Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

Tässä tutkimuksessa selvitimme mekaanisten korkean intensiteetin keskityttiin ultraääni (M-HIFU) kuin neo-adjuvanttihoito ennen resektioleikkaukselle primaarikasvaimen. Tutkimme myös roolia signaalin muuntimen ja aktivaattori transkription 3 (STST3) M-HIFU esiin anti-kasvain immuunivasteen käyttäen siirteen kasvain malli eturauhassyövän.

Methods

RM 9, hiiren eturauhasen syövän solulinja konstitutiivisesti aktivoitua STAT3, ympättiin ihonalaisesti C57BL /6J-hiirissä. Kasvainta kantavien hiirten (enintään kasvaimen halkaisija 5~6 mm) käsiteltiin M-HIFU tai sham altistuksen kaksi päivää ennen kirurgista resektio primaarikasvaimen. Sen jälkeen elpyminen, jos kasvain toistuminen havaittiin 30 päivää kasvaimen uusintatartuntapotentiaalista suoritettiin. Kasvua hoito aloitettiin uudelleen kasvain, eloonjäämisaste ja kasvaimen immuunivasteen eläimen arvioitiin.

Tulokset

Ei kasvaimen uusiutumisen ja etäinen etäpesäke havaittiin molemmissa ryhmissä käyttämällä M-HIFU + leikkaus ja leikkaus yksin. Kuitenkin verrattuna leikkaus yksin, M-HIFU yhdistettynä leikkauksen havaittiin merkitsevästi estävän kasvua hoito aloitettiin uudelleen kasvaimia, alas-säädellä sisäistä kasvainten STAT3 toimintaa, lisätä sytotoksisten T-solujen pernassa ja kasvaimen tyhjennys imusolmukkeiden (TDLNs), ja parantaa isäntä selviytymisen. Lisäksi M-HIFU yhdistettynä leikkauksen todettiin olevan huomattavasti tason alentamiseksi immunosuppression kanssa samanaikaisesti lisääntynyt määrä ja toiminta dendriittisolujen verrattuna leikkaus yksin.

Johtopäätös

Tuloksemme osoittavat, että M -HIFU voi estää STAT3 toimintaa, ja yhdistettynä synergistisesti leikkaus, voivat saada aikaan uudenlainen ja lupaava strategia hoitoon eturauhasen syöpiä.

Citation: Huang X, Yuan F, Liang M, katso HW, Shinohara ML Robertson C, et ai. (2012) M-HIFU kasvaimen kasvu estyy, vaimentaa STST3 Activity ja Parantaa kasvainspesifisen immuniteetin Transplant Kasvainmalli Eturauhassyöpä. PLoS ONE 7 (7): e41632. doi: 10,1371 /journal.pone.0041632

Toimittaja: Mitsunobu R. Kano, Tokion yliopisto, Japani

vastaanotettu: 24 helmikuu 2012; Hyväksytty: 22 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 24 heinäkuu 2012

Copyright: © 2012 Huang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain National Institutes of Health kautta avustuksen #: 5R21CA135221-02 (https://www.nih.gov/), jonka Eturauhassyöpä Pre-SPORE avustusta Duke Comprehensive Cancer Center, jonka avustusta DoD ( PC100266), jonka apurahan CONCERN Foundation, ja avustusta Morris Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Eturauhassyöpä on yleisin syöpä miehillä noin 230.000 tapausta diagnosoidaan vuosittain Yhdysvalloissa [1]. Joukossa eri hoitostrategioiden käytetään kliinisesti, prostectomy edelleen ensimmäinen parantava vaihtoehto eturauhassyöpäpotilaiden [2], [3]. Kuitenkin leikkaus ei sovellu hoitoon etäispesäkkeitä ja on siten usein työskentelee konsertti säteilyn ja /tai kemoterapian potilailla, joilla on edennyt eturauhasen syöpiä. Vaikka säteily ja kemoterapiaa leikkauksen jälkeen on usein hyödyllistä, ne eivät ehkä ole sovellettavissa kaikkiin potilaille riippuen syövän vaiheessa ja potilaan sietokyky. Lisäksi, kun läsnä on veri-eturauhasen este estää kemoterapeuttisten aineiden syöpäsolujen [4]. Vielä tärkeämpää on, alhainen spesifisyys säteilyn ja kemoterapian kohdistaminen syöpäsoluja johtavat usein merkittäviä sivuvaikutuksia. Sen vuoksi on erittäin toivottavaa yhdistää leikkauksen kohdistettu paikallisesti hoitoa, kuten korkean intensiteetin keskityttiin ultraääni (HIFU, joka tunnetaan myös korkean intensiteetin terapeuttinen ultraääni, Hitu), joka on hyvin siedetty potilailla, poistamaan primaarikasvaimen samalla lisäetuna tukahduttamaan kasvaimen uusiutumisen ja etäinen etäpesäke.

viime vuosikymmenen aikana, HIFU on noussut lupaavaksi ei-invasiivisia hoitomuoto lokalisoitu hyvän- ja pahanlaatuisten kiinteiden kasvainten [5]. Laajat eläin- ja kliiniset tutkimukset ovat osoittaneet, että HIFU soveltuu hyvin terminen ablaatio lokalisoitu alkuvaiheen kasvaimet sekä salvage terapia seuraavista ennen hoidon epäonnistuminen säteilyn tai kemoterapian [6] – [8]. Keskittymällä korkea intensiteetti ultraäänisäteen on hyvin määritelty alue sisällä potilaalle, kokoavan akustista energiaa voi absorboida kohde kasvainkudoksen, jolloin nopea lämpötilan nousu yli 65 ° C: ssa muutaman sekunnin, mikä coagulative solunekroosia [9] – [11]. Lisäksi kun HIFU käytetään pulssi tilassa alhaisen käyttöasteen ( 2%) läpi prosessia kutsutaan mekaaninen HIFU (M-HIFU), se voi tuottaa ei-lämpö-, mekaaninen vaurio kasvain kudoksen läpi akustinen kavitaatio [ ,,,0],12]. Nämä ominaisuudet tekevät HIFU luonnostaan ​​ei-invasiivisia, ei-ionisoiva hoito, joka on yleensä hyvin siedetty potilailla. Toisin kuin säteily ja kemoterapia, HIFU hoitoa voidaan antaa toistuvasti ilman riski kasvaa systeemisen toksisuuden [5].

Lisäksi terminen ablaatio tuumorikudoksissa, HIFU on osoitettu laukaisevan kasvaimen vastaisen immuunivasteen sekä hiirillä kuljettavat neuroblastooma [9] ja potilailla, joilla on loppuvaiheen kiinteät kasvaimet [13]. On ehdotettu, että HIFU-ablatoitu kasvaimen roskat ja jäljellä kasvaimeen liittyvät antigeenit voivat stimuloida dendriittisolut (DC) ja sen jälkeen T-solujen aktivaation, joka johtaa kehityksen kasvaimen vastaisen immuunivasteen [14], [15]. Tätä hypoteesia tukee monia kliinisiä tutkimuksia, jotka osoittavat lisääntynyt lymfosyyttien sytotoksisuutta, parannettu eloonjäämisaste, ja vähensi kasvaimen uusiutumisen ja etäinen etäpesäke [16].

Verrattuna perinteisiin HIFU joka perustuu ensisijaisesti terminen ablaatio, olemme osoittaneet aikaisemmin, että M-HIFU voi aiheuttaa voimakkaampia vapauttamaan endogeenisen vaarasignaalit [17], parantaa DC ja sytotoksisten T-lymfosyyttien (CTL) toiminta [12], joilla on alentunut etäpesäkkeiden [18]. Huolimatta rohkaisevista havaintoja, yleinen anti-kasvain immuunivaste HIFU ei vieläkään riitä, oletettavasti siksi, että siedätyshoitoa aikana kehittynyt tuumorigeneesin [19], jossa signaali anturin ja aktivaattori transkription 3 (STAT3) on osoitettu olevan kriittinen rooli [20] – [22]. STAT3 on tiedetään aktivoituvan Immunosuppressiivinen sytokiinit, kuten IL-10, joka puolestaan ​​voi edelleen parantaa IL-10. Lisäksi aktivoitu STAT3 (p-STAT3 /Y705) estää ilmentymisen pro-inflammatoristen sytokiinien, kuten IL-12 [23], ja indusoi Foxp3: n ilmentyminen, mikä on olennainen transkription tekijä säätelijä-T-solut (Treg) kehittäminen [24] . Vaikka STAT3 on osoitettu keskeinen rooli kasvainten synnyssä ja siedätyshoitoa, sen rooli M-HIFU esiin kasvaimia torjuvaa vasteita ei ole tutkittu.

Tässä tutkimuksessa selvitimme strategiaa käyttäen M -HIFU kuin neo-adjuvanttihoito ennen resektioleikkaukselle ensisijainen eturauhasen kasvain vaikutusten arvioimiseksi tämän uuden yhdistelmähoidon kasvaimen paikallisen uusiutumisen ja etäinen etäpesäke. Erityisesti olemme keskittyneet roolista STAT3 moduloinnissa HIFU aiheuttama anti-kasvain immuunivasteen. Tuloksemme osoittivat, että verrattuna leikkaus yksin, yhdistelmä M-HIFU ja kirurgia voisi merkittävästi estää kasvaimen uusiutumisen, tukahduttaa kasvua hoito aloitettiin uudelleen kasvaimia ja parantaa eloonjäämisaste. Lisäksi nämä havainnot tukevat alennettu p-STAT3 toimintaa samanaikaisesti lisääntynyt kasvaimen vastainen vaste. Kaikkiaan tulokset viittaavat siihen, että M-HIFU yhdessä leikkaus voi tarjota uusia terapeuttisia vaihtoehto eturauhassyövän hoito.

Tulokset

M-HIFU hajoaa RM-9 Kasvain Kudokset, Estää kasvaimen kasvun ja parantaa Host Survival

Kuvio 1A esittää edustaja B-mode ultraääni kuvia RM-9 kasvain aikana M-HIFU hoitoa. Painopiste HIFU anturin korostettiin risti symboli. M-HIFU hoito aloitettiin keskellä ja eteni 1 mm askel kohti kasvain rajan. Turvamarginaali on vähintään 1 mm: n aikana käytetty HIFU hoidon vaurioiden välttämiseksi viereiseen ihoon, lihasten ja luuston. Jokaisen altistuksen kirkas paikalla hyperechogenicity voitiin havaita (nuolilla yläpaneelit), mikä vastaa tuotannon inertiaan kavitaatiokuplia tuumorikudokseen [12]. Koska pulssi HIFU kanssa alhaisen käyttöasteen 2% käytettiin M-HIFU, tuloksena lämpötilan kasvainkudoksen oli alle 45 ° C: ssa sen jälkeen, kun 20-altistumista. Siksi lämpövaikutus oli vähäinen. Tutkiminen leikattiin kasvain kudosten paljasti hajoamisen kasvainkudoksen ja muodostumisen onteloita, jotka ovat tyypillisiä mekaanisia hajoamiseen tuottaman inertiaalinen kuplia HIFU käsitellyn alueen (alempi oikea paneeli kuvion 1A).

A,

Ultraääni kuvantaminen ohjattu M-HIFU hoitoa. Kavitaatio toiminta aiheuttama M-HIFU sisällä kasvainkudoksen näkyvät alueilla, joilla hyperechogenicity, nuolilla B-moodi kuvien (ylempi paneeli) ja leikattiin kasvaimissa (alapaneeli. Left: iho päälle kasvain oli ehjä jälkeen M-HIFU hoito; keskellä: poistetun kasvaimen osoittaa ehjä ulkopinta jälkeen M-HIFU kohtelun oikeassa: puolitetaan kasvain osoittaa mekaanisia vaurioita sisäalueelle jälkeen M-HIFU hoitoa.

B

, kasvaimen kasvukäyrä post uusintatartuntapotentiaalista . 2 x 10

4 RM-9 solua ihon alle ruiskutetaan kontralateraalista takajalkojen 30 päivän kuluttua M-HIFU hoito, kun hiiret täysin toipunut kirurginen resektio primaarikasvaimen. tilavuus hoito aloitettiin uudelleen kasvainten laskettiin mittaharppimittauksilla kasvaimen koon 3 päivän välein alkaen päivästä 7 kasvaimen uusintatartuntapotentiaalista. * p 0,05, ** p 0,01.

C,

kumulatiivinen selviytyminen käyrä kasvaimen uusintatartuntapotentiaalista. Hiiret pääsemästä inhimillinen päätepiste oli uhrataan. oli 10 hiirtä leikkauksen ryhmässä ja 12 HIFU + leikkaus ryhmä. P-arvo 0,019 määritettiin log-rank-testi. Tiedot saatiin kolmesta itsenäisestä kokeesta.

Kaksi päivää sen jälkeen M-HIFU hoitoa, primäärikasvaimissa resekoitiin hiiristä molemmissa ryhmissä. Tällainen viive valinta perustui aiempien havainto, että M-HIFU 2 päivää ennen resektioleikkaukselle primaarikasvaimen voi merkittävästi vähentää etäpesäkkeiden on hiiren melanoomaan malli [18]. Seuranta havainto seuraavien 30 päivän osoittanut mitään paikallista kasvaimen uusiutumisen, oletettavasti seurauksena tiukka ja kattava poisto kasvain kudosten leikkauksella. Tällä hetkellä, kasvain uudelleenaltistuksen suoritettiin ja kasvua hoito aloitettiin uudelleen kasvainten seurattiin vielä 30 päivää. Kuten kuviossa 1B on selvä erottaminen kasvukäyrät kanssa lääkettä uudestaan ​​kasvaimia M-HIFU + leikkaus ryhmä huomattavasti pienempiä kuin ne, leikkauksen ryhmässä. Merkittäviä eroja kasvaimen tilavuuden kahden ryhmän välillä havaittiin päivästä 10 alkaen loppuun asti seuraavien ylös ajan.

jälkeen hoito on aloitettu uudelleen, ei eläimiä kuoli. Hiiret altistettiin uudelleen kasvaimia vasta tapettiin kun inhimillinen päätepisteitä kasvaimen kasvua saavutettiin. Keuhkokudokset otettiin talteen ja tutkitaan leikkely mikroskoopin, mutta ei metastaattisen kyhmy havaittu. Kun leikkaus suoritettiin, RM-9 kasvaimen kyhmyjä havaittiin hyvin ympäröi kapseli sidekudoksen, mikä osoittaa mahdollinen syy puuttuminen etäpesäkkeiden. Kumulatiivinen selviytyminen M-HIFU + leikkaus ryhmä todettiin olevan tilastollisesti korkeampi kuin leikkaus ryhmässä (kuvio 1 C), mikä viittaa mahdolliseen kasvain painava vaikutus M-HIFU yhdistettynä kirurginen resektio primaarikasvaimen.

Eturauhassyöpä RM-9 Solut konstitutiivisesti Express p-STAT3, joita voidaan vähentää M-HIFU hoito

Phospho-STAT3 (Y705), aktivoitua muotoa STAT3, on avainasemassa herättämisessä immuunivalvonnan, kasvainten kehittymiseen ja kasvaimen etäpesäke [20], [22], [25]. Siksi estämällä tai purkamisesta aktiivinen STST3 on kiinnostava sekä suoraan kasvaimen vastaisen hoidon ja kasvaimen siedätyshoidon. Ennen selvittämiseen rooli M-HIFU on STAT3 aktivointia, tutkimme useita kasvainsolulinjoilla varten STST3 aktiivisuutta ja havaitsi, että korkea taso p-STAT3 ilmentyi RM-9 solua. Kuten on esitetty IF värjäys ja fluoresenssimikroskopia (kuvio 2A), lähes kaikki RM-9-solut värjättiin positiivisesti p-STAT3, kuten on esitetty vaaleanpunainen sulautuneen signaalit (nuolet). Tämä

in vitro

havainto varmistettiin edelleen

in vivo

. Kuten kuvassa 2B, tutkimme RM-9 kasvaimet korjattu kolmessa eri ajankohtina (10, 15-, ja 20-päivää) inokulaation p-STAT3 käyttäen IHC ja tulokset osoittavat, konstitutiivinen STST3 aktivaation RM-9 kasvaimet yli 20 päivän kasvaimen kehitystä. Nämä havainnot osoittavat myös, että RM-9 solua ja kasvaimet ovat ihanteellisia tutkia vaikutuksia M-HIFU on STAT3 toimintaa.

A

Expression of p-STAT3 in RM-9 solua. RM-9-solut altistettiin IF värjäytymistä p-STAT3 ja DAPI värjäys ytimiä. Loisteputken mikroskopia, p-STAT3 leimasi punaisen fluoresenssin kun tumat leimattiin sinisen signaalin. P-STAT3-positiiviset tumat merkitty sulautunut vaaleanpunainen signaaleja. Solid nuolet osoittavat edustava p-STAT3-positiivisten ytimien taas katkoviivanuolella merkitsee p-STAT3-negatiivinen ydin.

B,

Expression pattern of p-STAT3

in vivo.

RM-9 kasvaimet poistettiin kolmessa eri kehitys- ajankohtina käyttöaiheen altistettiin IHC värjäystä p-STAT3. Sen jälkeen vastavär- hematoksyliinillä, p-STAT3-positiiviset tumat merkitty tummanruskea signaaleja (nuolet), kun taas p-STAT3-negatiivinen ytimet olivat siniset.

C,

Laskua p-STAT3 tasot RM-9 kasvaimia jälkeen M-HIFU hoitoa. Kaksi päivää sen jälkeen M-HIFU hoito, RM-9 kasvaimet poistettiin ja alistettiin IHC värjäyksen p-STAT3. Kolme kasvaimet kussakin ryhmässä analysoitiin ja edustavan esitetyt luvut ovat. IHC oli itsenäisesti suoritettiin kolmesti. Aineisto esitetään keskiarvona ± SD. Opiskelijan

t

-testi suoritettiin määrittämään p-arvot. * P 0,05.

D,

Expression alas-säätely kolmen STAT3 loppupään kohdegeenien jonka M-HIFU hoitoa. Kaksi päivää post M-HIFU hoito, RM-9 kasvaimet poistettiin ja mRNA eristettiin. RT-PCR suoritettiin sitten tasojen havaitsemiseksi sykliini D1, Bcl-x L, IL-10 ja β-aktiini. Band signaaleja mittaamaan NIH ImageJ ohjelmisto. Kuvat ovat kolmesta itsenäisestä kokeesta on esitetty.

Seuraavaksi arvioitiin vaikutuksia M-HIFU on STAT3 aktivointi käyttämällä RM-9 tuumoreita kantavaa hiirtä. Kaksi päivää sen jälkeen, kun M-HIFU hoitoon, RM-9 kasvaimet poistettiin hiiristä ja niille p-STAT3 IHC (n = 3 ryhmää kohden). Kuten on osoitettu kuviossa 2C, p-STAT3 tason merkitsevästi väheni 1,8-kertaisesti seuraavat M-HIFU, mikä osoittaa, että anto M-HIFU voi tehokkaasti estää STST3 aktivaation RM-9 kasvaimia. Lisäksi yhdenmukainen havaitun vähentäminen p-STAT3 M-HIFU, ekspressiotasot kolmen STAT3 kohdegeenien vähensi merkittävästi M-HIFU samoin, kuten on esitetty tulokset RT-PCR kuvassa 2D. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että STAT3 aktivointi voidaan havaita RM-9 syöpäsolujen

in vitro

ja

in vivo,

ja että M-HIFU alentaa veren STAT3 aktivointi ja STAT3- kohdennettuja geenejä RM-9 kasvaimia.

M-HIFU Tehostaa kasvainspesifiset sytotoksisuus

Sen tutkimiseksi, M-HIFU käsittely johtaa kasvu CTL-vasteita [26], analysoimme muutos taajuus CD8

+ T-solut ja niiden IFN-γ tuotantoa, sekä M-HIFU + leikkaus ryhmässä ja kirurgian yksin ryhmä. Olemme havainneet, että 2 päivää leikkauksen jälkeen määrä CD8

+ T-solu nostettiin M-HIFU + leikkaus ryhmä (kuvio 3A ja B), verrattuna ryhmään, joka oli leikkaus yksin. Tumor-specific IFN-γ tuotannon kasvain hosts varmistettiin lisäksi ELISPOT-määrityksellä. Pernasoluja kerättiin 12 päivää leikkauksen jälkeen kolme hiirtä ryhmää kohti, ja näytteet yhdistettiin ja viljeltiin yhdessä joko RM-9 tai merkityksettömiä EL-4-tuumorisolut (splenosyytit vs. kasvainsolut 10:01 suhde), analysoitiin sitten määrittää IFN-γ tuotantoa. M-HIFU hoito lisäsi merkittävästi IFN-γ tuottavien CTL 4-kertainen ei-HIFU ohjaus (p 0,001) (kuvio 3C, D). Tämä kohonnut vastetta ei havaittu EL-4-soluja, mikä osoittaa, että IFN-γ tuotanto oli RM-9 kasvainspesifisen jonka kasvain isäntä. Nämä tulokset viittaavat siihen, että M-HIFU käsittely voi edistää sukupolven IFN-γ tuottavien CTL, joka on yksi kriittisimmistä tekijöistä kasvaimen vastaisen immuniteetin.

A,

2 päivää käsittelyn jälkeen, pernat kolme käsiteltyjen hiirien kanssa tai ilman M-HIFU kerättiin ja yhdistettiin. Osa pernan CD8

+ T-solut määritettiin virtaussytometrialla. Edustaja Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta on esitetty.

B,

Tilastollisesti merkittävä kasvu CD8

+ solupopulaation yhdistämällä HIFU kirurgisesti. * P 0,05

C

, Kaksitoista päivää leikkauksen jälkeen tai M-HIFU plus kirurgia, kolme hiirtä kustakin ryhmästä tapettiin ja niiden pernat kerättiin ja yhdistettiin. IFN-γ ELISPOT-määrityksessä suoritettiin yhdistettiin pernasolujen. Mitomysiini-C käsiteltiin RM-9-soluja lisättiin stimulaattoreina on suhde 1:10 (RM9: splenosyytit). EL-4-soluja käytettiin merkityksetön solujen valvontaa. Edustaja Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta on esitetty.

D

, leimaus IFN-γ-positiivisten solujen ja, ja tilastollinen analyysi perustuu ELISpotissa määrityksen tulokset. *** P 0,0001.

M-HIFU hoito kasvattaa väkilukua CTL ja DC pernassa ja TDLNs

DC: t ovat ainoa ammatillinen antigeenejä esitteleviä soluja, jotka voivat prime naiivi T-soluja, ja sillä on kriittinen rooli sukupolven kasvain-spesifisten CTL: ien. DC voidaan tunnistaa ilmentymisen CD11 c kuin solunpintamarkkeria. Koska p-STAT3 on keskeinen vaimennin DC aktivointi [27], [28], arvioimme taajuus CD 11 c

+ solupopulaation pernassa ja TDLNs 6 päivää post M-HIFU hoitoa hiirillä RM-9 siirrettyjen kasvainten . Kuten kuvassa 4A 4D, osuudet CD11c

+ solut huomattavasti pernassa ja TDLNs yli 3-kertainen ja 1,2-kertainen kontrolliryhmän ilman HIFU hoitoa, vastaavasti (molemmissa tapauksissa, p 0,001 ). Meillä on myös arvioitu osuus CD11 c

+ solujen aikaan pisteen 2 päivää sen jälkeen, kun M-HIFU hoitoon, mutta se näytti olevan liian aikaista tarkkailla kasvuun DC väestöstä (tuloksia ei ole esitetty). Lisäksi M-HIFU hoito tehostetun ilmentymisen kostimuloivaa molekyyliä, CD80 ja CD86, DC: issä (kuvio 4E ja 4F). Yhdessä M-HIFU hoito näyttää parantavan rekrytointi ja /tai laajentaminen DC lisäksi DC kypsymistä.

Kolme hiirtä kustakin ryhmästä lopetettiin kuuden päivän kuluttua leikkauksesta tai HIFU ja kirurgia. Yksisoluinen suspensio valmistettiin yhdistettiin pernat tai TDLNs; ja CD11 c

+ solupopulaatio määritettiin virtaussytometrialla. Edustaja Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta on esitetty.

,

C

, edustaja virtausmallit havaitsemisessa CD11 c

+ solut pernassa (

) ja TDLNs (

C

).

B

,

D

, Tilastollinen merkitys kasvu DC väestön pernassa (

B

) ja TDLNs (

D

), joka perustuu tulokset

ja

C,

vastaavasti.

E

,

F

, Evaluation of DC stimulaation ilmaisemalla CD80-positiivinen (

E

) ja CD86-positiivisia (

F

) CD11 c

+ solut pernassa ja TDLNs. * P 0,05, *** p 0,0001.

M-HIFU Enhanced Anti-kasvain Response on, osan aiheuttama vastustamisesta Treg Cell Generation

STAT3 myös on tärkeä rooli tehostetaan CD4

+ säätelijä-T-solujen (Tregs) [24]. Tregs estävät immuunivasteita ja niiden on todettu olevan indusoimaan sietokykyä kasvaimen vastaisen immuniteetin. Täällä me pyrittiin määrittämään, onko M-HIFU hoito estää sukupolven tai laajentamista Tregs tuumoriin siirrettyjen hiirillä. Pernasolua TDLNs solut kerättiin 6 päivää sen jälkeen, kun M-HIFU käsittely kuten edellä on mainittu arvioida taajuus Tregs. Tulos on esitetty kuviossa 5 osoitti, että M-HIFU hoitoa herättänyt huomattavaa vähenemistä Treg väestöstä noin 50% pernassa (p 0,001), ja noin 10%: in TDLNs (p 0,001). Samanlainen havainto DC, muutokset Treg väestöstä ei ollut merkitsevästi 2 päivää seuraavat M-HIFU hoitoon (tietoja ei esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että sen lisäksi, laajentaa DC väestöstä ja kasvava DC kypsymisen, M-HIFU vähensi populaation koko Tregs, joiden tiedetään alas-säädellä kehitystä kasvaimen vastaisen immuniteetin.

Yhden solun suspensio valmistettiin yhdistettiin pernoista tai TDLNs. Väestö CD4

+ Foxp3

+ -solujen jälkeen määritettiin Treg virtaussytometrialla. Luvut osoittivat ovat edustajia kolmesta itsenäisestä värjäystä ja myöhemmin analyysin.

,

C

, edustaja virtausmallit havaitsemaan Tregs pernassa (

) ja TDLNs (

C

).

B

,

D

, osuus on Treg väestön pernassa (

B

) ja TDLN (

D

) tulosten perusteella esitetään

ja

C

, vastaavasti. ** P 0,01, *** p 0,0001.

Keskustelu

Tämä tutkimus suoritettiin, jotta saataisiin parempi käsitys mekanismeja, joilla M-HIFU nostattaa anti- kasvain vaikutuksia ja tutkia strategioita optimaalinen käyttö M-HIFU eturauhasen syövän hoidossa. Pitkän aikavälin tavoitteena on luoda sovitusmenetelmät käyttää M-HIFU perustuvan yhdistelmähoidon kuin parannettu hoitomuotoa eturauhassyövän potilaille. Kaiken tulokset viittaavat siihen, että M-HIFU voi estää STAT3 aktivointia, joka johtaa kasvaimen vastaisen vasteen kahden mahdollisten mekanismien. Ensinnäkin vähentäminen p-STAT3 kasvaimissa suoraan inhiboi kasvaimen kasvua. Toiseksi vähentäminen STST3 toiminta johtaa lisääntynyt määrä kasvain-spesifisten CTL: ien ja DC, sekä pienempi määrä Treg, ja sen jälkeen parannus anti-kasvain immuniteetin.

konstitutiivisen aktivaation STAT3 havaitaan usein monissa ihmisen kasvaimissa, mukaan lukien melanooma, rintasyöpä, pään ja kaulan syöpä, gliooma ja eturauhassyövän [20], [22], [25]. On hyvin tunnettua, että jatkuvasti aktivoitu STAT3 toimii keskeinen säätelijä molekyyli- ja biologisten tapahtumien, jotka edistävät kasvaimen kehittymisen [29]. Poikkeava STAT3 aktiivisuus on keskeinen rooli säädeltyyn kasvua ja elossa kasvainsolujen sekä edistää angiogeneesiä. Lisäksi poikkeava STST3 edistää invaasio ja etäpesäkkeiden, mikä edistää kasvaimen etenemistä [20], [22], [30]. Aikana kasvaimen aktiivisuus STAT3 on kohonneet myös kasvaimeen liittyvät lymfosyyttien [31], [32]. Inhiboiva STST3 joko kasvainsoluja tai kasvainta infiltroituneen ydinsoluissa nostattaa Th1 anti-kasvain immuunivasteen, samanaikaisesti lisääntynyt määrä CTL: ien ja laski Tregs [33]. Siten tukahduttaa aktivointi STAT3 fysikaalisesti (

eli

HIFU) tai hoitomuotoja on erittäin kiinnostava sekä suoraan kasvaimen vastaisen hoidon ja kasvaimen siedätyshoidon.

Edellä mainitun ymmärtämisen noin STAT3, pyrimme vaikutuksen määrittämiseksi M-HIFU on STAT3 aktivointia käytettäessä

in vivo

siirremallissa eturauhassyöpää. Itse asiassa taso kasvaimensisäisenä p-STAT3 oleellisesti vähentynyt käsittelemällä M-HIFU. Eräässä aikaisemmassa tutkimuksessa B16 siirremallissa, p-STAT3 taso ikään todettiin olevan huomattavasti alassäädetty M-HIFU hoito [34], mikä viittaa vaikutukset M-HIFU on STAT3 aktivaatio voi olla yhteinen keskuudessa eri kasvaimia.

toiminnallinen alas-säätely p-STAT3 varmistettiin lisäksi vähentynyt ilmentyminen sen loppupään kohdegeenien. Sykliini D1, joka on säädelty aktivoitujen STAT3, on allosteerinen säätelijä sykliiniriippuvaisten kinaasien 4 ja 6 (CDK4 /6), ja edistää G1 /S-siirtymä kautta CDK4 /6-välitteisen fosforylaation ja inaktivaatio retinoblastoomaproteiiniin [ ,,,0],32], [35]. Ekspression inhiboimiseksi sykliini D1 hidastaa solusyklin G1 vaiheessa joutumasta S-vaiheeseen ja siten huomattavasti vähentää kasvainsolujen proliferaatiota [36] – [40]. Bcl-x L, myös merkittävä STAT3 kohdegeenin on anti-apoptoottinen molekyyliä Bcl-2-perheen ja parantaa kasvaimen etenemiseen [32], [41], [42]. Bcl-xL: n yliekspressio löydetään usein monenlaisia ​​syöpiä, kuten eturauhassyövän [43], [44]. Ehtyminen hallitseva Bcl-x L ilmaisu vähentää merkittävästi elinkelpoisuutta kasvainsolujen seuraavista apoptoottinen ärsykkeille [45]. Tässä tutkimuksessa tuloksemme RT-PCR osoitti selvästi, että alas-säätely p-STAT3 mukana on vähentynyt ilmentyminen sykliini D1 ja Bcl-x L kasvainkudoksessa seuraavissa M-HIFU hoitoa. Nämä tulokset osoittivat, että M-HIFU pystyy estämään poikkeavaa STAT3 toimintaa ja siten voi aiheuttaa kasvun pysähtymisen ja apoptoosin tuumorisoluissa, sekä regressio eturauhassyövän

in vivo

.

lisäksi kasvaimeen onkogeenisen rooli, p-STAT3 on mukana immunosuppression kautta häiritsevät DC stimulaation estämällä proinflammatoristen sytokiinien ja kemokiinien, jotka edistävät DC [28]. Vaihtoehtoisesti p-STAT3 edistää kasvaimen solut tuottamaan useita kasvaimia synnyttävän sytokiineja, kuten IL-10, joka puolestaan ​​aktivoi STST3 signalointi kautta positiivista palautetta silmukan ja estää toiminnallisen DC stimulaatio [28], [32], [33]. DC stimulaatio on olennaista tehokkaan antigeenin esittelyä ja kehittäminen tuumorin vastaista immuunivastetta T-soluja. Aikaisemmat tutkimukset käyttäen MC38 kasvainmuoto ovat osoittaneet, että HIFU syntyvän mekaanisen vaurion syöpäsolujen voi johtaa DC stimulaatio [17], ja mahdollisesti lisäsi CTL toimintaa [12]. Tässä tutkimuksessa olemme Lisäksi todennettiin, että M-HIFU voi parantaa toimintaa DC

in vivo

, mistä on osoituksena huomattava lisääntynyt populaatio DC: iden samanaikaisesti voimistunut ilmentyminen kostimuloivien molekyylien, kuten CD80 ja CD86.

Toinen immunosuppressoivilla funktio p-STAT3 liittyy sen rooli parantaa sukupolven Tregs, joka estää immuunivastetta itse antigeeni mukaan lukien kasvaimeen liittyvää antigeeniä. STAT3 myös tärkeä rooli, jonka orkestroida useita kriittisiä näkökohtia T-solujen funktion tulehduksen ja homeostaasin. Erityisesti Foxp3: n ilmentyminen, mikä on välttämätöntä sääntelyn toimintojen Treg, riippuu STAT3 aktivointi [24]. Inhiboiva STAT3 aktiivisuus vähentää muuntaminen Foxp3-negatiivisten T-solujen, kasvaimeen liittyviin Tregs ja lisää CD8

+ T-solujen tunkeutuminen kasvaimeen – strategia, jota on käytetty estämään primaarisen kasvaimen kasvua [46]. Samoin Tutkimuksessamme M-HIFU hoidon todettiin olevan huomattavasti vähentää osuus Treg sekä pernassa ja TDLNs, samanaikaisesti tukahduttaminen STAT3 aktiivisuuden näissä kudoksissa. Siksi tulokset viittaavat siihen, että M-HIFU voi vähentää Treg-esiin immuunitoleranssia RM-9 mallia.

Yhteenvetona olemme paljastaneet erityinen mekanismi M-HIFU indusoi anti-kasvain immuunivasteen, joka välittyy eston STAT3 aktivointi

in vivo

. Lisäksi olemme havainneet, että M-HIFU suoritetaan sopivana ajankohtana (eli 2 päivää RM-9 malli) ennen kirurgista poistoa primaarikasvaimen voi parantaa suojaa isännän vastaan ​​kasvaimen uusiutumisen, joten ne voivat lisätä selviytymisen potilaita pahanlaatuisuuden eturauhassyöpää. Vaikka tässä tutkimuksessa keskityttiin mekanismiin liittyy STAT3, osallistuminen muiden mekanismien M-HIFU indusoi anti-kasvain immuniteetin on myös mahdollista, ja tutkitaan tulevaisuudessa. Kaiken kaikkiaan olemme osoittaneet, että M-HIFU on lupaava neo-adjuvanttihoitona, joka voidaan yhdistää synergistisesti leikkauksen eturauhassyövän hoitoon.

Materiaalit ja menetelmät

eläinmallissa

C57BL /6J-hiiriä, 6~8 viikon ikäisiä, ostettiin Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA) ja sijoitettu Duke Vivarium ennen ja jälkeen M-HIFU hoitoon ja /tai leikkaus. Kaikki eläimet käsiteltiin mukaisesti perustettu eläinten hoito politiikka ja kaikki eläinkokeet oli hyväksynyt Duke University Institutional Animal Care Käytä komitea.

Cell Line ja Cell Culture

Hiiren eturauhassyöpäsolulinja RM-9 perustettu tri Thompson Baylor College of Medicine, oli lahja Dr. Mouraviev. EL4 hiiren lymfooma solulinjaa hankittiin American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA). Kaikki solulinjat pidettiin täydellisessä Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone, Logan, UT, USA), 2 mM L-glutamiinia, 50 IU /ml penisilliiniä ja 50 ug /ml streptomysiiniä (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Vasta-aineet, Kits ja Kemialliset reagenssit

seuraavat kit ja vasta-aineet hankittiin eBiosciences (San Diego, CA, USA): Mouse säätelevien T-solujen värjäys Set (FJK-16 s), PE-konjugoitu anti-hiiri-CD8-vasta-aineen, ja anti-hiiri-CD16 /32-vasta-ainetta. APC-konjugoidun anti-hiiri-CD11 c-vasta-aine, FITC-konjugoitu anti-hiiri-CD80, ja PE-konjugoitu anti-hiiri-CD86 olivat BD biotieteiden (San Jose, CA, USA). Kanin anti-hiiri-fosfo-STAT3 (Y705) vasta-aine hankittiin Cell Signaling (Danvers, MA, USA). Hiiren interferoni-y ELISpot kit oli peräisin Mabtech Inc (Cincinnati, OH, USA). Texas Red-konjugoidulla vuohen anti-kani-vasta-aine hankittiin Vector Laboratories Inc (Burlingame, CA, USA). Kiinnitysväliaine ratkaisu tai ilman DAPI, esto ratkaisu, Vectastain Elite ABC Kit (Rabbit IgG) ja AEC pakki olivat Vector Lab. SV kokonais-RNA: eristäminen järjestelmä hankittiin Promega (Madison, WI, USA). DNA-synteesi entsyymit olivat Invitrogen ellei toisin ole mainittu.

Kasvainmalli, HIFU hoito, Kirurginen resektio, ja Leikkauksen jälkeinen hoito ja mittaukset

RM-9 kasvainmuoto perustettiin ihonalaisesti ruiskuttamalla 8 × 10

4 RM-9 solua oikeaan takajalkojen C57BL /6J hiiriä. Kasvainten annettiin kasvaa noin 7 päivää, kunnes ne saavuttivat 5~6 mm halkaisijaltaan.