Krooninen sairaus

tiivistelmä

tunnistaminen geeniekspressioprofiilien syövän kantasoluja voi olla merkittäviä vaikutuksia ymmärtämisessä tuumoribiologiassa ja suunnittelun uusille hoitoja suunnataan näihin soluihin. Kirjoittajat raportoivat mahdollisesti munasarjasyövän kantasolujen geeniekspressioprofiili eristetyistä puolelta väestöstä tuoretta askites saatu naisten korkealaatuisesta pitkälle papillaarinen vakavasta munasarjojen adenokarsinooma. Affymetrix U133 Plus 2.0 mikrosiruja käytettiin kuulustella differentiaalisesti ilmentyvien geenien välillä puolella väestöstä (SP) ja valtaväestön (MP), ja tulokset analysoitiin pariksi T-testi käyttäen BRB-ArrayTools. Havaitsimme 138 säädelty ja 302 alas geenien, jotka ilmentyvät differentiaalisesti kaikkien 10 SP /MP paria. Microarray data validoitiin käyttäen qRT-PCR and17 /19 (89,5%), omasivat vankka korrelaatioita microarray ja qRT-PCR ekspressiotietojen. Reitti Studio analyysi tunnistettu useita geenejä osallisena solujen eloonjäämistä, erilaistumista, lisääntymistä, ja apoptoosin jotka ovat ainutlaatuisia SP solujen ja mekanismi aktivointia Notch signalointi tunnistetaan. Validoida Näiden havaintojen olemme tunnistaneet ja eristetty SP soluja rikastetaan syövän kantasoluja ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa. SP populaatioita, joilla on suurempi pesäkkeitä muodostavaa tehokkuutta verrattuna sen MP vastine ja myös kykenee ylläpitämään kestävää laajentamiseen ja erilaistumista SP ja MP fenotyyppejä. 50000 SP-solut tuottivat kasvaimen nude-hiirissä kun taas sama määrä MP-solujen ei anna mitään kasvainta 8 viikkoa injektion jälkeen. SP-soluissa osoitettiin annoksesta riippuva herkkyys tietyille γ-sekretaasin estäjät syyllistämättä rooli Notch signalointireitin SP solujen eloonjäämistä. Edelleen syntyvän SP geeni lista havaittiin rikastettu toistuvien munasarjasyövän kasvaimia.

Citation: Vathipadiekal V, Saxena D, Mok SC, Hauschka PV, Ozbun L, Birrer MJ (2012) tunnistaminen Mahdolliset Munasarjojen Cancer Stem Cell geeniekspressioprofiili Advanced Stage papillaarinen seroosit munasarjasyöpä. PLoS ONE 7 (1): e29079. doi: 10,1371 /journal.pone.0029079

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 05 heinäkuu 2011; Hyväksytty: 21 marraskuu 2011; Julkaistu: 17 tammikuu 2012

Tämä on avoin-yhteys artikkeli, vapaa kaikki tekijänoikeudet, ja saa vapaasti jäljentää, levittää, välittää, modifioitu, rakennettu, tai muuten käyttää kuka tahansa laillista tarkoitusta. Teos on saatavilla Creative Commons CC0 public domain omistautumista.

Rahoitus: Tätä työtä tukee osittain avustuksia National Institutes of Health (5R01CA142832-02 216288 2009A051746, 1RC4CA156551-01 217168 2010A053125 ja Intramural tutkimusohjelma National Cancer Institute) ja MJB. PVH ja DS tukivat avustusta CDMRP-DOD (W81XWH-06-1-0422 ja W81XWH-09-1-0292), Susan G. Komen varten Cure (BCTR 0600935), ja Orthopaedic Surgery Foundation, lastensairaala Boston. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

epiteelikasvaimet munasarjasyövän on viides suurin syy naisten yleisin kuolinsyy Yhdysvalloissa. Vuonna 2010 tulee olemaan arviolta 21880 uutta tapausta ja 13850 kuolemantapaukset munasarjojen Caner Yhdysvalloissa [1]. Vaikka 5 vuoden pysyvyys on 90% naisilla, joilla alkuvaiheen munasarjasyöpä, noin 80% naisista esiintyy myöhäisvaiheen tauti ja on 5 vuoden pysyvyys on vain 30%. Tavanomainen hoito sisältää sytoreduktiivisen leikkauksen ensilinjan yhdistelmä kemoterapiaa [2]. 75% potilaista aluksi vastata tavanomaisen kemoterapian kuitenkaan 80% näistä naisista lopulta taudin uusiutumiseen ja kuolevat kemoterapiaa resistenttejä [2].

On yhä enemmän todisteita siitä, että pienet populaatiot solujen kasvaimia kutsutaan syöpä kantasoluja (CSC) edistää kasvaimen huolto- ja etenemistä ja ovat luontaisesti resistenttejä hoitoja suunniteltu tuhoamaan nopeasti jakautuvia soluja, [3], [4], [5], [6], [7]. CSC on kuvattu useista ihmisen kiinteiden syöpien, kuten rinta- [8], aivot [9], [10], paksusuolen [11], [12], pään ja kaulan [13], ja haimasyövän [14]. Kokeet suoritettiin ihmisen akuuttia myelooista leukemiaa [15] ja kiinteät kasvaimet [8], [9] osoittavat, että CSCS näyttää kolme toiminnalliset ominaisuudet: 1) heillä on Tuumorigeenisuustutkimuksissa muodostaa kasvaimia kun ruiskutetaan nude-hiiriin, 2) ne ilmentävät erillistä pinta markkereita mahdollistaa toistettavissa ja ero puhdistus, ja 3) niillä on kyky luoda täysi fenotyyppinen heterogeenisyys vanhemman kasvain [16], [17]. Siten määritelmä CSC on toiminnallinen ja osakkeiden kaksi tärkeää toiminnalliset ominaisuudet normaali kantasolujen: itseuudistumiseen ja erilaistuminen [3], [7].

vaikeus luonteenomaiset normaalissa ja syövän kantasoluja on, näiden solupopulaatioiden ovat harvinaisia ​​ja jos erityisiä solunpintamarkkereiden on haaste voidaan eristää ja tunnistaa puhdas kantasolukkoa. Kyvyttömyys eristää puhdasta kantasolupopulaatiosta on luonut voimakasta keskustelua CSC malli [18], [19], [20]. Useat kantasolujen merkkiaineita (CD133, CD44, Sca1) on käytetty menestyksekkäästi eristämään kantasoluja normaalissa ja kasvainkudoksessa [21], [22], [23]. Ei kuitenkaan markkeri on tunnistettu, että on yksinomaan läsnä kantasolujen [7]. Solunpintamarkkereiden löytyy kantasoluja yhdestä kudoksesta eivät aina hyödyllistä tunnistaa kantasolujen toisesta kudoksesta koska monet näistä merkeistä löytyy myös ei-kantasolujen ulkopuoliselta kudosten ja elinten [7].

Goodell ym ensimmäinen raportoitu pienen solupopulaatio osoittaa selvästi FACS profiili pois puolelle valtaväestön johtuen tehokkaampi Hoechst väriaine ulosvirtausta ja alemman fluoresoiva intensiteetti signaali [24]. Tämä solujen alaluokka on kutsutaan puolelle väestöstä (SP) ja rikastetaan hematopoieettisten kantasolujen hiiren luuytimestä [24]. Monet tutkimukset SP on suoritettu useita syöpiä, kuten leukemiat, aivojen, eturauhasen, ruoansulatuskanavasta, melanooma, retinoblastooma, ja monet syöpäsolulinjat, johtavat oletuksen, että SP on rikastettu CSC [8], [25 ], [26], [27], [28], [29], [30], [31]. Nyt on osoitettu, että munasarjasyöpä, kuten monet muut tuumorit, sisältää SP-soluja, jotka ilmeisesti vastaavat CSCS vastuussa kasvaimen kasvua [32], [33]. SP soluja munasarjasyöpä on osoitettu sen herkkyys kohti Mullerin estävä aine ja IFN-α [32], [33]. Ehdotamme puolella väestöstä vesivatsoja naisten korkealaatuisesta pitkälle papillaarinen serous munasarjan adenokarsinooma olisi rikastettu syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja, ja ilmaisisi geenin allekirjoituksen trendi ”stemness” in munasarjasyöpä kantasoluja kaltaisia ​​soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tuore askites saatiin 10 naista, joilla on korkea-asteen pitkälle munasarjojen adenokarsinooma aikaan ensisijaisen sytoreduktiivisen kirurgian Brigham and Women n sairaala, Boston , MA. Kaikki näytteet kerättiin alle protokollien hyväksymien institutionaalisten tarkastuslautakunta Brigham ja naisten sairaalan ja saatiin ilmoitettiin kirjallinen suostumus potilaista. Eläinten hoito ja kokeet suoritettiin ohjeiden mukaisesti ja hyväksyntää MGH Animal Care ja Käytä komitea (pöytäkirja ei. 2009N000148).

tuumorinäytesylinterin ja eristäminen Osapopulaatioiden solujen

tuore askites saatiin 10 naista, joilla on korkea-asteen pitkälle munasarjojen adenokarsinooma aikaan ensisijaisen sytoreduktiivisen kirurgian Brigham and Women n sairaala, Boston, MA. Askites Näytteitä sentrifugoitiin 1400 RPM eristää soluja. Hajottamisen jälkeen erytrosyytit, jäljellä olevat solut siirrostettiin ja kasvatettiin viljelmässä ruokia ilman siirrostamalla. Ennen lajittelu, solut värjättiin CD45 poissulkemiseksi veriteitse soluja ja CA125-vasta vahvistaa munasarjojen alkuperä näiden solujen. CD 45 ja CA 125 analyysi suoritettiin käyttäen FACS. CD45 ja CA125 vasta ostettiin BioLegend ja Invitrogen vastaavasti. Välillä päivänä 7 ja 10 solut värjättiin Hoechst33342 tai 0,5 ug /ml rodamiini 123 (Rho) [34] ja lajitellaan BD FACSAria varustettu violetti laserilla. Ohjaus kokeita varmisti, että Hoechst

DIM

vs.

Rho

DIM puolella väestöstä (SP) jakeet eristetään molemmat menetelmät olivat samanlaisia ​​mukaan% runsaus ja geeniekspressioprofiili.

Affymetrix GeneChip hybridisaatio- ja kuvanseurantajärjestelmä

Kokonais-RNA uutettiin SP ja MP käyttäen RNeasy-kittiä (Qiagen, Germantown, MD). Kokonais-RNA laatu ensin tarkastettava Bioanalyzer (Agilent, Palo Alto, CA) ennen lisäkäsittelyä. Kaksi kierrosta monistusta käytettiin, kuten aikaisemmin on kuvattu [35]. Hybridisaatio, jalostus ja kuva hankinta suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [35].

Data normalisointi ja analyysi

Kaikki array data on vähimmäismäärä tietoa Microarray Experiment (MIAME) -yhteensopiva ja raakadataa on on talletettu MIAME yhteensopiva tietokanta (GEO, Liittyminen numero: Series GSE33874) B

GeneChip- kuvia ja tietoja ladattiin National Cancer Instituten Microarray Analysis Database (MADB) arvioinnin (http: //nciarray.nci .nih.gov /index.shtml). Matalan tason analyysiin sisältyi joukko normalisoituminen ja arviointi ekspressiotason. Tämä toteutettiin invarianttia asettaa normalisoinnin muuttaa tehosteen signaalitaso paneelit samalle tasolle edelleen vertailun [36]. Seuraavaksi soveltaa malliin perustuvaa lähestymistapaa laskea geeniekspression tasolla. Matalan tason analyysi tehtiin käyttäen MAS5.0 normalisoitu tietoja BRB ArrayTools versiossa 3.6.0 ohjelmisto on suunniteltu Dr. Richard Simon ja Amy Peng Lam on Biometrics Research Branch, NCI, NIH.

Quantitative real- PCR

qRT-PCR suoritettiin 50 ng monistettua RNA: ta käyttäen iCycler Real-Time Detection System (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), kuten aiemmin on kuvattu [37], käyttämällä SuperScript III Platinum SYBR Green One-Step qRT-PCR mukaan valmistajan ohjeiden (Invitrogen, Carlsbad, CA). Suhteellinen ekspressiotasot kunkin geenin saatiin normalisoinnin ilmentymistasojen kolme siivous geenien (

Syklofiliiniesimerkkeihin, GUSB, GAPDH

) [38]. Reaaliaikainen PCR ilmaisua arvoja käytettiin korrelaatio analyysit mikrosirujen signaali intensiteettiä. Pearsons ”ja Spearmans” listalla korrelaatio suoritettiin käyttämällä GraphPad Prism 5,00 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA).

Solulinjat ja viljelyolosuhteet

Ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa SKOV3, A224, OVCAR-3, ja UCI-107 pidettiin RPMI 1640 (Invitrogen Life Technologies), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia, 1% L-glutamiinia ja 1% penisilliini /streptomysiiniä kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2 37 ° C: ssa, kuten ovat kuvanneet Mok et ai [39].

Virtaussytometrianalyysi

solut irrotettiin trypsinoimalla, sentrifugoitiin ja suspendoitiin uudelleen kudosviljelyelatusaineeseen, joka sisältää 2% seerumia, jonka pitoisuus 1 x 10

6 solua /ml. Solut leimattiin 5,0 ug /ml Hoechst33342 väriaine 37 ° C: ssa 90 minuutin ajan joko yksin tai yhdessä ABCB1 effluksipumpun estäjä Verapamiili (100 uM). Lopussa Inkuboinnin jälkeen solut sentrifugoitiin kylmässä ja suspendoitiin uudelleen kylmään tuoretta kasvualustaa 2% seerumia. 7-amino-aktinomysiini D (7AAD) lisättiin soluihin loppupitoisuuteen 2 ug /ml ennen FACS-analyysiä jättää kuolleita soluja analyysista. SP-analyysi tehtiin käyttäen BD LSRII System (BD Biosciences). Hoechst-väriaine oli innoissaan UV laser ja sen fluoresenssi mitattiin sekä 675LP (Hoechst punainen) ja 440/40 suodattimet (Hoechst Blue).

Värjäys luulotellun kantasolujen merkkiaineita

immunofenotyyppisiä luonnehdinta SP-soluissa suoritettiin käyttäen fluoresoiva isotiosyanaatti (FITC), fykoerytriini (PE), ja allofykosyaniini (APC) konjugoituja monoklonaalisia vasta-aineita. Ennen vasta-aineen värjäyksen jälkeen solut värjättiin SP-soluissa käyttäen Hoechst 33342, kuten edellä on kuvattu. Sitten solut pestiin ja inkuboitiin CD24-RPE (ABD Serotec), CD34-FITC (Miltenyi Biotec), CD44-FITC (ABD Serotec), CD117-PE (Miltenyi Biotec), ja CD133-APC (Miltenyi Biotec) PBS: ssä 4 ° C: ssa 15 minuutin ajan pimeässä. Fluoresenssin korvaus puitteet monivärinen virtaussytometristen analyysit tehtiin käyttämällä BD CompBeads Anti-hiiri Ig, κ (BD Biosciences) ja kaikki analyysi suoritettiin käyttäen BD LSRII System (BD Biosciences). FITC ja PE-vasta-aineita viritettiin 488 nm ja kerättiin käyttäen 530/30 nm (FITC), 575/26 nm (PE) suodattimet. APC-vasta viritettiin 633 nm ja kerättiin 660/20 nm.

Colony muodostavat tehokkuuden määritys

analysoimiseksi pesäkkeitä muodostavien tehokkuus (TAE), SP ja MP solut maljattiin 100 solua per kuoppa kuuden kuoppaiselle kudosviljelylevylle ja kasvatettiin 14 päivää. Solut kiinnitettiin sitten kylmällä metanolilla 20 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla liuoksella laskea pesäkkeiden lukumäärä mikroskoopilla. Analyysi suoritettiin kaksi peräkkäistä kohtia. Pesäkettä muodostavaa tehokkuutta laskettiin myös prosenttiosuutena yksittäisistä soluista, jotka generoidaan pesäkkeet päivänä 14. solut värjättiin Hoechst väriaineella ja yhden solut lajitellaan käyttäen FACS-MP ja SP 96-kuoppaiselle levylle, joka sisältää 200 ui kudos- viljelyalustaan. Soluja kasvatettiin 14 päivän ajan ennen vahvistamista ja värjäys metanolilla ja kristalliviolettiliuoksella.

Anchorage riippumaton kasvu

Anchorage riippumaton kasvua tutkittiin pehmytagar kloonausta. A 7% varastossa matalan hyytelöimisaineiden agaroosia PBS laimennettiin RPMI-elatusaineessa /10% seerumia loppukonsentraatioon 0,7% agaroosia. Pohjakerrosta varten, 1,5 ml 0,7% agaroosia lisättiin 6-kuoppaisille levyille ja annettiin jäähtyä 4 ° C: ssa. Jääneen 0,7% agaroosia mediassa laimennettiin edelleen RPMI media /10% seerumia lopulliseen agaroosi pitoisuus 0,35%. Pintakerroksen, 2500 soluja (SKOV3) /5000 soluja (A224) maljattiin 6 ml 0,35% agaroosia. Inkuboinnin jälkeen 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa, levyt siirrettiin 37 ° C: seen ja inkuboitiin 14 päivää. Sitten solut värjättiin yön yli 0,5 mg /ml nitrosinitetratsoliumia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), ja pesäkkeiden välillä 100-2000 mikronia laskettiin kanssa Biocount 4000P (Biosys, Saksa). Kaksi itsenäistä koetta suoritettiin kunkin näytteen päällystetty kolmena koetta kohti.

kasvu SKOV SP ja MP-solujen

in vivo

Nainen atyymisissä karvattomia hiiriä (Balb /C Kateenkorvattomien hiiret) hankittiin Charles River Laboratories (Wilmington MA, USA). Hiiriä käytettiin näissä kokeissa, kun he olivat 4-6 viikkoa vanhoja. Aiheuttavan kasvaimia, SKOV3-SP ja MP (5 x 10

4 solua /100 ui PBS) solua injektoitiin ihonalaisesti selän alueen hiirillä. Sillä

in vivo

injektiot, solut lajiteltiin SP ja MP jakeet ja viljeltiin 8 päivää. Sitten solut trypsinoitiin ja sentrifugoitiin 800 rpm: llä 7 minuutin ajan 4 ° C: ssa, pestiin kahdesti PBS: llä, ja liuotetaan PBS: ssä (GIBCO /Invitrogen). Vain yksisoluiset suspensiot kanssa 95% elinkelpoisuuden määritettynä trypaanisiniekskluusiolla, käytettiin

in vivo

injektioita.

ottaminen uudelleen SP ja MP fraktioista SKOV3 ja A224 SP solut

solut värjättiin Hoechst 33342 väriainetta kuten edellä on kuvattu lajitteluun. Lajitellut SP solut ja MP soluja viljeltiin erikseen samoissa olosuhteissa 8 päivää ennen restained kanssa Hoechst 33342 väriainetta ja analysoitiin uudelleen.

vaikutus γ-Secretase Inhibitor IX (GSI-IX) SKOV3 SP ja MP-solujen

γ-Secretase estäjät GSI-IX (Calbiochem, EMD Biosciences Inc., La Jolla, CA) liuotettiin 100% dimetyylisulfoksidiin (DMSO), jotta kantaliuoksia (5 mg /ml), joka sitten laimennettiin viljelyalustaan ​​halutun pitoisuuksia. Lajitellut SKOV3 SP ja MP-soluja käsiteltiin 10 ja 20 ug estäjien vaikutuksen arvioimiseksi inhibiittorin on pesäkkeitä muodostavien tehokkuutta soluja. Ohjaus SKOV3 SP ja MP-soluja käsiteltiin DMSO määrinä yhtä suuri pitoisuus DMSO tarpeen liuottamiseksi estäjiä.

rikastaminen SP geenin allekirjoituksen toistuvia munasarjasyöpää sairastavilla potilailla ilmaisu tietokanta

rikastus SP-geenin allekirjoituksen toistuvia munasarjasyöpää sairastavilla potilailla verrattuna primaarikasvaimen analysoitiin käyttämällä kliinisen ilmentymän tietokannoista ihmisen munasarjasyöpä. Kuusi potilaan tiedot n sisältävä lauseke tiedostoja 12 näytettä (ensisijainen ja toistuva) olivat saatavilla meidän kliinisessä tietokannassa. Olemme saaneet ilmaus arvot kullekin koetin asetetaan käyttäen Robust Multichip keskiarvo menetelmä (RMA) Biometristen Research Branch (BRB) Array työkalut. Koetin sarjaa sijoitettiin poissaolevaksi jätettiin vain voimistunut geenejä SP solun geenin allekirjoitus otettiin mukaan analyysiin. qRT-PCR suoritettiin primääristen ja uusiutuvien munasarjakasvain näytteitä satunnaisesti valitut geenit SP geenistä luettelosta.

Tulokset

Expression profilointi SP /MP soluja Vesivatsanesteestä yksilöt

positiivinen CA 125 värjäystä käyttäen FACS vahvisti munasarjojen alkuperä eristetyt solut askites (kuvio S1) ja nämä solut analysoitiin SP ja MP-soluihin käyttämällä Hoechst ja /tai Rho värjäystä. Edustava kuvaaja SP ja MP lajitella askitesnesteestä näytteestä esitetään kuviossa S2, ja kaikissa potilaan näytteissä SP vaihteli noin 0,25% (taulukko 1). Askites yksilöitä ei tarkasteltu ilman kulttuuria, ja sulkemaan pois saastumisen verisolujen, käytimme vain solut, jotka olivat negatiivisia CD45 meidän analyysi. Eristetty SP ja MP -alapopulaatioiksi alikasvatettiin ja globaali geeniekspressioprofiilien käyttäen Affymetrix U133 Plus 2 paneelit saatiin. Informatiivinen tiedot joukko 16964 sekvenssit synnytettiin sen alkuperäisen suodatuksen datan. 446 ilmentyvät eri probesets edustavat 432 geenit tunnistettiin pariksi T-testi analyysi, jonka merkitys

P

0,01. 142 probesets oli säädelty, ja 304 probesets olivat alassäädetty, SP verrattuna MP. Lämpökarttana esittää 438 ekspressoituu differentiaalisesti probesets kaikille SP ja MP näytteet on esitetty kuvassa 1A.

(A) Heatmap osoittaa ekspressiokuviota 438 probesets että eroteltu SP soluja MP-solujen munasarjasyövän potilailla. Pystysarakkeisiin edustavat yksittäisiä näytteitä; vaaka rivit edustavat yksittäisiä geenejä. Punainen ja sininen väri osoittaa ylös ja alas-sääntelyn osalta. (B) validointi microarray dataa qRT-PCR: 19 satunnaisesti valittua geenejä käytettiin varmentamaan microarray data. Laskea suhteellinen ilmaisu kunkin geenin, 2

-ΔΔCT menetelmää käytettiin keskimäärin CT arvoa kolmelle taloudenhoito geenit (Syklofiliiniesimerkkeihin A, GUSB, GAPDH) yhden viite geenin arvoa. (C) edustaja tontteja korrelaatioanalyysiä välillä microarray ja qRT-PCR tiedot: 2

-ΔCT arvot (qRT-PCR) piirrettiin signaalin voimakkuuden arvoja (Microarray). Korrelaatio analyysi suoritettiin kunkin geenin Pearsonin ja Spearmanin menetelmällä käyttäen GraphPad Prism versio 4.00.

microarray tulokset todensi suorittamalla qRT-PCR-analyysi 19 satunnaisesti valittua ilmentyvät eri geenit. QRT-PCR ilmentymisen eroja varten yli-ilmentynyt ja alle ilmaistu geenien SP verrattuna MP oli validoitu 17/19 geenien (kuvio 1 B). Korrelaatio saatujen tietojen kanssa microarray ja qRT-PCR analysoitiin Pearsons ”ja Spearmans” listalla korrelaatiot analyysi (kuva S3 Taulukko S1, S2). 17/19 geenit osoittivat merkittäviä korrelaatioita microarray ilmaisun datan ja qRT-PCR ekspressiotietojen tuloksena on microarray validointi osuus 89,5%. Lineaarinen regressio tontteja kahden edustavan geenien (KITLG ja GEMIN6) on esitetty kuvassa 1C.

tunnistaminen signalointipolkujen edistää munasarjasyövän SP solujen eloonjäämistä, itseuudistumiseen ja kasvaimen huolto

Niistä 438 differentiaalisesti geenien, hieman olivat ali-ilmentynyt (68%) SP-soluissa verrattuna MP soluihin. Differentiaalisesti ilmaisi geeni allekirjoitusta rikastettiin geenien Gene ontologia biologisissa prosesseissa (

P

0,01) apoptoosin solusyklin, solujen lisääntymistä, liikenne, signaalitransduktion, transkriptio, translaatio, proteiini muutos, aineenvaihduntaan ja proteolyysi (kuvio 2A). Suurin osa geeneistä, joita ei ole siirretty mitään biologisia toimintoja, ja se voi sisältää uusia geenejä, jotka liittyvät mahdollisten varsi-, kuten solujen ominaisuudet. Tunnistaa signalointipolkujen liittyy SP solujen eloonjäämistä ja erilaistumista microarray aineisto analysoitiin käyttämällä Pathway Studio 6.0 (Ariadne Genomics). Data mining biologisesti asiaan liittyvien prosessien osoittaa biologisia prosesseja, jotka liittyvät differentiaalisesti ilmentyvien geenien (kuvio 2B). Geenit normaalissa kantasolujen toiminto NUP [40], ST3Gal [41], LTBP [42] oli yläreguloituja SP. Lukuun ottamatta; SP-soluja, jotka osoittavat eri geeniä, jotka liittyvät vastaisen aktiivisen apoptoosin mekanismi (kuvio 2B).

(A) Gene ontologia analyysi microarray data (P-arvo 0,01): Piirakka Kaaviossa biologisten toimintojen differentiaalisesti ilmaisi geenien joukossa SP ja MP soluja. Geeni allekirjoitusta rikastettiin geenien geeni ontologian biologisten prosessien apoptoosin, solusyklin, solujen lisääntymistä, liikenne, signaalitransduktion, transkriptio, translaatio, proteiini muutos, aineenvaihduntaan ja proteolyysiä. Muut edustaa liittyvien geenien puolustus Vastauksena vaskulogeneesin veren hyytymisen, näköhavainnon, ontogenesis, solumatriisimo- tarttuvuus, ja aloittaminen ensiarvoisen munarakkulan kasvua. (B) Graafinen esitys kirjallisuudesta peräisin faktoja biologisia reittejä mukana SP-soluissa. Pathway Studio 6.0 ohjelmistoa käytettiin tunnistamaan aktivoituvien reittien SP-soluissa. Solid symbolien geenit (EGFR, TNFRSF6, BCL2L11, FOXO3A, RUNX1) kuin alaspäin säännellään SP-soluissa, avoin symboleilla voimistunut geenit (EPHB4, EPHB2, PAWR, AKT1) ja harmaa symbolit ovat geenejä, joiden ilmentyminen ei muuttunut merkittävästi vuosina SP ja MP soluja. (C) Notch signalointireitin: Kuva esittää kaavamaisen Notch signaalitransduktion elementtejä. Yli-ilmennetty proteiinit SP-soluissa (FPTG, ST3GAL6 ja ADAM19) esitetään sinisellä. Translaation jälkeinen muutos esiasteen Notch-proteiini sisältää pilkkominen proteaasien ja glykosylaatiot trans-Golgi. Kiinnittyminen Notch solunulkoisen alueen (ECN) ja Notch solunsisäinen alue (ICN) johtaa kypsä Notch heterodimeerejä ja ne siirretään solukalvon. Reseptorin vuorovaikutus ligandien kanssa DSL perheen (Delta, Serraten, Lag3) on naapurisoluja on moduloitu glykosylaatiot ECN. Onnistunut vuorovaikutus solunulkoisen ligandin alueilla, joilla EGF: n kaltaisia ​​toistoja ECN johtavat proteolyyttinen pilkkoutuminen Notch transmembraanidomeeni kahdella peräkkäisellä askeleet ADAM proteaasien ja preseniliinit kanssa γ-sekretaasin aktiivisuutta. Vapautunut Notch solunsisäinen domeeni kulkeutua sen nukleaasin missä se vaikuttaa CSL1 korvaten CSL repressors ja muodostaa transkription kompleksin Mastermind kaltaiset tekijät ja transkription koaktivaattoreiden. Tämä transkription kompleksi aktivoi alavirran kohdegeenien ja voi selittää syövän kantasolujen selviytymistä, itseuudistumiseen ja kasvaimen huolto munasarja.

Olemme tunnistaneet useita geenejä, jotka voivat antaa stemness ominaisuuksien munasarjojen SP soluihin. Koska heterogeenisuus solupopulaation SP odotamme selkeitä polkuja ei voi olla luonnollisesti läsnä. ADAM19, FPGT ja ST3GAL6 havaittiin olevan yli ilmaistu SP-soluissa, ja ne voivat olla mahdollisia syöpää kantasolujen kaltaisten solujen liittyviä geenejä. Perustuen ilmaisun profiilia FPGT, ST3GAL6 ja ADAM19 SP geeni allekirjoitukset, ehdotamme todennäköinen mekanismi, joka voi olla aktiivinen SP-soluissa, joka huomioi SP solujen eloonjäämistä, erilaistumista ja kasvaimen huolto munasarjassa (kuvio 2C). Kuvassa on mukana kolme entsyymien aktivaatio Notch signalointireitin. FPTG aktivoi synteesi GDP-fukoosia ja joka hyväksyttiin Notch reseptoreihin fukosyylitähteitä transferaasien. Entsyymi ST3GAL6 voi aktivoida lisäämällä päätelaitteen siaalihappotähteeseen, edistää proteolyyttinen pilkkoutuminen Notch transmembraanidomeeni on solun ulkopuolella katalysoitiin ADAM19.

tunnistetiedot puolella väestöstä (SP) solujen munasarjasyöpäsolujen linjat

Havaitsimme SP solut neljästä ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa käyttämällä virtaussytometrianalyysin poissulkemista DNA: ta sitovaa väriaine, Hoechst33342. Kontrollina käytimme Verapamiili, joka salpaa lääkkeen kuljettajan proteiineja, estää niitä effluxing väriaine. Kuvio 3A esittää fluoresoivan aktivoidun solun lajittelu profiilia SKOV3 ja A224 munasarjasyövän solulinjoissa. Porteilla SP-solut on esitetty, ja esitetään prosentteina koko solupopulaation. SP on ablatoitu jos verapamiilia sisältyy Hoechst inkubointi. Olemme havainneet, SP-soluja kaikissa neljässä syöpäsolulinjoissa arvioidaan, SKOV3 (1,54%), A224 (1,02%), OVCAR-3 (0,08%), ja UCI-107 (0,12%). Edelleen aitouden puolella väestöstä solujen eristetty, qRT-PCR suoritettiin satunnaisesti valitun geenejä potilaasta SP geenistä lista (ADAM19, FPGT, ST3GAL6, LLGL1 ja TK2). Kaikki geenit olivat hyvin validoitu SP soluja eristettiin SKOV3 tukevat rikastuminen syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja eristettiin solujen puolen populaatioiden (kuvio 3B). Yli ilmentyminen ADAM 19 ja FPGT SP soluja validoitu proteiinin tasolla käyttäen immunoflourescence ja western blotting menetelmiä vastaavasti (kuva S4). Validoida Notch reitin geenit tunnistettiin reitin studio, arvioimme Notch kohdegeeneissä käyttäen qRT-PCR SP ja MP populaatiot. Merkittävä säätelyä Notch kohdegeenien lukien

HES1

ja

Notch1

havaittiin SP väestöstä verrattuna MP vastine (Kuva S5).

(A) tunnistetiedot SP solut perustettu ihmisen munasarjasyövän solulinjoissa. SKOV3 ja A224 solulinjoja leimattiin Hoechst 33342 väriaine ja analysoitiin virtaussytometrialla. SP-soluja, jotka katosivat läsnä ollessa Verapamiili (monilää- kuljettajan inhibiittori), on esitetty, ja esitetään prosentteina koko solupopulaation. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumatonta mittausta. (B) validointi satunnaisesti valittu geenien SP-geenin luettelo SP ja MP-solut eristettiin SKOV3-solulinjoja. (C, D) Colony muodostavat tehokkuuden määritys: Colony muodostavat tehokkuus lajitellun SP ja MP solujen SKOV3 ja A224-solulinjoja. Analysoitaessa pesäkkeitä muodostavien tehokkuus (TAE), SP ja MP-solut lajiteltiin ja maljattiin yhtä paljon kudosviljelmässä kuusi kuoppalevyille ja kasvatettiin 14 päivää. Solut kiinnitettiin sitten kylmällä metanolilla ja värjättiin 0,5% kristallivioletilla ratkaisu laskea pesäkkeiden lukumäärä mikroskoopilla. Kokeet tehtiin kolmena rinnakkaisena. (E, F) Passage lukumäärä: Colony muodostavat tehokkuus lajitellaan SP ja MP solujen SKOV3 ja A224 solulinjoja arvioitiin funktiona siirrostusjärjestysluku. Solut kiinnitettiin kylmällä metanolilla ja värjättiin 0,5% kristalliviolettia.

Biologiset validointi SP soluja eristettyjen solulinjojen

pesäkkeitä muodostavaa tehokkuus (TAE) SP ja MP-solujen eristetty SKOV3 ja A224 solulinjoja arvioitiin. SKOV3- MP solut oli CFE 13,0 ± 2,0% verrattuna CFE 27 ± 1,0% että SP solut (

P = 0,0077

) (kuvio 3C). A224 MP solut osoittivat CFE 3,0 ± 1,0% verrattuna CFE 9,0 ± 1,0%, että SP solut (

P = 0,0043

) (kuvio 3D). Unstained siirtomaita SP ja MP solujen SKOV3 näiltä maljoilta trypsinoitiin ja solut uudelleen maljattiin kuuden hyvin kudosviljelymaljalla 100 solua kuoppaa kohti ja kasvatettiin vielä 14 päivää ja TAE arvioitiin. SKOV3- MP solut oli CFE oli 8,0 ± 1,5% verrattuna CFE 44,0 ± 4,0% ja SP soluja. Alkuperäinen 2-kertainen ero TAE välillä MP ja SP SKOV3 todettu nostetaan 5-kertaiseksi jälkeen ensimmäinen kanava (

P 0,001

) (kuvio 3E). Samanlainen suuntaus havaittiin A224 SP soluja (kuvio 3F). Kasvu TAE funktiona passage osoittaa rikastuminen syövän kantasolujen kaltaisia ​​soluja läsnä SP osa SKOV3 ja A224, ja sen kyky kestävän laajentamiseen.

arvioimiseksi ankkurointi riippumaton kasvua SP ja MP-solut kustakin solulinjoista, sen kykyyn muodostaa pesäkkeitä pehmeässä agarissa arvioitiin. A224 SP solut muodostivat noin 90 pesäkettä /5000 solua maljaa kohden, kun taas A224 MP solut muodostivat parin pesäkkeitä vain (

P 0,001

) tuottaen maljaustehokkuus 1,8% SP soluihin. Tapauksessa SKOV3- solujen, pinnoituksen tehokkuus oli 4,8% ja 1,6% SP ja MP-soluissa (kuvio 4A, B).

(A, B) ankkurointi riippumaton kasvu järjestetty SP ja MP soluja SKOV3 ja A224 solulinjoissa. (C, D) Yhden solun määrityksessä 96-kuoppalevyille: Single solujen A224 ja SKOV3 SP ja MP-soluja viljeltiin yksittäisissä kuopissa. Yksittäinen solujen annettiin kasvaa 14 päivää, ja pesäkkeitä muodostava tehokkuutta arvioitiin käyttäen kristalliviolettia värjäystä. (E)

In vivo

kasvaimen kasvua SKOV3 SP ja MP solujen naisten kateenkorvattomissa nude-hiirissä.

Sen varmistamiseksi yhden solun kloonaustehokkuudet SP ja MP-solujen, yksittäinen soluviljelmät A224 ja SKOV3 SP ja MP-solut valmistettiin käyttäen FACS 96-kuoppalevyille. Levyjen annettiin kasvaa 14 päivää, ja pesäkkeitä muodostava tehokkuutta arvioitiin käyttäen kristalliviolettivärjäys- menetelmällä. A224 MP solut oli CFE 3,0 ± 1,5% verrattuna CFE 17 ± 1,0% että A224 SP solut (

P = 0,005

), kun taas SKOV3- MP soluilla oli CFE 2,0% verrattuna CFE 6,0 ± 1,0%, että SKOV3- SP-soluja (kuvio 3C, D). Lisäksi pesäkkeet tuotetaan SP-soluja kasvatettiin yli 80% kussakin kuopassa, kun pesäkkeet, jotka on muodostettu MP fraktiot osoitti vähäinen kasvu kuoppiin (kuvio S6).

arvioimiseksi

in vivo

Tuumorigeenisuustutkimuksissa SP ja MP soluja SKOV3, 5 x 10

4 solua 100 pl PBS: ää ihonalaisesti selkäpuolen alueen nude-hiirissä. Kasvaimen kasvu havaittiin kolmessa kolmen eläimen 8 viikon kuluttua injektion SP-soluissa, kun taas eläimiin ruiskutettiin vastaava määrä MP solujen ollut havaittavaa kasvaimia tuolloin (kuvio 4E).