Krooninen sairaus

tiivistelmä

Kasvain hypoksia indusoi epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), joka indusoi invaasio ja etäpesäke, ja siihen liittyy syövän kantasoluja (CSCS). Olipa EMT luo CSCS

de novo

, parantaa kaikki nykyiset CSCS tai molempien on epäselvä. Tutkimme potilaskudos haiman adenokarsinooma (PDA) yhdessä karsinoomat rinta-, keuhko-, munuais-, eturauhas- ja munasarja. Sillä

in vitro

tutkimuksissa viisi vakiintunutta PDA solulinjat luokiteltu vähemmän (CSC

alhainen) ja erittäin aggressiivinen CSC kaltaisia ​​soluja (CSC

korkea) tutkittiin yhden ja kahden hengen immunofluoresenssimikroskoopilla, haava -, transwell- ja nopeutus mikroskoopilla. HIF-1α ja Slug sekä HIF-2α ja CD133 olivat koekspressoi osoittaa oletetun rinnakkaiselon hypoksia, EMT ja CSCS

in vivo

. CSC

korkea solut osoittivat korkean perusilmennystä mesenkymaaliseen vimentiinista proteiinia, mutta vain vähän jos lainkaan ilmentymistä epiteelin merkki E-kadheriinin, vastakkaisen tuloksen CSC

alhainen soluja. Hypoksia laukaisi muuntamiseen solumorfologian peräisin epiteelin on mesenkymaaliset fenotyyppi, joka näkyi selvimmin CSC

korkea soluja. Samanaikaisesti E-kadheriinin ilmentyminen väheni ja ilmaus vimentiinista, Slug, Twist2 ja Zeb1 parannettu. Vaikka aiheuttama hypoksia muuttoliike kaikissa solulinjoissa, nopeus yhdessä prosenttiosuus vaeltavat, polarisoitunut ja valejalka muodostavien solujen määrä oli merkitsevästi suurempi CSC

korkea soluja. Nämä tiedot osoittavat, että hypoksian indusoima EMT tapahtuu PDA ja useita muita kasvaimen yksiköitä. Kuitenkin vaikka hypoksian aiheuttaman EMT signalointi tapahtuu kaikissa kasvainsolupopulaatioissa vain varsi kaltaisia ​​soluja hankkia korkea vaeltavia potentiaali ja siten voi olla vastuussa ja metastaasit.

Citation: Salnikov AV, Liu L, Platen M , Gladkich J, Salnikova O, Ryschich E, et ai. (2012) Hypoksia indusoi EMT Low ja erittäin aggressiivinen haimasyöpäkasvainsoluissa mutta vain Solut syöpä Stem Cell Ominaisuudet hankkia Ylikorostuneet vaeltavien Potential. PLoS ONE 7 (9): e46391. doi: 10,1371 /journal.pone.0046391

Editor: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 12 kesäkuu 2012; Hyväksytty: 29 elokuu 2012; Julkaistu: 26 syyskuu 2012

Copyright: © Salnikov et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia Saksan Cancer Aid (Deutsche Krebshilfe 109362), saksalainen tutkimus yhteisön (DFG HE 3186 /11-1) ja saksalainen Israelin Foundation tieteellisen tutkimuksen ja kehityksen (GIF 1058-7,11 /2008). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Haiman adenokarsinooma (PDA) on aggressiivinen pahanlaatuisen ominaista laaja paikallinen invaasio, varhainen systeeminen levittäminen ja merkitty vastustuskykyä kemo- ja sädehoidon [1]. Lisäksi useimmat PDA hallussaan voimakas hypoksinen kasvaimeen mikroympäristölle [2]. Kasvain hypoksia tapahtuu, kun hapenkulutus ylittää toimituksen verisuoniston [3]. Tämä johtaa induktion hypoksia-indusoituvan transkription tekijöitä, esim. HIF-1α ja HIF-2α, jotka säätelevät hypoksinen vasteen induktioon kohdegeenien kuten VEGF [4]. Hapen paine kiinteitä kasvaimia on yleensä alhaisempi kuin ympäröivän ei-pahanlaatuisten kudosten ja kasvainten, joilla laaja hypoksiaa on osoitettu olevan aggressiivisempi kuin vastaavat kasvaimia, jotka ovat paremmin oxygenized [5], [6], [7]. Tämä sisältää haimasyöpä, joissa korkea ilmentymä hypoksia merkki HIF-1α potilaan kudokseen on osoitettu olevan ennustava huonon kliinisen tuloksen [8]. Kokeellisissa tutkimuksissa, hypoksia ennustaa aggressiivista kasvua ja spontaani etäpesäkkeiden muodostumista haimasyövän ksenografteissa [9]. Niinpä uusiutunut kasvaimia on korkeampi hypoksinen murto verrattuna primäärikasvaimissa [10], [11] mikä viittaa rooliin hypoksian rikastukseen syöpäsolujen kanssa kantasolujen ominaisuuksia (CSC).

Pieni CSC väestö on ehdotti hallussaan itseuudistumiseen potentiaali ja kyky erilaistua ja aikaansaa näin heterogeenisen solupopulaation on peräisin kasvaimeen [12], [13], [14]. Nämä havainnot on myös osoitettu haimasyövän [15], [16]. Lisäksi CSC ehdotetaan välittävän hallitsematon kasvu, terapia vastus, invaasio ja etäpesäkkeiden [17]. Se, onko CSCS ovat todella vain solut

de facto

Tuumorigeenisuustutkimuksissa edelleen kiistanalainen [18], [19], [20], [21]. Viimeaikaiset raportit osoittavat, että syntyminen CSCS esiintyy osittain seurauksena epiteelin mesenkyymisoluyhteisviljelmissä-siirtymä (EMT) [21]. Näin ollen herää kysymys, EMT vaikuttaa CSC väestöstä vain tai myös eriytetympää progenitorisolujen

EMT on evoluutiossa konservoitunut kehitysprosessin aikana, että solut menettävät epiteelin ominaisuudet ja saada mesenkymaalisten ominaisuudet [22]. Tähän liittyy liukenemista solu-solu risteyksissä ja menetys apico-basolateraalisessa polaarisuus, jolloin muodostuu muuttavien mesenkymaalisten solujen invasiivisia ominaisuuksia [21]. Siksi EMT on sekaantunut kasvainprogression ja etäpesäkkeiden [23]. EMT-indusoijat, kuten transformoiva kasvutekijä-β (TGF-β) tai hypoksia, laukaista muutoksia geenien ilmentyminen monimutkaisilla signalointireitteihin. Perus mekanismi, joka osallistuu etenemistä EMT on ylössäätely mesenkymaalisten markkerin vimentiinista ja downregulation epiteelin markkerin E-kadheriinin – tärkeimmät transmembraaninen adheesiomolekyyli vastuussa solu-solu-vuorovaikutuksiin ja kudosten organisaation epiteelisoluissa [24]. E-kadheriinin on transkriptionaalisesti tukahduttaa Twist, Snail, Slug ja Zeb proteiineja. Alennettu E-kadheriinin ilmentymisen aiheuttaa vyöliitos erittely, ja yhdessä muiden signalointi tapahtumia edistää vankka geeniekspression muutokset [21]. Menetys polariteetin ja vahvistuksen liikkuvia ominaisuuksia mesenkyymisolujen alkionkehityksen aikana on pakottanut vertailuja metastaattinen syöpäsolujen aikana pahanlaatuisten etenemisen [25]. Erityisesti viimeaikaiset tiedot osoittavat, että EMT on todellakin mukana tuottavan solujen ominaisuuksia kantasoluja, kuten on esitetty rintasyövän [25], [26], colorectum [27] ja haiman [28], [29].

mukaan CSC hypoteesin ainoastaan ​​CSC väestö vastaa varhaista systeemistä levittämistä ja etäpesäkkeiden muodostumista. Tämä tarkoittaa, että hypoksian indusoima EMT joko vaikuttaa CSCS ainoastaan ​​aktivoi eriytetympää progenitorisolujen johtuvan kaltaisia ​​soluja tai molempia yhdessä. Koska tätä kysymystä ei ole tutkittu tähän mennessä olemme käsitelleet tätä kysymystä. Keskittymällä haimasyövän löysimme koekspressoimalla hypoxia-, EMT ja CSC merkkiaineiden potilaasta peräisin kudosta. Käyttämällä vakiintuneiden solulinjojen korkea tai matala kantasolujen ominaisuuksia (CSC

korkea tai CSC

matala) me aiheuttama hypoksia kaasuseoksen alhaisen hapen. Tämä johti muutoksiin solujen morfologia tuloksena on fibroblastit-fenotyypin ja EMT liittyvien proteiinin ilmentyminen molemmissa kasvainsolupopulaatioissa. Kuitenkin aggressiivisempia soluja oli korkeampi pohjapinta EMT-allekirjoitusta ja tämä liittyi nopeampi ja suurempi hypoksia välittämä induktio muuttavien toimintaa. Meidän havainnot voi olla vaikutusta useiden kasvain yhteisöjä, koska löysimme ilmentymä hypoksia merkki CA IX ja EMT merkki Twist2 paitsi PDA lisäksi myös potilaasta johdettujen syöpäkudoksessa rinta-, munuais-, eturauhas-, keuhko- ja munasarja.

Materiaalit ja menetelmät

Kasvainsolulinjat

BxPc-3, Capan-2, MIA-PaCa2, AsPC-1 ja Capan-1 PDA-solulinjat saatiin American Tyyppi Culture Collection (Manassas, VA, USA) ja todennettu koko kulttuurin tyypillinen morfologia. Mycoplasma negatiivinen viljelmiä varmistettu viikoittain testeissä. Soluja viljeltiin DMEM: ssä (PAA, Pasching, Itävalta), jota oli täydennetty 10% lämmöllä inaktivoitua FCS: ää (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) ja 25 mmol /L HEPES (PAA, Pasching, Itävalta).

Ethics Statement + kasvain kudosnäytteitä

Patient johdettuja kasvainkudoksen haiman, rinta-, munuais-, keuhko-, eturauhas- ja munasarjasyöpä saatiin hyväksynnän nojalla eettisen komitean Heidelbergin yliopiston. Kudos analysoitiin anonyymisti ja on peräisin 30-vuotiaan kudospankille. Siksi potilas suostumuslomake ei sovelleta. Diagnoosit perustettiin kliinisiä ja histologisia kriteerit mukaan Maailman terveysjärjestön (WHO). Kaikki kliiniseen tutkimukseen on tehty periaatteiden mukaisesti ilmaistu Helsingin julistuksen.

In vitro hypoksia mallissa

induktioon hypoksia 80% konfluentteja soluja laitettu hypoksian kammioon (itse- tehty), joka huuhdeltiin kaasuseoksen 1% O

2, 5% CO

2, 94% N

2 (Grandpair, Heidelberg, Saksa) noin 4 min. Soluja inkuboitiin hapenpuuteympäristössä 24, 48 tai 72 tuntia 37 ° C: ssa. Kammio täytetään kaasuseos 24 tunnin kuluttua voidaan varmistaa jatkuva kaasun pitoisuudet.

Immunohistokemia ja immunosytokemia

immunohistokemia 6 jam: n jää- tai parafiiniin upotettuja kudosleikkeiden suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [30 ]. Vasta-aineet, joita käytetään immunohistokemiaa olivat kanin polyklonaalista anti-ihmisen CA IX (Santa Cruz Biotechnology) ja hiiren mAb: t anti-humaani Twist2 ja vimentiinin (Abcam, Cambridge, UK). Kaksoislaimennustoiminnassa immunocytofluorescence värjäykset hiiren mAb: t suuntautuu HIF-1α (R 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

Expression of hypoxia-, EMT- ja CSC-merkkiaineiden haimasyövän kudoksessa

tutkimuksen koekspressio hypoxia- ja EMT-markkereita, suoritimme kahden immunofluoresenssivärjäyksen on potilaasta peräisin jäädytetyt kudosnäytteet haiman adenokarsinooma. In HIF-1α positiiviset alueet E-kadheriinin oli alassäädetty ja Slug sääteli paljastava kasvaimen hypoksia aiheuttama EMT (Fig. 1A). Joillakin kasvain alueilla, solut joko vimentiinista tai E-kadheriinin ilmentymisen havaittiin lähellä (Kuva. 1 B). Tämä osoittaa, että ympäröivä stromasoluja ovat positiivisia vimentiinista ja negatiivisia E-kadheriinin. Mitä mielenkiintoisinta on, hypoksinen alueet positiivinen hypoksia markkeri HIF-2α osoitti co-värjäyksen CD133, mikä viittaa siihen, että kasvaimen hypoksia liittyy ilmentymisen CSC markkereita (Fig. 1 C). Nämä tiedot vahvistavat, että hypoksia-ajettu EMT esiintyy kasvainkudoksessa potilaiden haimasyöpä ja CSC-positiivisia kasvainsoluja ovat läsnä hypoksinen kasvain mikroympäristöihin.

(A) Double immunofluoresenssivärjäyksessä kasvaimen näytteitä potilaista, joilla haimasyöpä . Nuclear ilmentyminen HIF-1α (vihreä, nuoli) ja kalvo ilmentyminen E-kadheriinin (punainen, nuoli) tai Slug (punainen, nuoli) on esitetty. Keltainen väri sulautunut kuvien osoittaa koekspressoimalla E-kadheriinin tai Slug in HIF-1α-positiivisia soluja. (B) Membrane ilmentyminen E-kadheriinin (punainen), sytoplasmista ekspressiota vimentiinista (vihreä) kanssa Dapi-värjäys ytimet (sininen). Valkoiset neliöt osoittavat vimentiinista-positiivisten solujen kasvain massa, jotka ovat negatiivisia E-kadheriinin tai

päinvastoin

. Bar: 100 pm. Kaksoislaimennokset suurennoksia alueet ympäröivät valkoiset neliöt näkyvät vasemmalla. (C) Nuclear ilmentymistä HIF-2α ja kalvo ilmentymistä CD133 on esitetty yksittäisinä värjäystä ja sulautunut värjäystä, jossa keltainen väri osoittaa kaksinkertainen positiivisuus.

Hypoksia indusoi HIF-1α signalointi ja morfologiset muutokset vitro

yksityiskohtaisempi arvio hypoksian aiheuttaman EMT ja vaikutusvaltaansa eriytettyä ja CSC kaltaisia ​​haimasyöpäsoluissa käytimme viisi vakiintunutta ihmisen solulinjat PDA. Mukaan erottelua primaarikasvaimen, mutaatiot K-ras tai p53, colony- ja pallojakaantuminen muodostava kyky, ALDH aktiivisuus, tuumorigeenisyyteen hiirissä ja ilmentyminen E-kadheriinin ja vimentiinista me luokitella näissä solulinjoissa kuin CSC

korkea tai CSC

alhainen (taulukko 1). Hypoksia aiheutettiin inkuboimalla soluja kaasuseoksessa on 1% O

2, 5% CO

2 ja 94% N

2. Tämä johti nopeasti ylös-säätely HIF-

1α ja sen kohdegeenin VEGF 2 tunnin kuluessa sekä CSC

alhainen ja CSC

korkea soluja tutkittiin Western blot-analyysi. Sitä vastoin solut viljellään happiolosuhteissa ei säätää ylös näitä proteiineja (Fig. 2A, data ei ole esitetty). CSC

alhainen soluilla oli ilmaus huippunsa 6 ja 12 tuntia, joka laski vähitellen ajan mittaan, mutta oli vielä näkyvissä 72 tuntia. Sen sijaan CSC

korkea solut oli aikaisemmin huippunsa 4 ja 6 h, joka oli vähentynyt hyvin alhaiselle tasolle jo 24 tuntia ja oli havaittavissa 72 tunnin molemmissa solulinjoissa. Sitä vastoin VEGF: n ilmentyminen tasaisesti parannettu aikana 72 tuntia. Mukaisesti havaittu hypoksia liittyvä signalointi solujen määrä, joissa on fibroblastit kaltainen fenotyyppi lisääntynyt 72 h 20-28% CSC

alhainen solut ja 28-33% vuonna CSC

korkea-soluissa (kuvio . 2C). Induktio prosenttiosuus kara-muotoinen solut oli vielä selvempi ja suurempi CSC

korkea solujen upon TGF-β, tunnettu-indusoija EMT, jota käytettiin positiivisena kontrollina. Samanlaisia ​​morfologisten muutosten altistuessaan hypoksia havaittiin Capan-1, Capan-2 ja AsPC-1 syöpäsolujen (kuva S1). Nämä tiedot viittaavat siihen, että

in vitro

induktion hypoksia indusoi EMT molemmissa solupopulaatioiden – eriytettyä ja CSC kaltaisia ​​haimasyöpäsoluissa, mutta vaikutus on nopeampi ja vahvempi CSC

korkea soluja.

(A) hypoksia induktioon

in vitro

, BxPc-3 ja MIA-PaCa2 soluja inkuboitiin ilmatiiviiseen kammioon ilmapiirissä 1% O

2, 5% CO

2 ja 94% N

2 ajankohdalle ajanjaksoilla. Kontrollit inkuboidaan happiolosuhteissa 48 h (N). Proteiinit kerättiin ja ilmentyminen HIF-1α: n ja VEGF tutkittiin Western blot -analyysillä. Teiiniuutteissa soluja viljeltiin happiolosuhteissa (N: 16% O

2, 5% CO

2, 79% N

2) toimi kontrollina induktiolle hypoksian (H). Värjäys Western blot kalvojen kanssa β-aktiini toimi kontrollina yhtäläiset. (B, C) morfologisia muutoksia soluissa alttiina hypoksia, normoksia, tai TGF-β (5 ng /ml) arvioitiin valomikroskoopilla 72 h inkubaation jälkeen /hoidon alle 100

x

suurennus (sisäkkeet, 200

x

). Prosenttiosuus fibroblastit kara-muotoinen solut laskettiin 24, 48 ja 72 tuntia.

Hypoksia up-regulation EMT liittyvät proteiinin ekspressiota

tutkitaan tarkemmin solutyyppispesifiseksi vaikutukset hypoksian aiheuttaman EMT tutkimme ilmaus proteiinien mukana EMT kahdessa CSC

alhainen solulinjoja BxPc-3 ja Capan-2 ja kolmessa CSC

korkea solulinjoja MIA-PaCa2, AsPC-1 ja Capan-1. Altistumisen jälkeen normoksia tai hypoksia 48 h leimasimme solujen spesifisten vasta-aineiden ja analysoitiin fluoresenssi kaksinkertaisella immunofluoresenssimikroskoopilla. Vaikka molemmat CSC

alhainen solulinjoissa oli vahva perusilmennystä E-kadheriinin mutta alhainen ilmentyminen vimentiinista, odotetusti, hypoksia indusoi downregulation E-kadheriinin ja säätelyä vimentiinista (Fig. 3). Tähän liittyi ylössäätely EMT-markkereita Twist2, Slug ja Zeb1. Sen sijaan CSC

korkea soluja ei esiintynyt (MIA-PaCa2) tai erittäin alhainen perusilmennystä (AsPC-1, Capan-1) ja E-kadheriinin mutta korkeammat perusilmennystä vimentiinista verrattuna CSC

alhainen soluja. Altistettaessa hypoksia tyypillinen-EMT-kaltaisen proteiinin ilmentyminen tapahtui samanlainen kuin havaittiin CSC

alhainen soluja. Immunofluoresenssilla tiedot vahvistettiin Western blot -analyysillä (tuloksia ei esitetty). Nämä tiedot viittaavat siihen, että sekä CSC

alhainen ja CSC

korkea soluilla tyypillinen hypoksian aiheuttaman EMT liittyvien geenien ilmentymisen mutta pohjapinta EMT-sukuinen proteiini ilmentymistä happiolosuhteissa on suurempi CSC

korkea soluja.

BxPc-3 ja Capan-2 CSC

alhainen ja MIA-PaCa2, AsPC-1 ja Capan-1 CSC

korkea solut altistettiin normoksia tai hypoksia 48 tuntia. Expression of EMT-sukuiset proteiinit havaittiin kaksinkertainen immunofluoresenssivärjäyksellä seuraa valokuvaamalla punasolut 400

x

suurennus. Koko otettujen kuvien edelleen kolminkertaistui Photoshop. E-kadheriinin (punainen), Twist 2 (vihreä), Slug (punainen), vimentiinistä (vihreä), ZEB1 (punainen). Tumat värjätään Dapi (sininen). Muutokset tasot EMT-sukuiset proteiinit, on esitetty valokuvia. Ei ilmentyminen havaittavissa (-), heikko ilmentyminen (+), mediaani ilmentyminen (++), voimakasta ekspressiota (+++).

Hypoksia stimuloi muuttavia ominaisuuksia haiman CSCS

tutkimaan hypoksian aiheuttamaa eroja, analysoimme syöpäsolun muuttoliikkeen kolmessa eri maahanmuuttoon määrityksiä. Ensinnäkin, käytimme tavallista

in vitro

haavoittaen määritys. BxPc-3, Capan-2, MIA-PaCa2, AsPC-1 tai Capan-1-solut altistettiin hypoksialle tai normoksia 24 tuntia, minkä jälkeen raaputtamalla konfluenttien solujen kerros ja edelleen inkuboitu happiolosuhteissa. Kuvia vaeltavien solujen samalla alueella esitetään 12 ja 24 tunnin jälkeen naarmuuntumista. Kaikissa solulinjoissa havaittiin, että haavoittuneen alueen suljettiin nopeammin solut, jotka oli altistettu hypoksia verrattuna soluihin alttiina normoksia. Emme kuitenkaan voi havaita mitään suuria eroja solujen kulkeutumiselle CSC

korkea ja CSC

alhainen solulinjat tässä ei-kvantitatiivinen määritys (tuloksia ei esitetty). Edustavia tiedot Capan-1 on esitetty (Fig. 4A). Siksi käytimme herkempää migraatiokokeessa suoritetaan 3D soluväliaineen. Migration yksittäisiä soluja dokumentoitiin Aikakierrosvideo mikroskoopilla. Mukaisesti saadut tiedot Haavan paranemista määritystä havaitsimme, että 48 tunnin altistaminen CSC

high AsPC-1 tai CSC

matalan BxPc-3 solujen hypoksian aiheuttamaa nopeammin liikkumiskyky ja suurempi osuus polarisoitunut, vaeltavat ja valejalka -forming soluja kuin normoksia molemmissa solulinjoissa (Fig. 4B). Samanlaisia ​​entisen tuloksia CSC

korkea solut vaelsivat nopeammin kuin CSC

alhainen soluja. Keskimääräinen nopeus AsPC-1 CSC

korkea soluja altistetaan hypoksia oli 7,8 um /h verrattuna 5,1 um /h CSC

matalan BxPc-3-soluissa. Myös prosenttiosuus pohjapinta vaeltavien solujen sekä muodostavat solut valejalka tai osoittaen polarisoitunut fenotyyppi oli suurempi CSC

korkea verrattuna CSC

alhainen soluja. Nämä tiedot vahvistettiin standardin transwell määritystä. CSC

high MIA-PaCa2, AsPC-1, Capan-1 ja CSC

matalan BxPc-3 ja Capan-2-soluja esi-inkuboitiin hypoksisissa olosuhteissa 48 tuntia normaalissa soluviljelyelatusainetta, jossa 10% FCS. Siirtymistä gradienttia 1%, 10% ja 20% FCS: ää alle normoksia mitattiin arvioimalla määrä transmigrated solujen 48 h (Fig. 4C). Olemme havainneet, että esi-inkubointi solujen hypoksisissa olosuhteissa lisääntynyt prosenttiosuus transmigrated solujen kaikissa solulinjoissa. Ilmeisimmät vaikutukset saatiin soluilla siirtymässä gradientilla 1% FCS. Gradientilla 10% FCS pohjapinta kulkeutumista CSC

korkea soluja oli jo korkeimmalla tasolla ilmenee positiivisen kontrollin kanssa 20% FCS. Siten hypoksia voinut edelleen aiheuttaa pohjapinta migraation MIA-PaCa2 ja Capan-1-solut kohti gradientilla 10% FCS. Melko samanlaisia ​​tuloksia saatiin, kun migraation hypoksia esikäsitellä solut analysoitiin hypoksisissa olosuhteissa (Fig. 4D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että vaikka hypoksia indusoi maahanmuuttoon eriytettyä ja CSC kaltaisia ​​soluja, pohjapinta ja hypoksian aiheuttaman muuttavien potentiaali on suurempi CSC

korkea soluja. Siksi hypoksian aiheuttaman EMT indusoi korkean vaeltavia potentiaalia lähinnä CSC kaltaisia ​​soluja, jotka voivat olla vastuussa ja metastaasit.

(A) Capan-1-soluja inkuboitiin hypoksisissa (H) tai normoxic (N) olosuhteissa 24 tuntia, minkä jälkeen raaputtamalla yhtenäinen so- kerros. Migration solujen osaksi haavoittunut alueelle seurattiin aikana 24 h ja valokuvat näkyvät 0, 12 ja 24 tunnin jälkeen naarmuuntumista. Bar: 100 pm. (B) BxPc-3 (CSC

alhainen) tai AsPC-1 (CSC

korkea) soluja altistettiin hypoksia (H) tai normoksia (N) 48 tuntia sisällytettiin kolmiulotteisen (3D) kollageeni geeli ja motorisen aktiivisuus analysoitiin POCmini kammiossa mikroskoopilla alle 50

x

suurennus kuvatun Material Menetelmät jaksossa. Neljä solun motorisen toiminnan arvioitiin: aktiivinen muodostuminen valejalka (1), polarisaatio kuin ilmenee solun pidentymisen ja kaksisuuntaisen muodon muodostumista (2), aktiivinen siirtyminen enemmän kuin kaksi soluhalkaisijan matkan (nuoli, 3) ei ole havaittavissa solun polarisaatio ja liikkumiskyky (4). Edustavia kuvia näytetään ja ajankohtina analyysin on merkitty. (C) BxPc-3, Capan-2, MIA-PaCa2, AsPC-1 ja Capan-1-solut esi-inkuboitiin hypoksisissa (H) tai normoxic (N) olosuhteissa. Transmigration analysoitiin jälkeen vielä 48 tunnin inkuboinnin alle normoxic tai hypoksinen (D) olosuhteissa käyttäen standardia Transwell määritystä. Solujen kulkeutumista kohti väliaineen kanssa 1%: n tai 10% FCS: ää alemmassa kammiossa arvioitiin. Siirtyminen kohti väliainetta, jossa 20% FCS toimi positiivisena kontrollina.

Co-ilmentymä hypoxia- ja EMT-markkereita on yleinen useissa kasvaimen yksiköiden

Hypoksia aiheuttama EMT tutkittiin parafinoidut potilaasta peräisin kudosnäytteistä haima-, rinta-, munuais-, keuhko-, eturauhas- ja munasarjasyöpä. Kaikissa näissä kudoksissa meidän tunnistaa ilmentymisen hiilihappoanhydraasi IX (CA IX), proteiini säädelty hypoksia [6], sekä ekspressio vimentiinista ja EMT liittyvät transkriptiotekijän Twist2 (Fig. 5). Sitä vastoin ilmaus CA IX, vimentiinistä ja Twist2 puuttui ei-pahanlaatuinen kudos esimerkkinä normaalissa keuhkokudoksessa, jotka ovat peräisin samasta potilaasta, jolta värjäykset vastaavan pahanlaatuista kudosta on esitetty (kuva S2). Nämä tiedot osoittavat, että hypoksia-driven EMT on yhteinen piirre useita kasvaimen yksiköitä, jotka voi seurata parantaa vaeltavien potentiaalia CSC väestöstä.

ilmentymisen hiilihappoanhydraasi IX (CA IX), Twist2 ja vimentiinin analysoitiin säännöllisesti immunohistokemia tuumorikudoksissa, jotka ovat peräisin potilaista, joilla haiman (n = 5), rinta (n = 11), munuaisen (n = 10), keuhko (n = 9), munasarjojen (n = 9) ja eturauhasen (n = 9) syöpä. Positiiviset solut (punainen) ovat punaisesta tumman punainen. Bar: 100 pm. Kolminkertainenkin suurennus (suurempi valkoiset neliöt) on pieni alue, jossa positiiviset-värjättyjen solujen (pienemmät valkoiset neliöt) esitetään kunkin kuvan.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa arvioitiin kysymys siitä, hypoksian aiheuttaman EMT vaikuttaa CSC kaltaisia ​​soluja PDA ainoastaan ​​tai myös eriytetympää syöpäsoluja. Potilaalla kasvainkudoksessa PDA tunnistimme yhteistyössä lokalisoinnin hypoksia merkki HIF-1α ja EMT merkki Slug. Tissue alueet haimasyövän positiivisia hypoksia markkeri HIF-2α olivat erittäin positiivisia CSC merkki CD133.

In vitro

sekä CSC

korkea ja CSC

alhainen haimasyöpäsoluissa vastasi hypoksia muuttamalla solumorfologian peräisin epiteelin entistä fibroblastit tai mesenkymaalisten ilmiasuun suurempi prosenttiosuus CSC

high solut. Morfologiset muutokset aiheuttama hypoksia liittyivät alassäädetty E-kadheriinin ilmentymisen ja sääteli ilmentymä vimentiinista, ja EMT liittyvien transkriptiotekijöiden Slug, Twist2 ja Zeb1 CSC

alhainen soluja. CSC

korkea soluja oli proteiiniekspressiota allekirjoitus mesenkyymisolujen lähes alle happiolosuhteissa, josta esimerkkinä on alhainen tai poissa E-kadheriinin tasot yhdessä korkea vimentiinista ilme, joka oli vain marginaalisesti lisääntyi hypoksia. Tämä korkeampi pohjapinta EMT tilan CSC

korkea solujen saattaa olla syynä siihen, että havaittu lisääntynyt muuttavien kapasiteettia normoxic ja hypoksinen olosuhteet. Oletamme, että haiman varsi kaltaisia ​​kasvainsolujen voi olla selviytymisen etu epäsuotuisissa hypoksisissa olosuhteissa, koska EMT on osoitettu osaltaan lääkeresistenssin haimasyövän [34]. Tämän mukaisesti oletuksen, MIA-PaCa2 ja AsPC-1 korkean pohjapinta EMT ominaisuuksia on osoitettu olevan paljon vastustuskykyisiä kohti Gemsitabiini kuin BxPC-3-soluissa, joilla on alhainen pohjapinta EMT ominaisuuksia [34], joka on myös yhtä mieltä CSC -kuten fenotyyppi MIA-PaCa2 ja AsPC-1.

Viime immunohistokemia tiedot osoittavat tuloksemme kaksinkertaisesta immunofluoresenssivärjäyksen HIF-1α /Slug koekspressoimalla, koska 87% ihmisen PDA kudosten pois 36 tutki olivat havaittu ilmaista etana ja 50%: lla potilaista saavutettiin myönteisiä ilmentymä Slug, kun taas Twist ei esiintynyt tai ainoastaan ​​heikkoja ilme [35]. Kuitenkin Twist voimakkaasti indusoituu hypoksia MIA-PaCa2, AsPC-1 ja Capan-1-solut, kuten havaittiin RT-PCR: llä [35]. Tämä sopii meidän havainnot Twist2 ilmaisun vakiintuneissa ja ensisijainen PDA soluja, jotka oli vahvempi induktion hypoksian

in vitro

. Toinen mielenkiintoinen raportti vahvistaa merkittävästi näitä tietoja koska Twist RNA ilmentyminen havaittiin olevan huomattavasti korkeampi invasiivisia kämmenmikrot verrattuna sovitettu ei-tuumori- ja IPMN näytteitä [36].

Kysymys on joka molekyylitason mekanismit ovat takana parannettu EMT ominaisuudet ja vaeltavat kapasiteetit CSC

korkea soluja. Erityisesti, EMT on kuvattu olevan riippuvainen NF-KB: n signaloinnin haiman syöpäsoluissa [37]. Koska olemme hiljattain tunnistettu tehostetut NF-KB aktiivisuuden CSC

korkea verrattuna CSC

alhainen solujen [32], NF-KB voi olla mukana välittämässä lisääntynyt muuttavien ominaisuuksien CSC

korkea soluja. Toinen tunnettu Perimmäisenä syynä erittäin invasiivisia kasvukuvion esim MIA-PaCa2 soluissa näyttää olevan, että hyökkäys on selvästi riippuvainen CXCR4 [16]. Koska haiman CSCS mieluiten ilmaista CXCR4-reseptoria ja etäispesäkkeitä käyttämällä CXCR4 /SDF-1 akselilla [16] Tämä voi helpottaa parannetun vaeltavia potentiaalia. Lisäksi p53 ehdotetaan säännellä EMT ja kantasolujen ominaisuuksia ja tämä on saattanut vaikuttaa havaittuun tehostetun muuttavia mahdollisuuksia CSC

korkea solulinjoja, koska MIA-PaCa2, AsPC-1, Capan-1 ja BxPc-3, mutta ei Capan-2 on mutatoitu p53 [31]. Siten menetys p53 korreloi miR-200c-riippuvainen lisäys ilmaisua EMT, stemness markkereita ja korkea kasvaimen kuvatulla äskettäin kohortin rintasyövistä [38]. Samaan tapaan, estämällä p53 tukahduttaa E-kadheriinin by promoottori Metylointia esitetty munasarjojen kasvainsoluissa [39]. Tämä havainto on yhtäpitävä havaitun matalan E-kadheriinin ilmentymisen CSC

korkea solulinjoissa p53.

Oletetaan, että havaitut reagointinopeutta kantasilmukan kuten haimasyöpäkasvainsoluissa hypoksia kanssa ilmen- tymisen lisääntymisen EMT signalointi ja suuremmat muuttavien potentiaalia voidaan entistä lausutaan

in vivo

kasvain microenvironment. Tämä voi johtua siitä, että kiinteät kasvaimet Toistuvat hypoksia, jota seuraa uudelleen hapetus on yleinen ilmiö. Tämä niin kutsuttu ”ajoittaista hypoksia” kuvataan säännellä varsi kaltaisia ​​ominaisuuksia [40]. Esiintyminen ajoittainen hypoksinen jaksoista vaihtelee huomattavasti nopeasti kasvavilla pahanlaatuisia kasvaimia [41]. Vuonna vaiheissa normoksia kun EMT-asiakkuutta signaalit poistetaan CSC

pieni soluja, jotka on houkuteltu EMT voi palata epiteelin tila samanlainen käymällä läpi mesenkymaalisten epiteelin siirtyminen (MET) kuten on raportoitu esiintyvän joissakin syöpäsolua [20 ], [42]. Muita uusia tietoja toimittamaan tietoa siitä, miten dynaaminen vuorovaikutus epiteelin, itseuudistumiseen, ja mesenkymaalisten geeniohjelmien määrittää plastisuus CSC vaihtamisesta epiteelin ja mesenkymaaliset valtioiden [43]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että CSC

alhainen solut voivat erilaistua CSC kaltaisia ​​soluja induktion EMT hypoksia ja dedifferentiate vedettäessä hypoksian.