Krooninen sairaus

tiivistelmä

SLD5 on jäsenenä giniä monimutkainen koostuu PSF1, PSF2, PSF3 ja SLD5, niillä on keskeinen rooli muodostumista DNA replikaatiohaarukan kanssa CDC45 hiivassa. Aiemmin olimme eristäneet PSF1 ortologin peräisin hiiren hematopoieettisten kantasolujen DNA-kirjaston ja pystyivät tunnistamaan ortologeja kaikkien muiden Gin jäseniä Hiivakaksihybridijärjestelmässä lähestymistapaa käyttäen PSF1 kuin syötin. Nämä Gin ortologeja voi myös toimia DNA-replikaatioon nisäkässoluissa, koska ne muodostavat tetrameerisiä komplekseja, kuten havaittiin hiivassa, ja geeni deleetiomutantteja sekä PSF1 ja SLD5 johtaa puute epiblast leviämisen ja varhaisen alkion kuolemaan. Olemme kuitenkin havainneet, että PSF1 on myös mukana kromosomi eriytymistä M vaiheessa viimeaikaiseen ehdotuksia, homologit liittyvien geenien DNA-replikaation alempiin organismeihin myös säätelemään solutapahtumiin muu kuin DNA-replikaation nisäkässoluissa. Tässä olemme analysoineet toiminta SLD5 muun kuin DNA: n replikaatiota, ja todettiin, että se on aktiivinen DNA-vaurioita ja korjaus. Vaimennus SLD5 ilmentymisen johtaa merkittävään DNA-vaurioita sekä normaalien solujen ja syöpäsolujen, mikä viittaa siihen, että se suojaa DNA-vaurioita. Vaimennus SLD5 viivästyttää DNA korjaukseen vasteen ja solusyklin palauttaminen normaaleissa soluissa, mutta ei syöpäsoluja. Nämä havainnot viittaavat siihen, että SLD5 voisi edustaa terapeuttinen kohdemolekyyli toimii tasolla kasvainten stroomasoluissa sijaan syöpäsoluja itseään, koska kehitys kasvaimen mikroympäris- saattavat viivästyä tai häiriintyä tukahduttaminen sen ilmentymisen normaalissa solutyypit kasvain.

Citation: Gong ZY, Kidoya H, Mohri T, Han Y, Takakura N (2014) DNA-vaurio Parannettu vaimennus SLD5 Myöhästymiset Cell Cycle Restoration normaaleissa soluissa, mutta ei syöpäsoluissa. PLoS ONE 9 (10): e110483. doi: 10,1371 /journal.pone.0110483

Editor: Ryuichi Morishita, Osakan yliopisto Graduate School of Medicine, Japani

vastaanotettu: 12 elokuu 2014; Hyväksytty: 15 syyskuu 2014; Julkaistu: 21 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Gong et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperin.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat Japanin opetus-, kulttuuri-, urheilu-, tiede ja teknologia sekä Apurahat-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (KAKENHI) Japanista Society for edistämisestä Science. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Nobuyuki Takakura on nyt akateeminen toimittaja tämän lehden. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One Pääkirjoitus politiikan ja kriteerit.

Johdanto

Solut ovat jatkuvasti alttiina genomista DNA aiheuttamat vahingot sisäisten ja ulkoisten tekijöiden, kuten oksidatiivisen stressin ja UV, vastaavasti. Virheitä DNA-vaurioiden korjaus voi johtaa syöpäsolun kehittämiseen [1], [2]. Estämään syövän syntyyn, normaalit solut valvoa ja korjata DNA-vaurioita niiden genomiin asettamalla solusyklin tarkastuspisteitä [3]. Kuitenkin, syöpäsolut pystyvät sietämään DNA-vaurion siten, että replikaatio jatkuu ilman korjausta, jolloin kertyminen epänormaali mutantin geenin ilmentymisen [4]. Tämä tapahtuma on ehdotettu yhdeksi syistä kemo- ja radio-vastustuskyvyn kehittyminen pahanlaatuisia syöpäsoluja.

SLD5 on jäsenenä giniä monimutkainen koostuu PSF1, PSF2, ja PSF3. Tämä monimutkainen säätelee DNA replikaatiohaarukan vuonna orastava hiiva [5]. Vuonna aloittamista DNA-replikaation alkuperän tunnustamista kompleksi (ORC) sitoutuu itsenäisesti replikoituvan sekvenssin (ARS), joka toimii DNA-replikaation alku domain. Myöhemmin solunjakautumisen sykli (CDC) 6 ja CDC1 sitoutuvat ARS ohjaavat ORC ja aiheuttaa sitoutumisen mini-kromosomin huolto (Mcm) proteiinien päälle ARS. Näitä kutsutaan pre-replikaation komplekseja (pre-RC) [6] – [8]. Edelleen, Cdc45 ja Gin rekrytoidaan ennalta RC ja muodostavat aktivoitu CMG (Cdc45-Mcm-Gin) helikaasin DNA- replikaatiohaarukan [9] – [12].

Havaitsimme hiiren ortologin PSF1 vuonna DNA-kirjastosta peräisin hematopoieettisten kantasolujen alkionkehityksen aikana, jona tämä solupopulaatiossa aktiivisesti lisääntyy [13]. Tämän jälkeen tunnistimme SLD5 käyttäen hiivan kahden hybridin järjestelmä PSF1 kuin syötin [14]. Lisäksi tunnistimme kaikki jäsenet gins hiirillä ja vahvistivat, että ne muodostavat komplekseja, kuten havaittiin hiivassa [15]. Raportoimme aikaisemmin, että mutanttihiirien puutteellinen varten PSF1 tai SLD5 näyttää alkion varhaisvaiheen kuolleisuutta aiheuttama kasvu pidättäminen epiblasts päivän ikäisessä sikiössä 6,5 [13], [16]. Nämä havainnot ehdotti, että PSF1 ja SLD5 ovat toiminnallisia nisäkkäillä ja välttämättömiä solujen lisääntymistä, mahdollisesti liittämällä DNA-replikaation havaittuna hiivassa.

Korkea ilmentymistä giniä geenien on havaittu syöpien ja korrelaatio niiden tasosta ilmaisu pahanlaatuisuuteen on ehdotettu [17] – [19]. Olemme myös raportoitu, että syöpäsolut osoittaa korkeampi PSF1 promoottorin aktiivisuus ovat syöpä aloittaneen /kantasolujen hiiren kasvainsolun elinsiirron malli [20]. Piirre pahanlaatuisia syöpäsoluja on kemo- ja radio-vastus. Korkean tason ilmentymistä giniä geenit voivat aiheuttaa paitsi solujen kasvua, mutta myös vastustuskyky kemoterapiaa. Kuitenkin, se ei ole määritetty, onko funktio giniä geenien on mukana DNA-vaurioita tai korjata. Tarkkailemalla luuytimen soluihin in Mutanttihiiristä olemme aikaisemmin havainneet, että haploinsufficiency of PSF1, mutta ei SLD5, vähentää solujen kasvua [13], [16]. Siksi on monimutkainen analysoida toimintaa PSF1 DNA vaurioita kaatamalla PSF1 ilmaisu koska solujen kasvua itsessään vaikuttaa myös puute tämän tekijän. Mikäli SLD5 heterotsygoottista SLD5

+/- hiiret, jotka olivat terveitä ja hedelmällisiä, syntyivät Mendelin taajuudella ja näytteillä normaalin kasvun. Lisäksi ei ole suuri ero luuytimen soluihin villien ja SLD5

+/- hiirissä [16]. Siksi käytimme SLD5

+/- hiiren alkion fibroblasteja (MEF) analysoida DNA-vaurioiden korjaus ja solujen kasvua jälkeen DNA-vaurioita. Lisäksi vertasimme toimintaa SLD5 DNA Vahinkosaneerauksessa käyttämällä siRNA knock-down kokeita syöpäsoluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja lääkehoito

MEF, B16-soluja (hiiren melanoomasoluja), ja colon26 soluja (hiiren paksusuolen syövän soluja) kasvatettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) (Sigma), jossa oli 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Sigma), ja penisilliiniä /streptomysiiniä (Sigma) 37 ° C ilmakehässä 5% CO

2. MEF valmistettiin villin tyypin (WT) tai SLD5

+/- hiirillä alkiopäivänä (E) 15,5 mukainen tavanomaisella menetelmällä [16]. B16-solut ja colon26 solut hankittiin riken solu pankki (Tsukuba, Japani). Soluja käsiteltiin 1 uM tai 10 uM etoposidi (Sigma). Aiheuttavan DNA-vaurioita voimakkaasti, käytimme 10pM etoposidia. Kuitenkin 10 uM etoposidi vakavasti indusoi apoptoosia. Siksi käytimme 1 uM etoposidi tarkkailla solusyklin palauttaminen. Eläimiä pidettiin ympäristön hallinnassa huoneissa eläinkokeiden laitokseen Osakan yliopisto. Kaikki kokeet tehtiin sovellettavan lainsäädännön ja suuntaviivat hoitoon ja käyttöön koe-eläinten tutkimuskeskuksen Microbial Diseases, Osakan yliopisto hyväksymä eläinkoe ​​komitean tutkimuskeskuksen Mikrobien Disease, Osakan yliopisto (lupa numero 3239- 6). Kaikki Leikkaus suoritettiin natrium- pentobarbitaalianestesiassa, ja yritettiin minimoida kärsimyksen.

siRNA transfektion

SLD5 ilmentymistä B16 ja Colon26 solujen lyhytaikaisesti pudotettiin pieniä häiritseviä RNA (siRNA) . Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) käytettiin transfektioon plasmidin ja siRNA soluihin jälkeen valmistajat protokollia, ja kokeet tehtiin 48 h transfektion jälkeen. Käytimme kahta eri siRNA-oligonukleotidien spesifistä SLD5; tavoite siRNA sekvenssit olivat: 5′-GGA CCA CAC GGA GAC CCA CUU UAA A-3 ’(# 1); 5’-GAU GAG CAG AGA GAC UAC GUG AUU G-3 ’(# 2).

trypaanisiniekskluusiolla testi solujen elävyyden ja regrowth hoidon jälkeen etoposidia

5 x 10

3-soluja ympättiin kuhunkin kuoppaan 24-kuoppaiselle viljelylevylle (BD Falcon) 500 ul: ssa väliainetta. 24 tunnin kuluttua kuopat altistettiin 1 uM etoposidi 12 tuntia. Sen jälkeen, kun lääke oli poistettu, solut kerättiin välittömästi (0 h). Solujen elinkelpoisuus arvioitiin trypaanisinieksluusiolla. Sama määrä eläviä soluja suspendoitiin uudelleen tuoreeseen elatusaineeseen, ja soluja viljeltiin 24, 48 tai 72 tuntia. Ne irroitettiin sitten lisäämällä 100 ui Trypsiini-EDTA: a kuhunkin kuoppaan; Sitten solut pestiin ja suspendoitiin uudelleen 400 ul: ssa väliainetta. 20 ui uudelleen suspendoidut solut sekoitettiin 20 ul: aan 0,4%: sta liuosta trypaanisinivärin (Life Technologies) 1 min. Solut välittömästi laskettiin käyttäen Neubauer mikrokammion valomikroskoopilla. Kaikki lukemat tehtiin käyttäen neljää teknisiä kopioita kunkin näytteen. Keskiarvot ja keskihajonnat laskettiin kullekin jatkoviljely.

Western blotting

Solut kerättiin ja lysoitiin SDS-näytepuskurissa (50 mM Tris-HCL, pH 6,8, 2% natriumdodekyylisulfaattia, 6 % 2-merkaptoetanolia, 10% glyserolia, 0,003% bromifenolisinistä), joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita. Proteiinit erotettiin 10%: n tai 15% SDS-PAGE: lla ja siirrettiin PVDF-membraaneille. Sen jälkeen, kun esto 1 h TBST: ssä (25 mM Tris, pH 7,5, 1,37 M NaCl, 27 mM KCI, 0,05% Tween 20: tä), joka sisälsi 2% rasvatonta maitojauhetta, kalvoja inkuboitiin anti-SLD5 (1:1000; Iwaki) anti-γ-H2AX (1:500, Cell Signaling), anti-Rad51 (H-92; 1:1000, Santa Cruz), tai hiiren anti-β-aktiini-vasta-aine estopuskurissa yön yli. Sitten membraanit pestiin TBST: llä ja inkuboitiin HRP-konjugoidun anti-rotta, kani tai vuohi-vasta-aineita (1:10000) 1 h. Sitoutuneet vasta-aineet havaittiin ECL sarjat (Amersham). Immunoreaktiivinen proteiinit visualisoitiin käyttämällä ECL Prime Western blotting tunnistus järjestelmä (GE Healthcare, Buckinghamshire). Blotit skannataan kuvannusdensitometriä Las-300 mini (Fujifilm, Tokio, Japani).

Tilastollinen analyysi

Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD. Opiskelijan

t

testiä käytettiin tilastolliseen analyysiin. Erot katsottiin tilastollisesti merkittäviksi, kun

p

0,05.

Tulokset

Enhanced DNA-vaurioita, joita vaimennus SLD5 ilmaisun MEF

Sen arvioimiseksi SLD5 koskee DNA-vaurioita vastausta, kun ero DNA-vaurioita käyttäen MEF WT-hiirissä ja SLD5

+/- hiirissä [16]. Olemme vahvistaneet, että taso SLD5 vuonna SLD5

+/- MEF oli noin puolet, että WT MEF (kuva 1A ja B). Tutkia DNA-vaurioita, me haastoi MEF-etoposidia, topoisomeraasi Π estäjä, joka indusoi DNA double-säikeen katkoksia [21], [22]. Soluja käsiteltiin 0,01% DMSO: ta kontrollina tai 10 uM etoposidin 1 tunti. Vakaassa tilassa (altistuminen DMSO), taso fosforylaation kromatiinin sitoutuneen histoni H2AX (γ-H2AX), joka on määrällinen merkkiaine DNA-vaurioita vastaus paikalla kaksinkertaisen säikeen katkoksia [23], [ ,,,0],24], oli pieni molemmissa WT ja SLD5

+/- MEF (kuvio 1 C ja D). Altistuminen etoposidia lisännyt tason γ-H2AX sekä WT ja SLD5

+/- MEF, mutta huomattavasti enemmän jälkimmäisessä (kuvio 1 C ja D).

(A) Western blot-analyysi SLD5 ilmaisun WT ja SLD5

+/- MEF. β-aktiini oli sisäisen valvonnan. (B) kvantitatiivinen arviointi SLD5 ilmaisun kuten paljastuu (A), joka perustuu densitometrisen analyysiin. Tulokset edustettuina kertamuutosta tasoon verrattuna nähty WT MEF. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD. *,

P

0,05 (n = 3). (C) Western blot-analyysi γ-H2AX ilmentymistä WT ja SLD5

+/- MEF-hoidon jälkeen etoposidia (ETO) tai kontrolli ajoneuvo (DMSO). β-aktiini oli sisäisen valvonnan. (D) kvantitatiivinen arviointi γ-H2AX lauseketta paljastuu (C). Tulokset ovat taitettava muutoksia tasoon verrattuna nähty WT MEF käsitelty DMSO. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD. *,

P

0,05 (n = 3).

Delay solusykliaktiivisuuden palauttamisen vaimennus SLD5 ilmaisun MEF jälkeen DNA-vaurioita

valaista onko merkitty DNA aiheuttamia vahinkoja vaimennus SLD5 ilmaisun koskee DNA-vaurioiden korjaamiseen, mittasimme taso Rad51 proteiini, joka on keskeinen osa homologiseen rekombinaatioon [25]. Kuten edellä on kuvattu, MEF käsiteltiin 1 uM etoposidin 12 tuntia, ja Rad51 proteiinin ilmentyminen analysoitiin sitten 0, 24, 48 ja 72 tuntia sen jälkeen, kun poisto (kuvio 2A, B). Taso Rad51 ilmentyminen oli vastaava WT ja SLD5

+/- MEF ennen hoidon etoposidia. WT MEF-taso Rad51 merkittävästi lisääntynyt nopeasti altistumisen jälkeen etoposidia, mutta vähemmän niin SLD5

+/- MEF, ja laski asteittain 24, 48 tuntia, lähes palasi perustasolle 72 tuntia. Sen sijaan Rad51 proteiinia SLD5

+/- MEF kasvoi hitaammin kuin WT MEF ja säilyi pidempään. Tämä viittaa siihen, että pidemmällä aikavälillä tarvitaan DNA: n korjaukseen laajojen DNA-vaurioita SLD5

+/- MEF. Pitkäaikainen DNA korjaukseen kertaa SLD5

+/- MEF puolestaan ​​viittaa viivästyneeseen solusyklin palauttaminen jälkeen DNA-vaurioita. Näin ollen, laskimme elävien solujen lukumäärä sen jälkeen, kun hoidon etoposidia, kuten edellä on kuvattu. Solujen proliferaatio määritettiin trypaanisiniekskluusiolla testi. Ei ollut merkittävää eroa WT ja SLD5

+/- MEF lisääntymistä altistuksen jälkeen DMSO-kontrollin (kuvio 3A), viittaa siihen, että puolittunut SLD5 ilmentyminen MEF ei vaikuta solujen kasvua itsessään. Sitä vastoin, kun altistuminen etoposidi, SLD5

+/- MEF näytetään hidasti merkittävästi solujen kasvua verrattuna WT MEF (kuvio 3B).

(A) Western blot -analyysi Rad51 ilmentymisen WT ja SLD5

+/- MEF. β-aktiini oli sisäisen valvonnan. MEF hoidettiin etaposidia 12 h (-12~0) ja hajotettiin ilmoitettuina aikoina. (B) kvantitatiivinen arviointi Rad51 ilmaisun kuten paljastuu (A), joka perustuu densitometrisen analyysiin. Tulokset ovat kertamuutosta tasoon verrattuna nähty WT MEF ennen hoidon etoposidia. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD. *,

P

0,05 (n = 3).

MEF käsiteltiin DMSO: ssa (A) tai etoposidi (B) esitetyllä tavalla Kuvio 2 ja sama määrä eläviä soluja kuten viljeltiin tuoreeseen väliaineeseen 72 tuntia. Solut laskettiin ilmoitettuun aikaan. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD. *,

P

0,05 (n = 3).

DNA-vaurio parannettu syöpäsolujen vaimennus SLD5 ilmaisun

normaalit solut, kuten MEF, DNA vaurioita voimakkaasti aiheuttama vaimeneminen SLD5 ilmaisua. Seuraavaksi testasimme, onko syöpäsoluja myös osoittaa samanlaisia ​​vasteita etoposidiksi kun SLD5 ilmentyminen oli estetty. Tätä varten SLD5 ilmentymistä pudotettiin vuonna B16 hiiren melanoomasoluja ja Colon26 hiiren koolonkarsinoomasoluissa transfektoimalla siRNA (# 1 ja # 2), kohdistettu SLD5 (siRNA B16 ja siRNA Colon26). Olemme vahvisti, että SLD5 ilmaisu voitaisiin tehokkaasti vaiennetaan erityisiä siRNA B16 ja Colon26 soluja, mutta ei salattu ohjaus siRNA (SCR B16 ja SCR Colon26) (kuvio 4A-D). Käyttämällä näitä soluja, me kvantitoitiin DNA-vaurioita mittaamalla taso γ-H2AX Western-blottauksella. Huollon jälkeen täydellisessä väliaineessa 48 tuntia, soluja käsiteltiin DMSO kontrollina tai 10 uM etoposidi 0,5 tuntia. Alkuperäisen γ-H2AX ilmentymisen taso ei ole korkea joko SCR B16 tai siRNA B16-soluja (kuvio 5A, B). Altistuminen etoposidia johti tehostettuun γ-H2AX sekä SCR B16-solujen ja siRNA B16 soluja, mutta se oli merkitsevästi korkeampi jälkimmäisessä (kuvio 5A, B). Samoin Colon26 soluissa, vaimennus SLD5 ilmaisun parantaa DNA-vaurioita etoposidin (kuvio 5C, D). Yhdessä voimme päätellä, että SLD5 ilmaisu koskee DNA-vaurioita normaalien solujen ja syöpäsolujen.

B16 tai Colon26 solut transfektoitiin sekoitetun negatiivinen kontrolli (SCR) tai SLD5 siRNA: ita (# 1, # 2) ja ne kerättiin 48 h transfektion jälkeen. SLD5 proteiinin ekspressiotasot B16 (A, B) tai Colon26 (C, D) kvantitoitiin Western-blottauksella. β-aktiini oli sisäisen valvonnan. Tiedot kvantitatiivisesti arvioitiin perustuen Densitometrinen analyysiin (B, D). Tulokset edustettuina kertamuutosta tasoon verrattuna nähdään siRNA-käsittelemätöntä B16-solut (B) tai Colon26 soluja (D), tässä järjestyksessä. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD. *,

P

0,05 (n = 3).

Western blot-analyysi γ-H2AX ekspression SCR tai SLD5 siRNA-transfektoiduissa B16 (A, B) tai Colon26 (C, D) solujen käsittelyn jälkeen etoposidia (ETO) tai kontrolli ajoneuvo (DMSO). β-aktiini oli sisäisen valvonnan. Tiedot kvantitatiivisesti arvioitiin perustuen Densitometrinen analyysiin (B, D). Tulokset ovat kertamuutosta tasoon verrattuna nähdään SCR siRNA saaneilla B16-solut (B) tai Colon26 soluja (D), tässä järjestyksessä. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD. *,

P

0,05 (n = 3).

vaimennus SLD5 ilmentymisen syöpäsoluissa ei viivytä solusyklin palauttaminen jälkeen DNA-vaurioita

ennusti, että vaimennus SLD5 ilmaisun viivästyttäisi DNA: n korjaukseen ja solusyklin palauttaminen syöpäsoluissa kuin havaittiin normaaleissa soluissa. Vaikka taso Rad51 ilmentymisen oli sama SCR B16 ja SLD5 siRNA B16-solujen ja SCR Colon26 ja SLD5 siRNA Colon26 soluja ennen hoidon etoposidin, sen jälkeen, nopea kasvu Rad51 oli niinikään havaittiin kaikissa neljässä solulinjoissa ( Kuvio 6A-D). Joka vastaa merkittyjä DNA-vaurioita siRNA B16 ja siRNA Colon26 solujen pitkäaikainen korkea Rad51 ilmentymistä havaittiin näitä rivejä. Näin ollen, pitkään DNA korjaukseen oli yhteinen normaalit solut ja syöpäsolut, mutta pieneni nopeasti vasteena DNA-vauriolle, jotka johtuvat vaimennus SLD5 ilmentyminen normaaleissa soluissa ei havaittu syöpäsoluja.

SCR tai SLD5 siRNA transfektoitu B16 (A, B) tai Colon26 (C, D) soluja käsiteltiin etoposidin 12 h (-12~0). Solut hajotettiin ilmoitettuina aikoina. Western blot analyysit Rad51 ekspression on esitetty. β-aktiini oli sisäisen valvonnan. Tiedot kvantitatiivisesti arvioitiin perustuen densitometrisen analyysiin. Tulokset ovat kertamuutosta tasoon verrattuna nähdään SCR B16 (B) tai SCR Colon26 (D) ennen hoidon etoposidia. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD. *,

P

0,05 (n = 3).

Jotta voitaisiin arvioida, miten nopeaa toimintaa DNA-vaurioita SLD5 tippuu alas syöpäsolujen vaikuttaa solusyklin palauttaminen, me luetteli solujen käsittelyn jälkeen etoposidia. Solujen lisääntyminen sinänsä ei vaikuttanut kaatamalla SLD5 joko siRNA B16 tai siRNA Colon26 solujen läsnäollessa ohjaus DMSO hoitoa (kuvio 7A, C). Neljäkymmentä kahdeksan tuntia etoposidi välittämän DNA-vaurioita, oli vain vähäistä viivästystä solukierron ennallistamisen sekä siRNA B16 ja siRNA Colon26 suhteessa, että nähdään SCR B16 ja SCR Colon26. Kuitenkin 72 tunnin jälkeen, solujen kasvu indusoitiin SLD5-vaimennettu syöpäsolujen samassa määrin kuin valvonta sekä B16 ja Colon26 soluja (kuvio 7B, D). Tämän vuoksi päättelemme, että laaja DNA-vaurioita, jotka johtuvat vaimennus SLD5 ilmaisun vakavasti vaikuttaa solusyklin palauttaminen normaalissa mutta ei syöpäsoluja.

SCR tai SLD5 siRNA transfektoitujen B16 (A, B) tai Colon26 (C, D ) soluja käsiteltiin DMSO: ssa (A, C) tai etoposidi (B, D), kuten on esitetty kuviossa 6, ja sama määrä eläviä soluja kuten viljeltiin tuoreeseen väliaineeseen 72 tuntia. Solujen lukumäärät kirjattiin. Tulokset edustavat keskiarvoa ± SD. *,

P

0,05 (n = 3).

Keskustelu

On raportoitu, että SLD5 muodostaa giniä kompleksin muihin osiin, kuten PSF1, PSF2, ja PSF3 ja on mukana DNA-replikaatioon hiivassa [5]. Esillä olevassa raportissa, ehdotamme, että SLD5 on mukana DNA-vaurioita ja korjaus nisäkässoluissa. Vaimennus SLD5 ilmaisun johti selvästi DNA-vaurioita agentit edistämällä DNA double katkeamisen; tämä oli yhteinen normaalit solut ja syöpäsolut. Pitempi aika oli palauttamiseen tarvittavan solusyklin kun DNA-vaurioita oli laaja. Tätä vastausta, solut täytyy parantaa DNA korjaukseen. Kun SLD5 ilmentyminen väheni normaaleissa soluissa, ekspressio Rad51 viivästyi, mikä viittaa siihen, että SLD5 on mukana myös DNA korjaukseen proteiinin kokoonpano. Sen sijaan nopean Rad51 ilmentyminen indusoitiin syöpäsoluissa jälkeen DNA-vaurioita ja viiveellä solukierron palauttaminen ei ollut niin vakava kuin normaaleissa soluissa. Roolit Gin geenien muiden syöpien on raportoitu [17], [26]. Näin ollen, se ehdottaa, että funktio SLD5 DNA vaurioita ja korjaus on myös käyttää muissa kasvainsolutyypit kuin melanooman ja paksusuolen syövän soluja käytetään kokeissa. Lisäkokeita tarvitaan selventää tätä.

Kuten edellä on kuvattu, Gin kompleksi on mukana DNA: n replikaatioon; kuitenkin, Gin komponentit PSF1, PSF2, PSF3, ja SLD5 eivät aina muodosta komplekseja, ja voi olla muita toimintoja. Esimerkiksi PSF1 säätelee mikroputkiorganisaatiota M vaiheessa ja on mukana kromosomi eriytymistä [20]. Viime aikoina on raportoitu, että homologisia molekyylejä liittämällä DNA-replikaation alempiin organismit voivat myös säädellä solutapahtumiin muu kuin DNA: n replikaatiota [27] – [29]. Näin ollen, on mahdollista, että SLD5, molekyyli osallistuu DNA-replikaation hiivassa, on myös mukana DNA-vaurioiden korjaukseen. Aiempi raportissa ehdotettiin, että DNA-vaurio on estetty, kun kromatiinin kondensoidaan histoni [30]. Kuitenkin aikana DNA: n replikaation, paljas DNA erottaa histoni ja vaarantavat aineet, jotka aiheuttavat DNA kaksinkertainen katkeamisen. Miten SLD5 suojaa DNA kaksinkertainen katkeamisen on toistaiseksi epäselvä, mutta se voi olla mukana histonimodifikaation. Edelleen tarkka analyysi vaaditaan selvittämiseksi mekanismi DNA-vaurioita suojan SLD5.

Oli odotettavissa, että pidemmän aikaa olisi tarpeellinen DNA: n korjautumista solujen huonompi DNA-vaurioita seurauksena puute SLD5. Oletimme, että nopea Rad51 ilmentyminen indusoituvan SLD5

+/- MEF verrattuna WT MEF korjaamisesta raskaasti vaurioitunut DNA. Kuitenkin SLD5 vaimennus todettiin viivyttää Rad51 ilmaisun MEF, aiheuttaen vaikean hidastumista solusyklin palauttaminen. Nämä havainnot ehdottivat, että SLD5 paitsi suojaa DNA-vaurioita, mutta säätelee nopeutta DNA: n korjaukseen. Viime aikoina on raportoitu, että PSF2, myös jäsen Gin monimutkainen, fosforyloituu ATM, kun DNA-juosteen rikkoutuminen [31]. Näin ollen, on mahdollista, että PSF2 on mukana DNA: n korjaukseen liikaa. Lisäksi on raportoitu, että N-terminaaliset ja C-terminaaliset domeenit Sld5 vuorovaikutuksessa N-terminaalin ja C-terminaalin alueet Psf2 Crystal rakenne ihmisen Gin monimutkainen [32], ja Sld5 todettiin vuorovaikutuksessa by kahden hybridin kanssa PSF2 in

Drosophila

[33]. On mielenkiintoista vuorovaikutuksen analysoimiseksi SLD5 ja fosforyloituu PSF2 aikana DNA korjaukseen.

Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että kasvaimen kasvu ja etäpesäkkeiden eivät määräydy syöpäsoluja, vaan myös eri stroomasoluihin. Strooman muodostaa suuren osan useimpien kiinteiden kasvainten ja syövän stroomasolujen vuorovaikutus vaikuttaa toiminnallisesti kasvaimen kasvun ja etäpesäkkeiden [34], [35]. Kasvaimen strooman sisältää monia erilaisia ​​soluja, mukaan lukien syöpään liittyvä fibroblasteissa (CAF), perisyytit, endoteelisolut, läpitunkema immuunijärjestelmän soluja. Niistä valuuttalisiin ovat suuret solutyyppi että ratkaisevassa asemassa kasvainten synnyssä ja etäpesäkkeiden [36], [37]. Tulokset meidän kokeet ovat osoittaneet, että vaimennus SLD5 aiheuttamaa merkittyjä DNA-vaurioita ja tukahdutti nopean solukierron restaurointi MEF. Siksi me ennustaa, että SLD5 estäjät voivat olla ehdokas syöpälääkkeet. Huomasimme, että syöpäsoluissa, DNA-vaurio voimakkaasti indusoi vaientaminen SLD5 ilmaisu, jota on havaittu MEF; kuitenkin, Rad51 nopeasti kasvanut ja solukierron palauttaminen ei suuresti vaikuttanut. Tämä viittaa siihen, että syöpäsolut olla enemmän DNA kuntoutuskoneet riippumatta SLD5, ja siten ylläpitää proliferatiivista kapasiteettia. Hiljentäminen SLD5 syöpäsoluissa voi näin ollen olla tehokas strategia estää kasvaimen kasvua. Kuitenkin, ei vain syövän soluissa, mutta myös normaalia solutyyppejä, kuten endoteelisoluissa ja fibroblasteissa lisääntyä kasvaimen mikroympäris- tukevat kasvaimen kasvua, kuten stroomasolujen komponentit [38] – [40]. Estää angiogeneesi on osoitettu olevan tehokas strategia estämään kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden [41]. Siksi hiljentäminen SLD5 ilmentymistä tai poistaminen SLD5 funktion pieni yhdiste tai nukleosidianalogi, kuten microRNA kasvainten stroomasoluissa voi estää kehitystä kasvaimen mikroympäristössä, ja se voisi olla lupaava lähestymistapa estää kasvaimen kasvua samanlainen strategia tuumorin angiogeneesiä.

Kiitokset

Kiitämme Ms K. Fukuhara, Ms Fujimoto tekniseen tukeen.