Krooninen sairaus

tiivistelmä

Epänormaali microRNA (miRNA) ilmentyminen on liitetty kehittymistä ja etenemistä useiden ihmisen syöpien, ja tällainen säätelyhäiriö voi johtua poikkeava DNA: n metylaatio. Vaikka pieni määrä miRNA tiedetään säänneltävä DNA: n metylaatio, me arveltu, että tällainen epigeneettisellä sääntely on yleisempää. Yhdistämällä MBD-eristetty Genomikartoituksen (koontiryhmien) arvioida genominlaajuisten DNA metylaation ja mikrosiruanalyysillä määrittää miRNA ekspressiotasot, me järjestelmällisesti etsittiin ehdokasta miRNA säätelee DNA: n metylaation kolorektaalisyövässä solulinjoissa. Löysimme 64 miRNA on tehostetusti metyloitavaa HCT116-soluissa; kahdeksantoista niistä sijaitsivat painamista alueilla tai jo raportoitu säätelevän DNA: n metylaatio. Jäljellä 46 miRNA, ekspressiotasot 18 olivat yhtäpitäviä niiden DNA: n metylaatio tila. Lopuksi 8 miRNA kasvoi-säädellään 5-atsa-2′-deoksisytidiini hoitoa ja tunnistettiin olevan uusi miRNA säätelee DNA: n metylaatio. Lisäksi osoitimme toiminnallista merkitystä näiden epigeneettiseltä vaiennetaan miRNA by ektooppisesti ilmaisemalla valitse ehdokkaita, mikä johti kasvun estyminen ja migraation syöpäsoluja. Lisäksi raportoinnissa nämä havainnot, tutkimuksemme tarjoaa myös luotettavan, järjestelmällinen strategia tunnistaa DNA metylaatio-säännelty miRNA yhdistämällä DNA: n metylaation profiileja ja ekspressiotietojen.

Citation: Yan H, Choi Aj, Lee BH, Ting AH (2011) tunnistaminen ja funktionaalinen analyysi epigeneettiseltä Silenced MikroRNA sisään peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 6 (6): e20628. doi: 10,1371 /journal.pone.0020628

Editor: Axel Imhof, Ludwig-Maximilians-Universität München, Saksa

vastaanotettu: 24 tammikuu 2011; Hyväksytty: 06 toukokuu 2011; Julkaistu: 16 kesäkuu 2011

Copyright: © 2011 Yan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä, ei-koodaavan RNA: t, jotka säätelevät geenien ilmentymistä ja pelata keskeisiä rooleja normaalissa solun prosesseissa, kuten solujen lisääntymisen, erilaistumisen, ja apoptoosin [1]. Sekä poikkeava ilme ja vaiennettu miRNA on havaittu ihmisen syövissä, mikä viittaa mahdollisten onkogeeninen ja tuumorisuppressoriproteiinia toimintoja näille miRNA [2], [3]. Biogeneesille miRNA liittyy transkription pitkä ensisijaisen transkripti (PRI-miRNA) RNA-polymeraasi II [4], pilkkominen osaksi välituotteena (pre-miRNA) by Drosha [5], ja lopullinen käsittely osaksi kypsä miRNA by Dicer [ ,,,0],6]. Jokainen vaihe prosessissa on hyvin säädeltyä ja säätelyhäiriö millä tahansa tasolla voi johtaa sopimattoman miRNA toimintoja. Erityisen kiinnostavaa Tutkimuksemme on miRNA transkription säätelyyn DNA metylaatio. Yleensä geenin promoottori-DNA: n metylaatio on korreloi negatiivisesti geenien ilmentymistä ja osuus voi poikkeavalle tuumorisuppressorigeenin geenien erilaisia ​​ihmisen syövissä [7]. Samanlainen nämä POLR2A puhtaaksi proteiinia koodaavan geenien miRNA transkriptio voidaan vaientaa promoottori DNA: n metylaatio.

epigeneettiseltä vaiennetaan miRNA on löydetty syöpien perustuu differentiaalikaavojen normaalin kudosten ja kasvainten tai välillä lähtötilanteen ja DNA demetyloitunut syöpä solut. Esimerkiksi Bandres

et al.

Ensimmäinen tunnistettu 23 miRNA joita säädellä vähentävästi ensisijainen kolorektaalisyövissä verrattuna vastaaviin normaaleihin peräsuolen epiteelin ja jälkikäteen ilmenee miR-129-2, miR-9-1, ja miR -137 vaiennetaan DNA: n metylaation syövässä [8]. Toyota

et al.

Käsitelty HCT116 peräsuolen syövän solut demetyloiva agentti, 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC), ja verrattiin miRNA ekspressioprofiileja välillä käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen tunnistamiseksi hiljentäminen miR-34b /c promoottori DNA hypermetylaation [9]. Lisäksi Lujambio

et al.

Vertasivat miRNA ilmaus profiilia villityyppisen HCT116-solujen kanssa, demetyloiduksi isogeeninen johdannainen, DNA metyylitransferaasin -1 ja -3b Double Knockout (DKO) soluja, ja löysi 18 miRNA sääteli in DKO soluissa [10]. Myöhemmin he vahvistivat, että DNA: n metylaatio on vastuussa vaiennettaisi miR-124a paksusuolen syöpä.

kirjallisuushaku käyttäen MEDLINE- paljasti, että 16 miRNA tiedetään epigeneettiseltä vaiennetaan DNA: n metylaatio [8], [9 ], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. DNA: n metylaatio viittaa kovalenttinen lisäys metyyliryhmä on 5-asemassa sytosiinit, tavallisesti CpG yhteydessä nisäkkään erilaistuneita soluja [18]. Genomialuetta joilla on korkea tiheys CpG: t kutsutaan CpG saaria ja ovat usein sivustoja säätely-DNA: n metylaatio. Ottaen huomioon, että 16% selityksin varustetun ihmisen miRNA sijaitsevat 1000 emäsparia CpG Island [19], me aavistaa epigeneettisellä sääntely miRNA saattaa olla yleisempää kuin on raportoitu tähän mennessä. Aiemmat tutkimukset tukeutunut ero ilmaus miRNA tunnistaa ehdokkaita myöhemmin epigenetic arviointia. Tämä lähestymistapa tuo bias että määrä rajoitetaan epigeneettiseltä säänneltyjen miRNA joka voidaan havaita. Esimerkiksi kudosspesifisiä miRNA, jotka säätelevät DNA: n metylaatio voi olla vastaavasti metyloitua normaaleissa kudoksissa ja kasvaimia, mikä puute erilaisen ilmentymisen normaali- ja syöpä- yksilöitä. Lisäksi miRNA alhainen ekspressiotasoja ei voida luotettavasti tunnistaa, koska erot ilmaisun välillä normaalin ja syövän välillä tai lähtötilanteen ja demetyloiduksi olosuhteet todennäköisesti laskee alle tavanomaisen cutoffs (välillä 2 ja 1,5-kertainen). Lopuksi jäljellä metylointi jatkuu sekä farmakologisesti geneettisesti demetyloituu soluihin [20]. Tällainen metylointi voi olla kriittinen solujen elinkyvyn säilymiselle, mahdollisesti kautta jatkuva tukahduttaminen keskeisten miRNA. Tämä johtaisi niin miRNA ei tunnistettu ilmaus perustuvia strategioita.

voittamiseksi löytö vääristymä ilmaisu-pohjainen tunnistaminen Strategiamme käyttää suoraan maailmanlaajuinen DNA metylaation tunnistamiseen miRNA säätelevät DNA-metylaation HCT116 ja DKO koolonkarsinoomasoluissa. Olemme aikaisemmin kartoitettu genominlaajuisten DNA metylaatio näissä solulinjoissa käyttämällä metyyli-CpG sitova alue (MBD) -isolated Genomikartoituksen (koontiryhmien) [21]. Ensin tunnistetaan miRNA proksimaaliseen DNA: n metylaatio ehdokkaiksi. Sitten ristiviittaus ehdokaslista kanssa miRNA ilme tietoja tukeva näyttö. Tätä lähestymistapaa käyttäen olemme onnistuneesti tunnistettu sekä tunnettuja ja uusia DNA metylaatio-säännelty miRNA. Täällä tarjota kattavampi luettelo epigeneettiseltä säännelty miRNA paksusuolen syöpäsoluissa, mikä osoittaa, että epigeneettiset sääntelyn miRNA on yleistä näissä syöpäsolun linjat. Lisäksi toiminnan tutkimuksessa valitse miRNA tarjoavat biologista merkitystä tällaisten epigeneettiset sääntelyn yhteydessä paksusuolen syövän.

Tulokset

Candidate miRNA säätelee DNA: n metylaatio tunnistettiin proksimaalinen genomista DNA metylaatio ja tukevat ilmaisun data

aiemmin käytetty Migs rakentaa genominlaajuisten DNA metylaatio profiileja HCT116-solulinjaa ja demetyloiduksi isogeenisistä solulinjassa, DKO [21]. DKO solut ovat HCT116-solut poistetaan DNA metyylitransferaasi -1 ja -3b ja säilyttää alle 5% genomista DNA: n metylaatio [20]. DNA metyloitu jakeet genomin eristettiin inkuboimalla rekombinantti MBD proteiineja, sekvensoitiin Illumina GAII sekvensseri, ja kartoitettu takaisin viittaus genomin tuottaa yksittäisiä methylome profiileja. Tunnistaa DNA: n metylaatio-säännelty miRNA etsittiin miRNA todisteet DNA: n metylaatio 500 emäsparia niiden selityksin tehtävissä HCT116 ja DKO soluja. Tätä lähestymistapaa käyttäen tunnistimme 64 ehdokasta miRNA myöhempää analysointia varten (kuva 1).

Niistä 64 ehdokasta miRNA, 13 on raportoitu säätelevän DNA: n metylaatio (taulukko S1). Toinen 5 kuuluvat suurelta miRNA klusteri sijaitsee ihmisen DLK1-GTL2 painettu domeeni 14q32 ja vaiennetaan sen isän kromosomissa DNA: n metylaatio [22]. Siksi olemme keskittyneet jäljellä 46 miRNA, joita ei ole raportoitu säätelevän DNA: n metylaatio yksityiskohtaisia ​​validointi. Ensin valitaan satunnaisesti 6 miRNA varten bisulfiitti sekvenssianalyysi tarkistaa DNA metylaatiostatuksen havaitaan Migs (kuvio 2 ja kuvio S1). Bisulfiitti sekvenointitulosten vahvistivat Migs tiedot ollenkaan 6 loci.

bisulfiittimodifiointi sekvensointi suoritettiin (A) miR-941, (B) miR-1237, ja (C) miR-1247 vanhempien HCT116-soluissa HCT116-solut käsiteltiin 5 uM 5-atsa-dC 48 tuntia, ja DKO soluja. UCSC genomi selaimen ruudulla näkyy DNA: n metylaation signaali kussakin näytteessä. Suorakulmioita merkitä alueiden vahvistanut bisulfiitti sekvensoinnilla. Jokainen ympyrä edustaa CpG. Mustat ympyrät edustavat metyloidut sytosiinit taas valkoiset ympyrät edustavat metyloitumattomien sytosiinien.

Seuraavaksi perusteltu, että DNA: n menettämisen metylaation DKO soluissa verrattuna HCT116 soluihin pitäisi johtaa suurempiin ilmentymä ehdokas miRNA taas säilyttämisestä DNA: n metylaatio tulisi korreloida jatkuviin hiljentäminen ehdokas miRNA. Siksi tutkimme ilmaisun microarray tiedot 46 ehdokasta HCT116 ja DKO soluja (taulukko S2). Käyttäen 1,5-kertainen muutos kuin meidän kynnys tunnistimme 18 miRNA olevan sopusoinnussa ekspressiotietojen niiden DNA: n metylaation tilaansa HCT116 ja DKO soluja (taulukko S1). Suoritimme miRNA-specific kvantitatiivisen tosiaikaisen RT-PCR: llä (miR-qRT-PCR) analyysi 6 valitsemalla miRNA tarkistaa ilmaisun data määritetään mikrosiru (kuva S2). MIR-qRT-PCR Tulokset vahvistivat microarray tiedot 6 miRNA, johon kuului sekä tunnettuja että ehdokas DNA: n metylaatio-säännelty miRNA. Siksi perustuvat empiiriseen genomista DNA metylaatio ja tukevat microarray ilmaisun data tunnistimme 18 novel ehdokas miRNA joka voidaan transkriptionaalisesti säädellä DNA: n metylaatio.

Candidate miRNA uudelleen express jälkeen 5-atsa-2′-deoksisytidiini hoito

vahvistaa, että ehdokas miRNA todellakin säätelee DNA: n metylaatio, käsittelimme HCT116, RKO, ja DLD1 koolonkarsinoomasoluissa kanssa demetyloiva agentti 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) ja onko nämä miRNA uudelleen ilmaistaan ​​jälkeen 5-atsa-dC hoitoa. Koska DNA: n metylaatio säätelee geenin ilmentymistä transkriptionaalisella tasolla, me määritetään ilmentymisen ensisijaisen miRNA (Pri-miRNA) reaaliaikaisella RT-PCR: llä [23]. sisältyvät Pri-miR-193a, -9-3, ja -375, mikä tiedettiin transkriptionaalisesti säätelevät DNA-metylaation HCT116-soluissa [8], positiivisina verrokkeina ja Pri-miR-1224, joka oli demetyloitu mutta pysyivät vaiennettu vuonna DKO solut tässä tutkimuksessa, negatiivisena kontrollina. Testasimme 17 ulos 18 romaani ehdokkaita, koska mikään alukkeiden suunniteltu miR-1234 saatiin käyttökelpoinen PCR-tuotteita. Vuonna HCT116-soluissa, löysimme 11 ulos 17 miRNA olevan merkittävästi säädelty jälkeen 5-atsa-dC käsittely (kuvio 3A). Olemme edelleen itsenäisesti vahvistaneet kaikki 11 ehdokasta RKO soluissa (kuvio 3B) ja 10 ulos 11 ehdokkaiden DLD1 soluissa (kuvio 3C). Voit varmistaa, että ylössäätöä näiden miRNA oli seurauksena DNA demetylaation jälkeen 5-atsa-dC hoito, arvioimme muutosten DNA metylaatiostatuksen proksimaalisessa alueilla miR-941-1 /3, miR-1237 ja miR-1247 bisulfiitti- genomista sekvensointia (kuva 2). Demetylaatio havaittiin näissä loci in HCT116-soluissa käsiteltiin 5-atsa-dC, tukeva, että uudelleen ilmentymisen havaittiin johtui DNA demetylaation.

Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi suoritettiin arvioimaan ehdokas ensisijainen miRNA (Pri-miRNA) tasoja (A) HCT116, (B) RKO, ja (C) DLD1 soluihin ennen ja jälkeen hoidon 5 uM 5-atsa-dC 48 tuntia. miR-1224 sisällytettiin negatiivisena kontrollina. miR-193a, miR-375, ja miR-9-3 sisällytettiin positiivisena kontrollina. * Tarkoittaa merkittävä kasvu Pri-miRNA ilmentymisen jälkeen 5-atsa-dC hoitoa (p 0,05). Ilmauksia miRNA olivat sisäisesti normalisoida ekspressiotasoja

GAPDH

, ja normalisoitu ilmaisun kunkin miRNA ennen 5-atsa-dC hoitoja oli asetettu 1.

Lopuksi, introni miRNA voidaan käyttää samanaikaisesti transkriboida isäntä geenistä promoottoreita ja siksi ei itsenäisesti säädellään transkription tasolla [24], [25]. Siksi täysin ymmärtää merkityksen DNA: n metylaation havaitsimme meidän 10 ehdokasta miRNA selvitimme genomisen yhteyksissä on 10 ehdokasta lähemmin (taulukko 1). miR-1247, miR-1826, ja miR-219-2 sijaitsevat intergeenisessä alueilla ja siksi on epätodennäköistä yhteistyössä säädellä isäntä geenin promoottori. Loput 7 ehdokkaat sijaitsevat intronit RefSeq tai EST selostukset ja tutkittiin tarkemmin. Joka perustuu genomin laajuinen DNA: n metylaatio profiileja, yksikään oletetun isäntägeenejä, lukuun ottamatta ei-koodaavat RNA

ANKRD30BL

, on merkittävää DNA: n metylaatio niiden promoottorit (taulukko 1 ja kuvio S3), mikä viittaa siihen, että nämä otaksuttu isäntägeenejä ei säännellä promoottori DNA: n metylaatio.

olemme kuitenkin arveltu, että jos oletetun isäntä geenin transkriptio sanelee ilmaus sulautettujen ehdokas miRNA, meidän pitäisi tunnistaa lisääntynyt isäntä geeniekspression jälkeen 5- atsa-dC hoidon HCT116, RKO, ja DLD1 soluja. Nämä lisäykset vastaanottavassa geeniekspression vastaisi lisäys havaittiin, että upotettu miRNA näissä samoissa soluissa, sen jälkeen 5-atsa-dC hoitoon. Toisaalta, jos otaksutun isäntägeenejä eivät reagoi 5-atsa-dC käsittely samalla tavalla kuin upotettu miRNA miRNA todennäköisesti transkriboidaan riippumatta oletetun isännän geenejä. Tässä jälkimmäisessä skenaariossa DNA: n metylaatio huomasimme lähellä miRNA olisi mielekkäintä heidän transkription säätelyyn. Perustuen qRT-PCR-tuloksiin, huomasimme, että miR-1237, miR-602, miR-941-1, miR-941-3, ja miR-663b ovat kopiointia riippumattomia niiden otaksuttu isäntägeenejä (kuva 4). Ilmaisu on

ANKRD30BL

, oletetun isäntä geeni miR-663b, ei ollut havaittavissa ennen tai jälkeen 5-atsa-dC kokeiluja ja siksi, ei esitetty kuvassa 4. miR-24-1 ja asennuspalveli- 27b, data on vähemmän vakuuttavia, ja emme voi sulkea pois, että nämä kaksi mi-RNA: t voidaan käyttää samanaikaisesti syntetisoida isännän geenistä,

C9orf3

[26]. Kaikkiaan tunnistimme ja vahvisti vähintään 8 uusia miRNA, jotka ovat transkriptionaalisesti säätelee DNA: n metylaation.

Reaaliaikainen RT-PCR-analyysi suoritettiin sen arvioimiseksi oletetun isäntä geenin ilmentyminen vasteena 5-atsa-dC hoitoja in HCT116 (sininen), RKO (tumma pinkki), ja DLD1 (keltainen). Muutokset sulautettujen miRNA ilmaisun myös piirretty side-by-side vertailuja. Kaikki ilmaukset olivat sisäisesti normalisoida ekspressiotasoja

GAPDH

, ja normalisoitu ilmaisun jokaiselle isäntä geenin ja miRNA ennen 5-atsa-dC hoitoja oli asetettu 1.

asennuspalveli- 941 ja miR-1247 tukahduttaa solujen kasvua ja muuttoliike koolonkarsinoomasoluissa

eteni testata biologisia toimintoja näiden epigeneettiseltä säänneltyjen miRNA saada tietoa merkitystä niiden DNA-metylaation koolonkarsinoomasoluissa. Sen määrittämiseksi, ilmentymistä näiden epigeneettiseltä vaiennettu miRNA vaikuttaisi syöpäsolujen kasvua ja muuttoliike, transfektoimme HCT116 soluja miRNA jäljittelee Mir-941 (kypsän muodon miR-941-1 ja -3), miR-1237, miR-1247 ja ei-koodaavan negatiivinen kontrolli (AllStars neg.).

ensin suoritetaan kasvukäyrä analyysi (kuvio 5A) ja MTT-määrityksellä (kuvio 5B) arvioida solujen kasvun ja aineenvaihdunnan kunto. Huomasimme, että ektooppinen ilmentyminen miR-1247 johti vähentynyt merkittävästi HCT116 solujen kasvua ja metabolinen aktiivisuus mitattuna kahdesta analyysistä vastaavasti. BrdU riippumattomasti todennettuja että vähentynyt kasvu ja aineenvaihdunta on todennäköisesti seurausta vähentynyt proliferaatio näissä soluissa (kuvio 5C). Havaitsimme samanlainen lasku solujen lisääntymisen ja metabolisen funktio DLD1 koolonkarsinoomasoluissa transfektoitu miR-1247 matkivat (kuva S4A ja B). Sitä vastoin DKO soluissa, joissa miR-1247 on jo demetyloituneiksi ja uudelleen ilmaisseet, transfektio ylimääräisiä miR-1247 matkii ei ollut vaikutusta solun kasvuun ja aineenvaihdunnan (kuvio S5a ja B). Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-1247 voi olla kasvain heikentävän paksusuolen syövän ja sen epigeneettiset hiljentäminen on näin ollen hyötyä syövän kasvua.

(A) kasvukäyrät ja (B) MTT määrityksissä valetransfektoidut HCT116-solut ja HCT116 transfektoiduissa soluissa ei-koodaavan negatiivinen kontrolli miRNA (AllStars neg.), miR-941, miR-1237, tai miR-1247 matkii. (C) BrdU of valetransfektoidut HCT116-solut ja HCT116-solut transfektoitu ei-koodaavan negatiivinen kontrolli miRNA (AllStars neg.), MiR-941, tai miR-1247. Edustava kenttä kutakin koetilalle näytetään. Pylväsdiagrammi edustaa keskimääräistä prosenttiosuutta (%) BrdU-positiivisten solujen. (D) haavan paranemista määritys valetransfektoidut HCT116-solut ja solut transfektoitu negatiivisen kontrollin (AllStars neg.), MiR-941, miR-1237, tai miR-1247 matkii. Valokuvat otettiin heti haavoitti ja 16 tuntia myöhemmin. Tulokset kvantitoitiin ja normalisoitiin valetransfektoiduilla soluja. (E) TranswellTM muuttoliikkeen määritykset valetransfektoidut HCT116-solut ja solut transfektoitu negatiivisen kontrollin (AllStars neg.), MiR-941, tai miR-1247 matkii. Edustavia aloilla invasiivisia solujen kalvolle esitetään. Pylväsdiagrammi edustaa keskimääräistä lukumäärää solujen alapuolella kalvoja kunkin hoidon normalisoidaan valetransfektoituihin soluihin.

Lisäksi laskennallisesti ennustaa tavoitteita miR-941 ja miR-1247 sisältyi useita geenien solujen maahanmuuton ja invaasiota. Esimerkiksi, ADAM metallopeptidaasi domain 15 (

ADAM15

) on ennustettu tavoite miR-1247 ja koodaa transmembraanisen glykoproteiinin tärkeä soluadheesion [27]. Olemme oletettu, että säätely alaspäin näistä ennusti tavoitteensa ektooppinen ilmentyminen miR-941 ja miR-1247 heikentäisi solujen vaeltamiseen. Siksi testasimme vaikutuksia kohdunulkoisen ilmentymisen miR-941, miR-1237, ja miR-1247 solun liikkuvuutta HCT116-soluissa. In arpeutumisprosessit määrityksissä, HCT116-solut transfektoitu miR-941 ja miR-1247 matkii merkittävästi heikentynyt kyvyssään asuttaa haavoittuneen alueille verrattuna mock, negatiivinen kontrolli tai miR-1237 transfektoiduissa soluissa (kuvio 5D). Nämä havainnot varmistettiin vielä käyttämällä Transvvell- migraatiokokeessa (kuvio 5E). Lopuksi samanlainen tukahduttava vaikutus solujen vaeltamiseen olivat itsenäisesti havaittiin DLD1 soluissa (kuvio S4C) ja DKO soluja (kuvio S5c) transfektoitu miR-941 ja miR-1247 matkii. Yhdessä nämä havainnot viittaavat siihen, että epigeneettiset vaiennettaisi miR-941 ja miR-1247 voi helpottaa paksusuolen syövän solujen vaeltamiseen ja invaasiota.

Keskustelu

MikroRNA ovat tärkeitä säätelymolekyyleja jotka moduloivat geeniekspressiota sekä kehitys- ja taudin prosesseja. Niiden sääntely on siis kriittinen osa ymmärtämään kunkin biologisen yhteydessä. Genomisen DNA: n metylaatio on osoitettu säädellä transkription muutama miRNA syövän. Nämä aiemmat tutkimukset, joilla pyritään tunnistamaan DNA: n metylaatio säädelty miRNA tukeutunut seulonta ilmentyvät eri miRNA syöpään ja normaalista vertailuja tai uudelleen ilmentäminen miRNA DNA demetyloitunut olosuhteissa. Ilmaus perustuva lähestymistapa tuo löytö ennakkoluuloista samanarvoisesti metyloitu, siis vastaavasti vaiennettu, miRNA vertailussa ryhmissä. Tämäntyyppinen epigeneettiseltä säännellyn miRNA voisi silti olla tärkeitä syövän kehityksen. Esimerkiksi, vastaavasti vaiennettu miRNA normaaleissa ja syöpä voi olla merkitystä syövän kudos-spesifisellä tavalla. Lisäksi DNA-jäännöksen metylaation aiheuttama demetylaatio olosuhteissa voisi ylläpitää vaiennettu kriittinen miRNA, mikä puute havaittavissa differentiaalikaavojen ja epäonnistuminen tunnistamaan tällaiset epigeneettiseltä säännelty miRNA. Lopuksi miRNA kanssa marginaalinen ero ilme alle tyypillinen kynnysarvojen myös jättää väliin, kun seulonta perustuu yksinomaan differentiaalikaavojen.

voittamiseksi edellä harhat ja kattavasti tunnistamaan DNA: n metylaatio säädelty miRNA paksusuolen syövän, me seulotaan sillä ehdolla miRNA perustuu empiiristä näyttöä genomisen DNA metylaation HCT116 ja DKO koolonkarsinoomasoluissa. Olemme systemaattisesti tutkineet DNA methylome kartat syntyy Migs näissä soluissa miRNA sijaitsevat 500bp DNA metylaatio signaaleja. Löysimme 64 ehdokasta, joista 5 tunnetaan painettu miRNA, 13 tunnettua DNA metylaatio-säännelty miRNA, ja 46 uusia ehdokkaita. Myöhemmin olemme vahvistaneet 8 uudet ehdokkaat todellakin säädellään DNA-metylaation HCT116, DKO, RKO, ja DLD1 koolonkarsinoomasoluissa. Yhdessä havaitsemista tunnetun DNA-metylaatio säännelty miRNA, tutkimuksemme tunnistettiin yhteensä 26 epigeneettiseltä säänneltyjen miRNA, joka osoittaa, että lähestymistapamme on tehokas ja toimiva.

On tärkeää huomata, että voimme silti puuttua DNA metylaatio säädelty miRNA johdettu pitkä ensisijainen selostukset. Aiemmat tutkimukset keskittyivät miRNA heidän varsi-silmukka sekvenssit upotettu tai lähellä CpG-saarekkeiden, ja nykyinen tutkimus keskittyi miRNA DNA metylaatio proksimaalisesti varren silmukan sekvenssit. Vaikka nämä vastaavia strategioita mahdollistavat järjestelmällisen seulonnan, ne todennäköisesti aliarvioidaan kokonaismäärä miRNA säätelevät DNA: n metylaatio, koska transkription aloitusta varten ensisijaisen miRNA voi olla kaukana ylävirtaan varsi-silmukka järjestyksessä. Esimerkiksi, ensisijainen transkriptio miR-21 on 3433 nukleotidia pitkä, kun taas kypsät miR-21 koodaa tähteitä 2445-2516 HeLa-soluissa [28]. Äskettäin Chim

et al.

Raportoitu että miR-34a säädeltiin promoottori CpG-saarekkeen DNA: n metylaatio sijaitsee 30 kb ylävirtaan kypsän miR-34a [29]. Siksi enemmän miRNA voidaan säädellä promoottori DNA: n metylaatio, mutta ei tunnistaa helposti käyttäen järjestelmällistä lähestymistapaa, joka perustuu nykyiseen genomin huomautus.

tutki vielä biologista merkitystä epigeneettisenä hiljentäminen vasta havaituille DNA metylaatio-säännelty miRNA. Me keskityttiin kahteen tärkeitä näkökohtia syövän kehitystä, kasvua ja muuttoliike, ja valittujen miR-941, miR-1237, ja miR-1247 toiminnallinen tutkimuksiin. Kohdunulkoinen ilmentyminen miR-1247 vähensi syöpäsolujen lisääntymistä ja muuttoliike HCT116 ja DLD1 soluja, mikä viittaa siihen, että miR-1247 voi toimia tuumorisuppressorina. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa tehtäviä useita ennusti tavoitteista miR-1247 (https://www.microrna.org). Esimerkiksi Citron (CIT), seriini /treoniini-kinaasi, on läsnä pilkkominen vako ja keskiosalla aikana sytokineesiin ja on välttämätöntä solun abscission [30], [31]. CIT säätelee myös G2 /M siirtyminen rotan hepatosyyteissä [32], ja kaatamalla CIT inhiboivat maksasolusyövän soluihin [33]. Toinen potentiaalinen kohde miR-1247 on FosB, joka dimerisoituu kanssa kesäkuu proteiinin transkription aktivoimiseksi proteaasien mukana kasvain muuttoliike ja invaasion [34]. Lopuksi, transmembraaninen glykoproteiini, ADAM15, voidaan myös kohdistaa miR-1247, helpottaa eturauhassyövän etäpesäkkeiden [35]. Nämä laskennallisesti ennustaa tavoitteet täytyy empiirisesti validoitu tulevaisuudessa.

Mielenkiintoista DKO soluissa, joissa miR-1247 demetyloidaan ja ilmaisi korkeammiksi kuin HCT116-solut, lisäaltistusta miR-1247 matkii ei johtaa laskua solujen kasvun mutta aiheutti heikentynyt muuttoliikettä. Väliset erot fenotyyppien kohdunulkoisen miR-1247 ilmaisun HCT116, DLD1 ja DKO solut voivat heijastaa eri pitoisuuksilla, joilla erillisiä solutoiminnoille moduloi miR-1247. Vaihtoehtoisesti se voi johtua läsnäolosta eri tavoitteita miR-1247 in HCT116 ja DKO soluja. Nämä kaksi vaihtoehtoa edellyttävät lisätutkimuksia selvittämään.

Vaikka differentiaalisesti metyloidut ja ilmaisi miRNA ovat tärkeitä syövän kehityksen, ehdotimme, että jäljellä DNA-metylaation demetyloiduksi olosuhteissa, kuten DKO soluissa, voi myös olla kriittinen. Meidän toiminnallinen tutkimus miR-941 toteen tätä hypoteesia. Huomasimme, että yli-ilmentyminen miR-941 kykeni merkitsevästi estävän solujen vaeltamiseen sekä HCT116 ja DKO solujen sekä lisäksi DLD1 soluissa. Tämä tulos on kohtuullinen ottaen huomioon useita korkea prioriteetti ennustettu tavoitteita miR-941 liittyvät solujen vaeltamiseen. Esimerkiksi matriisi metallopeptidaasi 24 (MMP24) on ennustettu kohde miR-941, ja se helpottaa kudoksen uudelleen ja soluvaelluksen kohdun limakalvon endometrioosi potilaista [36]. Samantyyppinen DNA: n metylaatio-säänneltyjen miRNA jäisi edellisten ilmaisu perustuva lähestymistapa, mutta voisi helposti vallata tutkimuksemme suunnittelu. Kuusi ulos 8 romaani epigeneettiseltä säänneltyjen miRNA tunnistettu tutkimuksessamme säilyttänyt proksimaalisen DNA-metylaation DKO soluissa, jossa 5% genomista DNA metylaatio jätetään verrataan sen vanhempien HCT116-soluissa.

Yhteenvetona lähestymistapamme Tutustu DNA: n metylaatio säädelty miRNA laadittiin useita aiemmin tuntemattomia ehdokkaita. Olemme osoittaneet kautta ektooppinen ilmentyminen ja funktionaalisia määrityksiä, että ainakin kaksi näistä miRNA voi olla erityisen tärkeää syövän etenemiseen. Menetelmämme on hyödyllinen lisä perinteisen lähestymistavan käyttämällä ilmaisua perustuva järjestelmä tunnistaa uusia miRNA vaiennetaan DNA: n metylaatio.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja lääkehoito

Kolorektaalisyöpä solulinjoissa HCT116, DLD1, RKO ja DKO-solujen [25] viljeltiin McCoyn 5A-media (Invitrogen, San Diego, CA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Gibco, Grand Island, NY) 37 ° C: ssa 5% CO

2 ilmakehässä. Solut kerättiin kaapimalla, ja solujen pelletit huuhdottiin kahdesti PBS: llä (Gibco, Grand Island, NY). Kokonais-RNA eristettiin käyttämällä Trizol (Invitrogen, San Diego, CA) uuttaminen mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kokonais-RNA käsiteltiin myös DNaasi I (Roche, Indianapolis, IN) poistamiseksi pieniä määriä jäljellä genomista DNA: ta. Genomi-DNA uutettiin solupelleteistä inkuboimalla pellettien liuoksia, jotka sisältävät 0,5 mg /ml proteinaasi K, 2% SDS: ää, ja 20 mM Tris-HCI: a yli yön 55

oC ravistellen ja sen jälkeen fenoli-kloroformi-uutolla ja etanolisaostuksella. 5-atsa-2′-deoksisytidiini (5-atsa-dC) hoidot, solut ympättiin 5 x 10

5 solua per 100 mm: n malja 24 tuntia, ennen kuin lisättiin 5-atsa-dC (Sigma, St Louis, MO). Soluja käsiteltiin 5 uM 5-atsa-dC 48 tuntia ennen korjuuta.

MBD-eristetty Genomikartoituksen data-analyysi

Genominlaajuiset DNA metylaatio tiedot HCT116 ja DKO solut aiemmin saatuja suorittamalla MBD-eristetty Genomikartoituksen (koontiryhmien) [21]. Raaka sekvensointi lukee voi ladata NCBI Short Read Archive (SRA # SRP001414). Vähimmäismäärä sekvensointi lukee osoittaa huomattavia DNA: n metylaatio signaalit määritettiin edellä kuvatulla tavalla. Selityksin varustetun miRNA (Hg18, NCBI Build 36,1) sijaitsee 500 emäsparia merkittävä DNA: n metylaatio havaittiin ehdokkaiksi myöhemmissä arvioinneissa.

miRNA mikrosiruanalyysi

Microarray-pohjainen miRNA ilmentymisen profilointi tehtiin käyttämällä Illumina ihmisen MicroRNA ilmentymisen profilointi V2 mukainen paneeli valmistajan ohjeiden mukaisesti. Ihmisen v2 miRNA paneeli sisältää 1,146 määrityksiä, havaitsemiseksi ~97%: n miRNA kuvattu miRBase tietokannassa (Sanger miRBase, v9.1, helmikuu 2007 release). Tietojenkäsittely suoritettiin GenomeStudio v2009.1 (Illumina, San Diego, CA). Rinnakkaisessa kokeessa suoritettiin kustakin solulinjasta. Tiedot kunkin kokeen normalisoitiin käyttäen edellä kuvatun menetelmän [37]. Sillä HCT116 versus DKO Vertailun Welchin

t

Testi suoritettiin

p

-arvo sulku 0,05 ja useita testaus korjausta vääriä löytö määrä (FDR). MicroRNA array data (GEO # GSE26819) pääsee Gene Expression Omnibus verkkosivuilla.

bisulfiittimodifiointi sekvensointi

1 ug genomista DNA: ta kustakin näyte bisulfiitti muunnettava EpiTect (Qiagen , GmbH, Hilden) seuraavat valmistajan protokollaa. PCR-olosuhteet ja alukesekvenssit on esitetty taulukossa S3. PCR-amplikonit geelipuhdistettiin ja subkloonattiin pCRII-TOPO-vektoriin (Invitrogen, Carlsbad, CA). Ainakin kahdeksan kloonia satunnaisesti valittu ja sekvensoitiin ABI3730xl DNA analysaattori varmistua metylaation kunkin lokuksen.

havaitseminen kypsiä ja ensisijaisen miRNA ilmaisun kvantitatiivisen RT-PCR

Expression of kypsä miRNA määritettiin käyttäen QuantiTect SYBR Green RT-PCR-kittiä (Qiagen, GmbH, Hilden) ja normalisoitiin endogeenisen U6 snoRNA ilmaisu käyttämällä 2

-ΔΔCt menetelmä [38]. Lyhyesti, 100 ng DNaasi-käsitellyn RNA: ta kustakin näytteestä lisättiin 10 ul: aan 2 x SYBR green PCR master mix, 0,2 ui RT-mix, 200 nM kutakin aluketta, ja RNaasi-vapaata vettä yhteensä 20 ui. Ensisijaiset miRNA ilmaisun GAPDH käytettiin normalisoinnin ohjaus. Ilmaisu Kunkin ensisijaisen miRNA suhteessa GAPDH määritettiin myös käyttämällä 2

-ΔΔCt menetelmällä. Alukesekvenssejä havaitsemiseksi kypsä ja ensisijainen miRNA suunniteltiin aiemmin kuvattu [23], [39] ja taulukossa S3. Keskiarvoa kolmesta kokeissa piirrettiin keskihajonnat edustettuina virhepoikkeamilla.

havaitseminen oletetun vastaanottavan geenin ilmentymisen kvantitatiivinen RT-PCR

Expression of oletetun isäntägeenejä määritettiin käyttäen QuantiTect SYBR Green RT -PCR (Qiagen, GmbH, Hilden) ja normalisoitiin GAPDH sisäisesti. Suhteellinen ilmentyminen sen jälkeen, kun 5-atsa-dC käsittely laskettiin käyttäen 2

-ΔΔCt menetelmällä. RNA uutettiin samalla tavoin kuin edellä on mainittu. Alukesekvenssit on lueteltu taulukossa S3. Keskiarvoa kolmesta kokeita piirrettiin keskihajonnat edustettuina virhepalkkeja.

ektooppinen ilmentyminen miRNA

Yli-ilmentyminen miR-941, miR-1237, ja miR-1247 in HCT116, DKO, ja DLD1 solut saatiin aikaan transfektoimalla soluja 20 nM miRNA duplexes että jäljitteli kypsän miR-941 (MSY0004984, Qiagen), miR-1237 (MSY0005592, Qiagen), ja miR-1247 (MSY0005899, Qiagen). AllStars negatiivinen kontrolli siRNA (+1.027.281, Qiagen) sisällytettiin negatiivisena kontrollina.