Krooninen sairaus

tiivistelmä

yli-ilmentyminen ja /tai aktivoimalla mutaatio of FLT3 kinaasi on tärkeä ajo rooli patogeneesissä akuutin myelooisen leukemian (AML). Näin ollen farmakologinen inhibiittorit FLT3 on terapeuttista potentiaalia AML hoitoon. Tässä tutkimuksessa BPR1J-340 tunnistettiin uutena voimakas FLT3 estäjä biokemiallisilla kinaasiaktiivisuutta (IC

50 noin 25 nM) ja soluproliferaatiota (GC

50 noin 5 nM) määritykset. BPR1J-340 esti fosforylaatiota FLT3 ja Stat5: n ja laukaista apoptoosin FLT3-ITD

+ AML soluja. Farmakokineettiset parametrit BPR1J-340 rotilla määritettiin. BPR1J-340 osoitti myös voimakkaampia kasvaimen kasvun estäminen ja heikentämiseen FLT3-ITD

+ AML hiiren ksenograftimalleissa. Yhdistelmä käsittely HDAC estäjä vorinostat (SAHA) ja BPR1J-340 synergistisesti aiheuttaman apoptoosin kautta Mcl-1 down-regulation in MOLM-13 AML soluissa, mikä osoittaa, että valikoivan FLT3 estäjät ja HDAC-inhibiittorit voivat ilmetä kliinistä hyötyä AML terapiassa. Tuloksemme viittaavat siihen, että BPR1J-340 voidaan kehittää edelleen prekliinisissä ja kliinisissä tutkimuksissa kuin lääkkeinä AML hoitoja.

Citation: Lin WH, Yeh TK, Jiaang WT, Yen KJ, Chen CH, Huang CT, et al. (2014) arviointi antituumorivaikutukset BPR1J-340, on voimakas ja selektiivinen FLT3 Salpa, yksin tai yhdistelmänä HDAC estäjä, Vorinostat, AML Cancer. PLoS ONE 9 (1): e83160. doi: 10,1371 /journal.pone.0083160

Editor: Zhengqi Wang, Emory University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 18 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 31 lokakuu 2013; Julkaistu: 8. tammikuuta 2014

Copyright: © 2014 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: rahoittajien ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Akuutti myelooinen leukemia (AML) on yleisin hematologinen maligniteetti aikuisilla, joilla on korkea ilmaantuvuus ja alhainen eloonjäämistä [1], [2], [3]. AML etenee nopeasti, koska nopea kasvu poikkeavia valkosoluja, jotka kertyvät luuytimessä ja häiritsevät tuotantoa punasoluja, verihiutaleita, ja normaali valkosoluja. Hoitamattomana AML on yleensä kuolemaan viikkojen tai kuukausien kuluttua diagnoosista. FLT3 (FMS-tyyppistä tyrosiinikinaasi 3), solun pinnan reseptoriin kuuluvat luokkaan III reseptorin tyrosiinikinaasin perhe, on keskeinen rooli erilaistumisen ja selviytymisen hematopoieettisten kantasolujen luuytimen [4], [5].

FLT3

on yksi yleisimmin mutatoituja geenejä AML [6], [7]. Aktivointi FLT3 mutaatiot, FLT3-ITD (sisäinen tandem päällekkäisyyttä mutaatio jukstamembraanidomeenissa) ja FLT3-TKD (missensemutaatio sisällä kinaasidomeeniin), usein havaittiin noin 30%: lla aikuisista AML potilaista [8], [9] , [10], [11]. FLT3 aktivoiva mutantions kriittisesti säädellä leukeemiset transformaatio nopeuttamalla lisääntymistä ja tukahduttamalla apoptoosin ja liittyvät merkittävästi huonoon ennusteeseen [12], [13]. Nämä havainnot korostavat FLT3-ITD ja FLT3-TKD kuten erittäin houkuttelevia terapeuttisia kohteita lääkekehityksen ihmisen AML.

Tällä hetkellä useita luokkia pienimolekyylisiä FLT3 estäjiä, jotka ovat tulleet kliinisissä kokeissa. Kuitenkin tehokkaiden lääkkeiden ei ole vielä tunnistettu klinikoilla [14], [15], [16]. Vaikka nämä inhibiittorit ovat osoittaneet lupaavia syövän vastaista aktiivisuutta in

in vitro

ja

in vivo

prekliinisissä, kliinisesti positiivisia vasteita AML saavilla potilailla single-aine FLT3 inhibiittorit ovat rajalliset johtuen ohimenevä väheneminen perifeerisen räjäytykset muttei luuydinblasteja tai esiintyminen estäjän vastustuskykyisten FLT3 mutaatiot potilailla [17], [18], [19], [20]. Siksi kombinatorinen strategioita FLT3 estäjien ja muiden kemoterapia-aineiden voi olla hyödyllistä tavoin tehostaa FLT3 estäjähoidosta ja voittaa hoitovirheitä [21], [22]. Flt3 estäjä CEP-701 (lestaurtinib) yhdistettynä standardin AML kemoterapia-aineiden on mahdollista parantaa hoitotuloksia AML potilailla [23]. Lisäksi histonideasetylaasi-estäjät (HDACi), luokka yhdisteitä, jotka voivat aiheuttaa syöpäsolujen kasvun pysähtymisen ja solukuoleman muuttamalla asetylointi tilan sekä histoni ja ei-histoni-proteiinien, voi parantaa toimintaa FLT3 estäjien AML-solujen apoptoosia [ ,,,0],24], [25], [26]. HDACi vorinostat (SAHA) osoittaa kliininen aktiivisuus AML; mutta sen tehokkuus ainoana lääkkeenä on vain kohtalainen [27], [28]. Tässä tutkimuksessa raportoimme ominaista dataa farmakologinen profiili uuden FLT3 estäjä, BPR1J-340, ja valottaa mahdollisia molekyylitason mekanismi voimakkaasti synergistisiä vaikutuksia yhdistelmänä SAHA in FLT3-ITD

+ soluja.

BPR1J-340 yhdisteellä on voimakas FLT3 estävä aktiivisuus, jolla on 50%: estävä pitoisuus (IC

50) 25 ± 5 nM ja kasvua estäviä vaikutuksia FLT3-ITD

+ leukemia MOLM-13 ja MV4 ; 11 solut GC

50-arvo 3,4 ± 1,5 ja 2,8 ± 1,2 nM, vastaavasti. IC

50-arvot olivat noin 1 nM FLT3-ITD ja 1 nM Stat5: n fosforylaatiota MV4, 11 solua. Lisäksi BPR1J-340 näyttelyitä suotuisat farmakokineettiset ominaisuudet ja merkittävä antituumorivaikutus in FLT3-ITD hiiren ksenograftimalleissa. Yhdistelmä HDAC estäjä SAHA kanssa BPR1J-340 esittelee vahvasti synergistinen anti-leukemia vaikutus FLT3-ITD + soluja. Nämä tulokset korostavat terapeuttista potentiaalia BPR1J-340 ja SAHA: AML ja tukevat sen prekliinisen tai kliiniseen kehitykseen.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

FLT3 inhibiittorit, BPR1J-340 ja AC220, syntetisoitiin laboratoriossamme. Histonideasetylaasi-inhibiittori vorinostat (SAHA) hankittiin SelleckBio (Houston, TX, USA). Kaikki inhibiittorit liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO), jonka varastossa pitoisuutena 10 mM. Anti-FLT3 (sc-480, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), anti-pFLT3-Tyr591 (# 3461, Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA) anti-Stat5: n (# 9363, Cell Signaling Technology ), anti-pSTAT5-Tyr694 (# 9351, Cell Signaling Technology), anti-katkaistuun poly ADP-riboosi-polymeraasi (PARP) (# 9542, Cell Signaling Technology), anti-Mcl-1 (# 4572, Cell Signaling Technology), anti-kaspaasi-3 (# 9662, Cell Signaling Technology) ja anti-β-aktiini (Gtx110546, GeneTex, Irvine, CA, USA) vasta-aineet hankittiin Western blotting -analyysi. Valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-proteiinien, FLT3 (tähteet Y567-S993), VEGFR1 (tähteet R781-I1338) ja VEGFR2 (tähteet V789-V1356), biokemiallisia kinaasimääritykseen on kuvattu aiemmin [29]. VEGFR3 (tähteet M800-Y1363) proteiinit hankittiin Upstate (Billerica, MA, USA).

Soluviljely

RS4, 11, MV4, 11, U937 ja K562-solut hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). MOLM-13-solut ostettiin Deutsche Sammlung von Microorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ, Braunschweig, Saksa). Kaikki leukemiasolulinjoilla kasvatettiin RPMI 1640 (Invitrogen, USA), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS) (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA). HEK293T ja FLT3-transfektoituja HEK293T-soluja viljeltiin DMEM: ssä (Invitrogen, USA) väliaineessa, jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS). 14 muun ei-leukemiasolulinjoilla, HCC827, H1975, H1650, H2228, NCIH460, A431, HCT-116, MKN45, MiaPaca-2, RT4, MCF-7, Huh7, Hep3B, ja Detroit 551, viljeltiin väliaineessa mukainen että ATCC suosituksiin.

In vitro kinaasiaktiivisuutta määritys

FLT3 ja VEGFR1 /2 Kinase-Glo kinaasi määritykset suoritettiin ilmoittamat aiemmassa tutkimuksessa [30]. VEGFR3 aktiivisuus analyysi suoritettiin käyttäen samaa protokollaa kuvattu VEGFR1 /2 määritys. Kinaasi esto profiloinnin ja estoaktiivisuus FLT3-D835Y, CSF1R, ja trkA määritettiin Invitrogen SelectScreen® kinaasin profilointi palvelu (Carlsbad, Kalifornia, USA).

Solun elinkelpoisuus ja solujen kasvua määritykset

Solujen elinkelpoisuus arvioitiin kanssa MTS-määritystä suoritettiin, kuten aikaisemmin kuvatulla menetelmällä [31]. Solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 10000 solua per kuoppa 16 tuntia ja sitten käsiteltiin vehikkelillä tai eri pitoisuuksia yhdistettä väliaineessa. Muutos elinkelpoisten solujen määrä määritettiin käyttäen MTS-menetelmällä (Promega, Madison, WI, USA) valmistajan suositteleman protokollan tai solun laskemalla mikroskoopin alla. GC

50 arvo määriteltiin yhdisteen määrä, joka aiheutti 50% vähennys solujen elinkelpoisuuden verrattuna DMSO-käsiteltyjen (ajoneuvo) ohjaus ja laskettiin käyttäen Prism versio 4 ohjelmisto (Graph-Pad Software, Inc., San Diego, CA, USA). Tiedot esitetään keskiarvona ± S.D. kolmesta itsenäisestä kokeesta. Solujen kasvua mitattiin trypaanisinivärin syrjäytymisen menetelmällä. -Soluja (1 x 10

4 ml

-1) viljeltiin 12-kuoppaisilla levyillä 24 tunnin ajan ja käsiteltiin sitten eri määriä testiyhdistettä, ja samalla tilavuudella ajoneuvon 72 tuntia. Lukumäärä eläviä soluja laskettiin trypaanisinivärin värjäyksen hemosytometrillä osoitettuna ajankohtana sen jälkeen, kun lääkehoitoa. Tuloksena ilmaistiin keskiarvona ± S.D. kolminkertaisista määrityksen.

Western blotting

Solut lyysattiin lyysipuskurissa (50 mM Tris, pH 8,0, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 1 mM natriumortovanadaatti, 1 mM PMSF: ää, ja 1 mM DTT). Proteiini lysaatit erotettiin SDS-PAGE: lla ja siirrettiin polyvinylideenidifluoridi (PVDF) kalvolle (Millipore, Bedford, MA, USA). Kalvot immunoblotattiin sopivia vasta-aineita, ja havaitaan käyttäen SuperSignal-reagenssia (Pierce, Rockford, IL, USA), jota seurasi altistus röntgenfilmille.

apoptoosimäärityksessä

apoptoottisten solujen määrässä määritettiin fluoresenssi-aktivoitujen solujen lajittelu (FACS) analyysit käyttämällä anneksiini V-FITC-värjäys. Lyhyesti, solut sentrifugoitiin, kun lääkehoitoa ja suspendoitiin uudelleen 1 x sitovia puskuria, joka sisälsi 2,5 mM kalsiumia (Ca2 +). Soluja inkuboitiin anneksiini V-FITC: tä (Biolegend, San Diego, CA) ja propidiumjodidia (PI) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) pimeässä huoneen lämpötilassa 20 minuuttia. Seuraavaksi näytteet käyttövalmiiksi 1 × sitovia puskuriin ja altistettiin virtaussytometria FACS Calibus (BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ) analysoida anneksiini V-positiivisia käyttävästä väestöstä CellQuest- Pro (BD Bioscience) ja FlowJo (Treestar, Inc., San Carlos, CA).

farmakokineettinen analyysi BPR1J-340

eläinten käytön hyväksyttiin The laitos- ja käyttö komitea National Health Research Institutes. Lyhyesti, Sprague-Dawley-rottia, joiden paino 300-400 g jokaisen saatiin BioLASCO, Taiwan Co., Ltd., Ilan, Taiwan. Yksi päivä ennen annostelua, rotat kirurgisesti valmistettu jugulaarisesta-vein kanyyli ja paastosivat yön yli (~18-20 h). Vettä oli saatavilla

halun

. Ruoka oli järjestetty 4 tuntia annostelun jälkeen. Yhden 1,5 mg /kg laskimonsisäisesti annos BPR1J-340, kuten PEG400: aa /vesi (80/20, v /v) liuosta, oli erikseen annettiin 3 rotan ryhmille kunkin kaulalaskimon kautta-vein kanyyli. 0 (ennen annostelua), 2, 5, 15 ja 30 min. ja 1, 2, 4, 6, 8 ja 24 tuntia annostuksen jälkeen, verinäyte otettiin talteen. Plasma erotettiin verestä sentrifugoimalla (14000 g 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa Beckman Model AllegraTM 6R sentrifugissa) ja säilytetään pakastimessa (-20 ° C) analyysiin saakka. Kaikki plasma näytteet analysoitiin LC-MS /MS: llä. Plasmassa analysoitiin ei-tilamalleista menetelmä farmakokineettisten määrittämiseen.

Subkutaanisesti -tuumoriksenografti kokeita

Mies karvattomia hiiriä (Nu-Fox1nu) kahdeksan viikon ikäisiä hankittiin BioLasco (Ilan, Taiwan ). Nude-hiirissä (n = 5~7 ryhmää kohti) istutettiin ihonalaisesti MOLM-13 (1 x 10

6 solua /kylki). Kaikki ihmisen syöpäsoluja määritettiin olevan vapaa Mycoplasma spp ennen rokotus. Kun kasvaimet koko saavutti 100~200 mm

3 ja suuri koko 500 mm

3, eläimet ryhmiteltiin ja käsiteltiin BPR1J-340 (5 ja 20 mg /kg, iv) tai ajoneuvo ohjata kerran päivässä 5 päivänä viikossa kaksi tai kolme viikkoa. Kasvaimen koot mitattiin ja lasketaan kaavalla pituus x leveys

2/2 aloittamisen jälkeen hoitojen. Kasvaimen koon ja eläimen kehon paino mitattiin kahdesti viikossa jälkeen tuumorisoluinokulaation. Lopussa tutkimuksen, eläimet lopetettiin hiilidioksidi inhalaatiolla, jota seuraa kaula sijoiltaan. Merkittävä ero käsitellyn ja ajoneuvon hallinnan analysoitiin käyttämällä yksisuuntaista

ANOVA

ja

Student-Newman-Keuls

testi. Taso tilastollista merkitystä asetettiin

p

0,05.

Tulokset

In vitro kinaasi profilointi BPR1J-340

BPR1J-340 , urea-substituoidun 3-fenyyli-1

H

-5-pyrazolylamine-pohjainen yhdiste, suunniteltiin kautta kemiallinen muuntaminen sulfonamidin sarja johdannaisten (BPR1J-097-sarja), jonka rakenne-aktiivisuussuhde (SAR) tutkimus (Fig. 1) [31], [32]. Kinaasien esto spesifisyys seulonta, BPR1J-340 testattiin 59 proteiinikinaasien kattaa tärkeimmät onkogeenisten kinaasien ihmisen proteiini kinome. Tämän kinaasin inhibitio profiili paljasti, että BPR1J-340 on erittäin selektiivinen estäjä ja suurin testattujen kinaasit eivät merkittävästi inhiboi konsentraatiolla 100 nM (taulukko S1). Sen jälkeen, tehokkain kinaasit 59 kinaaseja seulonta arvioitiin edelleen. Kuten on esitetty taulukossa 1, BPR1J-340 voimakkaasti inhiboi villityypin FLT3 (IC

50 = 29 ± 5 nM, verrattuna ABT869, jossa IC

50 38 ± 3 nM,), mutantti FLT3-D835Y (IC

50 = 19 nM), CSF1R (FMS) (IC

50 = 78 nM), KDR (VEGFR2) (IC

50 = 28 ± 9 nM), ja FLT4 (VEGFR3) (IC

50 = 29 ± 7 nM). Lisäksi, BPR1J-340 inhiboi trkA-, joka liittyy kasvuun ja etäpesäkkeiden rintasyövistä, ja IC

50-arvo 8 nM. Kun otetaan huomioon korkea samankaltaisuus ATP: n sitoutuminen taskuihin FLT3 ja Aurora-kinaasien, inhiboiva aktiivisuus Aurora A ja Aurora B mitattiin. IC

50s BPRJ-340 määritettiin olevan 1,040 nM ja 1344 nM Aurora kinaasi ja Aurora B-kinaasin, vastaavasti. Yhdessä BPRJ-340 on selektiivinen estäjä kanssa

in vitro

tehoavan FLT3, VEGFR2 VEGFR3 ja trkA reseptorityrosiinikinaaseihin.

BPR1J-340:

N

1-(3-4-[([(5-ethyl-3-isoxazolyl)amino]carbonylamino)methyl]phenyl-1

H

-5-pyrazolyl)-4-[(4-methylpiperazino)methyl]benzamide. BPR1J-097:

N

1-(3-3-[(phenylsulfonyl)amino]phenyl-1

H

-5-pyrazolyl)-4-(4-methylpiperazino)benzamide.

BPR1J-340 inhiboi proliferaatiota FLT3-ITD

+ solujen

Kun selektiivinen ja voimakas kasvua estäviä vaikutuksia BPR1J-340 osoitettiin FLT3-ITD-laakeri leukemiasoluja, solujen proliferaatiota estävää aktiivisuutta testattiin paneeli leukemiasoluja ja ei-leukemiasoluja. BPR1J-340 inhiboi solujen proliferaatiota FLT3-ITD

+ soluja (MOLM-13 ja MV4, 11 FLT3-riippuvaisia ​​solulinjoja), jossa on GC

50 noin 5 nM. Solut, jotka eivät olleet riippuvaisia ​​FLT3 signaloinnin kasvu, mukaan lukien RS4, 11, U937, ja K562 leukemiasolujen [33], [34], [35], ja ei-leukeemisia testatut solulinjat olivat joko heikosti estyy tai ei inhiboi by BPR1J-340 (taulukko 2). Kasvu FLT3 riippumaton RS4; 11 solulinja, joka sisältää villityyppisen FLT3 oli vain heikosti inhiboi BPR1J-340, jossa on GC

50-arvo 770 ± 360 nM. Herkkyys kohti BPR1J-340 vaihtelee FLT3-riippuvaisten solujen MOLM-13 /MV4, 11 ja FLT3-riippumaton solujen RS4, 11, mikä viittaa siihen, että FLT3-signalointireitin in FLT3-ITD + -solujen on lähes kokonaan häiritsee BPR1J-340. Lisäksi tulokset viittaavat siihen, että BPR1J-340 voi estää FLT-ITD aktiivisuutta

in vitro

biokemiallisten ja matkapuhelinverkon määrityksiä. Kaiken BPR1J-340 on voimakas ja erittäin selektiivinen varten lisääntymistä varten FLT3 perustuva soluissa.

BPR1J-340 estää FLT3-Stat5: n signalointi

kysyisi BPR1J-340 kykeni inhiboimaan FLT3 signalointireitin in FLT3-ajettu solut, MV4; 11-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla BPR1J-340 1 tunnin ajan, ja fosforylaatio tilan FLT3 ja Stat5: n (signaali-muuntimet ja Activator of Transcription 5), joka on kriittinen alavirtaan modulaattori, jolla on merkittävä rooli FLT3-ITD signaalitransduktion solun laajentamiseen ja selviytymistä, tutkittiin Western blot-analyysi. Kuten kuviossa 2A on esitetty, BPR1J-340 esti fosforylaatiota FLT3 ja Stat5: n annoksesta riippuvalla tavalla, jossa IC

50-arvo on noin 1 nM. Tutkia ero herkkyydessä FLT3-WT ja aktivoimalla mutantit FLT3-ITD ja FLT3-D835Y jotta BPR1J-340, HEK293T solujen muokattu ilmentämään FLT3-WT tai mutanttien FLT3 (FLT3-ITD, FLT3-D835Y) analysoitiin [31 ]. HEK293T-FLT3 soluja käsiteltiin BPR1J-340 erilaisina pitoisuuksina 1 tunnin ajan, ja FLT3-ligandi (50 ng /ml) lisättiin 5 min valmistamiseksi solulysaattiin havaitsemiseksi muutosten FLT3 fosforylaatio Western-analyysillä. Kuten on esitetty kuviossa 2B, fosforylaatio kaikki FLT3-WT, FLT3-ITD ja FLT3-D835Y estyi BPR-1J340, IC

50-arvot 10-100 nM. Yhdessä nämä tiedot osoittavat, että BPR-1J340 inhiboi solun FLT3 fosforylaation ja moduloi FLT3 signalointireitin, erityisesti FLT3-ITD-reitin.

(A) MV4; 11-soluja käsiteltiin BPR1J-340 ilmoitettuina pitoisuuksina 1 tunnin ajan. Fosforylaation tila FLT3 ja Stat5: n arvioitiin Western blot -analyysillä. (B) HEK 293T-solut transfektoitiin FLT3-WT, FLT3-ITD- tai FLT3-D835Y ilmentävien plasmidien 24 tuntia ja sitten inkuboitiin eri pitoisuuksien BPR1J-340: ssa 1 tunti. Flt3 fosforylaatio tila transfektoiduissa soluissa arvioitiin Western blot -analyysillä.

BPR1J-340 indusoi apoptoosia FLT3-ITD ilmentävien solujen

Koska esto FLT3 signalointi johtaa kasvupotentiaalin menettäminen ja apoptoosin induktio FLT3-ITD ilmentävien solujen vaikutukset BPR1J-340 solujen apoptoottisen vasteen FLT3-ITD

+ soluja tutkittiin. MOLM-13 ja MV4; 11-soluja käsiteltiin BPR1J-340 eri pitoisuuksilla 24 tunnin ajan ja analysoitiin apoptoosin induktio käyttäen aktiivista kaspaasi-3 ja halkaistut PARP (poly-ADP-riboosi-polymeraasi) analyysi. Kyky BPR1J-340 apoptoosin on ilmeistä, kuten on esitetty kuvassa 3, jossa merkittävä pilkkominen kaspaasi-3 (aktiivinen kaspaasi-3) ja PARP (aktiivinen PARP) havaittiin MOLM-13 ja MV4; 11-soluja käsiteltiin BPR1J- 340 10 nM.

Western blottaus osoitti, että BPR1J-340 kykeni indusoimaan apoptoosin FLT3-ITD-ajettu FLT3-ITD

+ AML soluja. MOLM-13 (A) ja MV4, 11 (B) Soluja käsiteltiin BPR1J-340 ilmoitettuina pitoisuuksina 24 tuntia, ja solun lysaatit alistettiin sitten Western blot-analyysillä käyttäen vasta-aineita kaspaasi-3 ja PARP (poly ADP-riboosi-polymeraasi). (Täyspitkä kaspaasi-3 (FL-kaspaasi-3), lohkaisu kaspaasi-3 (CL-kaspaasi-3), täyspitkä poly (ADP-riboosi) polymeraasin (FL-PARP), lohkaisu PARP (CL-PARP) ).

SAHA yhdessä BPR1J-340 lisää sytotoksisuutta FLT3-ITD

+ ilmentävien solujen

Jotkut histonideasetylaasi-estäjät (HDACi) parantaa sytotoksista aktiivisuutta FLT3 estäjän FLT3-ITD

+ solun kautta hajoamista FLT3-ITD ja Stat5: n [24], [26], [36], [37]. Sen määrittämiseksi, onko SAHA, joka on HDACi, voi synergoida BPR1J-340 parantaa sytotoksisuutta in FLT3-ITD ilmentävien solujen häiritsemällä FLT3-ITD ja Stat5: n akseli, yhdistetyt vaikutukset SAHA ja BPR1J-340 sytotoksisuuteen tutkittiin. Solu kasvuvauhti MOLM-13 ja MV4; 11 SAHA ja BPR1J-340 monimuotoiset hoito väheni verrattuna yhden lääkehoidon (Fig. 4A). Seuraavaksi tutkimme SAHA hoidon vaikutus BPR1J-340 aiheuttama apoptoosin FLT3-ITD-ilmentäviä soluja. Ainoa hoito SAHA (300 nM) 48 tuntia ei nostamaan apoptoottisten solujen ohjaus väestöstä 10%, kun taas SAHA /BPR1J-340 co-hoito johti suurempaan induktion apoptoosin (kasvoi 20% vuonna MOLM-13 ja 12% MV4, 11 solua, vastaavasti) verrattuna BPR1J-340 lääkehoidon yksinään (Fig. 4B ja Fig. 4C). Nämä tiedot osoittivat, että SAHA parantavat BPR1J-340 aiheuttama apoptoosin FLT3-ITD

+ soluja. Olemme edelleen selvitetty proteiinin tasot FLT3-ITD ja Stat5: n tässä SAHA /BPR1J-340 co-hoitoa tehostetun sytotoksisuuden. Käsittelimme MOLM-13-solujen SAHA, BPR1J-340, tai niiden yhdistelmän: ssa 20 tuntia. Verrattuna yhden lääkehoitoa, yhdistelmä SAHA ja BPR1J-340 remarkedly vähensi proteiinin tasot FLT3-ITD ja Stat5: n (Fig. 4D). Lisäksi BPR1J-340 /SAHA: hoito vähensi täysin Mcl-1 (myeloidisolun leukemia-1, anti-apoptoottisen jäsen BCL-2-perheen) proteiinin tasot FLT3-ITD

+ solut (Fig. 4D). Tämä tulosten Mcl-1 pienentäminen voi selittää tehostetun sytotoksisuuden jopa Stat5: n fosforylaation Tyr694 oli täysin estää by BPR1J-340 (Fig. 4D) Mcl-1 on keskeinen rooli vastustuskyvyn kemoterapian AML soluissa [38]. Näin ollen, MCL-1 käyttäen SAHA: /BPR1J-340 voi olla lupaava strategia voittaa lääkeresistenssin FLT3-ITD-positiivisia AML. Tuloksemme viittaavat siihen, että vähentäminen kokonaisproteiinipitoisuus tasot FLT3-ITD, Stat5: n ja Mcl-1 SAHA lisäämällä tarjoaa mahdollisen mekanismin selittää tehostetun sytotoksisuuden kanssa SAHA /BPR1J-340 samanaikainen.

MOLM-13 tai MV4; 11-soluja ympättiin aluksi pitoisuutena 1 x 10

5 solusta ml

-1 24 tuntia ja käsiteltiin sitten BPR-1J340 joko yksin tai yhdessä SAHA in ilmoitettuina pitoisuuksina. (A) Elinkelpoiset solut laskettiin värjäyksen jälkeen trypaanisinivärin ilmoitetuilla ajankohtana (B) 48-tunnin käsittelyn jälkeen solut värjättiin FITC-anneksiini V: n ja propidiumjodidi ja prosenttiosuudet apoptoottisten solujen analysoitiin virtaussytometrialla. (C) Edustavat virtaussytometrialla histogrammit määrityksiä anneksiini positiivisia apoptoottisten solujen 48 tunnin lääkehoidon (D) MOLM-13-soluja käsiteltiin lääkkeillä 20 tuntia, ja sitten seuraa Western blot -analyysi muutosten arvioimiseksi proteiinipitoisuuden kanssa mainituilla vasta-aineilla. Tilastollinen analyysi suoritettiin käyttäen Studentin

t

-testi. * Osoittaa merkittävä ero verrattuna auton ohjaus (* p 0,05, * * * p 0,01). Esitetyt tiedot edustavat useita toisistaan ​​riippumattomia kokeita.

farmakokineettiset parametrit BPR1J-340

arvioimiseksi farmakokineettisissa BPR1J-340, mittasimme plasman BPR1J-340 over 24 tunnin kuluessa siitä, kun yksittäisen laskimoon (Fig. 5 ja taulukko 3). Jälkeen 1,5 mg /kg laskimonsisäisen annostelun Sprague-Dawley-rottia, BPR1J-340 saavutti enintään plasmassa 7,9 uM (4296 ng /ml) 2 min annostelun jälkeen. Plasman pitoisuus ylitti 80 ng /ml 6 tunnin ajan ja pysynyt 9,9 ng /ml (C

24 tuntia, 18 nM) 24 tunnin annon. Siksi plasman BPR1J-340 saavuttaa riittävää estämään proliferaatiota ja indusoivat apoptoosia FLT3-ITD

+ soluja, joka perustuu solun kokeet. Elimistön kokonaispuhdistuma oli 20,4 ± 5,2 ml /min /kg ja jakautumistilavuus vakaassa tilassa (Vss) oli 10,3 ± 2,5 l /kg BPR1J-340 rotilla. Näennäinen puoliintumisaika plasmassa oli noin 8,8 tuntia.

Yksi laskimoboluksena annoksena (1,5 mg /kg) BPR1J-340 annettiin täysikasvuisia Sprague-Dawley-rottia (n = 3). Data kuvaavat keskiarvoja (n = 3) ± S.D. Plasman BPR1J-340 kussakin aikapisteessä.

Kasvaimen kasvu tukahduttava aktiivisuus BPR1J-340

FLT3-ITD

+ MV4, 11 ja MOLM- 13 ksenografteissa on käytetty laajalti arvioimaan

in vivo

tehoa FLT3 estäjiä vastaan ​​AML [39], [40]. Me ja muut ryhmät ovat löytäneet MV4; 11 ksenograftimallia on huomattavasti herkempi FLT3 estäjiä [30], [31], [39], [41]. Arvioida kykyä BPR1J-340 estää kasvaimen kasvua käytettäessä AML ksenograftimallissa, siksi valittu MOLM-13-ksenograftimallissa. BPR1J-340 annettiin laskimoon (5 mg /kg kerran päivässä) päivinä 1-5 viikossa 3 viikon ajan; loppuun mennessä Tämän jakson MOLM-13 kasvaimet oli saavuttanut keskimääräinen tilavuus 200 mm

3. Hoito kautta tämä hoito johti täydelliseen kasvain häviää kaikilla eläimillä päivällä 22; täydellinen regressio (CR) ilmeni 4 6 hoidetuista eläimistä 31 päivän kuluessa havaintojakson (Fig. 6A). Tässä tehokkuus tutkimuksessa hiirille suurempia kasvaimia (keskimääräinen kasvaimen tilavuuden 630 mm

3, n = 3) annettiin yksi annos laskimoon 20 mg /kg BPR1J-340 päivinä 1-5 kunkin viikossa 2 viikon ajan, joka johti täydelliseen ja kestävä kasvaimen regressio ilman palpoitavissa kasvaimia aikana havaitut 48 päivän seuranta (Fig. 6B). O painon menetys tai kuolleisuutta ei havaittu eläimillä, joita hoidettiin annoksella BPR1J-340 (tuloksia ei ole esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että BPR1J-340 vähentää tehokkaasti kasvaimen koko laskimoon annoksina 5 ja 20 mg /kg /vrk; BPR1J-340 on hyvin siedetty hiirillä näillä tehokkaina annoksina.

BPR1J-340 (iv) tehoaa ihmisen akuutti leukemia MOLM-13 kasvaimet kasvavat ihon alle ja voidaan pienentää kasvaimia jälkeenkin kasvaimia annettiin kasvaa kokoon 630 mm

3. (A) in vivo antituumorivaikutusta of BPR1J-340 MOLM-13 ksenografti nude hiirimallissa. Kasvua -tuumoriksenografti inhiboitui BPR1J-340 [5 mg /kg, i.v.]; p 0,05 verrattuna ajoneuvon käsittelyä. (B) toinen ihon alle kasvua MOLM-13 kasvaimen suuren koon ( 630 mm

3) nude-hiirissä, voidaan merkittävästi kumota BPR1J-340 [20 mg /kg, iv].

keskustelu

Koska epänormaali ilmentyminen FLT3 kinaasin, mukaan lukien monistettu tai poikkeavasti aktivoitu FLT3, havaitaan usein räjähdyksessä soluissa AML potilaita, FLT3 on houkutteleva terapeuttinen kohde valinta lääkkeiden kehittämiseen AML. Tähän mennessä useita mahdollisia FLT3 estäjät on kehitetty ja tutkittu AML potilaalla, joista lestaurtinib (CEP701) ja midostauriini (PKC412) faasin III kliinisissä tutkimuksissa ja sunitinibimaleaatti (Sutentin), sorafenibi (Nexavar), quizartinib (AC220), ja crenolanib (CP-868596) vaiheen II tutkimuksissa. Kuitenkin FLT3 kinaasi kohdistamista monoterapialla nykyisen kokeellisen aineilla ei tuota terapeuttisia hyötyjä AML potilailla. Se osoitti, että poikkeava aktivaatio FLT3 ja /tai lääkkeille vastustuskykyisiä FLT3, mukaan lukien olemassa oleviin ja hankki lääkkeille vastustuskykyisiä mutantteja, voi harvoin täysin inhiboida yhden aineella. Näin ollen on olemassa tarve tunnistaa tehokkaammin estäjiä FLT3 ja kehittää uusia terapeuttisia lähestymistapoja, mukaan lukien lääkkeen yhdistelmä strategioita, jotka kohdistuvat ei vain FLT3, vaan myös molekyylit merkitystä FLT3 eloonjäämisen tie ohittaa nykyisen lääkeresistenssin. Tässä tutkimuksessa osoitimme tehoa romaani FLT3 estäjä BPR1J-340 eri

in vitro

ja

in vivo

malleja AML ja tunnistaa synergiavaikutuksen kanssa HDACi SAHA on sytotoksisuutta FL3 -ITD-ilmentävien solujen

in vitro

analyyseissä.

Aiemmin olemme tunnistaneet sulfonamidi sarja 3-fenyyli-1

H

-5-pyrazolylamine-yhdisteitä, kuten voimakkaita inhibiittoreita FLT3 kuten BPR1J-097 [31]. Sen edelleen pyrkimyksemme kehittää voimakkaita FLT3 estäjiä, meidän tarkoitus etsiä muut sarjan estäjien, että ei ainoastaan ​​lisännyt

in vitro

kasvua estävä vaikutus AML soluissa, mutta myös pitkitti toiminta

vuonna vivo

. Kautta järkevä suunnittelu, huomasimme BPR1J-340, joka on urea sarja 3-fenyyli-1

H

-5-pyrazolylamine-pohjainen FLT3 estäjä, ja estää tehokkaasti FLT3-WT tai FLT3-ITD aktiivisuus

in vitro

ja

in vivo

. Koska useita signalointireittien vaikuttaa kasvua ja metastaattista potentiaalia kasvainsolujen, monet inhibiittoreiden kliinisen kehityksen on suunniteltu usean kohdistetut estäjiä, jotka estävät rajallinen määrä onkogeenisten kinaasien. Siten kinaasi valikoivuus profilointi BPR1J-340 tehtiin tunnistamiseksi lisätavoitteista paneelin 59 testattu onkogeenisten kinaasien. Edelleen biokemiallisia määrityksessä, BPR1J-340 osoitti voimakas inhibitio (20-190 nM) vastaan ​​angiogeenisten kinaasien VEGFR1, VEGFR2 ja VEGFR3, jotka kaikki on tärkeä rooli kasvaimen mikroympäristössä (taulukko 1). Lisäksi BPR1J-340 esti voimakkaasti trkA aktiivisuutta IC

50 arvoon 8 nM. Yhdessä BPRJ-340 luonnehditaan selektiivinen usean kohdistettuja estäjä, jolla on voimakas esto aktiivisuus FLT3-WT, FLT3-D835Y, VEGFR2 VEGFR3, ja trkA. Tämä inhibitio profiili voi sallia BPRJ-340 estää kasvaimen kasvua suoraan estämällä poikkeava FLT3 signalointireitin ja epäsuorasti kohdistamalla kasvaimen angiogeneesiä. BPR1J-340 voi myös olla kliinistä potentiaalia kasvaimen ohjaa poikkeuksellisen ilmaistuna trkA-reseptoreihin, joita voi esiintyä aivoissa, eturauhas-, haima-, ja rintasyövän [42], [43], [44], [45].

BPR-1J340 inhiboi solun FLT3 fosforylaation ja moduloida FLT3-signalointireitin, joka johti proliferaation inhibitio ja apoptoosin induktion. BPR1J-340 osoitti voimakkaan kasvun estäminen, pääasiassa FLT3-riippuvaisten solujen (MOLM-13 ja MV4; 11), mutta ei FLT3-riippumattomia soluja. BPR1J-340 inhiboivat mutantti FLT3-ITD

+ solujen kanssa GC

50 2-6 nM ja esti FLT3-ITD fosforylaatiomallissa IC

50 10 nM; vaikka solut transfektoitu FLT3-D835Y mutantti myös inhiboi BPR1J-340, jossa on IC

50 noin 100 nM. Yhdenmukainen Näiden tulosten BPR1J-340 tehokkaasti indusoi apoptoosin FLT3-ITD

+ solut.

HDAC-inhibiittorit voivat osoittaa kasvun estäminen aktiivisuus AML soluja ja parantaa merkittävästi terapeuttista tehoa FLT3 estäjien [24], [46]. Tuore tutkimus kertoi, että HDACi LBH589 plus FLT3 estäjä (PPKC412, AC220) yhdistelmähoito voisi synergistisesti apoptoosin kautta FLT3-ITD ja Stat5: n hajoaminen [26]. Se osoitti myös, että aktivoitu kaspaasi-3 (CL-kaspaasi 3) edistää degrdation on FLT3-ITD ja Stat5: n [26]. FLT3-ITD hajoamista raportoitiin myös toissijainen HDACi aiheuttama säätely ylöspäin UBCH8 ja alas-säätely HSP90 [36], [47]. MCL-1, antiapoptoottisena proteiini, joka edistää selviytymistä FLT3-ITD

+ soluihin Stat5: n aktivaation, on alas-säätelee FLT3 esto [25]. HDACi SAHA indusoi myös alas-säätely Mcl-1 [48]. Lisäksi Mcl-1-proteiini on suora pilkkominen substraatti aktivoitu kaspaasi-3 [49].