälkeen EGF hoidon kaksi peräsuolen adenokarsinooma solulinjat, Caco-2- ja HT-29, jotka eroavat toisistaan ​​erilaistumista tilan ja metastaattisen potentiaalin. Havaitsimme, että EGF-hoito ei merkittävästi muuttanut proteiinia tasot claudins 1 ja 3 Caco-2 ja HT-29-solujen varhaisessa ajankohtana (6 h) (Fig. 1A). Pitkäaikaisessa EGF-hoidon ajat (24 ja 48 h), proteiinin tasot claudins 1 ja 3 ei muuttanut merkittävästi Caco-2-soluissa. Kuitenkin HT-29-solut osoittivat merkitsevästi kohonneeseen klaudiini-3, kun taas tasojen klaudiini-1 pysyi ennallaan tässä samassa aikapisteessä hoidon (Fig. 1 B). Lisäksi immunofluoresenssilla analyysi osoitti, että EGF-hoito 48 h ei muuttanut leviäminen claudins 1 ja 3 Caco-2-solut (Fig. 2A). Kuitenkin, epäjatkuva värjäytymiskuvion ja täsmällinen kertyminen näiden proteiinien havaittiin joissakin solu-solu-kontakti alueilla HT-29-solut (Fig. 2B). Koska EGF ei muuttanut proteiinin tasot claudins 1 ja 3 Caco-2-solut, me tutki EGF voi aktivoida efek- reittejä tässä solulinjassa. Olemme varmistaneet, että EGF käsittely lisäsi fosforylaation tasoja ERK1 /2 (Fig. S1), tunnettu signalointi efektori laukaisi EGF. Nämä tulokset osoittavat, että EGF-hoito differentiaalisesti säätelee claudins 1 ja 3 riippuen solujen yhteydessä. Näiden tulosten perusteella valitsimme HT-29-solujen myöhempää toiminnallisia analyysejä johtuen muutokset havaittiin ilmaisua ja subsellulaarisen jakelu klaudiini proteiinien jälkeen EGF hoidon.

viljellyissä Caco-2- ja HT-29-soluja käsiteltiin EGF: ää (20 ng /ml) 6 tunnin ajan (A), 24 h ja 48 h (B). Seuraavat EGF hoito, koko solulysaatit kerättiin ja analysoitiin immunoblottauksella ekspressiota varten claudins 1 ja 3. α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. Luvut edustavat suhde optinen tiheys EGF-käsiteltyjen käsittelemättömiin soluihin normalisoidaan α-tubuliinin.

Claudin

; Cld. α

tubuliinia

; α-amme.

yksisoluiset kerrokset kasvatettiin lasipeitinlevyille ja käsitellään immunofluoresenssimenetelmällä analyysi klaudiini-1 ja klaudiini-3 jakelun jälkeen EGF hoidon (48 h). Värjätyt solut suhtautua konfokaali

FV10i-O tai

Axio Observe.Z1 mikroskoopit. (A) Caco-2-solujen

; bar: 5

um. (B) HT-29-solut; bar: 10 um.

Arrowheads

; täsmällinen kertymistä claudins.

Ctr

; ohjaus.

EGF Hoito Kasvattaa Migration ja Anchorage-Dependent ja Anchorage-Independent Colony Formation of HT-29 Cells

Olemme osoittaneet, että lisääntynyt solujen maahanmuutto liittyy mekanismeihin kasvaimen etenemisen syöpäsoluissa [10], [31] ja että EGF käsittely lisäsi muuttoa Caco-2-solujen [34]. Sen määrittämiseksi, ovatko EGF muuttanut muuttoa HT-29-solujen, suoritimme arpeutumisprosessit määrityksissä jälkeen EGF hoidon. Havaitsimme, että 24 h kuluttua EGF: n hoitoon, solun muuttavia mahdolliset lisättiin verrattiin käsittelemättömien solujen (kuvio. 3A ja 3B). Tutkia tarkemmin, ovatko haavan sulkemiseen oli todellakin johtuu siirron tilan eikä solujen lisääntymistä, me todentaa suhteellisen määrän eläviä soluja. Kuvio 3C osoittaa, että solujen lisääntymistä ei muuttunut EGF-käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin samaan aikaan pisteen, joka havaittiin haavan paranemista määrityksessä. Lisäys solujen proliferaatio havaittiin vain 48 tuntia sen jälkeen, kun EGF-hoidon.

(A, B) HT-29-soluja kasvatettiin 6-kuoppaisilla levyillä, kunnes konfluentteja. Seuraavaksi yksisolukerrokset haavoittuneen ja käsiteltiin EGF, ja solumigraatio näillä alueilla seurattiin 24 tuntia. (C) HT-29-solut ympättiin 96-kuoppaisille levyille ja käsiteltiin EGF: n kanssa osoitettuna aikoina, ja proliferaatio määritettiin kvantitatiivisesti käyttämällä kideviolettimenetelmää. Pylväskaavion osoittaa suhde absorbanssi EGF-käsiteltyjen käsittelemättömiin soluihin (kontrolli). Bar: 100 pm. Virhejanat osoittavat keskiarvoja ± SEM (n = 3); ** P 0,01, *** p 0,001 määritettynä t-testillä.

Tiedetään, että solun muuntaminen on tärkeä parametri arvioida pahanlaatuinen potentiaalia, jota voidaan myös arvioi solujen kyky muodostaa kiinnittymisestä riippuvaisia ​​ja kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeet [35], [36]. Tässä yhteydessä voimme arvioida solun muuttamassa potentiaalia EGF HT-29-soluja. Kuten havaitaan kuviossa 4A, EGF-käsitellyt solut näytetään suurempi määrä kiinnittymisestä riippuvaisten pesäkkeitä verrattuna käsittelemättömiin soluihin. Lisäksi EGF hoito lisäsi kiinnittämisestä riippumaton pesäkkeitä ja siirtomaa koot verrattuna kontrolliin soluihin (Fig. 4B). Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että EGF parantaa liittyvät tapahtumat pahanlaatuistumisriskin erilaistumattoman peräsuolen syöpäsoluja.

(A) edustaja valokuvia kiinnittymisestä riippuvaisten pesäkkeet, jotka värjättiin kristallivioletilla jälkeen EGF hoidon. Pylväiden osoittavat suhde kertainen nousu pesäkkeitä muodostumiseen EGF-käsiteltyjen käsittelemättömiin soluihin (kontrolli). (B) Kuvat ovat kiinnittymisestä riippumattoman pesäkkeet, jotka osoittavat kokoerot EGF-käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen. Pylväiden osoittavat suhde kertainen nousu pesäkkeiden muodostumiseen EGF-käsiteltyjen käsittelemättömiin soluihin (kontrolli). Bar: 10 um. Virhejanat osoittavat keskiarvoja ± SEM (n = 3); * P 0,05, ** p 0,01 määritettynä t-testillä.

ERK1 /2 ja PI3K-Akt Signaling Mediate EGF-indusoitu Kohonneita Cell Muuttoliike ja Colony muodostaminen HT-29 Cells

EGF on hyvin tiedetään aktivoivan signalointireittien, kuten ERK1 /2 ja PI3K-Akt, säätelemään solujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja erilaistumista erilaisissa kasvainsolun malleja. Siksi olemme analysoineet ovatko nämä reitit voivat myös moduloida taustalla EGF aiheuttama tapahtumia, meillä oli huomannut täällä, kuten lisääntyminen klaudiini-3 ilme. Kuten nähdään kuviosta 5A, EGF-hoito lisäsi fosforylaation tasoja ERK1 /2 ja Akt, joka osoittaa aktivointi näiden proteiinien. Seuraavaksi farmakologisesti esti MEK1 /2-ERK1 /2 ja PI3K-Akt reittejä kanssa PD98059 ja LY294002 vastaavasti tarkistaa, olivatko reittejä pystyi mukauttamaan EGF aiheuttama lisäys klaudiini-3 ekspressiotasot HT-29-soluja. Havaitsimme, että hoito nämä inhibiittorit yksinään tai yhdistelmänä estää EGF-indusoitu kasvu klaudiini-3 ilmentymistasot (kuvio. 5B). Lisäksi havaitsimme, että inhibitio ERK1 /2 ja PI3K-Akt signalointireittien estää EGF-indusoitu lisääntyminen solujen vaeltamiseen (kuvio. 5C). Kuvioissa 5D ja 5E, me Lisäksi todennettiin, että esto molempien reittien esti EGF-indusoimaa kasvua numerot kiinnittymisestä riippuvaisen ja kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeitä. Mielenkiintoista, esikäsittely kanssa PI3K estäjän yksin ja yhdessä ERK1 /2-estäjä vähensi ankkurointi riippuvaista pesäkkeiden muodostumista. Yhdessä nämä tiedot tukevat vahvasti käsitystä, että ERK1 /2 ja PI3K-Akt reittejä ovat mukana myös lisääntynyt klaudiini-3 ekspressiotasot samanaikainen lisääntyneen pahanlaatuinen potentiaalia, jota indusoi EGF HT-29-soluja.

(A) HT-29-soluja kasvatettiin ja käsiteltiin EGF 5, 15, 30 ja 60 min, jonka jälkeen koko solulysaatit kerättiin ja analysoitiin immunoblottauksella p-ERK1 /2, ERK1 /2, p- Akt, ja akt. (B) Soluja kasvatettiin ja esikäsiteltiin 1 tunti, jossa on esitetty estäjien ennen inkubaatiota EGF 48 tuntia. Kokosoluliuotteista kerättiin ja analysoitiin immunoblottauksella varten klaudiini-3. a-Tubulin käytettiin latauskontrollina. Luvut edustavat suhde optinen tiheys käsitelty käsittelemättömien solujen normalisoidaan proteiinin kokonaismäärän tai α-tubuliinin. Edustavat kuvat haavan paranemista (C), kiinnittymisestä riippuvaisia ​​pesäkkeiden muodostumisen (D) ja kiinnittymisestä riippumaton pesäkkeiden muodostumisen (E) määritykset. Solut esikäsiteltiin estäjien kanssa kuten on osoitettu, ja määritykset suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Kiinnittymisalustasta riippuva määrityksessä pylväsdiagrammi osoittaa suhde kertainen nousu pesäkkeitä muodostumiseen käsitelty käsittelemättömien solujen (verrokki). Kiinnittymisalustasta riippumaton määrityksessä bar kaaviot osoittavat suhde kertainen nousu pesäkkeiden muodostumista käsitelty käsittelemättömien solujen (verrokki). Bar: 200 pm. Virhejanat osoittavat keskiarvoja ± SEM (n = 3); ** P 0,01 määritettynä ANOVA.

Pakko yliekspressio Claudin-1 ja Claudin-3 lisää TER, mutta Claudin-3-ilmentymän Helpottaa parasellulaarisen Flux makromolekyyleihin

tulosten perusteella edellä kuvatun, me olettaisi, että ero ekspressiotasot klaudiini-1 ja klaudiini-3 on tärkeä rooli paksusuolen syövän etenemisen. Edelleen Tämän hypoteesin testaamiseksi olemme pakko ekspressiota klaudiini-1 ja klaudiini-3: n cDNA: HT-29-soluja, ja tuloksena saadut solut nimettiin HT-29

Cld-1 ja HT-29

Cld-3 vastaavasti. Immunoblot-analyysi vahvisti vankka klaudiini-1 (HT-29

Cld-1) ja klaudiini-3 (HT-29

Cld-3) yli-ilmentymisen verrattuna soluihin, jotka oli transdusoitu tyhjällä vektorilla (HT-29

pBabe) (Fig. 6A). Lisäksi solut, jotka yli-ilmentynyt nämä proteiinit näytetä lisääntynyt sytoplasminen värjäys; kuitenkin, merkinnät pidettiin solu-solu-kontaktien (Fig. 6B).

(A) Soluja kasvatettiin ja kokosoluliuotteista kerättiin ja analysoitiin immunoblottauksella ilmentämistä varten klaudiini-1 ja claudin- 3. Luvut edustavat suhde optinen tiheys klaudiini transdusoimattomien tyhjille vektori-transdusoidut solut normalisoidaan α-tubuliinin. (B) Soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille jalostettu läpäiseväksi edellytykset immunofluoresenssimenetelmällä analyysiä klaudiini-1 ja klaudiini-3 jakelu; bar: 5 um. (C) Soluja kasvatettiin TranswellTM insertit ja TER mitattiin käyttäen Millicel-ERS-järjestelmä. Pylväiden esittävät TER arvot normalisoitu alueelle insertin kanssa tyhjän arvo vähennetään. (D) Soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille ja käsitellään immunofluoresenssimenetelmällä ei-läpäiseväksi olosuhteissa arvioida makromolekyyliseen läpäisevyys käyttäen anti-uvomorulin /E-kadheriinin vasta-aine; bar: 10 um. (E) Soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille ja käsiteltävä läpäiseväksi olosuhteet immunofluoresenssianalyysillä E-kadheriinin jakeluun. Värjätyt solut katsella

FV10i-O

-konfokaalimikroskoopilla. Virhejanat osoittavat keskiarvoja ± SEM (n = 3); α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina.