Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Curcumin estää niiden kasvun ruokatorven syöpä solulinjojen; kuitenkin, vaikutusmekanismi ei ole täysin ymmärretty. On käymässä yhä selvemmäksi, että poikkeava aktivaatio Notch signalointi on liittynyt kehittämisen ruokatorven syöpään. Täällä olemme päättäneet, että curcumin estää ruokatorven syövän kasvua mekanismilla välittämien Notch signalointireitille.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että curcumin käsittely johti annoksen ja ajasta riippuva lisäkasvun estäminen ja pesäkkeenmuodostusta ruokatorven syöpään solulinjoissa. Lisäksi Kurkumiini indusoi apoptoosia kaspaasi 3 aktivaation, vahvisti lisääntyminen suhteessa Bax ja Bcl2. Solusyklin analyysi osoitti, että curcumin indusoi solukuolemaa ja säädeltiin sykliini D1 tasolla. Curcumin käsittely johti myös pienempi määrä ja koko esophagospheres. Lisäksi Kurkumiini hoito vähentänyt Notch-1 aktivointi, ilmentyminen Jagged-1 ja sen loppupään kohde Hes-1. Tämä vähennys Notch-1 aktivaatio oli päättänyt johtua alas-säätely kriittisten komponenttien γ-sekretaasin kompleksin proteiinien, kuten preseniliini 1 ja nikastriini. Yhdistelmä tunnetun γ-sekretaasin estäjä DAPT ja curcumin edelleen vähentynyt proliferaatio ja indusoi apoptoosin ruokatorven syöpäsoluja. Lopuksi Kurkumiini hoito alas-säädellä ilmaisuja Notch-1 spesifisten MikroRNA miR-21 ja miR-34a, ja ilmen- tymisen lisääntymisen tuumorisuppressoriproteiinia let-7a miRNA.

Päätelmä /merkitys

Curcumin on estäjä ruokatorven syövän kasvua, joka kohdistuu Notch-1 aktivointi γ-sekretaasi kompleksin proteiineja. Nämä tiedot viittaavat siihen, että Notch signaloinnin esto on uusi vaikutusmekanismi ja kurkumiinin aikana terapeuttinen intervention ruokatorven syöpiä.

Citation: Subramaniam D, Ponnurangam S, Ramamoorthy P, pysyvä D, Battafarano RJ, Anant S, et ai . (2012) Curcumin Aiheuttaa solukuoleman Ruokatorven Syöpäsolut kautta Moduloiva Notch Signaling. PLoS ONE 7 (2): e30590. doi: 10,1371 /journal.pone.0030590

Editor: Dhyan Chandra, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 31 lokakuu 2011; Hyväksytty: 19 joulukuu 2011; Julkaistu: 17 helmikuu 2012

Copyright: © 2012 Subramaniam et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Työ tukivat NIH avustuksia. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Ruokatorven syöpä on kahdeksas yleisin tapaus syöpä maailmassa ja kuudes syöpään kuolleisuus [1]. Yhdysvalloissa, 4-10 100000 henkilöt periksi taudin vuodessa ja koko taudin esiintymistiheys on suurin miehillä yli 50-vuotiailla [2]. American Cancer Society (ACS) arvioi, että vuonna 2011, 16980 amerikkalaiset (13450 miestä ja 3530 naista) olisi diagnosoitu ruokatorven syöpä. ACS myös arvioitu, että valtaosa näistä yksilöistä [14, 710 amerikkalaiset (11910 miestä ja 2800 naista)] kuolisi ruokatorven syöpään vuonna 2011 [3]. Ruokatorven adenokarsinooma, suuret muodossa ruokatorven syöpään Yhdysvalloissa, on nopeimmin kasvava syöpä länsimaissa. Se on yleensä diagnosoidaan vasta myöhäisessä vaiheessa ja on huono ennuste, jossa on 5 vuoden pysyvyys on alle 10%. Vaikka nykyinen hoito sisältää kemoterapian, sädehoidon, ja, mikäli mahdollista, esophagogastric resektio, monet potilaat, joilla ruokatorven adenokarsinooma kokemusta sairauden etenemisen, vaikka tällaista hoitoa, mikä viittaa siihen, että nämä kasvaimet ovat vastustuskykyisiä tavanomaista hoitoa.

Koska tavanomaisiin hoitoihin , kuten kirurginen resektio, kemoterapiaa, ja säteily ovat usein riittämättömiä hoidettaessa tämän taudin, uusia hoitovaihtoehtoja kriittisesti tarvitaan. Huolimatta syntyminen uusia kohdennettuja tekijöille ja käyttää erilaisia ​​terapeuttisia yhdistelmiä, ei hoitovaihtoehtoja ovat käytettävissä, jotka ovat hoitavia potilailla, joilla on edennyt syöpä. Suuruus tämän ongelman valtuuttaa tarvitaan uusia terapeuttisia aineita, erityisesti käyttämällä aineita, kemopreventiolle. Tämä on houkuttelevin ruokatorven adenokarsinooma koska esipahanlaatuisessa edellytys -Barrett ruokatorvi on hyvin tunnustettu vaurio.

Curcumin, joka on kasvien polyfenolista pigmentti johdettu kurkuma (

Curcuma longa

), on osoitettu olevan useita syöpää ehkäisevistä vaikutuksista, mukaan lukien proliferaation inhibitio, apoptoosi angiogeneesin inhiboituminen, ja estämällä DNA-topoisomeraasi II: [4]. Curcumin myös indusoi apoptoosia riippumaton kuolemaa kuten autophagy ruokatorven syöpäsoluissa [5]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että curcumin edistää apoptoosia, lisää kemosensitiivisyys, ja estää NF-KB ruokatorven adenokarsinooma [6] [7].

Notch signalointi on kriittinen rooli kehityksessä ja homeostaasin kudosten säätelemällä solu- kohtalo päätökset, lisääntymistä, erilaistumista ja apoptoosia. Notch signalointireitin on sekaantunut kantasolujen itseuudistumisen, solu-kohtalon määrittämiseen, proliferaatiota, erilaistumista ja apoptoosia [8]. Notch signalointi yliaktiivista ruokatorven syöpien ja on ehdotettu terapeuttinen kohde ruokatorven syöpiä [9] [10]. Notch signalointi aloitetaan, kun lovi ligandi vuorovaikutuksessa loven transmembraani- reseptoriin viereisten solujen [11] [12]. Tämä prosessi on yleensä aloittaa γ-sekretaasin välittämän proteolyyttisen vapautumisen Notch solunsisäisen domeenin (NICD), joka puolestaan ​​translokoituu tumaan solujen [13]. NiCd tumassa vuorovaikutuksessa C promoottori-sitova tekijä-1 (CBF1) transkription kofaktorina ja transaktivoi kohdegeenien, kuten on karvainen ja tehostaja split (HES) ja Hes liittyvät YRPW motiivi (Hey) perheet [ ,,,0],12] [14]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet yhteyden kurkuma, Notch ja NF-KB. Notch-1 signalointireitin on suoraan osoitettu aktivoida NF-KB suun syöpäsoluissa [15]. Lisäksi, kurkumiini estoa Notch-1 aktivointi johti myös downregulation NF-KB: n ja sen kohde-geenit, mukaan lukien Bcl-2, sykliini D1, verisuonen endoteelin kasvutekijä (VEGF), ja matriisin metalloproteinaasi -9 (MMP-9 ) suun okasolusyöpä soluja [4].

MikroRNA (miRNA) ovat lyhyitä ei-koodaavat RNA: t, jotka sitoutuvat 3’alue (UTR) ja sukulais RNA: iden (mRNA: t) kautta täysin toisiaan tai epätäydellinen emäspariutumista tukahduttaa käännöksen tai vähentämällä vakautta sitoutuneen mRNA: iden [16]. Jotkut miRNA raportoidaan oncomirs, joka voisi toimia joko onkogeenien tai tuumorisuppressorit [17]. Esimerkiksi miR-21 pienenee tuumorisuppressoriproteiinia Pdcd4 ilmaisun ja edistää invaasio, intravasation ja etäpesäkkeiden kolorektaalisyövässä [18]. Ylössäätely miR-21 liittyy vahvasti sekä korkean Ki-67 proliferatiivinen indeksi ja läsnäolo maksan etäpesäke [19]. miR-21 säännellään myös PTEN-riippuvaisen reitin ja vaikutti solujen kasvua, muuttoliike ja invaasio maksasolusyövän [20]. Viime aikoina olemme osoittaneet miRNA biomarkkereina Barrettin ruokatorvi etenemistä. miR-21 ylössäädellään 12,57-kertaisesti ruokatorven syöpä [21]. Toinen tärkeä miRNA on miR-34, joka on todettu osallistua sääntelyn p53 ja Notch polkuja sopusoinnussa tuumorisuppressoriproteiinia toimintaa [22]. Tuore tutkimus osoitti, että on olemassa rajat talk välillä miRNA ja Notch signaalireaktioteissä kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen [23]. Lisäksi Notch signalointi ja sen määräykset ovat erittäin tärkeitä tasolla transkription jälkeisen ja /tai translaation säätely geenien miRNA glioblastoma [24]. Toisaalta, anna-7a vähenee solujen proliferaatio ja migraatio glioblastooma ja pienentää kasvaimen kokoon ksenograftimallia [25].

Tässä artikkelissa olemme määritti kurkumiinista ruokatorven syöpä solujen ja mekanismi välittämää kautta Notch signalointireitin.

Materiaalit ja menetelmät

solut ja reagenssit

TE-7, TE-10 ovat ihmisen ja ESO-1 on hiiri ruokatorven adenokarsinooma syöpäsoluja, jotka olivat ystävällisesti saatu Dr. Richard J. Battafarano, University of Maryland, ja kasvatettiin RPMI 1640, joka sisälsi 10% lämmöllä inaktivoitua naudan sikiön seerumia (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) ja 1% antibiootti-anti-sieni-liuosta (Mediatech Inc., Manassas, VA) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. Curcumin ostettiin LKT Laboratories, St. Paul, MN. N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl) -L-alanyyli] -S-fenyyliglysiini-t-butyyliesteri (DAPT) ostettiin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO).

leviämisen ja apoptosis määritykset

arvioimiseksi lisääntymistä, solut ympättiin 96-kuoppalevyille ja kasvaa yön yli. Sitten soluja käsiteltiin kasvavia annoksia curcumin 10% FBS, joka sisälsi RPMI 1640: Analyysi soluproliferaation suoritettiin entsymaattisella määrityksellä, kuten on kuvattu [26]. Apoptoosin, kaspaasi 3/7 aktiivisuus mitattiin käyttäen Apo-one homogeeninen kaspaasi-3/7 Assay Kit (Promega, Madison, WI).

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Lyhyesti, 6 ja maljaa ympättiin 500 eläviä soluja, ja annettiin kasvaa 24 tuntia. Sitten soluja inkuboitiin, kun läsnä tai poissa ollessa 30 uM curcumin 24 tuntia. Curcumin sisältävät Sitten väliaine poistettiin ja solut pestiin PBS: ssä ja inkuboitiin vielä 10 d täydelliseen alustaan. Kukin käsittely tehdään kolmena kappaleena. Pesäkkeet saatiin pestiin PBS: llä ja kiinnitettiin 10% formaliinilla 10 minuuttia huoneenlämpötilassa ja pestiin sitten PBS: llä, mitä seurasi värjäys Kristalliviolettiliuos. Pesäkkeet laskettiin ja käsittelemättömiin soluihin verrattuna.

Cell kaarianalyysien

Soluja käsiteltiin 30 uM kurkumiinin 12 ja 24 tunnin ajan, sitten solut trypsinoitiin ja suspendoitiin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen ( PBS). Yksisoluiset suspensiot kiinnitetään käyttäen 70% etanolissa 2 tuntia, ja sen jälkeen tehtiin läpäiseviksi PBS: llä, joka sisälsi 1 mg /ml propidiumjodidia (Sigma-Aldrich), 0,1% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) ja 2 ug DNaasi-vapaata RNaasi (Sigma-Aldrich) huoneen lämpötilassa. Virtaussytometria tehtiin FACSCalibur analysaattori (Becton Dickinson, Mountain View, CA), syömällä 10000 tapahtumien jokaisesta näytteestä. Tulokset analysoitiin ModFit LT ™ -ohjelmiston (Verity Software House, Topsham, ME).

Real Time Reverse-transkriptio polymeraasiketjureaktio Analysis

eristetty kokonais-RNA TE-7-soluja käyttäen TRIZOL reagenssia käänteistranskriboitiin Superscript II käänteistranskriptaasilla läsnä ollessa ta satunnaisheksanukleotidialukkeilla (kaikki Invitrogen, Carlsbad, CA). Täydentävät DNA: t käytettiin sitten Real Time PCR: llä käyttämällä Jumpstartin Taq DNA-polymeraasia (Sigma-Aldrich) ja SYBR Green nukleiinihapon tahra (Molecular Probes, Eugene, OR). Crossing kynnystä geenien normalisoitiin p-Actin. Muutoksia mRNA: n ilmentymisen ilmaistiin kertainen muutos suhteessa kontrolliin. Alukkeita käytettiin tässä tutkimuksessa olivat seuraavat: β-Actin: 5′-GCTGATCCACATCTGCTGG-3 ’ja 5′-ATCATTCTCCTCCTCAGCG-3′; Sykliini D1: 5’-AATGACCCCGCACGATTTC-3 ’ja 5′-TCAGGTTCAGGCCTTGCAC-3′; Notch-1: 5’-CACTGTGGGCGGGTCC-3 ’ja 5′-GTTGTATTGGTTCGGCACCAT-3′; HES-1 5’-AGGCGGACATTCTGGAAATG-3 ’ja 5′-CGGTACTTCCCCAGCACACTT-3’; Preseniliini-1 5 ’ATCATGCTCTTTGTCC-3′ ja 5’-TCTTCTGTGAATGGG-3 ’; Nikastriini 5’-CAGATTGGCTGCCAGT-3 ’ja 5′-CTCCAGCAGAACCAT-3’.

miRNA analyysi

Yhteensä miRNA eristettiin käyttäen Mirvana ™ miRNA eristyspakkausta (Ambion Inc, Grand Island, NY) . Yhteensä miRNA eristetty TE-7-solut altistettiin käänteistranskriptio Superscript ™ II RNaasi H-käänteistranskriptaasia ja ta satunnaisheksanukleotidialukkeilla (Invitrogen). CDNA myöhemmin käytetään suorittamaan reaaliaikainen PCR SYBR kemia (SYBR® Green I, Molecular Probes) ja yksi-

let-7a

transkriptio käyttämällä spesifisiä alukkeita ja Jumpstart Taq DNA-polymeraasia (Sigma-Aldrich, St . Louis, MO). Merimatka kynnysarvo arvioidaan Reaaliaikainen PCR huomattiin

pri-let-7a

miRNA ja normalisoitu

U6

pri-miRNA. Muutokset pri-miRNA ilmaistiin kertainen muutos suhteessa ohjata ± SEM arvoa. Käytetyt alukkeet ovat:

pri-U6

: 5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ’ja 5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’,

pri-let-7a

: 5′-GAGGTAGTAGGTTGTATAGTTTAGAA-3 ’, 5’-AAAGCTAGGAGGCTGTACA-3 ’. Pri-miR-34 5’-TGGCAGTGTCTTAGCTGGTTG-3 ’ja 5′-GGCAGTATACTTGCTGATTGCTT-3′, pri-miR-21: 5’-GCTTATCAGACTGATGTTGACTG-3 ’ja 5′-CAGCCCATCGACTGGTG-3’.

Western Blot-analyysi

Solulysaatit altistettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla ja blotattiin Immobilon-P polyvinylideenidifluoridi kalvoja (Millipore, Bedford, MA). Notch-1, Caspase 3, Bcl2 ja Bax vasta-aineet hankittiin Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Sykliini D1, Notch-1, Jagged-1, Hes-1 ja Actin vasta ostettiin Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). Preseniliini 1, 2, nikastriini, APH1 ja Pen2 vasta-GenScript Inc (Piscataway, NJ) ja erityiset proteiinit havaittiin tehostetun kemiluminesenssin järjestelmä (GE Healthcare, Piscataway, NJ).

Sferoidiviljelmiä määritys

muodostumista pallosia, soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä (Mediatech), jota oli täydennetty 20 ng /ml bFGF: ää (Invitrogen) 10 ml per 500 ml 50X B27 täydentää (Invitrogen) EGF 20 ng /ml (Invitrogen) ja antibiootti ja antimykoottia ratkaisu. Solut ympättiin pienillä tiheyksillä (5000 solua /ml) 6 hyvin alhainen tarttuvuus levyjä. Soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla curcumin (0-50 uM). 7 päivän jälkeen palloset valokuvattiin.

immunofluoresenssi

Solut maljattiin yli yön peittely luistaa kuuteen kuoppalevyillä. Hoidon jälkeen 30 uM curcumin 24 h, solut kiinnitettiin sitten paraformaldehydillä 15 min, huuhdeltiin PBS: lla, ja inkuboitiin 2% naudan seerumin albumiinia PBS: ssä 30 minuutin ajan. Sitten soluja inkuboitiin yön yli anti-Notch-1, anti-Jagged-1, anti-HES-1, anti-preseniliini 1 ja anti-nikastriini-vasta-aine, vastaavasti. PBS-pesun jälkeen soluja inkuboitiin Cy-3-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta 30 minuutin ajan ja pestiin PBS: llä. Cell kuvat havaittiin fluoresenssimikroskoopilla.

Tilastollinen analyysi

Kaikki arvot on ilmaistu keskiarvona ± SEM. Aineisto analysoitiin parittomalla 2-tailed t-testiä.

P

arvo on alle 0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Curcumin estää ruokatorven syöpä solujen kasvua

määritti kurkumiinista ruokatorven syöpäsolun proliferaatiota moniin erilaisiin solu- linjojen (TE-7, TE-10 ja ESO-1). Curcumin merkittävästi tukahdutti leviämisen ruokatorven syöpä solulinjoja TE-7, TE-10 ja ESO-1 in annoksesta ja ajasta riippuvaisella tavalla. Tämä anti-leviämisen vaikutusta kasvaimen soluihin nähtiin sisällä 24 tunnin ajan, joka jatkoi merkittävästi seuraavien 72 h (kuvio 1A). Määrittää pitkän aikavälin vaikutus curcumin hoidon, soluja käsiteltiin 30 uM curcumin 24 tuntia, jonka jälkeen solujen annettiin kasvaa normaaliin media. Curcumin hoito tukahdutti pesäkkeiden muodostumista kaikissa ruokatorven syöpä solulinjoissa (kuvio 1 B), mikä viittaa siihen, että kurkumiini n vaikutus kasvainsoluihin on peruuttamaton. Sykliini D1 on yksi solusyklin sääntelyn proteiini, joka säätelee G1 S-vaiheeseen siirtymistä solusyklin ja toimii kofaktorina useita transkriptiotekijöitä useissa solulinjoissa. Tämä sykliini muodostaa kompleksin ja toimii säätelyalayksikön CDK4 tai CDK6, joiden aktiivisuutta tarvitaan G1 /S siirtyminen. Sykliini D1 yli-ilmentyminen on yhdistetty kehittymistä ja etenemistä syövän [27]. Curcumin hoito esti sykliini D1 mRNA ja proteiinin ilmentyminen viittaa siihen, että se estää syöpäsolujen lisääntymistä. Toisaalta, ekspressio p21-proteiinin lisättiin (kuvio 1C ja D).

(A) Curcumin inhiboi proliferaatiota ruokatorven syöpäsoluja. Soluja inkuboitiin kasvavia annoksia curcumin (0-50 uM) enintään 72 tunnin ajan ja analysoitiin solujen lisääntymisen. Curcumin hoito johti merkittävään ja ajasta riippuva väheneminen solujen lisääntymisen kaikissa kolmessa soluissa verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin. (B) Curcumin estää pesäkkeiden muodostumista. Ruokatorven syöpä soluja inkuboitiin 30 uM curcumin 24 h ja annettiin kasvaa pesäkkeiksi ja 10 päivää. Inkubointi curcumin estää pesäkkeiden muodostumista. Tulokset edustavat kolmen erillisen kokeen. (C) sykliini D1 on yksi solusyklin sääntelyn proteiinia ja joka on osallisena solusyklin pysähtymiseen. RNA TE-7 inkuboidaan 30 uM curcumin alistettiin Real Time PCR sykliini D1 mRNA: n ilmentymisen. Curcumin hoito estää merkittävästi sykliini D1 mRNA: n ilmentymisen (* p 0,05). (D) Lysaatit TE-7 inkuboitiin 30 uM curcumin analysoitiin western-blottauksella ja sykliini D1 ilmentymisen tasot käyttäen hiiren anti-sykliini D1-vasta-ainetta. Curcumin hoito estää sykliini D1-proteiinin ilmentymisen.

Curcumin indusoi solukuolemaa apoptoosin

Koska vaikutuksia kurkumiinista tukahduttamisesta leviämisen ja pesäkkeen muodostumisen, me seuraavaksi ratkaistava, onko curcumin vaikuttaa solusyklin etenemistä. Hoito curcumin merkittävästi indusoi solukuolemaa TE-7 soluja 12 h ja lisääntyi jatkuvasti jopa 24 tuntia (kuvio 2A). Tällaisia ​​vastaavia lisäykset solukuoleman on havaittu muissa solutyypeissä [28]. Kurkumiinia tiedetään indusoivan apoptoosia erilaisissa syöpäsoluissa. Kaspaasit ovat perhe proteiineja tunnetaan toteuttamista apoptoosin. Kaspaasi-3 ja kaspaasi-7 ovat keskeisiä efektorimolekyylien tiedetään indusoivan apoptoosia eri syöpäsolujen vahvistamalla signaalia initiaattorin kaspaasit, kuten kaspaasi-8: n tai kaspaasi-10. Aktivoitunut efektori kaspaasi-3 ja kaspaasi-7 havaittiin 24 tunnin kuluessa TE-7-solulinja käsiteltiin curcumin viittaa apoptoosin induktio (kuvio 2B). Western blot analyysit TE-7 solulysaateista osoittivat merkittävää laskua prokaspaasi-3 curcumin kasvaimen solut (kuvio 2C). Edelleen vahvistus siitä, että solut apoptoosin saatiin Western blot-analyysit anti-apoptoottisen Bcl2 ja BclxL ja pro-apoptoottisten Bax proteiineja. Curcumin hoito esti ilmaus Bcl2 ja BclxL ja lisääntynyt Bax-proteiinin tasoja. Nämä tiedot viittaavat siihen, että kurkuma indusoi apoptoosin ruokatorven syöpä soluja (kuvio 2D).

(A) Solusyklianalyysiä kurkumiinin käsiteltyjen solujen. TE-7-soluja käsiteltiin 30 uM kurkumiinin 12 ja 24 h, tutkittiin virtaussytometrialla seuraavasti propidiumjodidivärjäys DNA-sisältöä. Curcumin hoito johtaa lisääntynyt määrä kuolleita soluja. Kuvaajat edustavat kerättyjen kolmen kokeen. (B) Curcumin indusoi kaspaasi-3, apoptoosin sovittelija. TE-7-soluja inkuboitiin 30 uM curcumin analysoitiin apoptoosi kaspaasi-3 ja-7 aktivointi. Curcumin käsittely lisäsi solujen lukumäärä apoptoosin käsittelemättömiin kontrolleihin verrattuna (* p 0,05). (C) Lysaatit TE-7-soluja inkuboitiin 30 uM curcumin analysoitiin western-blottauksella ja kaspaasi-3-proteiinin suhteen käyttäen kanin anti-kaspaasi-3-vasta-aine. Curcumin hoito johti vähentynyt prokaspaasi-3. (D) Lysaatit TE-7-soluja inkuboitiin 30 uM curcumin analysoitiin western-blottauksella ja Bcl2, BclxL, ja Bax proteiineja. Curcumin vähentää ilmentymistä anti-apoptoottisten proteiinien Bcl2 ja BclxL, kun taas lisääntynyt ilmentyminen pro-apoptoottisten proteiinien käsitellyissä soluissa verrattuna käsittelemättömiin soluihin.

kurkumiini estää esophagosphere muodostumista

Koska curcumin estää colonosphere muodostumista koolonkarsinoomasoluissa ja vaikuttavat Notch signalointireitille proteiineja. Me seuraavaksi määrittää vaikutukset kurkumiinista ruokatorven syöpä solujen pallomainen muodostumista. Curcumin hoito inhiboi merkittävästi esophagosphere muodostumista annoksesta riippuvaisella tavalla sekä TE-7 ja TE-10-soluissa (kuvio 3A). Pallojen koko, lukumäärä laskettiin. Curcumin hoito vähensi sekä ensimmäisen ja toisen sferoidiviljelmiä muodostumiseen (kuvio 3B ja C).

(A) TE-7 ja TE-soluja kasvatettiin matalan kiinnittyvä levyillä ja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla curcumin (0-50 uM) ja esiintyi pallomainen määrityksessä. Viikon kuluttua, palloset valokuvattiin. (B) Sferoidiviljelmiä laskettiin ja suoritettiin bar kaavio. Curcumin hoito merkitsevästi esti ruokatorven syöpä soluja pallosia (* p 0,05). (C) Ensisijainen palloset koottiin ja erotettiin yksittäisiksi soluiksi ja maljattiin uudelleen. Curcumin hoito esti merkitsevästi ruokatorven syöpä soluja toissijainen pallosia (* p 0,05).

kurkumiini estää Notch aktivointi vähen- tämisessä γ-sekretaasin kompleksin

Notch-1 on solun kalvoon liittynyt proteiinia. Ligandin sitoutuminen aiheuttaa solunsisäisen domeenin transmembraanisen reseptorin Notch (NICD) voidaan lohkaista kalvon läpi toiminnan γ-sekretaasin monimutkainen. NICD siirtyy tumaan, jossa se on yhteydessä perheen DNA sitovien proteiinien transkription aktivoimiseksi Notch kohdegeenien, kuten karvasoluleukemian ja tehostajana-of-split 1 (

Hes1

) [29]. Olemme määritti kurkumiinista Notch-1, sen ligandi rosoinen-1 ja HES-1 TE-7-soluissa. Curcumin hoitoon merkittävästi vaimentua Notch-1 ja sen ligandi Jagged-1 ja loppupään kohdeproteiineja HES-1 sekä mRNA: n ja proteiinin tasot (kuvio 4A ja B). Proteiini tasot vahvistettiin immuuni-fluoresenssivärjäysreagenssia, jossa huomattavasti vähemmän ydin- Notch-1 ja sytoplasminen Jagged-1 havaittiin curcumin käsitellyissä soluissa (kuvio 4C).

(A) reaaliaikainen käänteistranskriptio -PCR-analyysi RNA: n TE-7-soluissa 30 uM curcumin hoitoa 24 h osoitti ilmentyminen vähenee Notch-1, sen ligandi Jagged-1 ja sen kohdegeenin HES-1-mRNA: n (* p 0,05). (B) lysaatit curcumin hoito aiheutti merkittäviä ilmentyminen vähenee katkaistun Notch-1, sen ligandi Jagged-1 ja sen kohdegeenin HES-1-proteiinin tasot TE-7-soluissa. (C) TE-7-soluja käsiteltiin 30 uM curcumin 24 tuntia tehtiin immunoblottaus fluoresenssivärjäys käyttäen anti-Notch-1, anti-Jagged-1 ja anti-HES-1-vasta-aineita. Curcumin hoito johti alhaisempi Notch-1-proteiinin tumassa ja vähentää Jagged-1 ja HES-1 ilmentymisen TE-7-soluissa.

vieressä määrittää mekanismia, jolla curcumin vaikuttaa Notch- 1 aktivointi. γ-sekretaasi on multi-proteiini-kompleksi, joka sisältää sisäisen kalvon pilkkova proteaasi. Monimutkainen on kasvava luettelo proteiinien alustoille, mukaan lukien Notch reseptoreihin. Neljä komponentit γ-sekretaasin monimutkainen, preseniliini 1, nikastriini, Pen2, ja Aph1 ovat kaikki uskotaan olevan välttämättömiä toimintaa [13] [30] [31]. Katalyyttinen domeeni oleskelee preseniliini, kun taas nikastriini on ehdotettu olevan kriittisiä substraatin tunnustamista [32]. Curcumin hoito johti alassäätöä ilmaus γ-sekretaasin kompleksi proteiineista, preseniliini 1 ja 2, nikastriini, APH1 ja PEN2 (kuvio 5A, B ja C). Nämä tiedot viittaavat siihen, että kurkuma välitteinen säätely alaspäin Notch signalointireitin tapahtuu osittain läpi estämällä γ-sekretaasin monimutkainen.

(A) reaaliaikainen käänteistranskriptio-PCR-analyysi RNA: n TE- 7-soluissa 30 uM curcumin hoitoa 24 h osoitti ilmentyminen vähenee ja preseniliini 1 ja nikastriini mRNA (* p 0,05). (B) lysaatit curcumin hoito aiheutti merkittäviä ilmentyminen vähenee ja γ-sekretaasin kompleksin proteiinien preseniliini 1 ja 2, nikastriini, APH1 ja Pen2 proteiinin tasot TE-7-soluissa. (C) TE-7-solut käsiteltiin 30 uM curcumin 24 tuntia tehtiin immunologiseen fluoresenssivärjäys käyttäen anti-preseniliini 1 ja anti-nikastriini vasta-aineita. Curcumin hoito johti alhaisempi preseniliini 1 ja nikastriini ilmentymisen TE-7cells.

yhdistelmä kurkuma ja γ-sekretaasi monimutkainen estäjä DAPT edelleen vaikuttaa ruokatorven syövän kasvua

Hoito yhdistelmä kurkumiinin ja γ-sekretaasi kompleksin inhibiittori (GSI) DAPT edelleen inhiboi Notch-1 kohdeproteiinit HES-1 ja sykliini D1 ilmentyminen (kuvio 6A). Suoritimme yhdistelmä curcumin kanssa γ-sekretaasi monimutkainen estäjä DAPT proliferaatioon ja apoptoosiin. Yhdistelmä curcumin ja DAPT hoito edelleen inhiboi proliferaatiota ja indusoi apoptoosia TE-7-soluissa (kuvio 6B ja C). Samanlaisia ​​tuloksia havaittiin TE-10-soluja (tietoja ei esitetty).

(A) TE-soluja käsiteltiin DAPT (50 uM) ja kurkumiini (30 uM) yksinään ja yhdistelmänä 24 tuntia. Lysaatit analysoitiin Western blot -menetelmällä. HES-1 ja sykliini D1 proteiinit laskivat edelleen yhdistelmällä kahden yhdisteen. (B) TE-soluja käsiteltiin DAPT (50 uM) ja kurkumiini (30 uM) yksinään ja yhdistelmänä 48 tunnin ajan. Solujen proliferaatio inhiboitui merkittävästi hoidon jälkeen yhdistelmä DAPT ja kurkumiinin verrattuna kunkin curcumin yksin käyttämällä heksosaminidaasin entsyymin systeemiä (*

P

0,05). (C) Apoptoosi indusoituu merkittävästi hoidon jälkeen yhdistelmä DAPT ja kurkumiinin verrattuna kunkin curcumin yksin käyttämällä Apo-oni homogeeninen kaspaasi-3/7 Assay Kit (*

P

0,05).

Curcumin estää oncomir miRNA ja lisää tuumorisuppressoriproteiinia miRNA ruokatorven syöpäsoluissa

Curcumin muuttaa microRNA ilmaisun paksusuolessa [33] haiman [34], rintojen [35], virtsarakon [36] ja keuhko [37] syöpäsoluja. Viime aikoina olemme osoittaneet, että miRNA kuten biomarkkereita Barrettin ruokatorvi etenemistä ja miR-21 ylössäädellään 12,57 kertaisesti ruokatorven syöpä [21]. Me seuraavaksi määrittää vaikutukset kurkumiinista oncomir miRNA ja tuumorisuppressoriproteiinia miRNA ruokatorven syöpäsoluja. Curcumin hoito merkitsevästi säädeltiin miR-21 ja miR-34a ilme taas upregulating let-7a miRNA ilmaisu (kuvio 7A ja B).

(A) reaaliaikainen käänteistranskriptio-PCR-analyysi koko miRNA peräisin TE- 7-soluissa 30 uM curcumin hoidon 24 tunnin ajan. Curcumin hoito merkitsevästi estävän oncomiR miRNA ilmentymistä TE-7-solut (*

P

0,05). (B) Curcumin hoito merkitsevästi sääteli tuumorisuppressoriproteiinia let-7a miRNA ilmentymisen TE-7-soluissa.

Keskustelu

Ruokatorven syöpä on yksi kuudesosa johtavista syistä syöpää liittyvien kuolemien länsimaissa. Kaiken taudin esiintymistiheys on suurin miehillä yli 50-vuotiailla [2]. Ruokatorven syöpä on yleensä diagnosoitu myöhäisessä vaiheessa ja on huono ennuste, jossa on 5 vuoden pysyvyys on alle 10%. Merkittävä sairastavuus, myrkyllisyys ja huono vaste oli nykyisen sytostaattihoitoon ovat johtaneet etsii vähemmän myrkyllisiä vaihtoehtoisia hoitoja. Me ja muut ovat osoittaneet, että kurkuma estää proliferaatiota ja indusoi apoptoosia erilaisissa kasvainsoluissa, mukaan lukien haima-, rinta-, paksusuoli-, suun kautta, keuhkojen, melanooma, myelooma, leukemia, ja eturauhassyöpä. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että curcumin tukahduttaa leviämisen ja lisää apoptoosia ruokatorven syöpäsoluissa [5] [6] [38] [39].

esitetyt tiedot tässä artikkelissa osoittavat, että kurkuma estää selektiivisesti leviämisen ruokatorven syöpäsolut, estää muodostumista ruokatorven syöpä solujen pesäkkeitä, edistää solusyklin pysähtymisen ja apoptoosin, estää esophagosphere muodostumista, alas säätelee lovi signalointi ja sen γ-sekretaasi monimutkaisia ​​proteiineja, ja myös estää oncomir miRNA ilmaisun ja indusoi kasvaimia estävä miRNA ilme. Nämä tulokset edelleen esitetty kaaviokuva kuviossa 8. Tuloksemme osoittavat, että kurkuma voi estää tehokkaasti solujen lisääntymistä 24 tunnin sisällä. Lisäksi estovaikutusta tuumorisoluihin näyttävät jatkuvan ja peruuttamaton 24 tunnin kuluttua hoidon. Tuloksemme sykliini D1 on kiehtova, että oli vähentää ilmaisumuodoltaan 24 tuntia. Tämä olisi voinut johtaa soluissa meneillään G0-G1 pidätyksen jälkeen proteiini on vastuussa etenemisensä G0-G1 /S faasimuutos [40]. Vastaavia curcumin aiheuttama G0 /G1 pidätys on myös osoitettu esiintyvän muissa syöpäsolujen tyypit, mukaan lukien paksusuolen ja mahalaukun syövistä, ja Manttelisolulymfoomapotilailla [28] [41]. Todellakin, havaitsimme merkittävän kasvun kuolleiden solujen ruokatorven syöpä solujen jopa 12 tunnin inkuboinnin jälkeen curcumin, mikä johti sittemmin solukuolemaan.

tutkimukset osoittavat, että kurkuma estää ilmentymistä Jagged-1 ja Notch-1-reseptorin. Curcumin estää myös γ-sekretaasi kompleksin proteiineista, estäen siten lohkaisu Notch-reseptorin. Tämän seurauksena, Notch solunsisäinen domeeni (NICD) ei vapaudu eikä se näin ollen tumaan aktivoida alavirtaan kohdegeenien c-myc ja sykliini D1. Tämä johtaa soluproliferaation inhibointi ja kantasolujen palautuminen, kun taas samaan aikaan apoptoosin.

Esillä olevassa tutkimuksessa olemme myös havainneet, että kurkuma alas säätelee Notch signalointi inhibition kautta γ-sekretaasin monimutkainen. Curcumin estää Notch-1 ja sen ligandi Jagged-1 ruokatorven syöpäsoluja. Olemme myös havainneet, että kurkuma esti ilmentymisen Notch-1 on alavirrassa oleva kohde

HES-1

. Viime aikoina on raportoitu, että Notch-reitillä on kriittinen rooli prosesseissa kasvainsoluproliferaation, apoptoosin ja kantasolujen ylläpitoon ja on tiiviisti mukana tuumorigeneesiä ruokatorven syöpäsoluissa [42]. Siksi Kurkumiini välittämä solujen kasvun estäminen voidaan osittain välittyy inaktivoitumisen Notch-1 aktiivisuutta. Tämä varmistettiin edelleen yhdistelmä GSI ja kurkuma, joka edelleen esti proliferaatiota ja indusoi apoptoosia. Samoin yhdistelmä kurkumiinin kanssa GSI edelleen inhiboivat HES-1 ja sykliini D1 ilmaisuja. Kuitenkin Notch-1 ei ole ainoa reitti aktiivinen ruokatorven syöpä, kuten monet muut solureiteillä aktivoidaan [7] [39]. Olisi mielenkiintoista selvittää curcumin on yhtä voimakas estossa muihin signaalitransduktioreitteihin. Lisäksi olisi mielenkiintoista selvittää ektooppinen ilmentyminen Notch loppupään kohdegeenien kuten Hes-1 ja c-myc kunnossa Notch Knockdown tai pelastus suojaa curcumin välittämä solukuolema.

Notch signalointi tarvitaan kantasolujen itseuudistumiseen ja ylläpitää stemness [43].