Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on yleisin maligniteetti ja johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti. Vaikka tupakointi on ylivoimaisesti suurin syy keuhkosyövän, muut ympäristötekijät ja geneettiset tekijät vaikuttavat kehittymistä ja etenemistä syöpä. Koska ainutlaatuinen mutaatiot kuviot on havaittu yksittäisissä syöpänäytteissä, tunnistamiseen ja erottuva keuhkosyöpä molekyyliprofiilin on välttämätöntä kehittää tehokkaampia, räätälöityjä hoitoja. Viime aikoihin asti, henkilökohtainen DNA sekvensointi tunnistaa geneettisiä mutaatioita syöpä oli epäkäytännöllistä ja kallista. Viimeaikainen teknologinen edistys seuraavan sukupolven DNA sekvensointi, kuten puolijohde-pohjainen Ion Torrent sekvensointialustamme, on tehnyt DNA: n sekvensointi kustannuksia ja aikaa tehokas luotettavampia tuloksia. Käyttämällä Ion Torrent Ampliseq Cancer Panel, sekvensoimme 737 loci 45 syöpään liittyvien geenien tunnistamiseen geneettisiä mutaatioita 76 ihmisen keuhkosyövän näytteitä. Sekvensointi analyysi paljasti missense mutaatioiden KRAS, EGFR, ja TP53 geenien rintasyövän näytteitä eri histologisia tyyppejä. Näin ollen tämä tutkimus osoittaa, että on välttämätöntä sekvensoimalla yksittäisten ihmisen syövissä, jotta voidaan kehittää yksilöllisiä lääkkeitä tai yhdistelmähoidot tehokkaasti kohdistaa yksittäisiä, rintasyöpä-mutaatioita.

Citation: Cai X, Sheng J, Tang C, Nandakumar V, Ye H, Ji H, et al. (2014) Usein Mutaatiot EGFR, KRAS ja TP53 Geenit Human Lung Cancer Kasvain tunnistanut Ion Torrent DNA Sequencing. PLoS ONE 9 (4): e95228. doi: 10,1371 /journal.pone.0095228

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 25 heinäkuu 2013; Hyväksytty 25 maaliskuuta 2014; Julkaistu 23. huhtikuuta 2014

Copyright: © 2014 Cai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China, Wu Jieping Foundation, ja National Institute of Health (R01 CA90427 R01 AI084811 SY Chen). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Chuanning Tang Hua Ye, Feng Lou, Dandan Zhang, Hong Sun, Haichao Dong , Guangchun Zhang, Zhiyuan Liu, Zhishou Dong, Baishuai Guo, hän Yan, Chaowei Yan, Lum Wang, Ziyi Su, ja Yangyang Li ovat työntekijöitä San Valley Biotechnology, Inc. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS One politiikan jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Keuhkosyöpä on yleisin maligniteetti maailmanlaajuisesti ja myös suurin syy syöpään liittyvät kuolemat. Vuonna 2008 arviolta 1610000 uusia tapauksia on raportoitu maailmanlaajuisesti, osuus 12,7% kaikista uusista syöpätapauksista [1]. Lisäksi noin 1,38 miljoonaa kuolemantapausta (18,2% kaikista syöpäkuolemista) on raportoitu ympäri maailmaa [2]. Kiinassa, keuhkosyöpä on korkein esiintyvyys kaikista uusista syöpätapauksista sekä miehillä että naisilla (21,7% vuonna 2008), joissa on enemmän kuin 24,9% kuolleisuus [2]. Naiset Kiinassa raportoitu vain hieman useammin keuhkosyövän yli rintasyövän tänä samana vuonna; kuitenkin, kuolleisuus keuhkosyöpään on yli 3 kertaa suurempi kuin rintasyövän (20,2% vs. 6,1%, vastaavasti) [2]. Keuhkosyöpä usein on epäspesifistä oireita, ja diagnoosi usein tapahtuu myöhäisessä vaiheessa tai sen jälkeen, etäpesäkkeitä on jo tapahtunut [3]. Vaikka pyrkimyksiä edelleen parantaa varhainen diagnoosi ja hoito keuhkosyövän, huikea esiintyvyys, huono ennuste, ja huomattava kuolleisuus vallitsee.

suurin syy keuhkosyöpään on tupakointi, ja suurentunutta on suoraan korreloi lisääntynyt riski sairastua keuhkosyöpään [4]. 85-90% keuhkosyöpäkuolemista liittyy tupakointi, ja tupakoijilla ovat 15 kertaa suurempi todennäköisyys kuolla keuhkosyöpään kuin koskaan tupakoineet [5]. On olemassa kaksi päätyyppiä keuhkosyöpään: ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC) ja pienisoluinen keuhkosyöpä (SCLC). NSCLC, mikä muodostaa noin 85% kaikista keuhkosyövässä, voidaan edelleen jakaa kolmeen suureen histologinen alatyyppiä: squamous-cell carcinoma (SCC), adenokarsinooma, ja suuret keuhkosyöpä. Vaikka tupakointi voi johtua kaikenlaisen keuhkosyöpään, se on yleisimmin liitetty SCLC ja SCC. Koskaan tupakoimattomilla, toisaalta, ovat yleisimmin diagnosoitu adenokarsinooma [3], [5]. Mielenkiintoista, vain 10-24% tupakoitsijoista keuhkosyövän, mikä osoittaa, kuinka tärkeää on muiden ympäristötekijöiden ja yksittäisten geneettisten tekijöiden [6], [7]. Sen lisäksi tupakansavun muiden etiologic aineet ja riskitekijöitä on tunnistettu, kuten ammatti, altistuminen tupakansavulle, asbesti, radon, ja ilman saastumista, lisäksi perinnölliset tekijät [8] – [10]. Noin 10-15% keuhkosyövässä syntyy potilailla, jotka ilmoittavat Ei koskaan tupakoinut ja näiden syöpien tehdä itsestään kertyminen geneettisten ja epigeneettiset muutokset [5].

Huolimatta jatkuvasti kehittämään seulontaa ja keuhko- syöpiä, ennuste potilaiden useimpien keuhkosyöpään edelleen huono [3]. Koska geneettisten ja ympäristötekijöiden aiheuttaa keuhkosyöpää vaihtelevat suuresti, kunkin kasvaimen on potentiaalia omaavat ainutlaatuisen geenimutaatio profiili. Sinänsä kertyvät näyttöä siitä, että yksilöllisiä, räätälöityjä hoitoja ovat välttämättömiä tehokasta hoitoa vastaan ​​keuhkosyövässä. Tämä voidaan suorittaa profilointi yksilön syövän genomin jotta leikellä onkogeenisen mekanismeja, jotka säätelevät syövän etenemistä. Äskettäin uusi tekniikka perustuu puolijohde sekvensointi kutsutaan Ion Torrent sekvensointi [11] ratkoo monia kysymyksiä, jotka liittyvät muihin sekvensointimenetelmiin eli rahaa, aikaa, ja yleinen käytännöllisyys yksilöllisten Genomikartoituksen. Tässä tutkimuksessa olemme käyttäneet Ion Torrent sekvensointi analysoida 76 kliinistä keuhkosyöpä näytteiden geneettisen mutaatioiden 737 loci 45 tunnettujen syöpään liittyvien geenien.

Tulokset

Mutaatio analyysi Ihmisen keuhkosyöpä kasvaimia Ion Ampliseq Cancer Panel

yhteensä 76 keuhkosyöpä näytteet (taulukko 1) analysoitiin Ion Torrent Ampliseq Cancer Panel mutaatioiden tunnistamiseksi 737 loci 45 onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille ihmisen keuhkosyöpätapauksista . Nämä Keuhkosyöpä näytteet olivat kaikki kiinalaiset potilaat vaihtelevat 28-80 vuotta vanha edustaa 40 miestä, joiden keski-ikä oli 62 vuotta ja 36 naista, joiden keski-ikä 59 vuotta.

sekvensoitiin data käsiteltiin ja mutaatioita tunnistettiin käyttämällä Ion Torrent Suite Software v3.0 kanssa plug-in ”variantti soittaja”. Jotta voitaisiin poistaa virhe base calling, kolme suodatus vaiheet käytetään tuottamaan luotettavia variantti calling kuvatulla Materiaalit ja menetelmät. Jakson lukea jakautuminen 189 amplikoneihin tuotetaan 76 FFPE näytteet normalisoitiin 300000 lukee näytettä kohden (Fig. 1). Käyttämällä tiukka standardi muunnos kutsuvan tunnistimme mutaatioita seuraavissa geeneistä luetellaan taulukossa 1: BRAF, EGFR, erbB2, KRAS, PIK3CA, PTEN, Smad4, ja TP53.

. Jakelu keskimääräinen kattavuus kunkin amplikonin. Tiedot osoittivat keskiarvona ± SD. B. lukumäärä amplikonien tietyn lukea syvyys, lajitellaan siiloissa 100 lukee. (Siniset palkit läsnä määrä kohde amplikonien sisällä luku- syvyys, punainen viiva esittelee% tavoitteesta amplikonien = lukea syvyys).

Näytteet luokiteltiin perustuen niiden alkuperästä keuhkojen adenokarsinooma, keuhkojen storcell syöpä, keuhkojen okasolusyöpä ja keuhkojen neuroendokrii- syöpä. Eri vaiheissa syövistä ovat edenneet pisteytettiin perustuvat ”American sekakomitean Cancer /Tuumorikoko, imusolmukkeiden vaikuttaa, etäpesäkkeitä (AJCC /TNM)” järjestelmä (Ia, Ib, IIa, IIb, IIIa, IIIb) ja metastasizing ja ei-metastasizing keuhkosyövässä. Myös syöpiä selvittäneet lähtien runsaasti tupakoivat, kevyt-tupakoitsijoita ja tupakoimattomia tarkistaa korrelaatio tupakointi kertyminen näistä mutaatioista. Yksityiskohtainen luettelo missense pistemutaatioiden, insertiot ja deleetiot profiloitu 737 lokusten 76 keuhkosyövän näytteet on esitetty taulukossa S1.

Ulos mutaatioiden tunnistettu meidän vedostulostus, BRAF (2,6%), EGFR (42,1%), erbB2 (1,3%), KRAS (5,3%), PIK3CA (2,6%), PTEN (1,3%), Smad4 (1,3%), ja TP53 (22,4%) aiheutuneet korkeimmat mutaatioiden (taulukko 2 ). Mutaatio taajuudet niiden eri erilaistumisen tasoilla (taulukko 3), eri AJCC pysähdyspaikan (taulukko 4), ja metastaattisen ja ei-metastaattinen keuhkosyövässä (taulukko 5) ja potilailla, joilla on eri tupakointi (taulukko 6) on esitetty taulukot. Yksityiskohtainen Sekvensointianalyysin eksoneissa ja toimintakykyyn näiden geenien oli siten tehty.

missensemutaatio jakautuminen eksonit ja toimintakykyyn EGFR

Out of 76 sekvensoitiin keuhkosyöpään näytteitä, 36,1% EGFR mutaatioita olivat missensemutaatio pitkin eksonin 19, 50,0% oli missensemutaatio pitkin eksonin 21, 5,6% sekä eksonin 20 ja 8,3% pitkin eksonissa 18 (Fig. 2A). Nämä mutaatiot olivat ja ympäri tyrosiinikinaasidomeeniin EGFR (Fig. 2B-3C). Aktivoivat mutaatiot tyrosiinikinaasidomeeniin on

EGFR

geenin stimuloi proteiinin tyrosiinikinaasin, joka johtaa signaloinnin aktivaatioon reitit, jotka liittyvät solun kasvuun ja eloonjäämiseen. Mutaatiot solunulkoinen domeeni EGFR liittyy usein vahvistusta geenien muiden syöpien [12]. 57,7% EGFR-liittyvä keuhkosyövässä oli adenokarsinoomia (taulukko 2) ja 86,7% EGFR mutaatioita, jotka liittyvät ”korkean erilaistumista” syöpä (taulukko 3). Meidän näyte asetetaan 50% EGFR-liittyvä keuhkosyövässä metastasized paikallisille alueille, 27,3%: sta lymphs ja 46,2% syövistä metastasized kaukaisiin elimiin meidän näytejoukolla (taulukko 5).

. Taajuudet havaittujen mutaatioita eri eksonien. B. Mutaatio jakelu eksoneissa. C. Mutaatio jakelu toimintakykyyn.

. Taajuudet havaittujen mutaatioita eri eksonien. B. Mutaatio jakelu eksoneissa. C. Mutaatio jakelu toimintakykyyn.

missensemutaatio jakautuminen eksonit ja funktionaalisia domeeneja KRAS

Out of 76 sekvensoitiin Keuhkosyöpä näytteet 100% KRAS mutaatioista olivat missense pitkin eksoni 2 (Fig. 3A). 34G T mutaatiot johtavat aminohapon substituutio asemassa 12 KRAS, mistä glysiini (G) ja kysteiini (C) tai valiini (V). 64C mutaatio aiheuttaa aminohappo- substituutio asemassa 22 glutamiini (Q) ja lysiinin (K) on KRAS. Kaikki nämä aminohapposubstituutiot tapahtunut pitkin GTP sitova domeeni KRAS (Fig. 3A-C). KRAS sitoutuu GTP aktiivisessa tilassa ja sillä on sisäinen entsymaattinen aktiivisuus, joka katkaisee päätelaitteen fosfaatti nukleotidin, se voidaan muuntaa BKT. Kun muuntaminen GTP bruttokansantuotteeseen KRAS on sammutettu [13]. Tuloksena Näiden mutaatioiden on konstitutiivinen aktivaatio

KRAS

signalointireittejä. Kun se on päällä, se rekrytoi ja aktivoi tarvittavat proteiinit leviämistä kasvutekijän ja muihin reseptoreihin ”signaali, kuten c-Raf ja PI3-kinaasi [13]. 7,7% KRAS liittyvien keuhkosyövässä olivat adenokarsinoomat (taulukko 2) ja 6,1% KRAS liittyviä mutaatioita ”alhainen eriyttäminen” syöpiä ja 7,4% KRAS mutaatioita olivat ”mid eriyttäminen” syöpiä (taulukko 3). Meidän näyte asetetaan 6,3% KRAS liittyvien keuhkosyövässä metastasized paikallisille alueille, 9,1%: sta lymphs ja 5,1% syövistä metastasized kaukaisiin elimiin meidän näytejoukolla (taulukko 5).

missensemutaatio jakautuminen eksonit ja funktionaalisia domeeneja TP53

poikkeavuutta TP53-geenin on yksi merkittävimmistä tapahtumista keuhkosyövässä ja sillä on tärkeä rooli tuumorigeneesissä keuhkojen epiteelisolujen. P53-tuumorisuppressorin geeni sijaitsee 17p13 kromosomissa ja ulottuu 20 kb genomista DNA: ta käsittää 11 eksonia, joka koodaa 53KD fosfoproteiini [14]. Useimmat TP53 mutaatiot klusterin on TP53 DNA-sitova domeeni, joka kattaa eksonit 5: stä 8 ja ulottuu noin 180 kodonia tai 540 nukleotidia, ja ei ole rajoitettu muutaman tiettyjä sekvenssejä tai kodonit pitkin tätä geeniä [15]. TP53 aiheutuneet useita vahingollisia mutaatioita meidän vedostulostus 76 keuhkosyövässä, enimmäkseen pitkin DNA-sitovan domeenin koodaama eksonista 5 (27,8%), 6 (16,7%), 7 (33,3%), 8 (16,7%), ja pitkin oligomerisaatioon verkkotunnuksen koodattu eksonista 10 (15,6%) (Fig. 4A-C). Useimmat TP53, joiden mutaatiot johtavat synteesin stabiili proteiini, jolla ei ole sen erityinen DNA: ta sitovan ja transaktivaatiofunktiota ja kerääntyy solujen tumaan. Tällainen mutantti valkuaisesta aktiivinen ja puuttuu kyky transaktivoida loppupään tavoite sääteleviä geenejä solusyklin ja apoptoosin [16]. Näiden lisäksi vaikuttavia mutaatioita rooli TP53 kuin kasvaimeen soriproteiini, TP53 mutaatioita myös varustaa mutantti proteiini ”gain-of-function” (GOF) toimintaa, joka voi edistää aktiivisesti eri vaiheissa syövän etenemisen, kuten etäispesäkkeitä ja lisääntyneen resistenssin syöpähoitojen [17] – [19]. 50,0% ja TP53 liittyvien keuhkosyövässä olivat okasolusyöpä (taulukko 2), ja 20,0% ja TP53 mutaatioita, jotka liittyvät ”korkean erilaistumista” syöpien ja 25,9% ja TP53 mutaatioista olivat ”puolivälissä erilaistumista” syöpä (taulukko 3). Meidän näyte asetetaan 25,0% of TP53 liittyvien keuhkosyövässä metastasized paikallisille alueille, 54,5%: sta lymphs ja 12,8% syövistä metastasized kaukaisiin elimiin meidän näytejoukolla (taulukko 5).

. Taajuudet havaittujen mutaatioita eri eksonien. B. Mutaatio jakelu eksoneissa. C. Mutaatio jakelu toimintakykyyn.

Useita mutaatioita ja mutaatio kriisipesäkkeisiin ihmisen keuhkosyövässä

Kliininen menestystä yksilöllisen yhdistelmähoidon vetoaa tunnistamisesta mutaatiostatuksesta yhdistelmiä ja kaavoja co -administration yhden tai yhdistelmän kohteena aineina havaittu mutaatiostatuksesta yhdistelmiä. Osa mutaatioista havaittu omassa kasvaimen ryhmässä läpi Sekvensointianalyysin olivat paitsi toistuvat ja usein myös esiintyi yhdessä muiden mutaatioiden kanssa. Keuhkosyövässä meidän näytejoukolla sisälsi seuraavat: 64,5% näytteistä oli ainakin yksi tai useampi missensemutaatioita, 19,7%: lla oli ainakin kaksi tai useampia missensemutaatioita, 3,9% oli ainakin kolme tai useampia missensemutaatioita, 1,3%: lla oli ainakin neljä tai enemmän, joiden mutaatiot, ja 35,5% näytteistä ei aiheutunut vahingollisia mutaatioita tahansa seulotaan 13500 loci mahdollisia tuumorisuppressorin ja onkogeenit (taulukko 7).

keskustelu

koska keuhkosyöpä on yleisin syöpä ja johtava syy syöpäkuolemista maailmanlaajuisesti jatkuvia ponnisteluja pyritään parantamaan ehkäisyyn, diagnosointiin ja tehokkaita hoitovaihtoehtoja potilaille, joilla on keuhkosyöpä. Tällä hetkellä erilaisia ​​hoitovaihtoehtoja keuhkosyöpäpotilaita, leikkaus on tehokkain hoitoon NSCLCs, ja kemoterapiaa tai ilman sädehoitoa kuin vakiohoito SCLCs. Koska useimmat SCLCs metastasoituneet aikaista kaukaisiin elimiin, leikkaus on usein tehoton kuivatuksen tämä syöpä. NSCLCs, toisaalta, ovat todennäköisesti edelleen paikallista kehityksen aikana, ja ovat näin ollen ne tehokkaammin käsitellään kirurgisia toimenpiteitä. Lisäksi SCLCs ovat yleensä paljon herkempiä kemoterapiaa ja /tai sädehoitoa kuin ovat NSCLCs [20], [21]. Yksi haaste asianmukaista luokittelua ja Keuhkosyövän hoidossa on äärimmäisen heterogeenisyys aiheuttamat erilaiset geneettiset, biologiset ja kliiniset ominaisuudet, kuten hoitovaste, yli 50 histologinen muunnelmia WHO: n tunnustamaa kirjoittamalla järjestelmä [22], [23]. Tämän vuoksi oikean luokittelun keuhkosyöpää on tarpeen varmistaa, että potilaat saavat optimaalisen hallinnan [24].

Koska näiden eri tasojen heterogeenisyys, yleistynyt hoidot voivat olla tehottomampia. Vaihtoehtoisesti täsmähoitoihin, johon liittyy käyttöä erityisesti suunniteltu lääkeaineiden valikoivasti tavoite molekyyli polkuja korreloi pahanlaatuinen fenotyyppi keuhkosyöpään solujen, voi olla enemmän hyötyä [25]. Useita geenejä yleisesti todettu olevan mutatoitunut eri keuhkosyövässä on raportoitu, mukaan lukien ALK /ELM4 fuusio, K-

ras

, EGFR, VEGF, ja p53, mutta koko geneettinen profiili kutakin muotoa ei vielä ole ollut täysin määritelty [3]. Tämä osoittaa, että on välttämätöntä sekvensointi yksittäisen ihmisen keuhkosyövässä, jotta ne vastaisivat käyttöön yhden kohdistuva lääkkeiden tai kaksi tai useampia kohdistettuja lääkkeitä yhdistelmänä yksittäisiin keuhkosyöpä-spesifisiä mutaatioita. Tässä tutkimuksessa on käytetty Ion Ampliseq Cancer Panel sekvensoida 13500 lokusten 45 syöpään liittyvien geenien, pääasiassa onkogeenit ja tuumorisuppressorigeenit, 76 ihmisen keuhkosyövän näytteitä. Havaitsimme usein mutaatioita ryhmä geenejä, mukaan lukien EGFR, KRAS, ja TP53 (taulukko 2). Vaikka useimmat näistä geeneistä oli jo tiedetään liittyvän kanssa keuhkosyövässä, mutatoidun pistettä ja liittyvät mutaatiot muissa geeneissä olivat erilaisia ​​meidän näytejoukolla (taulukot 7).

Koska olevan yhä muutoksista keuhkojen syöpäsoluja viime aikoina, uudempia lääkkeitä että erityisesti näiden muutosten on kehitetty. Nämä kohdennetut lääkkeet joko toimivat synergistisesti kemoterapia huumeiden tai itse paljon pienempi myrkyllisyys johtuen valikoivaan vaihtoehtona enemmän systeemisiä modulaatio proteiinien liittyy syövän synnyn. EGFR: n estäjien (Afatinib, Erlotinibi ja Gefitinibi) ja VEGF-estäjien (Bevasitsumabilla) käytetään tällä hetkellä tavoite hoitomuotoja pienisoluista keuhkosyöpää mutaatioiden kanssa VEGF ja EGFR [26]. Erlotinibi on huume, joka estää EGFR päässä signalointi solusta kasvamaan. Se estää etenemisen keuhkosyöpää, erityisesti savuton naisilla, ja useimmiten käytetään kehittynyttä NSCLC hoitoa, joka ei reagoi kemoterapiaa. Sitä käytetään myös ensimmäisenä hoitoa potilaille, joiden syövissä on mutaatio

EGFR

geeni [27]. Setuksimabi on monoklonaalinen vasta-aine, joka kohdentuu EGFR jota käytetään myös kehittyneitä NSCLC yhdessä tavanomaisen kemoterapian osana ensilinjan hoitoon [28]. Kuten erlotinibi, afatinib on huume, joka estää kasvua signaalin EGFR ja käyttää kehittyneitä NSCLCs jotka ovat mutaatiot

EGFR

geeni [29]. Jotkut nuoremmat, tupakoimattomien kanssa adenokarsinooman on todettu ALK /EML4 fuusio onkogeeni, joka on tällä hetkellä tavoite lääke Crizotinib [30]. Muut lääkkeet hoidossa nykyisin käytettäviä keuhkosyöpätapauksista ole geenispesifiseen, ja sen sijaan kohdistaa yleistä molekyyli- reittejä kuten folaatti anitmetabolites (metotreksaatti ja pemetreksedin), mitoosi-inhibiittorit (doketakseli, piclitaxel, ja vinorelbiini), topoisomeraasin estäjät (Etopophos ja topotekaani), ja nukleosidi analogeja, jotka häiritsevät DNA-synteesiä (karboplatiini, sisplatiini, ja gemciabine) [31], [32]. Inhibiittorit EGFR-suunnatun tyrosiinikinaasin vahvistetaan olevan tehokas hoitovaihtoehto kehittynyt NSCLC ei reagoi kemoterapiaa. Kuitenkin EGFR-suunnattu monoklonaalisia vasta-aineita yhdessä platinapohjaisen ensilinjan kemoterapiaa, setuksimabi yhdistettynä sisplatiinin /vinorelbiini ja bevasitsumabin yhdessä platinapohjaisen kemoterapian johti paremmin selviytymisen kemoterapiaan verrattuna yksinään potilailla, joiden EGFR-positiivisten NSCLC [ ,,,0],33]. Muita kohdennettuja hoidot, mukaan lukien dual ja multi-estäjät ovat aiemmissa vaiheissa kliinisen kehityksen [34].

kertyminen tietoa ja kokemusta seuraavan sukupolven teknologioihin, on tarpeen laajentaa ymmärrystämme herkkyydessä erityisiä mutaatioita yksilöllisesti hoitoja. Siksi kerääminen täydellinen profiilia mutaatioiden keuhkosyövässä soveltamisesta yksilöllisiä ja räätälöityjä kohdennettu hoito on kriittinen kehittää tulevaisuuden syöpähoitojen. Uskomme nopeamman ja kustannustehokas genotyypityksen väline kuten Ion Torrent sekvensointitekniikan on suuresti hyötyä siirrosta tällaisia ​​erityisiä terapeuttisia lähitulevaisuudessa käyttää keuhkosyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

etiikka selvitys

Tutkimus on hyväksynyt Human Research Ethics komitean ensimmäisen Affiliated sairaala Dalian Medical University, Kiina. Sillä formaliinilla ja parafiiniin (FFPE) kasvain näytteet kasvainkudoksen pankki patologian osaston sairaalan, institutionaalisten eettisen komitean luopua tarvetta suostumusta. Kaikki näytteet ja lääketieteellisten tietojen Tässä tutkimuksessa käytetyt ovat peruuttamattomasti nimettömiksi.

Potilastiedot

Kasvain näytteitä käytettiin tutkimuksessa kerättiin First Affiliated sairaala Dalian Medical University, Kiina. Kaikkiaan 76 FFPE kasvain näytteet keuhkosyöpäpotilaiden analysoitiin. Keskimääräinen ikä 76 potilaista oli 61 vuotta (vaihteluväli: 28-80 vuotta). Näistä 40 potilasta oli miehiä, joiden keski-ikä oli 61 vuotta (vaihteluväli: 28-80 vuotta), ja 36 oli naisia, joiden keski-ikä oli 61 (vaihteluväli 36-75 vuotta). Kasvain näytteitä käytetään tutkimuksessa kerättiin First Affiliated sairaala Dalian Medical University, Kiina. Kaikkiaan 76 FFPE kasvain näytteet keuhkosyöpäpotilaiden analysoitiin. Keskimääräinen ikä 76 potilaista oli 61 vuotta (vaihteluväli: 28-80 vuotta). Näistä 40 potilasta oli miehiä, joiden keski-ikä oli 61 vuotta (vaihteluväli: 28-80 vuotta), ja 36 oli naisia, joiden keski-ikä oli 61 (vaihteluväli 36-75 vuotta). 33 76 potilasta (20 miestä, 13 naista) luokiteltiin alhainen patologisen erilaistuminen; 27 (14 miestä, 13 naista) puolivälissä, 15 (6 miestä, 9 naista) korkeissa ja 1 naiset tuntemattomien erilaistumista. AJCC syöpä pysähdyspaikkojen on seuraava: 0 potilailla, joilla on I tai Ia; 18 (10 miestä, 8 naista) vaiheessa Ib; 3 (2 miestä, 1 nainen) vaiheessa IIa; 9 (5 miestä, 4 naista) vaiheessa Hb; 26 (14 miestä, 12 naista) ensimmäisessä vaiheessa III; 8 (4 miestä, 4 naista) vaiheessa IIIb; 0 potilasta vaiheessa IIIc; ja 12 (5 miestä, 7 naista) vaiheessa IV. Kokonaismäärästä 76 potilasta, 16 40 miestä raportoitu ei tupakointianamneesista, kun taas yksikään 36 naista raportoitu olevan tupakoitsijoita; 6 miehistä ilmoitti valoa tupakointi; 17 miestä raportoitu runsas tupakointi, ja 1 mies tuntemattoman tupakoinnin historia.

DNA: n valmistus

DNA eristettiin FFPE näytteistä jälkeen deparaffinization ja louhinnan 3-5 pm paksu parafiinileikkeillä ksyleenissä, käyttäen QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen) kohti valmistajan ohjeiden.

Ion torrent PGM kirjasto valmistelu ja sekvensointi

ioni Torrent adapteri ligoitiin kirjasto tehtiin noudattamalla valmistajan protokolla Ion AmpliSeq Kirjasto Kit 2.0 (Life Technologies) (osa # 4475345 Rev. A). Lyhyesti, 50 ng yhdistettiin amplikonien olivat lopussa korjattu, ja DNA-ligaasi käytettiin ligatoimiseksi Ion Torrent adapterit P1 ja A. Kun puhdistus AMPure helmiä (Beckman Coulter, Brea, CA, USA), adapteri ligoitiin tuotteet olivat lovitranslaatiolla ja PCR: llä monistetut yhteensä 5 sykliä. AMPure helmet (Beckman Coulter) käytettiin puhdistamaan tuloksena kirjasto ja Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) ja Agilent Bioanalyzer DNA Suuri herkkyys LabChip (Agilent Technologies) käytettiin pitoisuuden määrittämiseksi ja koko kirjaston.

Sample emulsio PCR, emulsio rikkomatta, ja rikastus suoritettiin käyttäen Ion PGM 200 Xpress Template Kit (osa # 4474280 Rev. B) mukaan valmistajan ohjeiden. Lyhyesti, tulo pitoisuus yhden DNA-templaatin kopion /Ion Sphere Hiukkaset (ISP) lisättiin emulsioon PCR Master Mix ja emulsio tuotetaan käyttäen IKADT-20 mikseri (Life Technologies). Seuraavaksi Internet otettiin talteen ja template-positiiviset Internet rikastettiin käytettäväksi Dynabeadsilla MyOne streptavidiini C1 helmiä (Life Technologies). ISP rikastaminen varmistettiin käyttämällä Qubit 2.0 fluorometrissä (Life Technologies). 316 siruja käytettiin sekvensointi Ion Torrent PGM 65 sykliä ja näytteet viivakoodilla. Ion PGM 200 Sequencing Kit käytettiin sekvenointireaktioita, kuten per suositeltu protokollan (osa # 4474004 Rev. B). Aineisto on talletettu NIH Sequence Read Archive, ja hakunumerolla on SRP028756 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Traces/sra/?study=SRP028756).

Variant kutsuvan

tiedot PGM kulkee käsiteltiin aluksi käyttäen Ion Torrent alustakohtaisia ​​putki ohjelmisto Torrent Suite tuottaa järjestyksessä lukee, leikata adapteri sekvenssit, suodata ja poista huono signaali-profiilin lukee. Alustava variantti soittajat Ion AmpliSeq sekvenointitulosten luotiin käyttäen Torrent Suite Software v3.0 kanssa plug-in ”variantti soittaja” ohjelma. Jotta voitaisiin poistaa virheelliset base calling, kolme suodatus vaiheet käytetään tuottamaan lopullinen muunnos calling. Ensimmäinen suodatin asetettiin keskimääräinen koko kattavuus syvyys 100, kukin muunnelma kattavuus 20, variantti taajuus kunkin näytteen 5, ja P-arvo 0,01. Jotta voitaisiin poistaa virhe base calling useita suodatus vaiheet käytetään tuottamaan lopullinen muunnos kutsuvan (Fig. S1.). Ensimmäinen suodatin asetettiin keskisyvyys yhteensä kattavuuden 100, joka on kunkin variantin kattavuus 20, variantti taajuus kunkin näytteen 5 ja P-arvo 0,01. Toinen suodatin työskenteli visuaalisesti tutkimalla mutaatioiden avulla genomiikkaa Viewer (IGV) ohjelmisto (http //www.broadinstitute.org /IGV) tai Samtools ohjelmisto SAMtools ohjelmisto (https://samtools.sourceforge.net), sekä suodattamalla pois mahdollinen säikeen koskevat virheet, eli. mutaatio havaittiin vain joko ”+” tai ”-” nauha, mutta ei molemmat DNA-juosteet. Kolmas suodatus vaiheessa asetettiin variantteja sisällä 727 kuormittajat, mukaan valmistajan ohjeiden. Viimeinen suodatin vaihe oli eliminoida variantit amplikoni AMPL339432 (PIK3CA, exon13, CHR3: 178938822-178938906), joka ei ole ainutlaatuinen sovitettu ihmisen genomin. Meidän sekvensointi suoritetaan käyttäen Ion Ampliseq Cancer Panel, vääriä poistetaan tietoja, jotka syntyvät JAK2-geenin lokukseen ja siten sekvensointi tiedot tässä lokuksessa jätettiin pois lisäanalyysistä.

Somaattiset mutaatiot

havaittu mutaatioita verrattiin variantteja 1000 Genomes Project [35] ja 6500 exomes National Heart, Lung, and Blood Institute Exome sekvensointiprojektista [36] erottaa somaattisten mutaatioiden ja ituradan mutaatioita.

Bioinformatical ja kokeellinen validointi soveltava

Käytimme COSMIC [37] (versio 64), MyCancerGenome tietokanta (https://www.mycancergenome.org/) ja muutamia julkaisuja arvioida ilmestyminen mutaatioita keuhkosyöpä (taulukko S1). Lisäksi jotkut havaittu missensemutaatioita varmistettiin Sangerin sekvensoinnilla (Fig. S2).

Tilastollinen

Valitse ilmestyminen somaattisia missense /in-del mutaatioiden keuhkosyöpään tehdä tilastollinen analyysi.

tukeminen Information

Kuva S1.

suodatin prosessi muunnelmia. Huomautus: (a) Strand-puolueellinen variantteja eliminoitu genomiikkaa Viewer (IGV) ohjelmisto (http //www.broadinstitute.org /IGV); (B) Eri vaihtoehdot in AMPL339432 olisi poistettava, koska tämä amplikoni ei ole ainutlaatuinen sovittaa PIK3CA ihmisen genomissa; (C) Kaikki tilastollinen analyysi perustuu tietoihin siniselle.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0095228.s001

(DOCX) B Kuva S2.

Sanger vahvistukset 15 variantteja.

doi: 10,1371 /journal.pone.0095228.s002

(DOC) B Taulukko S1.

Taajuudet pistemutaatioiden, lisäys ja poisto mutaatioita 737 loci 76 ihmisen keuhkosyövässä.

doi: 10,1371 /journal.pone.0095228.s003

(DOCX) B

Kiitokset

Haluamme kiittää Rong Shi klo Wu Jieping Foundation, tohtori Haibo Wang, Zhi Yu, Ying Li ja muut jäsenet San Valley Biotechnology Inc. Beijing heidän avustaan ​​näytteessä ja tiedonkeruuseen. Haluamme myös kiittää henkilöstöä Pekingin Sotilassairaala näiden anteliaasta tuesta DNA sekvensointi ja tiedonkeruuseen.