Krooninen sairaus

tiivistelmä

aloittaminen, kasvu, uusiutuminen, ja etäpesäke pään ja kaulan okasolusyöpää (HNSCC) ovat olleet käyttäytymiseen liittyvät syövän kantasoluja (CSC), joka voidaan tunnistaa niiden aldehydi-dehydrogenaasi-isoformi-1 (ALDH1) aktiivisuus. Me määrällisesti ja rikastettu ALDH1

+ solujen HNSCC solulinjojen ja myöhemmin ominaista niiden fenotyyppiset ja toiminnalliset ominaisuudet, kuten invaasion kapasiteettia ja epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT). Sferoidiviljelmiä kulttuuri rikastettu CSC viidestä HNSCC solulinjoista jopa 5-kertaiseksi. In sferoidi peräisin olevia soluja (SDC) ja vanhempien yksikerroksista peräisin oleva solulinja ALDH1, CD44, CD24, E-kadheriinin, α-SMA, ja vimentiinin ilmentymistä verrattiin virtaussytometrialla ja immunofluoresenssilla yhdessä proliferaation ja solusyklin analyysi. Invasion aktiivisuus arvioitiin Matrigel määrityksen ja ilmentyminen stemness liittyvien transkriptiotekijöiden (TF) Nanog, Oct3 /4, Sox2 ja EMT liittyviä geenejä Snail1 ja 2, ja Twist reaaliaikaisella PCR: llä. Kaikki solulinjat muodostettiin pallosia, jotka voisivat itse uudistaa ja sarjoittain uudelleen siirrostaa. ALDH1 ilmentyminen oli merkitsevästi korkeampi SDC. ALDH1

+ solut osoittivat lisääntynyttä pesäkkeen muodostumista. Osuus solujen oletetun CSC merkki tähdistö CD44

+ /CD24

– oli erittäin vaihteleva (0,5%: sta 96%) yksikerroksisessa ja sferoidiviljelmiä ja limitetty 0% -33% kanssa CD44

+ /CD24

– /ALDH1

+ solujakeen. SDC oli merkittävästi korkeammat tunkeutuvaa toimintaa. mRNA stemness liittyvien geenien Sox2, Nanog ja Oct3 /4 lisääntyi merkitsevästi SDC kaikista solulinjoissa. Twist oli merkittävästi lisääntynyt kahdessa taas Snail2 kasvoi huomattavasti yhden ja merkittävä väheneminen SDC kahden solulinjoista. SDC oli suurempi G0 vaiheen osuus, osoitti korkean tason ilmentymisen α-SMA ja vimentiinista, mutta laskivat merkittävästi E-kadheriiniekspressiota. HNSCC-linjat satama potentiaali CSC ominaista ALDH1 ja stemness merkki TF ilme sekä ominaisuuksia, kuten invasiivisuus, liikkumattomuus, ja EMT. CSC voidaan rikastaa kiinnittymisestä riippumaton viljelymenetelmiä, jotka voivat olla tärkeitä tutkittaessa niiden vaikutusta terapiassa vastus, kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäkkeitä.

Citation: Chen C, Wei Y, Hummel M, Hoffmann TK, Gross M, Kaufmann AM, et al. (2011) Evidence for epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon in Cancer Kantasolut pään ja kaulan Okasolusyöpä. PLoS ONE 6 (1): e16466. doi: 10,1371 /journal.pone.0016466

Editor: Lin Zhang, University of Pennsylvania, Yhdysvallat

vastaanotettu: 20 syyskuu 2010; Hyväksytty: 20 joulukuu 2010; Julkaistu: 27 tammikuu 2011

Copyright: © 2011 Chen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tutkimus rahoittivat kokonaan rahaa Charité-Universitätsmedizin. Ei ulkoisia rahoituslähteitä tätä tutkimusta käytettiin. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

HNSCC osuus on noin 6% kaikista syöpätapauksista ja noin 650000 uutta tapausta ja 350000 kuolemantapausta maailmanlaajuisesti vuosittain [1], [2], [3]. Ennakot terapiassa ovat parantaneet elämänlaatua, mutta eloonjäämisluvut ovat pysyneet muuttumattomina viime vuosikymmeninä. Kuolleisuus tästä taudista pysyy korkeana, koska kehitys etäispesäkkeitä ja syntyy paikallisen ja systeemisen uusiutumisen kestävät kemo- ja sädehoidon. Siksi on tärkeää kehittää syvempää ymmärrystä biologiaan tämän taudin, jotta voidaan kehittää tehokkaampia terapeuttisia lähestymistapoja.

Evidence on äskettäin kertynyt tukemaan hypoteesia, että kasvaimet sisältävät pienen alapopulaatio soluja kutsutaan syövän kantasoluja solut (CSC), joilla on itseuudistuvien kapasiteetit ja vastaavat kasvaimen huolto- ja etäpesäkkeiden [4]. CD44

+ /CD24

soluissa on ensinnäkin ehdotettu näytteille CSC ominaisuuksia rintasyövän [5].

Myöhemmin CD133 todettiin tunnistaa CSC aivokasvaimia [6], kolorektaalisyövän [7], ja haimakarsinooma [8]. Vuonna HNSCC, Prince et al. Ensimmäinen osoittaneet, että CD44

+ solujen populaatiota sillä on sekä CSC [9], mutta suhteellisen suuri määrä näitä soluja ( 5000 solua) tarvittiin tuottamaan uutta kasvaimia immuunivajaissa hiirillä osoittaa joko matala taajuus CSC tai matala spesifisyys CD44 kuin CSC-markkerina HNSCC. Jälkimmäinen hypoteesia tukee havainto, että CD44s ja CD44v6 ilmaisua ei eroteta normaali peräisin hyvänlaatuisia tai pahanlaatuisia epiteelin pään ja kaulan. CD44s ja CD44v6 olivat täysin läsnä suurimmassa osassa soluja pään ja kaulan kudosten, mukaan lukien karsinoomien [10]. Näin ollen, tunnistaminen tarkempia CSC markkereita HNSCC on toivottavaa. Äskettäin, korkea aldehydidehydrogenaasin 1 (ALDH1, joka tunnetaan myös nimellä ALDH1A1) aktiivisuus osoitettiin tunnistaa CSC HNSCC ja muiden epiteelisyöpien [11], [12], [13], [14], [15]. Kuitenkin rintasyöpää sairastavaa ALDH1

+ väestö näyttää yllättävän pieni päällekkäisyyttä aiemmin kuvattu CD44

+ /CD24

– fenotyyppi vain 0,1-1,2%. Mielenkiintoista on, että rintasyövän soluissa, joissa on molemmat fenotyypit näytti olevan erittäin tuumorigeenisiä olla kykenevä generoimaan kasvaimia jopa vain 20 solua [15]. On vielä määrittää, jos saman fenotyypin rakenteessa kantasolujen HNSCC liittyy samanlainen Tuumorigeenisuustutkimuksissa.

Tarttumattomat alalla määrityksissä käytetään yhä enemmän arvioimaan kantasolujen toimintaa normaalia kudosta ja otaksuttu CSC. Neuropallon on parhaiten tutkittu alalla määrityksessä. Keskushermoston soluja kasvatetaan tarttumattomat pinnat aiheuttavat neuropalloja, joilla on kyky itseuudistumisen ja voi periaatteessa tuottaa kaikki solutyypit aivojen [16], [17]. Kyky toistuva sukupolven neuropallojen yksittäisistä soluista on yleensä pidetty todisteena itseuudistumisen [18]. Äskettäin kuvattiin, että pallomainen peräisin olevia soluja (SDC) päässä gliosarcoma rotan solulinjojen hallussaan CSC kapasiteetti [19]. Toistaiseksi ei tiedetä, sferoidiviljelmiä of HNSCC voivat rikastuttaa CSC.

Normaalit Veren kantasolut kykenevät itse uudistaa ja aiheuttaa kaikille verisolujen tyyppejä. Ne ovat ei- tai erittäin hitaasti jakautuviin soluihin ja oleskella vapaasti luuytimen markkinaraon lepotilassa kunnossa. Kyky säilyttää tämä ei jakamalla kunnossa, tai muita ehtoja, pysyä G0 vaiheessa solusyklin, kutsutaan liikkumattomuus [20]. On ehdotettu, että CSC on monia ominaisuuksia, joilla on normaali kantasoluilla, koska valtaosa heistä tulisi pysyä lepotilassa ja pystyä itse uudistaa. Koska suurin osa syöpälääkkeet kohdistamaan aktiivisesti jakamalla (pyöräily) soluja, lepotilassa CSC pysyvät elossa ja voi olla syynä pahenemisvaiheita ja etenemiseen syövän. Ki-67-antigeenin prototyyppinä solusyklin liittyvät ydinaseiden proteiini, ilmaisemat lisääntyvät solut kaikissa vaiheissa aktiivisen solusyklin (G1, S, G2 ja M-vaiheessa), mutta se puuttuu lepäävät (G0) soluja.

Toinen ominaisuus CSC on suorittaa epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT), tärkeä askel alkionkehityksen aikana [21], [22], [23] ja haavan paranemista [24]. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että geneettiset ohjelmat merkitystä EMT myös lyhytaikaisesti aktivoidaan epiteelisyövissä pelissä rooli syövän etenemisessä, jonka kautta epiteelisyövissä tunkeutuvat kudoksiin ja etäispesäkkeitä. Vaikka EMT ohjelma on välttämätön normaalille kehitys, poikkeava aktivaatio EMT osallistuu erilaisiin patologisia tiloja, kuten fibroosin ja syövän etenemistä [25], [26]. Aikana EMT epiteelisolujen hajottaa solu-solu- ja solu-soluväliaineen yhteyksiä ja siirtyä muihin paikkoihin kehossa [27]. Aikana syövän etenemisessä, EMT näyttää tarjoavan syöpäsolujen kanssa kyky tunkeutua ympäröivään kudokseen ja lopulta metastasoituneet kaukaisiin sivustoja [28]. Viime aikoina on raportoitu, että induktio EMT vuonna eriytetty ikuisti ihmisen maitorauhasen epiteelisolujen johti hankinta CD44

+ /CD24

– kantasolujen fenotyyppi [29]. Lisäksi kävi ilmi, että näiden oletettujen CD44

+ /CD24

– CSC eristetty neoplastisten ihmisen rintakudosten ilmensivät runsaita mRNA-tasot, jotka koodaavat EMT liittyvää markkereita Snail1 (SNA), Snail2, ja Twist. Pahanlaatuisia kasvaimia koostuvat syöpäsolujen ja kasvaimeen liittyvien isäntäsoluja, joista jälkimmäinen houkutella enemmän kiinnostusta viime aikoina, koska heidän osallistumisensa kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden, ja hoitovaste [30], [31]. Myofibroblasteja ovat tärkeimmät komponentit kasvaimen strooman. Kuitenkin alkuperä näiden solujen on edelleen kiistanalainen toistaiseksi. Ilmaisu alfa-sileän lihaksen aktiini (α-SMA) pidetään markkeri täysin eriytetty myofibroblasteja. Kehittyvät näyttöä siitä, että myofibroblasteja voidaan johtaa epiteelin (kasvain) solut kautta EMT [32], [33]. Tätä käsitystä tukee se havainto, että pienikokoinen pallosia muodostama munasarjasyöpäsoluja vesivatsanes- näyttö supistuvien käyttäytymistä, omaavat suuren hyökkääviä kapasiteetin in vitro ja ilmaus α-SMA, joka liittyy myös suuren supistuvien kapasiteetin [34].

Tässä työssä, testasimme jos kiinnittymisestä riippumaton soluviljelytekniikoilla mahdollistavat sukupolven pallomainen-viljelmistä, ja jos nämä viljelmät rikastettiin solujen toiminnallisia ja fenotyyppiset ominaisuudet kuvaavat CSC of HNSCC. Täällä tarjoamme todisteita siitä, että myofibroblasteja voidaan johtaa HNSCC käyttämällä pallomaista soluviljelymalli joka rikastuttaa CSC kaltaisia ​​soluja ominaista suuri osuus ALDH1 positiivisuus, proliferatiivinen liikkumattomuus, ja invasiivisia kapasiteettia.

Tulokset

HNSCC solulinjat sisältävät solut itseuudistuvien valmiuksia, jotka muodostavat kasvain pallosia

useita erilaisia ​​lähestymistapoja on käytetty tunnistamaan CSC. Strategia käytetty kokeissa oli in vitro pallomainen pesäkemuodostusta menetelmällä. Tutkimme mahdollisuutta viiden HNSCC solulinjat (UD-SCC1, UT-SCC22, UM-SCC11B, UT-SCC9, UT-SCC24A) kasvaa ankkurointi itsenäisesti sferoidiviljelmiä-viljelmiä. Solut maljattiin tiheydellä 20000 /ml. Sen jälkeen kun in vitro viljelmässä 5-10 päivää seerumittomassa väliaineessa tarttumattomat olosuhteissa, kaikki tutkitut solulinjat muodostetaan pallosia, jotka vaihtelevat 50-500 solua per pallonen (kuvio 1A). Itsestään uusimisesta kapasiteetti näiden kasvainten pallosia arvioitiin käyttäen julkaiseman menetelmän Ghods et al [19]. Lyhyesti, sferoidit kerättiin ja hajotetaan yksittäisten solujen suspensioksi, joka myöhemmin maljattiin klonaalinen tiheydellä 1000 solua per ml. Kasvaimen subspheroids vaihtelevat 20-40 solut olivat nähtävissä sen jälkeen, kun 10 to14 päivää (kuvio 1 B, C). Sen sijaan vanhempien yksikerroksista soluviljelmissä kasvatettu samoissa olosuhteissa ei pallosten muodostamiseksi, jos pinnoitettu tällä matalalla pitoisuus jopa 21 päivän jälkeen. Kun pallojen siirrettiin takaisin säännöllisesti kudosviljelypullossa päällystetty yksikerroksista soluviljelmässä, pallojen kiinni pulloon ja solut kasvoivat ulos pallomainen ja muodostivat yksisolukerroksena. Fenotyyppi nämä solut oli identtinen emo-solulinjojen (kuvio 1 D).

edustaja kuvia solulinjan UD-SCC1 on esitetty. (A) Ensimmäisen sukupolven pallosia. (B) subspheroid muodostettu ymppäyksen jälkeen pitoisuutena 1000 solua /ml. (C) sferoidi muodostettu 21. sukupolvi. (D) Sferoidiviljelmiä kiinni ja kasvava yhtenäisiksi jälkeen jatkomaljausta pulloihin päällystetty kudosviljelmässä. (E) Emäsolulinja kasvanut pysyvästi kuin yksikerrosviljelmään.

fenotyyppinen karakterisointi SDC

Ilmaisu oletetun kantasolujen markkeri ALDH1 SDC ja vastaavat vanhempien yksikerroksista solulinja jota käytettiin verrokkina verrattiin CD44

+ /CD24

– ilmentävät väestöä monivärinen FACS-analyysi.

Mielenkiintoista, kaikki SDC oli lisääntynyt määrä ALDH1 positiivisten solujen verrattuna vanhempien solulinjoja (kuvio 2). Suurin osa ALDH1

+ soluja havaittiin pallosia syntyvät UD-SSC1 solulinja (46,4 ± 8,1%), joka oli 5 kertaa suurempi kuin vastaava emosolulinjassa (9,4 ± 5,3%).

(A) edustaja FACS-analyysi kahden solulinjan jälkeen Aldefluor värjäystä. Vertailu taajuuksien ALDH1 positiivisten solujen yksikerroksisessa SDC ja DEAB valvontaa. DEAB on spesifinen inhibiittori ALDH1. (B) Tulokset edustavat ilmentymisen ALDH1 soluissa, jotka ovat peräisin sferoidiviljelmiä (suojattu pylväät) verrattuna yksikerrossoluissa (avoimet pylväät). ALDH1 ilmentyminen SDC on yleensä huomattavasti parannettu (A, B). UD-SCC22, UT-SCC24A, ja UM-SCC11B näytetään osittainen mesenkymaaliset fenotyyppi on jo suhteellisen korkea ALDH1 ilmentyminen vanhempien solulinjoissa. (** P 0,01, * p 0,05).

kasvainsoluista, joilla on CD44

+ /CD24

– fenotyyppi osoitettiin olevan CSC ominaisuuksia erilaisia ​​kiinteitä kasvaimia [4]. Siksi myös tutkittu verrattain CD44 ja CD24 ilmentyminen HNSCC solulinjoissa ja totesi, että osuus CD44

+ /CD24

– soluja on erittäin vaihteleva (0,5-97%). Päällekkäisyys ALDH1

+ soluja oli pieni (0-2,2%) lukuun ottamatta kahta solulinjoista UM-SCC11B ja UT-SCC22 joka oli päällekkäisyyttä noin 33% ja oli koostuu yli 95% CD44

+ /CD24

– soluja. Mielenkiintoista, osuus CD44

+ /CD24

– soluja ei johdonmukaisesti rikastaa pallomainen kulttuuri menetelmää (taulukko 1). Tämä tulos nosti esiin kysymyksen siitä, miten hyvin ALDH1 soveltuu tunnistamiseen solujen CSC ominaisuuksia HNSCC. Lähestyä tätä kysymystä, ALDH1 positiivisia ja negatiivisia soluja palloset syntyvät solulinjojen UT-SCC9 ja UD-SCC1 erotettiin FACS lajittelua. Myöhemmin niiden kykyä pesäkemuodostusta arvioitiin. UT-SCC9 ja UD-SCC1 valittiin, koska verrattuna muihin solulinjoihin ne tuotetaan enemmän sferoidit suurempi rikastuminen ALDH1

+ soluja. Tiedot osoittavat, että ALDH1

+ solut voivat muodostaa 3-4 kertaa enemmän klooneja kuin ALDH1

– soluja (kuvio 3). Valomikroskooppinen havainto 2 viikon kuluttua osoitti, että kloonit muodostama ALDH1

+ solujen keskimäärin sisälsivät 197 (197 ± 47) soluja verrattuna 33 (33 ± 16) solujen klooneja syntyvät ALDH1

– soluja (p 0.01). Tuloksemme osoittavat myös, että yksittäinen ALDH1

+ solut voivat huomattavasti parempi regeneroida sferoidin käynneistä riippumaton kulttuuri seerumia täydennetty bFGF ja EGF (UT-SCC9: 17,1%, UD-SCC1: 19,3%), kun taas samoissa olosuhteissa yhden ALDH1

– soluja regeneroidaan vain yhdessä tapauksessa sferoidin. (Taulukko 2, kuvio S1).

Kaksi tuhatta ALDH1-lajitellut solut ympättiin ja sen jälkeen 14 päivää, pesäkkeet, jotka muodostivat kvantitoitiin. ALDH1

+ alaryhmän UD-SCC1 ja UT-SCC9 solulinjoilla on suurempi klooni muodostumisen hyötysuhde verrattuna ALDH1

– alaryhmässä (** p 0,01).

Yhteenvetona, SDC tuotettu HNSCC linjat ilmentävät korkeita oletetun CSC markkeri ALDH1, muodostaa merkittävästi enemmän klooneja, jotka myös merkittävästi elvyttää useammin osaksi palloset sitten ALDH1

– soluja ja on vaihteleva päällekkäin CD44

+ /CD24

– väestöstä.

SDC osoittavat lisääntynyt valtaavat kapasiteetti in vitro

Keski määrittelyyn CSC on kyky aloittaa ja ajaa kasvua primaarikasvaimen ja hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden. Läheinen suhde prosentuaalinen solujen CSC fenotyyppi (CD44

+ /CD24

-) in primaarikasvaimen ja kehittäminen etäpesäkkeiden rintasyövän äskettäin raportoitu [35]. Myös osoitus metastaattista potentiaalia solujen CSC-fenotyyppi rintasyövän peräisin havainnosta, että rintasyövän soluja havaitaan luuytimessä pääasiassa osoitti tämän fenotyypin [36].

Samalla tavalla tähän havaintoon, me kysytään CSC johdettu of sferoidiviljelmiä of HNSCC näyttää vastaavan invasiivisen potentiaali. Käyttämällä Matrigel hyökkäyksen kammio, vertasimme hyökkääviä solujen kapasiteetin joko esille sferoidiviljelmiä tai yksikerrosviljelmän. SDC kaikista viidestä testattu solulinjoissa oli merkitsevästi lisääntynyt tunkeutuvat kapasiteetti 2,1-8,6 kertaiseksi yli lapsilukko (kuva 4).

matrigeelin invaasio kammioita käytettiin vertaamaan hyökkääviä kapasiteetti solujen välillä johdettu pallosia (haudottu pylväät) tai yksikerroksista (avoimet pylväät). SDC kaikista solulinjoista Tutkituilla korkeampi hyökkääviä aktiivisuus in vitro kuin yksikerroksisiin peräisin olevat solut. (** P 0,01, * p 0,05).

yli-ilmentyminen stemness liittyvien geenien SDC

Kerrottiin, että Oct4, Sox2, ja Nanog, jotka muodostavat itse järjestänyt ydin transkriptiotekijöiden (TF), ylläpitää pluripotenttisuus ja itseuudistumisen ihmisalkion kantasolujen [37], [38]. Halusimme tietää, jos CSC myös jakaa tämän piirteen TF ilmaisun kanssa alkion kantasoluja (ES). Tätä tarkoitusta varten olemme kvantitatiivisesti verrattiin mRNA-ekspressiota näiden TF välillä SDC ja vanhempien yksisolukerroksen peräisin olevat solut. Huomasimme, että mRNA tasot Oct3 /4, Sox2, ja Nanog olivat kaikki merkittävästi lisääntynyt SDC. Suurinta kasvu havaittiin UT-SCC22, jossa 52-kertainen Sox2 ekspressio havaittiin pallosia. Pienin muutos havaittiin UT-SCC9, jossa 1,23-kertainen Oct3 /4 ekspressio havaittiin pallosia. Avain TF mukana EMT, Snail1 oli myös merkitsevästi lisääntynyt kaikissa SDC syntyvät viiden eri HNSCC solulinjoissa. Mielenkiintoista, kaksi muuta TF mukana EMT, Snail2 ja Twist, osoitti ilmentämiskuviota mukaisesti CD24 tila. In UD-SCC1, UT-SCC9, ja UT-SCC24A jossa useimmat solut ovat CD44

+ /CD24

+ -ohjelmasta Snail2 supistui pallosia kun Twist ei ollut merkittävää muutosta. Kuitenkin UT-SSC22 ja UM-SCC11B, jotka koostuvat yli 95% CD44

+ /CD24

– soluja Snail2 ja Twist, osoittivat merkittävää kasvua (kuvio 5). Nämä havainnot ymmärtää, että Snail2 ja Twist ilmentymisen taso oli verrannollinen CD24 fenotyypin.

Lähetti-RNA eristettiin sferoideina ja yksikerrosviljelmiä kvantitoitiin ekspressiota varten ilmoitettu TF. Suhde ilmaisun sferoidiviljelmiä ja yksikerrossoluissa annetaan. Merkittävät erot olivat * p 0,05; ** P 0,01. MRNA taso stemness liittyvien TF Nanog, Oct3 /4, ja Sox2 korotettiin huomattavasti vuonna pallosia. Avain TF EMT Snail1 lisääntyi myös kaikissa pallosia mutta toiset kaksi TF mukana EMT, Snail2 ja Twist, osoittivat ekspressiokuviota riippuen CD44 /CD24 tilan.

SDC ovat lepotilassa kuin vanhemman yksikerroksisen johdettuja kollegansa

solusyklin analyysi FACS, solulinjat UT-SCC24A, UT-SCC9, UD-SCC1, UT-SCC22, ja UM-SCC11B kasvatettu sferoidiviljelmiä tai yksikerrosviljelmän värjättiin Ki-67-FITC ja DNA vastavärjättiin propidiumjodidilla. Solut asuvat G1 /G0 huippu, jotka olivat negatiivisia Ki-67 värjäys pidettiin olevan lepotilassa jae (G0 vaihe). Kaikissa solulinjoissa, osuus solujen G0 vaiheessa osoitti erittäin merkittävän kasvun SDC, mikä osoittaa, että SDC sisältävät suuremman osuuden lepotilassa olevat solut kuin vanhempien yksisolukerroksen peräisin olevia soluja (kuvio 6).

(A ) Kaksoisvärjäys Ki-67 ja propidiumjodidilla mittaamiseksi leviämisen ja solujen DNA sisältöä. Yhden solut eroteltiin FL2-W ja FL2-A. DNA: n määrä ja Ki-67-ekspressio arvioitiin virtaussytometrialla analysointia. (B) taajuudet lepotilassa solujen SDC kuin verrattuna yksikerroksista peräisin olevat solut. Kaikissa tapauksissa solut, jotka ovat peräisin sferoidit sisältävät erittäin merkittävä suurempi osa lepotilassa (G0) soluja. (** P 0,01).

alapopulaatio solujen pallosia ovat saaneet piirteitä myofibroblasteja ja mahdollisesti läpikäyneet EMT

myofibroblasteja ovat komponentteja kasvaimen strooman ja voi olla rooli rakennettaessa CSC-markkinarako, joka voi auttaa säilyttämään stemness CSC. Kuitenkin alkuperä näiden solujen edelleen tuntematon. Myofibroblasteja tuottaa useita tekijöitä, jotka voivat stimuloida syöpäsoluja ja helpottaa tunkeutumista kudoksen. Kirjallisuudessa, tarttumaton pallosia syntyy syövän solulinjat on osoitettu sisältävän oletetun CSC. Nämä palloset voidaan ylläpitää viljelmässä pitkiä aikoja, mikä tarkoittaa, että palloset voivat tarjota kapealla sopii ylläpitoon ja kasvuun CSC. Siksi kysyimme i) myofibroblasteja olemassa kapealla luoma palloset, ii) nämä myofibroblasteja peräisin epiteelikasvainsolut kautta EMT, ja iii) on olemassa viitteitä siitä, että tämä prosessi on palautuva?

Ongelman asia, tutkimme ilmaus myofibroblastin merkkiaineiden vimentiinista ja α-SMA SDC 3 solulinjoja, jotka ovat eri ALDH1 ekspressiotasot yksikerrosviljelmässä (low: UD-SCC1: 9,4 ± 5,3%, väliaine: UT-SCC22: 16,9 ± 4,1 %, korkea: UT-SCC24A: 25,8 ± 3,0%). Olemme havainneet, että eri solulinjojen ja SDC syntyvät näistä solulinjoista vaihtelevaa ilmentävien solujen osuus vimentiinista ja α-SMA (taulukko 3). UD-SCC1 ei osoittanut α-SMA ilmentäviä soluja ja heikkoa (12,5 ± 2,5%) vimentiinista ilmentyminen solujen yksikerrosviljelmässä. Sen sijaan, UT-SCC24A (kuvio 7) ja UT-SCC22 yksisolukerroksen peräisin olevia soluja oli suhteellisen korkealla taajuudella ja vimentiinin ja α-SMA ilmentävien solujen mikä osoittaa, että näissä solulinjoissa on sekä epiteeli- ja mesenkymaalisten ominaisuudet. Mielenkiintoista on, että nämä kaksi solulinjaa on suhteellisen suuri osuus solujen yksikerrosviljelmiä, jotka ovat ALDH1 positiivinen (taulukko 3). Kuitenkin, kuten sferoidiviljelmiä, kaikki solulinjat sisälsivät enemmän α-SMA ja vimentiinista positiivisia soluja kuin vastaava vanhempien yksikerroksista solulinjoissa.

(A) immunofluoresenssi yksikerroksisen (A1-3 ja B1-3) ja pallomainen (C1-3 ja D1-3) kulttuurien UT-SCC24A vasta-aineiden kanssa α-SMA (vihreä) ja vimentiinista (punainen). Kaikki SDC (paneeli C ja D) osoittavat korkeita mesenkymaaliseen merkkiaineiden α-SMA ja vimentiinista verrattuna niiden yksikerroksista kollegansa. (B) E-kadheriiniekspressiota analyysi FACS. Verrattuna niiden yksikerroksista kollegansa, pallosia osoitti väheni E-kadheriiniekspressiota; kahden populaation peräisin olevien solujen UT-SSC24A voidaan erottaa mukaan E-kadheriiniekspressiota tasolla, mikä osoittaa, että SDC ovat saaneet myofibroblastin ominaisuudet EMT.

EMT on myös mukana menetys solu-solu kontakteja epiteelisolujen ominaista alas-säätely E-kadheriiniekspressiota. Määrä E-kadheriini ilmentävien solujen SDC ja yksisolukerroksista kvantitoitiin FACS (kuvio 7, taulukko 3). SDC osoitti huomattavasti osuudet E-kadheriinin negatiivinen alhaisen ilmentävien solujen verrattuna niiden yksikerroksista johdettuja kollegansa, mikä osoittaa menetys solujen kiinnittyminen tässä alaryhmässä.

Lopuksi testasimme myös uudelleen tarttumista pallosia ja kulttuuri muovia. Mielenkiintoista on, kun palloset kiinnitetty pulloon ja alkoi kasvaa ulos yhtenä kerroksena kulttuuri, α-SMA ja vimentiinin aleni, ja suurin osa soluista, jotka kasvoivat ulos palloset värjättiin negatiivisesti näiden kahden merkin (kuvio 8).

(A-C) Light-mikroskooppisen kuvia, joissa vaihekontrasti muodossa UD-SCC1 pallosia reattaching kattamaan liukuu prosessin aikana uudelleen kasvun yksikerroksinen fenotyypin. (A) 24 tunnin kuluttua kiinnityksen, jotkut karamaisen solut kasvavat ulos noudatetaan pallosia. (B) 72 tunnin kuluttua uudelleenkiinnitys useimmat liitteenä solujen muoto näyttää heidän vanhempien yksikerroksista vastine (C). (D-E) Epäsuorat immunofluoresenssivärjäyksen of reattached pallosia 24 tunnin jälkeen värjättiin DAPI (D1, E1), α-SMA (D2, vihreä), ja vimentiinistä (E2, punainen). Kuvat D3 ja E3 esittävät peitettä tumavärjäystä. Nuolet kuvaavat outgrowing soluja säteili pallomainen. Ekspression α-SMA ja vimentiinin laski outgrowing soluissa (nuolet) sen jälkeen, kun kiinnityksen ja suurin osa värjäytyminen rajoittui pallosia, kun taas suurin osa soluista kasvatettujen sferoidit olivat värjäämättä.

Keskustelu

tuumoribiologiassa monia yrityksiä on tehty selittää alkion kaltaisia ​​piirteitä transformoitujen syöpäsoluja. Kyky CSC rakentaa kasvaimen yhteen soluun voi selittää monia eroja, jotka syrjivät syöpäsolujen eriytetty somaattisten solujen kuten kuolemattomia, liikkumattomuus, invaasio johtavat etäpesäkkeiden ja uusiutumisen hoidon jälkeen. Prince ja työtovereiden [9], osoitti, että pieni populaatio CD44

+ HNSCC-soluilla CSC ominaisuudet, jotka voivat aiheuttaa uusia kasvaimia in vivo (≈5,000 solut ruiskutetaan). Mack ja työtovereiden kyseenalaiseksi käyttö CD44 erityisenä CSC markkeri HNSCC koska CD44 oli runsaasti ilmaistu useimmissa kasvainsoluissa kuluessa HNSCC (60% -100%), joten niitä ei voida käyttää erottamaan normaalin peräisin hyvänlaatuisia tai pahanlaatuisia epiteelin pään ja niska [10]. ALDH1 äskettäin osoitettu olevan sopivampi markkerin tunnistamiseksi oletetun CSC on HNSCC ja muiden epiteelisyöpien [11], [12], [13], [14], [15]. Vuonna HNSCC, Chen et al osoittivat, että 3000 ALDH1

+ HNSCC soluja viisi potilasta ksenotransplantaatio hiirille aiheutti kaikissa tapauksissa sukupolven silmin havaittavat kasvaimet 6 viikkoa injektion jälkeen, kun taas 10

4 ALDH1

– soluja epäonnistui tuottaa kasvaimia. [12], [39]. Kuvaamme menetelmän leviämistä ja rikastaminen ALDH1

+ soluviljelmissä HNSCC solulinjoissa. Kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia nämä solut analysoitiin vertaamalla pinta-antigeenin ilmentymistä ja ilmentymistä sikiön TF sekä toiminnalliset ominaisuudet vanhempien yksikerroksista solulinjat. Havainto, että sferoidiviljelmiä-viljelmät eivät muodostu homogeenista solupopulaation laukaisi lisäksi subanalyses että paljasti solupopulaation kanssa ilmentymisen EMT-markkereita. Tämä saattaa tarkoittaa, että näissä soluissa on aktivoitu EMT-ohjelman ja osoittaa mahdollisesti läheinen suhde CSC ja solujen aktivoitu EMT-ohjelma, joka on saattanut peräisin CSC.

Pallot ovat kolmiulotteisia (pallomainen) klusterit tuumorisolujen kasvanut yhden tai useamman solun klooneja. Verrattuna soluun kaksinkertaistaa kertaa mitattu yksikerrosviljelmässä, nopeus ja rakenteessa pallomainen kasvun in vitro sopivammille että havaitut kasvaimiin in vivo [40]. Anchorage riippumaton kasvu on osoitettu olevan kiinteistön yhteinen normaalia kudosta soluja, jotka osoittavat kantasolujen ominaisuuksia [41]. Myös CSC johdettu melanooma [42], rintasyövän [43], ja gliosarcoma [19] pystyivät olemaan lisätyistä ankkurointi itsenäisesti ja näyttää fenotyypin tarttumaton pallosia.

Kuten esimerkkinä rintasyövässä esimerkiksi otaksuttu CSC (CD44

+ /CD24

-) voidaan rikastaa in vitro eristämällä mammospheres päässä suspensioviljelmissä [43], [44]. Tutkimuksessamme löysimme taajuus CD44

+ /CD24

– soluja HNSCC linjat olevan erittäin vaihteleva (0,5%: sta 97%). Lisäksi, he eivät voi rikastua pallomainen kulttuuriin. Sen sijaan, ALDH1 positiivisia soluja havaittiin olevan hyvin rikastettu sferoidiviljelmiä kaikkien viiden HNSCC solulinjoissa. Jos ympättiin hyvin alhaisella densitiy,, FACS-lajiteltu ALDH1

+ solut muodostivat merkitsevästi enemmän pesäkkeitä sitten ALDH

– väestö, mikä osoittaa suuremman proliferatiivisen kapasiteetin tämän alaryhmän. Toiset ovat osoittaneet, että ALDH1

+ tai ALDH1

+ /CD44

+ /CD24

– solupopulaatioiden eristetty HNSCC-potilailla on suurempi Tuumorigeenisuustutkimuksissa sitten ALDH1

– soluja, vaikka ne olivat CD44

+24

– jos ksenotransplantaatio hiirillä [12].

Syöpä ja normaalit kantasolujen (SC) jakaa proliferatiivisia ominaisuuksia itseuudistumisen, liikkumattomuus ja ilmaus keskeisten transkriptiotekijöiden (TF ). Chickarmane et ai. [45] perustettu tietokone-malli kuvaamaan keskeiset transkriptiotekijä yhdistelmiä SC ja määritellään korkea Oct3 /4, Sox2, ja Nanog. Toisaalta, Ji et ai. [46] verrattuna roolia Oct3 /4 ja Nanog transformoiduissa (t-hPSCs), ja normaalin ihmisen pluripotenttien kantasolujen (hPSCs). Toisin kuin tavalliset SC, itseuudistumisen ja selviytymistä t-hPSCs havaittiin olevan riippumattomia Oct3 /4 ilme. Sitä vastoin geneettinen knockdovvn Nanog aiheutti täydellinen menetys itseuudistumisen samanaikaisesti apoptoosin t-hPSCs. Tutkimuksessamme ilmaus Oct3 /4, Sox2, ja Nanog oli säädellään ylöspäin SDC viiden HNSCC solulinjat. Tämä tarkoittaa, että SDC voi olla kantasolujen ominaisuuksia.

Tutkimukset käsittelevät geeniekspressioprofilointi käyttäen in vivo invasiivisia soluja tai meneillään EMT in vitro paljasti siirtyminen proliferatiivista ja invasiivisen fenotyypin. Yhteisymmärryksessä tähän havaintoon, solulisäkasvumäärityk- markkeri Ki-67 on osoitettu merkitä vain pieni vähemmistö solujen leviämisrintamassa verrattuna eriytetympien keskiosassa kasvain, mikä viittaa siihen, että proliferoimattomissa syöpäsolujen karannut kasvain massa voi olla metastaattinen potentiaali [47]. Tutkimuksessamme havaitsimme, että SDC oli suurempi osuus Ki-67-negatiiviset solut verrattuna vastaavaan yksikerrosviljelyissä. Tämä osoittaa, että SDC ovat lepotilassa kuin solut, jotka ovat peräisin yksikerroksen. Olemme myös havainneet, että SDC on suurentunut invaasio kapasiteettia, mikä merkitsee sitä, että nämä solut voivat olla korkeampi kyky etäispesäkkeitä.

myofibroblasteja ovat eräänlainen mesenkyymisolun keskeinen rooli kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden ja hoitovasteen. Ne voivat tuottaa useita tekijöitä, jotka voivat stimuloida syöpäsolujen lisääntymistä ja helpottaa niiden tunkeutuminen [31]. Kuitenkin alkuperä näiden myofibroblasteja ei ole selvä. EMT on raportoitu tärkeä rooli käynnistämisessä CSC [29]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että myofibroblastin kaltaisia ​​soluja ovat alapopulaatio SDC. Nämä sferoidia peräisin yksinomaan kloonatuista syöpäsoluja. Näin ollen voidaan päätellä, että myofibroblasteja voi syntyä ainoastaan ​​epiteelisyöpäsolujen muuttamalla epiteelin on mesenkymaaliset fenotyypin avulla EMT. Vielä tärkeämpää on, kuten huomasimme, että yli 90% SDC värjättyä positiivisia α-SMA ja vimentiinista vaikka prosenttiosuus ALDH1

+ solujen vaihteli 37%: sta 46,4%. Merkittävä väheneminen E-kadheriiniekspressiota voitiin osoittaa SDC, mikä osoittaa vähennystä solu-solu kosketuksiin in sferoidiviljelmiä. Nämä merkki ilmaisut olivat palautuvia viljelyolosuhteissa, joissa pallosia voisivat sitoutua ja solut kasvoivat säteittäin ulos muodostamaan yksikerroksinen.