Krooninen sairaus

tiivistelmä

MikroRNA (miRNA), noin 22-nukleotidin ei-koodaava RNA-molekyylejä, säädellä erilaisia ​​keskeinen fysiologisia tai patologisia, kuten alkion kehitykseen kasvaimen kehittymisen. Saadakseen kattavan ilmentymisen profiilit miRNA ihmisalkioilla, me tunnettu miRNA ilmaisun viikkoa 4-6 ihmisalkion kehityksen avulla miRNA mikrosiruja ja tunnistettu 50 ihmisen alkion erityisiä miRNA (HES-miRNA). Lisäksi valitsimme kolme ei-konservoitunutta tai kädellisen erityisiä miRNA, HSA-miR-638, -720 ja -1280, ja tutkittiin niiden ekspressiotasot erilaisissa normaaleissa ja tuumorikudoksissa. Tulokset osoittavat, että ilmentyminen useimmissa miRNA on erittäin alhainen alkupuolella ihmisen alkion kehitykseen. Lisäksi, ekspression joitakin ei-konservoituneita tai kädellisen erityisiä miRNA eroaa huomattavasti toisistaan ​​kasvaimen ja vastaavassa normaalissa kudosnäytteet, mikä viittaa siihen, että miRNA liittyvät läheisesti patologisten prosessien eri kasvaimia. Tämä tutkimus esittelee ensimmäisen kattava yleiskatsaus miRNA ilmaisun aikana ihmisen alkion kehityksen ja tarjoaa välitöntä näyttöä suhteesta ihmisen alkion varhaiskehityksen ja kasvaimen kehittymisen.

Citation: Lin Y, Zeng Y, Zhang F, Xue L, Huang Z, Li W, et ai. (2013) karakterisointi MicroRNA Expression Profiles ja Discovery of Novel MikroRNA osallisina syövän aikana ihmisalkion kehityksen. PLoS ONE 8 (8): e69230. doi: 10,1371 /journal.pone.0069230

Editor: Wei Yan, University of Nevada School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 15 maaliskuu 2013; Hyväksytty: 6. kesäkuuta 2013. Julkaistu: 02 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Lin et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National High Technology Researchin ja kehittämisohjelma Kiina (863 Program) Grant 2006AA02A306, National Natural Science Foundation of China Grant 30871245 ja 31271511. rahoittajat ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista, tai valmisteen käsikirjoituksen.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat ~ 22-nukleotidin (nt) ei- koodaus RNA-molekyylejä, jotka säätelevät geenin ilmentymistä tasolla lähetti-RNA hajoamisen tai käännös, käyttää keskeisiä toimintoja erilaisia ​​biologisissa prosesseissa vaihtelee solukierron säätelyssä, erilaistumista ja aineenvaihduntaa, normaaliin kudokseen ja alkionkehityksen, ja jopa kasvaimen kehittymisen [1-4] . Muutoksia miRNA ilmaisun osallistuvat aloittamisesta, eteneminen, ja etäpesäkkeiden ihmisen kasvaimista [5]. Asteittain kasvava näyttö viittaa siihen suora yhteys miRNA ja monia sairauksia, erityisesti syöpää.

Käyttämällä erilaisia ​​kokeellisia menetelmiä, aiemmat tutkimukset eläinten alkionkehityksen että tietyt miRNA olivat jatkuvasti raportoitu, ja useimmat keskeisessä asemassa ovat erilaistumiseen tai huoltoa kudoksen identiteetti [6-10]. Ihmisen kehitys ensimmäisen 8 viikon alkionkehityksen on mahdollisesti yksi mielenkiintoisimmista alueita biologisen tutkimuksen. Erityisesti joitakin tärkeitä kudoksia ja elimiä, mukaan lukien neurogenesis ja kehittäminen maksan, alkoi muodostua viikoilla 4-6 (Carnegie Vaiheet 10-17) ihmisen alkionkehityksen [11]. Viime aikoina meidän tutkimusryhmä ja muut ovat ominaista transkription profiileja genominlaajuisten mRNA ilmaisun aikana ihmisen alkionkehityksen käyttäen mikrosirujen [12,13]. Kuitenkin ihmisen miRNA ilmaus tänä aikana on vielä selvittämättä.

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA kietoutuvat eri näkökohtia tumorigeneesin ja eläinten alkionkehityksen (katsaus esitetty 4,5,14-21). Vuonna 1892, Ranskan biologien Lobstein ja Recamier spekuloitu käsite alkion peräisin kasvainten ensimmäistä kertaa. Vuonna 1970, tohtori Pierce ehdotti, että teoria ”syöpä, joka on kehitysbiologian” ja korosti, että kasvaimien synnyn oli läheisesti mukana kehitysbiologian suurelta osin [22-27]. Tällä hetkellä on kuitenkin merkittäviä viitteitä suhteesta aikaisin ihmisalkion kehityksen ja kasvaimen kehittymisen on vielä vähäistä [28-32]. Täyttämään tämän tärkeän aukon tietämyksen siis lisää tutkimuksia tarvitaan.

Tässä tutkimuksessa miRNA ekspressioprofiileja aikana ihmisalkion kehitystä tunnistettiin ja karakterisoitiin miRNA mikrosiruja. Tulokset osoittavat, että lähes kaikki miRNA tunnettuja toiminto, jotka ovat erittäin ilmaistu tai näytteille ilmentyminen muuttuu aikana ihmisalkion kehitystä ovat sekaantuneet useiden pahanlaatuisten sairauksien. Lisäksi kudoksen ilmentymistä tutkimuksia useiden miRNA tuntemattoman funktion, jotka ovat erittäin ilmaistu tai tehdään ilmentyminen muuttuu aikana ihmisalkion kehitystä osoittavat, että ilmentyminen näiden miRNA oli merkitsevää eroa syövän näytteiden ja vastaavat normaaleissa kudoksissa, mikä viittaa siihen, että nämä miRNA voi myös olla tärkeä roolit kasvainten synnyssä. Nämä tulokset antavat näyttöä läheinen suhde ihmisen alkionkehityksen ja syövän synnyn, ja edelleen osoittavat, että miRNA liittyvä alkionkehityksen tuntematonta voidaan mukana kehittämässä ja etenemiseen syövän.

Materiaalit ja menetelmät

alkionsiirtoryhmistä ja solulinjaa

Ihmisen alkionsiirto- suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [13]. Asianmukainen kirjallinen suostumus saatiin potilaiden ja hyväksyntä saatu Medical Ethics komitean Zhongnan sairaalassa Wuhan University seuraamalla kansalliset ohjeet.

Microarray ja bioinformatiikan analyysit

MikroRNA microarray analyysi suoritettiin käyttäen palveluntarjoajan (LC Sciences). Määritys alkoi 2-5 ug kokonais-RNA: näyte, joka fraktioitiin koon käyttämällä YM-100 Microcon keskipako- suodatin (Millipore). Eristetty pieni RNA: t ( 300 nt) oli 3′-laajeni poly (A) hännän käyttämällä poly (A) polymeraasi. Oligonukleotidi tag ligoitiin poly (A) hännän myöhempää fluoresoiva väriaine värjäystä; kahta eri tunnisteita käytettiin kahta RNA-näytteet dual-näytteessä kokeita. Hybridisaatio suoritettiin yön yli

μ

Paraflo ™ mikrofluidinen sirun avulla mikroverenkiertoa pumppua (Ataktisessa Technologies) [33,34]. On mikrofluidinen siru, kukin detektiokoetinta koostui kemiallisesti modifioitu nukleotidi-koodaavan segmentin komplementaarinen kohdistaa microRNA (alkaen miRBase, https://www.mirbase.org/) tai muita RNA: ta (kontrolli tai asiakkaan määriteltyihin sekvensseihin) sekä spacer segmentti polyetyleeniglykolia jatkaa koodaavan segmentin poispäin alustasta. Havaitsemiseksi koettimet tuotettu

in situ

synteesin avulla PGR (photogenerated reagenssi) kemia. Hybridisaatio sulamis- lämpötilat tasapainottavat kemiallisia muunnoksia detektiokoettimia. Hybridisaatio käytetään 100 ui 6xSSPE puskuria (0,90 M NaCl, 60 mM Na

2HPO

4, 6 mM EDTA, pH 6,8), joka sisälsi 25% formamidia 34 ° C: Hybridisaation jälkeen havaitsemista käytetään fluoresenssi leimaamisen tag-specific Cy3 ja Cy5 väriaineita. Hybridisaatio kuvat kerättiin käyttämällä laserskannerin (GenePix 4000B, Molecular Device) ja digitoitu käyttäen Array-Pro kuva-analyysi-ohjelmisto (Media Cybernetics). Tiedot analysoitiin ensin vähentämällä taustan ja normalisoimalla signaalit käyttäen LOWESS suodatin (Paikallisesti painotettu regressio) [35]. Kahden värin kokeissa suhde kahden havaittujen signaalien (log

2 muuttaneet, tasapainoinen) ja p-arvot t-testien laskettiin; differentiaalisesti havaittujen signaalien olivat ne, joilla on p-arvot alle 0,01. Normalisoitu signaali intensiteettiä 8 näytettä (viikko 4 ihmisalkion kehitystä: ZN18, ZN46 /47, ZN75; Viikko 5: ZN38, ZN43, ZN63-1; Viikko 6: ZN61, ZN70) käytettiin ryhmittely analyysi käyttäen yksi- tapa varianssianalyysi (ANOVA) palveluntarjoaja (LC Sciences). Normalized tiedot kaikista paneelit on talletettu Gene Expression Omnibus (GEO) National Center for Biotechnology Information (NCBI), pääsee GEO Sarjan hakunumerolla GSE46795 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo /query/acc.cgi?acc=GSE46795).

Tiheä monen elimen kasvain ja normaali kudossiruina (luettelo MC5003), joka sisälsi 18 kasvaintyypeille (20 tapausta tyyppi) ja normaalia vastaava valvonta (5 tapausta per tyyppi), ostettiin USA Biomax. Mirna ja salattu oligonukleotidlen

in situ

-hybridisaatio ostettiin digoksigeniiniperoksidaasia leimatun lukittu nukleiinihappo (LNA) koettimia Exiqon (Tanska). Sekvenssi LNA detektiokoettimia olivat: LNA-638: 5′-DIG-AGGCCGCCACCCGCCCGCGATCCT-3 ’; LNA-720: 5’-DIG-TGGAGGCCCCAGCGAGA-3 ’; ja LNA-1280: 5’-DIG-GGGTGGCAGCGGTGGGA-3 ’. LNA-U6: 5’-DIG-CACGAATTTGCGTGTCATCCTT-3 ’ja LNA-scramble: 5′-DIG-GTGTAACACGTCTATACGCCCA-3’ käytettiin positiivisten ja negatiivisten kontrollinäytteiden koettimia vastaavasti.

in situ

-hybridisaatio kudosta matriisia miRNA Ilmeeni suoritettiin käyttäen palveluntarjoajan (Shaanxi Chaoying Biotechnology CO, LTD, Shaanxi Kiina), ja dioja luettiin kaksi riippumatonta tutkijaa. Intensiteetti värjäytyminen pisteytettiin negatiivisiksi (- /0), heikko (+ /1), kohtalaista (++ /2), tai vahva (+++ /3), kuten aiemmin on kuvattu [36,37].

miRNA reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) B

miRNA RT-PCR-määritys suoritettiin käyttäen palveluntarjoajan (LC Sciences). Lyhyesti, miRNA kvantitatiivinen tutkittiin käyttäen TaqMan

® MicroRNA Analyysit ja TaqMan® Universal PCR Master Mix ja analysoitiin ABI PRISM 7000 Sequence Detection System. RNU24 käytettiin sisäisenä kontrollina määrittää suhteellinen miRNA ilme. Kukin näyte suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Tilastolliset analyysit

Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) suoritettiin käyttäen normalisoitua tietoja viikon 4-6 tunnistaa miRNA joiden ekspressio muuttunut. Vertailla miRNA ilmentymistä ihmisen normaalia ja syövän kudoksissa, kaksihäntäinen Opiskelijan

t

suoritettiin käyttäen edellä tulokset näytteistä.

Tulokset ja keskustelu

karakterisointi miRNA ekspressioprofiileja aikana ihmisalkion kehityksen

tunnistamiseksi miRNA ekspressioprofiilit ihmisalkioiden miRNA mikrosiruja määritykset suoritettiin ihmisalkion näytteistä (viikon 4, 5, ja 6 hedelmöityksen jälkeen) käyttäen μParaflo® tekniikkaa, ja mikrosiruja raakadataa analysoitiin. Array kattaa kaikki miRNA selostukset saatavilla Sanger miRBase tietokanta (release 10,1). Katso lisätietoja Koejärjestelyt ja lisätietovarasto (taulukko S1 saatavana verkossa). Siten miRNA näytteille signaalin voimakkuudet yli 32 pidettiin havaittu ilme. Normalisoinnin jälkeen, voimakkaan signaalin kynnys miRNA havaitsemisen määriteltiin 500 (kuvio 1). Olemme nimenneet nämä 50 miRNA (~ 6%), jossa ilmaisu-signaali oli suurempi kuin 500 missä tahansa vaiheessa viikoilla 4, 5, tai 6 aikana ihmisen alkion kehitykseen, kuten ihmisalkion erityisiä miRNA (HES-miRNA) (Taulukko 1 ).

Mirna ekspressiotasot aikana ihmisen alkion kehitykseen (viikon 4, 5, ja 6 hedelmöityksen jälkeen), jossa signaalin voimakkuus on suurempi 32 pidettiin havaittu ilme. Vahva signaali kynnys miRNA havaitsemisen määriteltiin 500 normalisoinnin jälkeen. MiRNA kanssa fluoresenssisignaali on suurempi kuin 500 missä tahansa vaiheessa, viikoilla 4, 5 tai 6 määriteltiin HES-miRNA.

MiRNA

viikolla 4

Viikko 5

Viikko 6

hsa-miR-1031020.97589.63775.30hsa-miR-106a3717.471283.56988.08hsa-miR-106b705.36336.58217.08hsa-miR-107837.20446.95520.07hsa-miR-10b1679.971511.97688.29hsa-miR-1224805.009396.8510671.26hsa-miR-1246356.13816.55100.26hsa-miR-125a-5p387.96827.091146.67hsa-miR-125b558.09937.533407.28hsa-miR-126513.43257.52195.18hsa-miR-126867.10212.18725.03hsa-miR-1275238.04928.53413.71hsa-miR-1280189.87292.811238.08hsa-miR-130a522.76130.33161.38hsa-miR-130b827.85593.00936.95hsa-miR-151-5p713.59579.19423.27hsa-miR-15b1041.17788.21368.30hsa-miR-161080.15395.87286.75hsa-miR-174108.911437.681210.55hsa-miR-181a312.21269.73741.07hsa-miR-181b192.98187.58873.77hsa-miR-182341.78579.71453.59hsa-miR-191482.51483.55631.69hsa-miR-199a-3p1284.651201.391165.51hsa-miR-19b758.72559.73223.40hsa-miR-206791.121067.481658.21hsa-miR-20a3614.131105.53804.23hsa-miR-20b1471.15540.45323.50hsa-miR-2142654.733566.049605.29hsa-miR-23b745.25594.28767.96hsa-miR-251871.251553.321021.11hsa-miR-26a4645.233390.432536.21hsa-miR-320a1849.633185.424495.39hsa-miR-320b1358.111904.943209.74hsa-miR-320c1666.092358.804068.96hsa-miR-320d790.281072.821897.73hsa-miR-361-5p751.92719.17643.41hsa-miR-423-5p553.06888.43400.99hsa-miR-432499.71807.49534.52hsa-miR-4511355.12622.2018.66hsa-miR-483-5p480.512580.411537.07hsa-miR-574-5p163.53375.89709.17hsa-miR-6384622.856092.422891.58hsa-miR-663290.15525.9244.41hsa-miR-720101.92181.661255.10hsa-miR-92a11338.0811838.016909.45hsa-miR-92b4171.404315.192556.64hsa-miR-93872.20552.87445.45hsa-miR-936323.52512.7235.61hsa-miR-99b510.57635.731232.78Table 1. Luettelo ihmisen alkiospesifistä-miRNA.

jälkeen normalisointi, voimakkaan signaalin kynnys miRNA havaitsemisen määriteltiin 500 (kuvio 1), ja 50 miRNA (~ 6%, 50/835), jossa ilmaisu-signaali oli suurempi kuin 500 minkä tahansa vaiheessa viikkoa 4 , 5, tai 6 aikana ihmisen alkion kehitykseen, nimettiin ihmisen alkion erityisiä miRNA (HES-miRNA). CSV Lataa CSV

Ilmaus profiilit osoittavat, että ilmentyminen eniten miRNA on alhainen alkupuolella ihmisalkion kehitystä, jossa noin 80% miRNA (666 835 miRNA) näytteille signaalin voimakkuus katsottiin havaitsematta ilmaisu (kuvio 1 ja taulukko S1). Nämä tiedot ovat samankaltaisia ​​havaintoja, että useimmat miRNA ei ole havaittu varhaisessa zebrafish kehitys [10]. Hierarkkinen klusterin määritykset HES-miRNA ilmentymistä (kuvio 2A) ja 169 miRNA jolla signaalin voimakkuus yli 32 (kuvio S1) aikana ihmisen alkion kehitystä on esitetty. Kuviossa 2A, seuraavat kolme klustereita HES-miRNA ilmaisuja tunnistettiin: A-ryhmän, upregulated viikolla 6; Cluster b, vaimentua viikolla 6; ja Cluster c upregulated viikolla 4. Kuvassa S1, neljä klustereita 169 miRNA tunnistettiin: klusterit 1, 2, 3, ja 4. Cluster miRNA kuviossa 2A kasvoi kolme ihmisalkion vaihetta (viikko 6 viikko 5 viikko 4), ja myös joitakin miRNA lajien raportoitu rikastettu eri kehitys- ja sairausprosesseista (esim HSA-miR-122, -206, -214, -181 perhe, ja -125 perhe) [38]. Cluster c miRNA että laskivat kolmessa ihmisalkion vaihetta (viikko 4 viikko 5 viikolla 6) sisältyi noin miRNA että myös rikastettu eri kehitys- ja sairausprosesseista (esim HSA-miR-451, -106, -16 ja -17) (kuvio 2A) [38]. Ilmaisulla monien klusterin b jäseniä että lisääntynyt viikosta 4 viikkoon 5, mutta laski viikon 5 viikkoa 6, ovat tuntemattomia toimintoja kehittämiseen ja sairausprosesseista.

(A) Fifty HES-miRNA olivat jaettu 3 klusterit: ryppäät, a, b ja c. Nuoli osoittaa miRNA, jotka on valittu edelleen vahvistaa microarray dataa microRNA qRT-PCR: llä (kuvio 3). Tähti osoittaa ei-säilyneitä tai kädellisen erityisiä HES-miRNA (kuva S4). Ontto kolmio osoittaa miRNA harborring samalla siemen alueen sekvenssiin klusterien c. (B) Kuvio 2B esittää kypsän sekvenssin kuuden miRNA (miR-17, -106a, -106b, -20a, -20b, -93), jolla on identtinen siemenen alueen koodattu vaaleanpunainen varjo. (C) Piirakkakuvio esittää toiminnallista mallia analyysi (Gene ontologia) konservoituneiden tavoitteista (1245 selostukset), ennusti TargetScan (https://www.targetscan.org/vert_60/), kuudesta miRNA.

joukossa HES-miRNA (taulukko 1 ja kuvio 2A), jotkut ovat kokeellisesti vahvistettu pelata keskeisiä rooleja erilaistumisen ja sairaus. Esimerkiksi nisäkkään maksaspesifiset miRNA, miR-122, joka oli korkein ekspressiotaso viikolla 6 ihmisalkion kehitystä, on usein tukahdutetaan ensisijainen maksasolukarsinoomat [39,40], ja on myös välttämätöntä hepatiitti C-viruksen RNA kertymistä viljellyissä maksasoluissa [10,41-47]. HSA-miR-214 liittyy lihasten kehittämiseen ja luun muodostumista ja on mukana maha- ja munasarjasyöpä [48-53]. HSA-miR-92a /b, jäseninä miR-17 ~ 92 perhettä, on mukana useissa kiinteiden kasvainten ja leukemian [54-57]. HSA-miR-106a osallistuu säätelyyn aiheuttama pluripotenttien kantasolujen sukupolvi, posttranskriptionaalisella sääntely interleukiini-10 ilme, mahasyöpä, ja astrosytooma [58-61]. Siksi tuloksemme tukevat vahvasti käsitystä siitä, että on silmiinpistävää samankaltaisuutta alkion varhaiskehityksen ja kasvaimen kehittymisen [22].

Lisäksi nämä erittäin ilmaistuna miRNA, sekä ne, jotka ovat alhaiset ilme, voi olla erilainen sääntelyn rooleja eri vaiheissa ihmisen alkion kehityksen. Vaihtoehtoisesti nämä miRNA korkeat ekspressiotasot on vahva kudosspesifisyys, kuten HSA-miR-122.

joukossa klusterin c, on hämmästyttävää, että huomasimme 6 miRNA (HSA-miR-17, -106a, -106b , -20a, -20b ja -93), jotka sisältävät saman siemenen alueen sequcence AAAGUG (kuvio 2B), olivat vaimentua viikolla 6 ihmisalkion kehitystä, ja voisi olla samanlaisia ​​biologisia toimintoja ihmisen alkionkehityksen. Hannon ja Hammond laboratoriosta suoraan Koetulokset että nämä MikroRNA, jota koodaa miR-17-92 klusterin ja sen paralogeille (MIR-106a-363 ​​klusteri ja miR-106b-25 klusterit), on onkogeeninen aktiivisuus kiinteä kasvain [62 ]. Ventura ja työtovereiden dokumentoitu vahva todisteita, jotka poistetaan miR-17-92 klusteri johti vakavasti hypoplastic keuhkot ja vähentäminen esi-B-solujen määrän hiirissä, lopulta johtavat pienempiin alkioiden jopa välittömästi synnytyksen jälkeinen kuolema [63]. Kun otetaan huomioon tärkeä rooli näiden miRNA kehittämiseen ja tuumorigeneesiprosessin me ennusti kaikki tavoitteet nämä 6 miRNA mukaan TargetScan, ja sitten konservoitunutta tavoitteet (1245 selostukset) analysoitiin edelleen. Aikana varhaisessa vaiheessa ihmisalkion kehityksen yksi tärkeä tapahtuma liittyy kehitysvaiheittain siirtyminen varhaisen solujen lisääntymisen vaihe organogeneesin ja histogeneettisesti on, että määrä kantasoluja tai erilaistumattomien solujen vähenee, koska enemmän solut alkavat erilaistua eri elin /kudos- spesifisiin solutyyppeihin. Aikana varhaisessa vaiheessa ihmisalkion kehityksen yksi tärkeä tapahtuma liittyy kehitysvaiheittain siirtyminen varhaisen solujen lisääntymisen vaihe organogeneesin ja histogeneettisesti esitetään. Toiminnalliset kuvio analyysi (Gene ontologia) päässä konservoitunutta kohde (1245 selostukset) 6 miRNA osoittaa, että valtaosa näiden geenien GO ryhmiin liittyvät biologisille sääntelyä, sääntely biologisen prosessin, metabilic prosessi, soluprosessiin, monisoluisten eliöiden prosessi ja kehitysprosessiin (kuvio 2C). Viime aikoina raportoitu joitakin tavoitteita miR-17 ~ 92 perhettä, kuten CDKN1A (p21) [64], BIM [65], RUNX1 [66], molemmat ovat mukana näissä GO ryhmään, jotka viittaavat siihen, että nämä geenit ovat korvaamattomia asema säätelyssä solusyklin, solu apopotosis, ja erilaistumista hematopoieettisten esisolujen. Ja nämä tulokset voivat auttaa meitä ymmärtämään paremmin roolin HES-miRNA ihmisen alkionkehityksen ja kasvaimen kehittymisen.

Lisäksi vahvistaa laatu miRNA microarray data, neljä miRNA (HSA-miR-125b, -720 , -1280, ja -20b, kuvio 3 ja kuvio S2), joiden ekspressiotasoja muuttunut merkittävästi kehityksen aikana validoitiin käyttäen TaqMan® reaaliaikaisen RT-PCR-miRNA määrityksissä. Suuntauksia miRNA ilmaisun vastasivat, että havaittu miRNA microarray data (kuvio 3B, C, D ja E).

neljä miRNA [HSA-miR-125b (B), HSA-miR-720 (C), HSA-miR-1280 (D), ja HSA-miR-20b (E)], jotka ilmentyvät differentiaalisesti (p 0,05, kuvio 3A) ja (p 0,10, kuvio S2) viikoilla 4, 5 , ja 6 ihmisalkion kehitystä, valittiin. qRT-PCR suoritettiin ja U6 snRNA käytettiin sisäisenä kontrollina määrittää suhteellinen miRNA ilmaisua.

Human-hiiri vertaileva analysointi miRNA Expression alkionkehityksen aikana

Jos haluat vertailla miRNA ekspressioprofiileja ihmisen ja hiiren alkion kehitystä teimme vertaileva analyysi suhteessa aiemmin julkaistu microRNA ekspressioprofiileja hiiren alkioiden kattaa syntymää edeltävän kehityksen (E9.5, E10.5 ja E11.5) [8], jotka vastaavat viikkoa 4, 5, ja 6 ihmisalkion kehityksen [67,68]. Koska sama miRNA ihmisen ja hiiren, rakensimme risteys analyysin välillä 835 ihmisen miRNA tässä tutkimuksessa ja 390 hiiri miRNA, ja tunnistettiin 195 homologisia miRNA (taulukko S2). Hierarkkinen klusterointi määritykset ihmisen-hiiren homologia miRNA on esitetty kuviossa S3A ja B. Venn kaaviot (kuviot S3C ja S3D) osoitti, että 38 tai 32 ihmisen-hiiren homologia miRNA oli voimistunut tai vaimentua, vastaavasti, aikana, ihmisen ja hiiren alkion kehitystä. Näistä miRNA, anna-7 perheenjäseniä, miR-34a, miR-221/222, miR-145, miR-125b, miR-15a, ja miR-223 ovat osoittautuneet pelata moninaiset roolit kehittämisen aikana ja patogeneesi eri nisäkkäiden elimet [38]. Nämä tulokset viittaavat edelleen siihen, että jotkut homologinen ihmisen-hiiren miRNA ovat tärkeitä kehityksen ja patogeneesissä, kun taas ne, jotka eivät ole homologisia todennäköisesti mukana erilaisissa kehitysprosesseihin, jotka heijastavat kehitykselliset erot ihmisen ja hiiren.

Yksinkertainen ominaisuudet HES-miRNA

Aiemmassa tutkimuksessa on osoitettu, että monet tunnetut miRNA geenejä on tyypillinen säilyttäminen kuvio, pysyviä koko klustereita, mikä viittaa siihen, kehittyvä ja toiminnallisia vaikutuksia [69]. Kuitenkin huomattava osa MikroRNA vahvistetaan ei-konservoituneita tai kädellisen erityisiä miRNA koska monet ihmisen uuden miRNA on jatkuvasti havaittu [70]. Määritellä säilyttämisen HES-miRNA, käytimme miRviewer [71], mikä osoittaa säilyttäminen miRNA geenien ryhmitelty nimen. Kuten kuviossa S4, useimmat HES-miRNA ovat erittäin konservoituneita, ja niiden toiminnot ovat hyvin tunnettuja. Merkillistä, joukossa HES-miRNA, kahdeksan miRNA, HSA-miR-638, -663, -720, -936, -1246, -1268, -1275, ja -1280, ovat erittäin ei-säilyneitä, vaikka useimmat ovat primate- erityinen (kuva S4) [70,72]. Huomattavasti, huippu ilmaus arvoja 5 Näiden miRNA, miR-638, -663, -936, -1246, ja -1275, ovat 5 viikon ihmisalkion kehitystä. Toisin sanoen, nämä miRNA voi toimia vain tietyn ihmisen alkion kehitysvaiheessa. Lisäksi me tiedämme hyvin vähän biologisten toimintojen näiden miRNA nisäkkäiden organogeneesin ja synnyssä. Kuitenkin, koska ilmaisu näiden ei-konservoituneita tai kädellisen erityisiä miRNA on korkea aikana ihmisen alkion kehitykseen, nämä miRNA todennäköisesti pelata keskeisiä rooleja nisäkkään organogeneesin ja /tai synnyssä. Itse asiassa, muutama tutkimukset osoittavat, että nämä ei-säilyneet tai kädellisen erityisiä HES-miRNA voi liittyä erilaisia ​​taudin [73-82]. Toiminto Näiden ei-säilyneitä tai kädellisen erityisiä HES-miRNA on vielä määrittämättä.

Comparative analyysejä ilmentymisen HSA-miR-638, -720 ja -1280 normaaleissa ja pahanlaatuisten kudosten

Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA osallistuvat moninaiset näkökohdat eläinten kehitys- prosessien ja tautien [4,16-21,38,83-89]. Edelleen vahvistaa suhdetta HES-miRNA ja erilaisten kiinteiden pahanlaatuisia kasvaimia, keskitymme kolme ei-konservoituneita tai kädellisen erityisiä HES-miRNA, HSA-miR-638, -720, ja -1280 (taulukko 1), on erittäin ilmaistuna tai näytteille ilmentyminen muuttuu viikolla 4-6 ihmisalkion kehityksen edelleen toiminnallinen tutkimus. Tutkimme, onko ilmentymisen kolmen HES-miRNA eroaa merkittävästi eri ihmisen kasvaimissa ja vastaavassa normaalissa kudoksessa.

käyttäminen kudokseen microarray MC5003 ja erittäin spesifisiä ja herkkiä LNA-modifioitu oligonukleotidikoettimia, ilmentymisen profiilit 3 miRNA normaalissa ja syöpä- kudoksia todettiin käyttäen

in situ

hybridisaatio. U6 snoRNA ja scramble-miR koettimia käytettiin positiivisten ja negatiivisten kontrollinäytteiden koettimia vastaavasti. Tilastolliset tulokset osoittavat, että ekspressio HSA-miR-638 on merkittävästi yliaktiivista hepatosellulaarinen maksasyövän kudosten (n = 20) ja normaalissa maksakudoksessa (n = 5) (p = 0,0092), ja kohdunkaulan okasolusyöpä kudoksissa ( n = 18) verrattuna normaaliin kohdunkaulan kudoksissa (n = 7) (p = 0,0003). Sitä vastoin ilmaus HSA-miR-638 oli merkittävästi vaimentua vatsaan adenokarsinooma kudoksissa (n = 19) verrattuna normaaliin mahaan kudoksissa (n = 6) (p = 0,0095) (kuvio 4A). Nämä tiedot samaa mieltä tulokset Tsukamoto et al. osoittavat downregulation tämän miRNA mahasyövän [90]. HSA-miR-720 ilmentyminen on huomattavasti yliaktiivista kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma kudoksissa (n = 18) verrattuna normaaliin kohdunkaulan kudoksissa (n = 6) (p = 0,0086), keuhkojen okasolusyöpä /adenokarsinooma kudosten (n = 17) ja normaalissa keuhkojen kudoksiin (n = 6) (p = 0,0386), munasarjassa kystadenokarsinooma /adenokarsinooma kudosten (n = 18) ja normaalissa munasarjakudoksessa (n = 6) (p = 0,04045), ja uroteelin karsinooma kudoksissa (n = 17 ) ja normaalissa vesica urinaria kudoksissa (n = 5) (p = 0,03504) (kuvio 4B). Lisäksi HSA-miR-720 ilmentyminen on merkittävästi vaimentua suolen limakalvon pahanlaatuisten kudosten (n = 19) verrattuna normaaliin ihoon kudoksissa (n = 9) (p = 0,0017) (kuvio 4B). Ilmaisu HSA-miR-1280 on merkittävästi vaimentua in levyepiteelisyövän kudosten pään ja kaulan ihon (n = 20) verrattuna normaaliin ihoon kudoksia (n = 9) (p 0,0001), suolen limakalvon pahanlaatuisten kudosten (n = 20 ) verrattuna normaalin ihon kudoksia (n = 9) (p = 0,0009), ja haiman adenokarsinooma kudoksissa (n = 17) verrattuna normaaliin haiman kudoksista (n = 6) (p = 0,0270) (kuvio 4C). Sen sijaan, HSA-miR-1280 ilmentyminen on huomattavasti yliaktiivista kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma kudoksissa (n = 17) ja normaalissa kohdunkaulan kudoksissa (n = 7) (p = 0,01076) (kuvio 4C). Edustavia esimerkkejä kolme miRNA, jotka ilmentyvät differentiaalisesti tuumorikudoksissa ja normaalissa kudosten on esitetty kuvioissa 5, S5, S6, ja S7. Tulokset viittaavat siihen, että nämä HES-miRNA läheisesti liittyvät patologisten prosessien eri kasvaimia.

High-density monen elimen tuumorin ja normaalin kudossiruina sisältää 500 kudos-pisteitä 18 kasvaintyypeissä ja normaalia vastaava kontrollisilkkipaperia . Digoksigeniini-leimatun lukittu nukleiinihappo (LNA) koettimia (LNA-638, LNA-720, ja LNA-1280) käytettiin spesifisesti havaitsemiseksi miRNA ilmentymistä kudokseen siru. (A) Poikkeava ilmentyminen HSA-miR-638 kudosten microarray. Merkittävät säätely ylöspäin miR-638 voidaan havaita hepatosellulaaristen maksasyövän ja kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma. miR-638 down-regulation löytyy vatsassa adenokarsinooma verrattuna vastaavan normaalien kudosten (p = 0,0092, p = 0,0003 ja p = 0,0095, vastaavasti) (B) Poikkeava ilmentyminen HSA-miR-720 kudosten microarray. HSA-miR-720 on merkittävästi yliaktiivista kohdunkaulan levyepiteelikarsinooma, keuhkojen okasolusyöpä adenokarsinooma, munasarja- adenokarsinooma, ja uroteelin karsinooma verrattuna vastaavan normaalien kudosten (p = 0,0086, p = 0,0386, p = 0,0404 ja p = 0,035, vastaavasti ). HSA-miR-720 on merkittävästi vaimentua suolen limakalvon pahanlaatuisten kudosten ja normaalissa ihon kudoksia (p = 0,0017). (C) Poikkeava ilmentyminen HSA-miR-1280 kudosten microarray. HSA-miR-1280 on vaimentua on okasolusyöpä, suolen limakalvon pahanlaatuista kudosta, ja haiman adenokarsinooma verrattuna vastaavan normaalien kudosten (p 0,0001, p = 0,0009 ja p = 0,0270, vastaavasti). HSA-miR-1280 ylössäädellään merkittävästi kohdunkaulan okasolusyöpä kudosten ja normaalissa kohdunkaulan kudoksissa (p = 0,01076). MiRNA ekspressiotasot (y-akseli), joiden pistemäärä = 0, 1, 2 tai 3, osoittavat negatiivinen, heikko, keskipitkällä tai vahva värjäytyminen intensiteettiä, vastaavasti. n ilmaisee numerot yksilöitä tutkittu. NT osoittaa normaalia kudosnäytteiden; CT osoittaa kohdunkaulan kudosnäytteitä. Kaksisuuntainen opiskelija

t

suoritettiin vertaamaan miRNA ilmentymisen normaaleissa ja syöpäkudokset.

Paneelit läpi t osoittavat mahan adenokarsinooma näytteitä ja paneelit u kautta z näyttää normaalissa vatsa kudos . Sinistymiselle signaali ilmaisee ilmentymistä HSA-miR-638. Punainen värjäys osoittaa solun tumassa (asteikko 200 um kuin kuvio 5a). J2 arvo on suurempi suurennos (5x) osoitetun alueen kuvassa 5j, ja z2 arvo on suurempi suurennos (5x) osoitetun alueen kuvassa 5Z.

Yhteenvetona tutkimuksemme tässä paljastaa, että ilmaus tasot useimpien miRNA aikana ihmisen alkionkehityksen ovat hyvin alhaiset. Olemme nimenneet 50 (~ 6%) ja 835 miRNA säännelty viikkoa 4 kautta 6 ihmisalkion kehityksen HES-miRNA, ja osoittivat, että joitakin ei-säilyneitä tai kädellisen erityisiä HES-miRNA osallistuvat kasvainten synnyssä, mikä tukee hypoteesia että alkion varhaiskehityksen monia yhtymäkohtia syövän kehityksen biologista käyttäytymistä sekä molekyylitasolla [22]. Kuitenkin toiminnot kuin säilyneitä tai kädellisen erityisiä HES-miRNA vielä kokeellisesti vahvistettu, joka auttaa meitä ymmärtämään lisäksi monimutkainen molekyyli modulaatio verkko, joka tapahtuu ihmisalkion kehitystä.

tukeminen tiedot

Kuva S1.

Hierarkkinen klusterointi analyysit ilmentymisen 169 miRNA, joilla signaalin voimakkuudet yli 32 miRNA (n = 169) jaettiin 4 klusterit: klusterit 1, 2, 3, ja 4. Nuoli osoittaa miRNA, jotka on valittu validoida by microRNA qRT-PCR: llä (kuvio 3). Tähti osoittaa ei-säilyneitä tai kädellisen erityisiä HES-miRNA (kuva S4).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0069230.s001

(TIF) B Kuva S2.

klusterointi analyysit miRNA ilmaisun (

p

0,10) aikana ihmisen alkion kehityksen Punainen ja vihreä osoittavat korkean ja matalan ilmaisun tasolla, vastaavasti.

doi: 10,1371 /journal.pone.0069230.s002

(TIF) B Kuva S3.

Konservoitavia miRNA ekspressiokuvioiden ja biologiset ominaisuudet ihmisen-hiiren homologit alkionkehityksen aikana. Valvomatta hierarkkinen klusterointi analyysit miRNA ilmaisun-profiileihin ihmisillä (viikoilla 4, 5, ja 6, kuva S3A) ja hiiren alkion näytteitä (E9.5, E10.5 ja E11.5, kuvio S3B). Hiiren alkion microarray tiedot julkaistiin vuonna 2006 Mineno ja työtovereiden. Väri kussakin hilan uudelleen fl op ilmentymisen taso miRNA vastaavassa näytteessä. Lisääntyvä voimakkuudet punainen osoittaa, että eritelmien fi c miRNA on suurempi ilmaisua näytteessä. Lisääntyvä voimakkuudet vihreitä mukaan tämä miRNA on pienempi ilme. Venn kaaviot kuvaavat leikkauspiste miRNA välillä ihmisillä (viikoilla 4, 5, ja 6) ja hiiren alkion näytteitä (E9.5, E10.5 ja E11.5) ja osoittavat, että 38 ja 32 ihmisen-hiiren homologia miRNA oli voimistunut (C ) ja vaimentua (D), tässä järjestyksessä, aikana ihmisen ja hiiren alkionkehityksen.

doi: 10,1371 /journal.pone.0069230.s003

(TIF) B Kuva S4.

Conservation analyysit HES-miRNA. MiRviewer näyttää säilyttämiseen HES-miRNA geenejä, ryhmitellään nimi. MiRNA että vain voidaan havaita ihmisen tai muiden kädellisten, mukaan lukien miR-638, -663, -720, -936, -1246, -1268, -1275, ja -1280, erotettiin alla. Lisääntyvä voimakkuudet vihreä osoittaa, että eritelmien fi c miRNA (tai miRNA perhe) on korkeampi säilyttäminen annetussa lajeja. Suluissa ilmaisevat numerot miRNA tietyllä miRNA perhe. Useimmat samanlaiset säilyttäminen tuloksia.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0069230.s004

(TIF) B Kuva S5.

HSA-miR-638 ilmentymisen kohdunkaulan adenokarsinooma ja vastaavat normaalit kudokset. Paneelit läpi t näytä kohdunkaulan adenokarsinooma näytteitä ja paneelit u kautta z näyttää normaalissa kohdunkaulan kudoksissa. Sinistymiselle signaali ilmaisee ilmentymistä HSA-miR-638. Punainen värjäys osoittaa solun tumassa (asteikko 200 um kuten kuvassa S5a).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0069230.s005

(TIF) B Kuva S6.

HSA-miR-720 ilmentymisen kohdunkaulan adenokarsinooma ja vastaavat normaalit kudokset.