Krooninen sairaus

tiivistelmä

on todistettu ydin- läsnäolo funktionaalisen kompleksia epidermaalisen kasvutekijän (EGFR), src ja Signal muuntimet ja Activator of Transcription (Stat) 3 proteiineja haiman syöpäsoluja. Stat3 edelleen ydin- ja liittyy Src tai EGFR, vastaavasti, kun siRNA pudotus EGFR tai Src, osoittaa vastus monimutkainen modulaatio EGFR tai Src yksin. Merkittävää on, kromatiinin immunosaostus (chip) analyysit paljastavat ydin- EGFR, Src ja Stat3 kompleksi sitoutuu c-Myc promoottori. SiRNA Knockdown EGFR tai Src, tai farmakologinen esto Stat3 aktiivisuuden vain marginaalisesti tukahdutetaan c-Myc ilme. Sitä vastoin samanaikaisesti modulaatio Stat3 ja EGFR, tai Stat3 ja Src, tai EGFR: n ja Src suppressoi voimakkaasti c-Myc ilmaisu, joka osoittaa, että uusi ydin kompleksia monimutkaisesti säätelee c-Myc-geeniä. Esiintyvyys kopiointia toiminnallisen EGFR, Src, ja Stat3 ydinvoimalassa tarjoaa ylimääräisen ja uudella mekanismilla tukemiseksi haimasyövän fenotyyppi ja selittää osittain epäherkkyys haimasyövän solujen EGFR, Src tai Stat3 yksin.

Citation: Jaganathan S, Yue P, Paladinon DC, Bogdanovic J, Huo Q, Turkson J (2011) Toimiva Nuclear epidermaalisen kasvutekijän reseptori, Src ja Stat3 Heteromeeriset Complex haimasyöpäsoluissa. PLoS ONE 6 (5): e19605. doi: 10,1371 /journal.pone.0019605

Editor: Marcelo G. Bonini, University of Illinois at Chicago, Yhdysvallat

vastaanotettu: 30 marraskuu 2010; Hyväksytty: 12 huhtikuu 2011; Julkaistu: 05 toukokuu 2011

Copyright: © 2011 Jaganathan et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Cancer Institute apurahat CA106439 (JT) ja CA128865 (JT), Florida Department of Health Bankhead-Coley Foundation (Bridge Grant) (HQ), osittainen tuki World Gold neuvoston (KASVAA Program) (HQ), sekä National Natural Science Foundation of China Overseas Young Investigator Award (20828006) (HQ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Monet solunsisäiset biokemiallisten prosessien käynnistyvät kokoonpanoon proteiinien makromolekyylikompleksien. Yhdistyksen välinen proteiinit tai proteiinien muiden molekyylikokonaisuuksiin moduloi proteiinin konformaation, joka tarjoaa keinon säädellä lukemattomia biokemiallisia prosesseja, jotka palvelevat tehokkaasti hallita elintärkeitä biologisia vasteita. Proteiini dynamiikka ja kaupan, ja proteiinia vakaus ovat myös prosesseja, jotka voidaan moduloida yhdistyksen proteiinien toisten kanssa. Laajemmassa merkityksessä, molekyylien välisiä yhdistysten sallivat erikoisuus proteiineja, kuten reseptoreita, adapterit, entsyymejä, ja transkriptiotekijät differentiaalisesti moduloida solunsisäisten tapahtumien luoden monimuotoisuuden fysiologisia reaktioita ja edistää yhteydessä riippuvuutta.

aikana induktio signaalitransduktion, on eri proteiinien, joista jokaisella on tiettyjä toimintoja tärkeää signaalitransduktion ja siihen liittyvän biologisen vasteen. Perinteinen epidermaalisen kasvutekijän reseptorin (EGFR) signaalinvälitysreitin sisältää aktivointi mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin kinaasin (MEK) -mitogen-aktivoitu proteiinikinaasi /solunulkoisen signaalin säädelty kinaasi (Erk

MAPK) ja edistää mitogeenisia vasteita [ ,,,0],1], [2]. EGFR induktio edistää myös aktivointi Signaalin muuntimet ja Activator of Transcription (STAT) proteiinien perheen, joka samalla on keskeinen rooli EGF aiheuttaman biologisia vasteita [1]. STAT-proteiinit ovat piileviä sytoplasmisen transkriptiotekijöitä, jotka aktivoituvat vasteena solujen stimulaation sytokiinien ja kasvutekijöiden [3] kautta fosforylaation kriittisen tyrosyylitähteen (Tyr705 ja Stat3). Tyrosiinifosforylaation STAT välittyy tyrosiinikinaasien Kasvutekijäreseptorien ja sytoplasman tyrosiinikinaasien, kuten Src ja Janus-kinaasi (Jak: it) perheet. Aktivoidut STAT dimeereinä tumassa sitoutuvat tiettyihin DNA vaste elementit promoottorit kohdegeenien aiheuttavan geenin transkription. Ydinvoima translokaatio mekanismi STAT on tehty viime aikoina voimakasta tutkimus. Stat3 tumaansiirtymiseen on raportoitu välittyvän tunnustamisesta ja kuljetusta Importiini-α ja Ran-GTPaasi [4], ja mekanismeilla, joihin chaperoning mukaan MgcRacGAP [5], EGF-reseptorin endosytoosin [6], sekä solukalvon liittyvä lipidilauttojen ihmiskauppaa [7].

esiintyvyys monia hyperaktiivinen signaalitransduktioreaktioteiden jotka tukevat syöpä fenotyyppi on suuri haaste terapiaan. Edelleen klassisen tapa edistää ylikuulumisyhdistelmää jakamiseen useiden signalointireittien, makromolekulaarista proteiiniliukuhihnat tarjota lisää ainutlaatuisen mekanismeja indusoimiseksi tapahtumia, jotka tukisivat pahanlaatuinen fenotyyppi. Tällainen ei-perinteisten signalointi mekanismi on havaittu, että EGFR, joka on havaittu solun tumassa, ja havaittiin toimimaan transkriptiotekijä [8], [9]. Tutkimukset kertoo vielä ydinvoiman EGFR komplekseja Stat3 rintasyöpäsoluissa, ja tämä monimutkainen aiheuttaa spesifisten geenien, kuten indusoituvan typpioksidin (iNOS) [10]. Ylimääräiset EGFR-toiminto voisi pahentaa asemaansa mitogeeni ja edistäjä solun eloonjäämisen, jossa kaikki suosivat syöpä. Tältä osin samanaikaisesti poikkeava aktivointi EGFR ja loppupään signaali välittäjäaineiden, mukaan lukien Src ja Stat3, joita esiintyy korkeilla taajuuksilla ihmisen syövissä perustuu kaiken signaloinnin monimutkaisuus, joka tukee syövän fenotyyppi. Esimerkiksi, viitaten haimasyöpä, poikkeava aktivaatio EGFR esiintyy 30-50%: ssa tapauksista [11], aktivoitu c-Src on huomattava, yli 70%: ssa tapauksista, ja usein mukana EGFR yli-ilmentyminen [12], kun taas poikkeava Stat3 aktivointi on myös erittäin yleistä [13], [14], [15]. Tärkeää on, meidän tuore raportti että haimasyöpä on herkempi samanaikainen estäminen poikkeavien Stat3 ja EGFR tai Src [16] näyttää hyödyntämistä useiden poikkeavien signalointireittien ylläpidosta syöpä fenotyypin ja miten tämä vaikuttaa reagointikykyä hoitoa. Laajentamaan aikaisempien tutkimusten [16], pyrimme koetin molekyyli ja toiminnallinen vuorovaikutus Stat3, EGFR ja Src ja taustalla olevien mekanismien tukemiseksi haimasyövän fenotyyppi. Olemme tässä tarjota näyttöä toiminnallinen ydin- heteromeerinen EGFR, Src ja Stat3 monimutkaisia ​​haiman syöpäsoluissa, joka edistää induktion c-Myc-geeniä. Meidän raportti on ensimmäinen tunnistamista ydinonnettomuuden EGFR, Src ja Stat3 kompleksia, joka edistää c-Myc-geeniä induktio. Ymmärtäminen dynamiikka EGFR, Src ja Stat3 molekyylivuorovaikutusten haimasyövän antaisi perustan suunnitella uusia tehokkaita usean täsmähoitoihin lähestymistapoja haimasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Solut ja reagenssit

ihmisen haimasyövän, Panc-1 ja Colo-357 riviä ovat kaikki aiemmin kuvattu [16], [17]. Ihmisen immortalisoitu haimatiehyeeseen epiteelisolu- (HPDEC) linja oli ystävällinen lahja Dr. Tsao, OCI, UHN-PMH, Toronto) [18]. HPDEC kasvatettiin Keratinosyyttien-SFM-alusta täydennettynä 0,2 ng EGF, 30 ug /ml naudan aivolisäkeuutetta, ja joka sisältää antimycol. Kaikki muut soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), joka sisälsi 5% rautaa täydennetty naudan vasikan seerumia ja 100 yksikköä /ml penisilliiniä-streptomysiiniä.

peptidisynteesi

Stat3 SH2 verkkotunnuksen peptidin inhibiittori (SPI), FISKERERAILSTKPPGTFLLRFSESSK, EGFR peptidimotiivit, pY1068EGFR (pY1068), PEpYINQS ja pY1086EGFR (pY1086), PVpYHNQP hankittiin Peptide 2,0 (Fairfax, VA) on 95%: n puhtaudella.

Nuclear Pura valmistelu ja Gel Shift Analyysit

Tumauute valmistelu soluista suoritettiin kuten aikaisemmin on kuvattu [17].

Sub-solujen fraktiointiin, ja SDS-PAGE /Western Blot analyysi

Western blotting -analyysi suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [19], [20] on kokosolulysaateista, ja sytosolisia ja membraanifraktioissa, ja tumauutteet. Sub-solufraktioiden valmistettiin vakioyhteyskäytäntöä. Lyhyesti, solut pestiin käyttämällä PBS: ää, suspendoitiin uudelleen ja lyysattiin vähäsuolainen puskuri (20 mM HEPES (pH 7,9), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA: a, 20 mM NaF, 1 mM Na-

3Vo

4, 1 mM Na

4P

2O

7, 1 mM ditiotreitolia, 1 mM TLA, 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia ja 0,5% Nonidet P-40), ja sentrifugoitiin (13000 x

g

, 4 ° C, 30 s), jolloin saatiin sytosolifraktion. Pelletti pestiin kolme kertaa fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS), resuspendoitiin korkea-puskuria (420 mM NaCl, 20 mM HEPES (pH 7,9), 1 mM EDTA, 1 mM EGTA: ta, 20% glyseroli, 20 mM NaF, 1 mM Na

3Vo

4, 1 mM Na

4P

2O

7, 1 mM ditiotreitolia, 1 mM TLA ja 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia), inkuboitiin 4 ° C: ssa 30 minuutin ajan , jossa keinutuoli, ja sentrifugoitiin (13000 x

g

, 4 ° C, 30 min), jolloin saatiin tumafraktios- (supernatantti). Saatu pelletti pestiin kolme kertaa PBS: llä, suspendoitiin uudelleen RIPA lyysipuskuria (50 mM Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS, 1 mM TLA, ja 0,5 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia), inkuboitiin 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa heiluttaen, ja sentrifugoitiin (13000 x g, 4 ° C, 20 min). Supernatantti kerättiin membraanifraktion. Ensisijainen Käytetyt vasta-aineet vastaan ​​pY845EGFR (Upstate Biotech, Millipore, Billerica, MA), pY705Stat3, Stat3, pY1068EGFR, pY1086EGFR, pY1173EGFR, EGFR, pY416Src, Src, ja β-Actin (Cell Signaling Technology, Danvers, MA), ja Tata- sitovan proteiinin (TBP) (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA). Lukituksen peptidit hankittiin vastaavien yritysten.

Small-häiritsevä RNA (siRNA) Transfektio

siRNA sekvensseillä EGFR ja Src tilattiin Dharmacon RNAi Technologies, Thermo Scientific (Lafayette, CO) . Käytetyt sekvenssit ovat: EGFR sense-juosteen, 5′-GAAGGAAACUGAAUUCAAAUU-3 ’; EGFR antisense-juoste, 5’-pUUUGAAUUCAGUUUCCUUCUU-3 ’; ohjaus siRNA juosteen, 5’-AGUAAUACAACGGUAAAGAUU-3 ’; ja hallita siRNA antisense-juoste, 5’-pUCUUUACCGUUGUAUUACUUU-3 ’. C-Src SMARTpool siRNA-reagenssia (NM-005417, Catalog # M-003175-01-05) käytettiin Src. Transfektio soluihin suoritettiin käyttäen 20 nM EGFR siRNA tai 25 nM Src siRNA ja 8 ui Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA) OPTI-MEM-viljelyväliaine (GIBCO, Invitrogen Corporation).

immunosaostus (IP), ja Sequential immunosaostus laitos

Nämä tutkimukset suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [21], käyttämällä kokosolulysaateista tai tumauutteita (250 ug kokonaisproteiinia) ja 5 ui anti-EGFR tai anti-Src polyklonaalista vasta-aine tai monoklonaalinen anti-Stat3-vasta-ainetta (Cell Signaling Technology). Spesifisyyden, immunoblottauksella analyysi käyttäen anti-EGFR, anti-Src ja anti-Stat3-vasta-aine tehtiin, kun läsnä on kunkin esto-peptidin. Peräkkäinen IP-tutkimukset suoritettiin julkaistujen menetelmien mukaisesti [10], muutamin muutoksin seuraavasti: tumauutteita, valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [21], tehtiin samanlainen immunosaostus suhteen ensimmäinen ensisijainen vasta-aine, anti-EGFR-vasta-ainetta (Cell Signaling ) tai IgG: tä (Santa Cruz), 4 ° C: ssa yön yli. Immunecomplex sitten pelletoitiin 20 ul proteiini-A /G-agaroosi-helmiä (Santa Cruz), pestiin kolme kertaa käyttäen pesupuskuria A (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0 ), ja sitten kaksi kertaa pesupuskurilla B (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0). Sitten proteiinit eluoitiin juuri valmistettua eluointipuskuria (1% SDS, 100 mM NaHCO

3), ja altistettiin toisen immunosaostuksella inkuboimalla anti-Src-vasta-ainetta tai IgG: tä (Santa Cruz). Kompleksit saostettiin sitten, pestiin, eluoitiin lamelli puskurilla ja sen jälkeen SDS-PAGE ja Western blotting -analyysi hyvää ja Stat3.

Immunovärjäys laser-skannaus samapolttopisteistä kuvantamisen

Panc-1-soluja kasvaa peitelaseille 12-kuoppalevyille käsiteltiin kanssa tai ilman estäjiä 1 tai 24 tuntia ja suoritettiin immunovärjäyksellä ja fluoresenssi- tai laser-skannaus konfokaalimikroskopialla, kuten aiemmin on kuvattu [21]. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä 15 minuutin ajan, pestiin kolme kertaa PBS: llä, tehtiin läpäiseviksi 0,25% Triton X-100: ssa 10 minuutin ajan, ja pestiin kolme kertaa PBS: llä. Näytteet blokattiin sitten 0,1% BSA PBST: ssa 30 minuuttia ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa rotan monoklonaalinen anti-EGFR (Santa Cruz), hiiren monoklonaalinen anti-Src (Cell Signaling), ja kaniinin polyklonaalista anti-Stat3 (Cell Signaling ) vasta-aineet klo 1:50 (0,1% BSA). Sen jälkeen solut huuhdeltiin kolme kertaa PBST: ssä, inkuboitiin 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä 1:1000 laimennoksia kolmen AlexFluor sekundaarisia vasta-aineita, ALexaFLuor405 (vuohen anti-hiiri), AlexaFluor488 (aasin anti-kani) ja AlexaFluor546 (vuohen anti -rat) (Molecular Probes, Invitrogen) ja EGFR, Src ja Stat3 havaitsemiseen, vastaavasti. Näytteet pestiin sen jälkeen kolme PBST. Myöhemmin peitelaseja poistettiin ja kiinnitetty dioja käyttäen Fluoromount-G (Southern Biotech, Birmingham, AL) ja estää kuivumisen sulkemalla reunat kynsien maalilla. Objektilasit säilytetään pimeässä 4 ° C: ssa, kunnes kuvat otettiin kiinni. Negatiivinen värjäytyminen, sekundaariset vasta-aineet lisättiin ilman primaaristen vasta-aineiden. Konfokaaliset analyysi suoritettiin tutkimisen liukuu alle Leica TCS SP5 -konfokaalimikroskoopilla (Saksa) sopivina aallonpituuksilla. Kuvat otettiin ja käsiteltiin käyttäen Leica TCS SP 5 -ohjelmaa.

Kromatiini Immunosaostaminen (chip) ja peräkkäinen ChIP Analyysit

siru määrityksessä soluviljelytutkimuksista käsiteltiin formaldehydin loppupitoisuudeksi 1%, 10 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen käsittelemällä glysiinin lopullinen konsentraatio 0,125 M 5 min huoneen lämpötilassa silloittumisen. Sen jälkeen solut pestiin jääkylmällä PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen ja lyysattiin lyysipuskurilla (20 mM HEPES, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 1 mM NaF, 1 mM Na-

3Vo

4, 1 mM Na

4P

2O

7, 1 mM ditiotreitoli), 1X TLA, 1 mM fenyylimetyylisulfonyylifluoridia, 5% Nonidet P-40, ja sentrifugoitiin. Sitten ydin pelletti suspendoitiin ytimet lyysipuskuria (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS: ää ja proteaasi-inhibiittoreita) (Roche, Indianapolis, IN). Ydin- lysaatit sonikoitiin (Omni International, Kennesaw, GA) 30% teholla 3 pulssia 10 sekunnin välein jäällä leikkausvoimien DNA. Kromatiinin Liuos esipuhdistettiin proteiini A /G-agaroosi-helmiä (Santa Cruz) 1 tunnin ajan 4 ° C: ssa keinuttaen. Sitten esipuhdistettiin lysaatit immunosaostettiin inkuboimalla anti-EGFR, anti-Src, tai anti-Stat3-vasta-aineiden tai IgG: tä (ilman vasta-ainetta) (Santa Cruz) 4 ° C: ssa yön keinuttaen. Kompleksit kerättiin 20 ul proteiini-A /G-agaroosi-helmiä (Santa Cruz), pestiin kolme kertaa käyttäen pesupuskuria A (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 20 mM Tris-HCl, pH 8,0) ja kaksi kertaa pesupuskurilla B (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA, 500 mM NaCl, 20 mM Tris-HCI, pH 8,0). Sitten kompleksit eluoitiin juuri valmistettua eluointipuskuria (1% SDS, 100 mM NaHCO

3). Ristisidosten palautettiin kuumentamalla 65 ° C: ssa, kun läsnä oli NaCl ja sen jälkeen proteinaasi K käsittely (20 ui 20 mg /ml) 6 tuntia. DNA otettiin talteen ja puhdistettiin käyttäen DNA: n puhdistus kit Qiagen (Valencia, CA). Puhdistettu kromatiinin immunosaostettiin DNA seuraavan käytettiin templaattina polymeraasiketjureaktiossa (PCR) c-Myc-promoottorin käyttäen alukkeita, Forward, 5’AAAAGGGGAAAGAGGACCTGG-3 ’, ja taaksepäin, 5′-TAAAAGGGGCAAGTGGAGAGC-3’ tai TWIST promoottori käyttäen alukkeita, Forward, 5’AGTCTCCTCCGACCGCTTCCTG -3 ”.

Reverse: 5’CTCCGTGCAGGCGGAAAGTTTGG -3 ’(Invitrogen). PCR-tuotteet, 133 bp c-Myc, ja 332 emäsparia TWIST [22] erotettiin 2% agaroosigeelissä. Peräkkäinen ChIP tutkimuksia suoritettiin, kuten aiemmin on raportoitu [10], ja sen jälkeen, kun juokseva immunosaostusta kuvatuissa tutkimuksissa, käyttämällä ensimmäistä primääristä vasta-ainetta (anti-EGFR) ja toinen primäärinen vasta-aine (anti-Src). Talteen komplekseja sen jälkeen, kun toissijainen immunosaostus eluoitiin eluutiopuskurilla, ja sitten altistettiin ChlP määritystä, kuten on kuvattu.

Geelisuodatuskromatografia

valmiiksi pakattu Superdex 200 10/30 GL lasikolonni hankittiin GE Healthcare Life Sciences (Piscataway, NJ). Kromatografia käytetty tutkimuksessa oli BioLogic Duoflow System (Bio-Rad, Hercules, CA). Kromatografiaa analyysi suoritettiin seuraten valmistajan ohjeita yleisellä juoksujakso tasapainotuspuskuria, kuormitus, eluointi, uudistumista ja varastointi. RIPA-puskuria (50 mM Tris, pH 7,4, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 0,1% SDS, 1% Nonidet P-40) käytettiin liikkuvana faasina puskuria. Näytteet (Panc-1 solulysaatti, 2 mg kokonaisproteiinia tilavuudessa 250 ui) ladattiin asti sarakkeessa, virtausnopeus säädettiin 0,25 ml /min, ja sitten osa (500 ui) kerääminen aloitettiin heti, kun näyte lastaus ja valvoo eluentin absorbanssi 280 nm: ssä. Mukaan absorbanssi huiput, fraktiot 21-34 valittiin ja alistettiin immunoblottauksella-analyysillä käyttäen vasta-aineita EGFR: ää, Stat3, ja Src (Cell Signaling), ja RNA: helikaasia A (RHA) (Abcam, Cambridge, MA). Immunosaostukseen määrityksessä, 100 ui kutakin fraktiot 23-27 yhdistettiin, josta EGFR immunecomplex saostettiin käyttämällä anti-EGFR-vasta-ainetta (Cell Signaling), ja alistettiin immunoblottauksella analyysi Stat3, Src ja EGFR.

valmistaminen EGFR ja hiiren IgG1-BKTL antureista

Kultananohiukkasia (BKTL), 0,1 nM, joiden halkaisija on 40 nm ostettiin Ted Pella Inc. (Redding, CA). Hiiren monoklonaalinen anti-EGFR-[F4] vasta-aine hankittiin Abcam (cat. No. AB62, väk. 1,2 mg /ml), ja ei-spesifisen hiiren monoklonaalinen IgG1 ostettiin Sigma (cat. No. M9629, väk. 1 mg /ml). Polyklonaalinen anti-Stat3 (väk. 0,2 mg /ml), polyklonaalinen anti-Src (0,1 mg /ml), polyklonaalinen anti-EGFR (0,2 mg /ml), ja ei-spesifisen kanin IgG: tä (0,4 mg /ml) ostettiin Santa Cruz. Kaikki muut kemikaalit ja puskureita määritystä varten kehittämiseen hankittiin Sigmalta. Anti-EGFR-BKTL koetin valmistettiin lisäämällä 10 ui hiiren monoklonaalinen anti-EGFR-vasta-ainetta 1 ml BKTL. Kun oli inkuboitu 15 minuuttia huoneenlämpötilassa, koetin blokattiin 2,5 mg BSA 30 min. Sen jälkeen, kun oli sentrifugoitu 10000 rpm: llä 5 minuutin ajan, supernatantti heitettiin pois ja nanohiukkasten jäännös dispergoitiin 0,5 ml: aan 0,25% BSA: ta 10 mM fosfaattipuskurissa (PB). Koetin käytettiin sitten kokeessa. Negatiivinen kontrolli hiiren IgG1-BKTL koetin valmistettiin lisäämällä 10 ui hiiren monoklonaalista IgG1 vasta-ainetta 1 ml BKTL, ja noudattamalla identtinen käytetään EGFR koettimen valmistamiseksi. Hiiren IgG1 käytettiin tässä valmistella kontrollikoettimen, koska anti-EGFR monoklonaalinen vasta-aine on hiiren IgG1 tyypin vasta-aine.

Detection ja kineettinen sitovia tutkimus EGFR ydinvoimaloista ote BKTL antureista

Euroopan Panc-1 tumauutteesta näyte laimennettiin fosfaattipuskurissa (PB) ja 1 mg /ml kokonaisproteiinia. Vuonna näytesolusta dynaamisen valonsironta (DLS) mittaus (Hellma kyvetti QS 3 mm), 20 ui anti-EGFR-BKTL koetin sekoitettiin 2 ui näytettä, ja partikkelikoon kasvua luettiin DLS väline (Zetasizer Nano ZS90 DLS järjestelmä, Malvern Instruments Ltd, Englanti) on tasan 1, 6, 11, 16, ja 30 minuutin sekoituksen jälkeen. Sama koe suoritettiin myös käyttäen hiiren IgG1-BKTL koetin. Jotta voitaisiin vahvistaa spesifisyys anti-EGFR-BKTL anturi havaitsemiseksi EGFR ydin- uutetta, inhibointi koe tehtiin käsittelemällä 5 ui näytettä 1 ui monoklonaalista anti-EGFR-vasta-aine huoneenlämmössä 7 min ja 24 min ennen käyttämällä määrityksen näyte. Tämän inkuboinnin jälkeen lisättiin 20 ui anti-EGFR-BKTL koetin sekoitettiin 2 ui käsiteltyä näytettä, ja hiukkaskoko luettiin 1, 6 ja 11 min sekoituksen jälkeen.

Protein-kompleksin sitoutuneena kumppani tutkimuksessa, jossa käytettiin polyklonaalista vasta-ainetta

1,5 ml: n mikrosentrifugiputkeen, 80 ui anti-EGFRGNP koetin sekoitettiin 8 ui näytettä. Kun oli inkuboitu 30 minuuttia huoneenlämpötilassa, tämä liuos jaettiin neljään 20 ui annoksia. Siirron jälkeen näytteeseen soluun, partikkelikoko kaikkien näiden osien luettiin DLS väline. Tämän jälkeen käsittelyn, liuos, johon oli lisätty polyklonaalinen vasta-aine: joko 1 ui anti-Stat3 tai 2 ui anti-Src tai 1 ui anti-EGFR tai 0,5 ui kanin IgG. Hiukkaskoon kasvu luettiin tasan 5 min ja 10 min alkamisen jälkeen ensimmäisen käsittelyn.

Dynaaminen valonsironta (DLS) mittaukset

DLS mittaukset kaikista näyteliuoksista suoritettiin käyttäen Zetasizer Nano ZS90 DLS järjestelmä varustettu punaisella (633 nm) laser ja Avalanche valodiodin ilmaisimen (APD) (kvanttitehokkuuden 50% 633 nm) (Malvern Instruments Ltd). DTS sovelluksia 5.10 ohjelmistoa käytettiin analysointiin. Keskimääräinen hiukkaskoko (Z-keskiarvo) ja liuos saatiin käyttäen Cumulant menetelmää. Kunkin näytteen kymmenen DLS Mittaukset tehtiin yhdellä aikavälillä, ja kukin ajaa kesti 10 sekuntia. Kaikki mittaukset tehtiin 90 ° tunnistus kulmassa.

Tulokset

Detection ydinaseiden EGFR, Src ja Stat3 heterocomplex

pyrki tutkimaan signalointi mutkikkaaksi ja dynamiikka vuorovaikutuksesta hyperaktiivisen Stat3, EGFR ja Src [14], [16], [23] puitteissa ihmisen haimasyövän fenotyypin. Samanaikainen immunosaostus (co-IP) ja immunoblottaus-analyysi osoittaa, EGFR immunecomplex alkaen Panc-1 tai Colo-357 kokosolulysaateista sisälsi sekä Src ja Stat3 (Fig. 1A (i)), Src immunecomplex sisälsi sekä EGFR ja Stat3 (kuvio . 1A (ii)), kun taas Stat3 immuunisaostumassa sisälsi EGFR ja Src (Fig. 1A (iii)). Spesifisyyden, ei-spesifisen kanin IgG immunosaostus ja immunoblottauksella analyysi Src, Stat3 tai EGFR ei näkynyt havaittavissa olevaa proteiinia (Fig. 1A, IgG, ja tietoja ei ole esitetty), ja immunoblottaus-analyysi suoritetaan immuunijärjestelmän saostuu läsnäollessa kunkin esto peptidit (BP) oli täydellinen tai lähes täydellinen lohko immuunijärjestelmän havaitseminen Stat3, Src tai EGFR, pitoisuuksiin verrattuna havaita puuttuessa estää peptidien (Fig. 1 B (i) – (iii), vertailla + BP, alempi paneelit – BP, ylempi paneeli). Olemme määritti siRNA pudotus EGFR tai Src monimutkainen muodostumista. Co-immunosaostus immunoblottauksen tutkimukset kokosolulysaateista päässä Panc-1-solut osoittivat, että kun EGFR on pudotus siRNA (1C (i), ylemmän kaistan), Src immunecomplex edelleen liittyy Stat3 (Fig. 1 C (i), IP: Src), ja päinvastoin (Fig. 1 C (i), IP: Stat3). Samoin kun Src on pudotus siRNA (Fig. 1 C (ii), ylempi bändi), EGFR immunecomplex pysyy liittyy Stat3 (Fig. 1 C (ii), IP: EGFR), ja päinvastoin (Fig. 1 C (ii) , IP: Stat3). Salatut (con) siRNA ei ole vaikutusta. Nämä havainnot osoittavat, että suhteessa EGFR, Src ja Stat3 kompleksia, Stat3 proteiinit pysyy liittyy Src tai EGFR, vastaavasti, kun siRNA knockdown EGFR tai Src.

Immunoblottausmääritys analyysit immunecomplexes EGFR (IP : EGFR), Src (IP: Src), ja Stat3 (IP: Stat3), tai ei-spesifisten IgG ei-immunosaostumalla valmistettu kokosolulysaateista ja Panc-1 tai Colo-357-soluja transfektoimattomia (A ja B) tai transfektoitu EGFR siRNA, Src siRNA, tai ohjaus (con) siRNA (C) ja hyvää Src, Stat3 ja EGFR puuttuessa (A ja C) tai läsnä (B) Stat3 estävän peptidin (Stat3 BP), Src estävän peptidin (Src BP) tai EGFR estävän peptidin (EGFR BP). Bändit vastaavat proteiinien geelillä näkyvät; tulo: ellei toisin mainita, edustaa immunoblottaus vastaaville immunosaostettiin proteiini sama määrä lysaattia käytettiin määrityksessä; Tiedot edustavat 3 itsenäistä tutkimuksiin.

Kysyimme, onko havaittu EGFR, Src ja Stat3 kompleksia oli läsnä tumassa. Co-immunosaostus immunoblottausanalyysillä tumauutteiden osoittaa, että EGFR immunecomplex sisälsi sekä Stat3 ja Src (Fig. 2A (i), IP: EGFR), Src immunecomplex sisälsi sekä Stat3 ja EGFR (Fig. 2A (ii), IP: Src) , kun taas Stat3 immunecomplex sisälsi sekä EGFR: n ja Src (Fig. 2A (iii), IP: Stat3). Nämä tiedot osoittivat, että läsnä EGFR, Src ja Stat3 kompleksia tumassa. Varten spesifisyys immunoreagensseja, ei-spesifisen kaniinin IgG pull-down näytteitä, jotka oli samalla tavoin immunoblotattiin ei näkynyt havaittavissa EGFR, Src tai Stat3 (Fig. 2A, IgG ja tietoja ei ole esitetty). Immunoblottaus analyysi luotaa varten Tata sitovan proteiinin (TBP) vahvistettiin, että uutteita käytetään näissä tutkimuksissa ydinperäisen (Fig. 2A (iv)). Heteromeerisen kompleksi validoitiin suorittamalla peräkkäisiä immunosaostusanalyysille, jolloin EGFR immunecomplex (IP: EGFR) edelleen altistettiin sekundaarinen immunosaostus käyttäen anti-Src-vasta (IP: EGFR /IP: Src) ja sitten immunoblotattu EGFR ja Stat3. Tulokset näistä tutkimuksista osoittivat läsnäolon EGFR ja Stat3 peräkkäiseen immunosaostumissa (Fig. 2B, IP: EGFR /IP: Src). Sitä vastoin IgG avattavista joka alistettiin immunoblottauksella EGFR tai Stat3 ei osoittanut havaittavia määriä (Fig. 2B, IgG), joka edelleen varmistaa spesifisyys immunoreagensseja käyttää.

(A ja B) immunoblottausmääritys analyysit of immunecomplexes EGFR (IP: EGFR), Src (IP: Src), Stat3 (IP: Stat3), EGFR /Src (IP: EGFR /IP: Src) tai epäspesifisten IgG ei-immuneprecpitate valmistettu tumaekstrakteilla of Pancin-1 tai Colo-357-solujen ja hyvää varten Stat3, EGFR, Src, tai Tata sitovan proteiinin (TBP); ja (C), immuuniblottausanalyysi kalvon (mem) ja sytosolin (cyto) jakeet ja ydinvoiman (nuc) otteita Pancin-1-soluissa hyvää varten (i) EGFR, (ii) Stat3 ja (iii) Src. Bändit vastaavat proteiinien geelillä näkyvät; input: ellei toisin mainita, edustaa immunoblottaus vastaaville immunosaostettiin proteiini saman verran tumauutetta käytettiin määrityksessä; IP: EGFR /IP: Src, peräkkäinen immunosaostus anti-EGFR ja sitten anti-Src-vasta; Tiedot edustavat 3 itsenäistä tutkimuksiin.

Läsnäolo EGFR, Src ja Stat3 monimutkainen tumassa haimasyöpäsoluissa tutkittiin tarkemmin alistamalla tumauutteesta valmistelut geelisuodatuspylväskromatografia analyysi (Superdex200 , syrjäytyminen rajoittaa 200 kD), kuten kohdassa ”Materiaalit ja menetelmät”, yhdessä immuuniblottausanalyysi. Kerätyt fraktiot, joka osoitti piikin absorbanssi 280 nm: ssä (tuloksia ei ole esitetty) on immunoprobed. Tulokset osoittivat, että EGFR-proteiini esiintyy ensimmäisen kerran osa 23 ja on läsnä yhdessä Stat3 ja Src, ja kolme proteiinit samanaikaisesti havaitaan fraktioissa 23-29 (Kuva. S1A). Tulokset osoittivat myös havaittavissa Stat3 ja Src-proteiinien fraktioissa 30 kautta 32 hyvin jälkeen EGFR oli kokonaan eluoitunut (Fig. S1A). Analyysi aiemmin raportoitu EGFR-proteiinin kumppani, RNA helikaasia A (RHA) [24] osoittivat myös havaittavissa, jotka olivat pääasiassa fraktioissa 23 ja 24 (kuvio. S1A, RHA). Nämä fraktiot alistetaan edelleen co-immunosaostusanalyysille validoimiseksi kompleksin läsnäolo. Immunoblottaus analyysi EGFR immunecomplex valmistettu yhdistetyistä fraktioista 23-27 osoitti lisäksi läsnäolon Src ja Stat3 (Fig. S1B). Varhainen ja samanaikainen eluution EGFR, Src ja Stat3 esiin mahdollisuuden, että kukin proteiinien on osa korkeamman molekyylipainon proteiini monimutkainen, ja myös, että kolme proteiinit osakkuusyrityksen osana samalla monimutkainen, ehdottivat immunecomplex muodostumista . On ollut aiemman raportin ydinaseiden EGFR /Stat3 monimutkaisia ​​olosuhteissa solujen stimulaation EGF [10]. Siksi tutkimme, ydinvoiman EGFR, Src, Stat3 kompleksi oli läsnä konstitutiivisesti (ilman ligandia stimulaatiota) tuumorisoluissa. Immunoblottauksella analyysi ei havaittu mitään merkittävää tasoilla Stat3 tai Src EGFR immunecomplex tai Src tai EGFR Stat3 immuunisaostumassa ydin- uutteet valmistettiin ihmisen rintasyöpä, MDA-MB-231 ja ihmisen ei-pienisoluinen keuhkosyöpä, A549 linjat (Fig. S1C), mikä viittaa siihen, minimaalinen mahdollisuus, että on olemassa konstitutiivisen ydin- EGFR, Src, Stat3 monimutkainen kaksi syöpäsolutyyppien. Nämä tutkimukset yhdessä osoittavat ensimmäistä kertaa, että EGFR, Src ja Stat3 muodostavat kompleksia tumassa haiman syöpäsoluja.

Koska havaitseminen EGFR, Src ja Stat3 monimutkainen koko solun ja ydinvoiman lysaatit olimme kiinnostuneita määrittämään suhteelliset tasot ja koot EGFR, Src ja Stat3 eri solukomponenttien jakeet. Kalvo ja solulimafraktiot, ja ydin- uutteet valmistettiin Pancin-1-solujen vakiintuneiden protokollien ja joka käsitti 10% Nonidet P-40 lyysin ja vähäsuolainen HEPES-puskuria kopioiminen sytosolin uutetta, korkean suolaa HEPES-puskuriin louhinta ydin- uutteet (18, 22), ja 0,5% SDS-puskurissa membraanifraktion. Immunoblottauksella näytteiden analysointi yhtä peräisin olevan proteiinin kokonaismäärän solukomponenttien jakeet osoittaa, että kutakin EGFR, Src, tai Stat3 proteiini, jonka koko on sama kalvon (Mem), sytosolin (Cyto), tai ydin- osa (Nuc) (Fig. 2C). Tulokset osoittavat lisäksi, että taso koko EGFR-proteiini on korkein kalvo, ja on suurempi sytosolifraktion kuin tumaekstrakti (Fig. 2C (i)). Sen sijaan tulokset osoittavat, että Stat3 tasot ovat korkeimmat sytosolifraktion, ja korkeampi tumaekstrakti verrattuna tasoihin, jotka liittyvät solukalvon (Fig. 2C (ii)). Tulokset Src osoittivat myös huomattavia eroja, jossa kalvoon liittyvä korkeammalle tasolle sekä sytosolin ja ydinvoima tasoja, jotka olivat lähes identtiset (Fig. 2C (iii)). S2.