Krooninen sairaus

tiivistelmä

tavoite

kehittyminen hoidon kestävyys ja haitalliset myrkyllisyys liittyy klassisen kemoterapia-aineiden korostetaan turvallisempia ja tehokkaita terapeuttisia lähestymistapoja. Tässä tutkimme tehokkuutta yhdistelmän hoito 5-fluorourasiilin (5-FU) ja curcumin kolorektaalisyövässä (CRC) soluja.

Methods

Villityypin HCT116-solut ja HCT116 + CH3-soluja (täydennetty kromosomin 3) käsiteltiin kurkumiinin ja 5-FU on ajasta ja annoksesta riippuvaisella tavalla, ja arvioitiin Soluproliferaatiomäärityksiä DAPI-värjäyksellä, transmissioelektronimikroskopialla, solusyklin analyysi ja immunoblottaus avaimen signalointi proteiineja.

tulokset

yksittäiset IC

50 curcumin ja 5-FU oli noin 20 uM ja 5 uM HCT116-soluissa ja 5 uM ja 1 uM HCT116 + CH3 soluja, tässä järjestyksessä (

p 0,05

). Esikäsittely curcumin vähensi eloonjäämistä molemmissa soluissa; HCT116 + CH3-solut olivat huomattavasti herkempiä hoidon kurkumiinin ja /tai 5-FU kuin villityypin HCT116-soluissa. IC

50-arvot yhdistelmähoito oli noin 5 uM ja 1 uM HCT116 ja 5 uM ja 0,1 uM HCT116 + CH3, vastaavasti (

p 0,05

). Curcumin indusoi apoptoosia sekä soluissa indusoimalla mitokondrioiden rappeutuminen ja sytokromi c: vapauttaa. Solusyklin analyysi paljasti, että anti-proliferatiivista vaikutusta kurkumiinin ja /tai 5-FU edelsi kerääntyminen CRC solujen S solusyklin vaihe sekä apoptoosin induktion. Curcumin voimistua 5-FU-indusoitua tai pilkkomalla pro-apoptoottisten proteiinien (kaspaasi-8, -9, -3, PARP: n ja Bax), ja alas-säädellä anti-apoptoottiset (Bcl-x L) ja proliferatiivinen (sykliini D1) proteiineja . Vaikka 5-FU aktivoitua NF-KB /PI-3K /Src väylän CRC soluissa, tämä alas-säädellä curcumin hoitoon estämällä IκBα kinaasiaktivaatiota ja IκBα fosforylaation.

Johtopäätökset

Yhdistämällä curcumin tavanomaisten kemoterapeuttisten aineiden, kuten 5-FU voisi tarjota tehokkaamman hoidon strategioita vastaan ​​solunsalpaajaresistentti paksusuolen syöpäsoluja. Mekanismeja voidaan välittyvän NF-KB /PI-3K /Src polkuja ja NF-KB säänneltyjä geenituotteet.

Citation: Shakibaei M, Mobasheri A, Lueders C, Busch F, Shayan P, Goel (2013) Curcumin Parantaa vaikutus Kemoterapia vastaan ​​peräsuolen syövän solut inhiboimalla NF-KB: n ja Src proteiinikinaasi signalointireittejä. PLoS ONE 8 (2): e57218. doi: 10,1371 /journal.pone.0057218

Editor: Bharat B. Aggarwal, The University of Texas M. D. Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 22 tammikuu 2013; Julkaistu: 22 helmikuu 2013

Copyright: © 2013 Shakibaei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi johtavista kuolinsyistä miesten ja naisten, ja joukossa kolmanneksi yleisin syövät maailmanlaajuisesti [1]. Esiintyvyys CRC kasvaa edelleen huolimatta ymmärryksen lisääntyessä patogeneesin tämän sairauden, sekä perustamalla parantunut seulonta strategioita tämän maligniteetti. On raportoitu, että lähes 50%: lla potilaista, joilla CRC, kehittyy uusiutuva sairaus, mikä osoittaa, että tällä hetkellä saatavilla hoito-ohjelmat eivät pysty hallitsemaan tätä tappavaa tautia ja on välttämätöntä tarvetta parantaa hoitojen [2]. 5-fluorourasiili (5-FU) on yksi klassista lääkkeitä käytetään kemoterapeuttisen aineen vastaan ​​CRC. 5-FU hoito estää kasvainsolujen kasvua ja indusoi apoptoosin sisällyttämällä sen metaboliitit DNA ja RNA kautta tymidylaattisyntaasia. Kuitenkin, voitot tekemät kemoterapeuttisen tehoa 5-FU vähäisempiä potilailla, joilla peräsuolen syöpä, johtuen ensisijaisesti hankittu progressiivisen vastuksen CRC solujen 5-FU ja myrkyllisyys ympäröiviin terveisiin soluihin [3], [4].

Suurin kasvaimia aktivoida transkriptiotekijä Nukleaaritekijä-KB (NF-KB), kun taas luonnollinen kemopreventiivisiä aineita tukahduttaa sen, mikä osoittaa vahvan yhteyden tuumoribiologiassa ja syövän vaikutukset eri luonnollisia yhdisteitä [5]. Toisin kuin terveitä soluja, useimmissa kiinteiden ja hematopoieettisten kasvainsolulinjoja NF-KB: n on konstitutiivisesti aktiivinen [6]. Lisäksi pro-inflammatoristen sytokiinien, kemoterapeuttiset aineet ja sädehoito, jotka indusoivat apoptoosin myös aktivoida NF-KB: n [7], ja näin voivat välittää chemoresistance ja radioresistance kasvainsolujen [8]. Mielenkiintoista, NF-KB kasvainsoluissa lohkojen leviämisen, aiheuttaa solusyklin pysähtymiseen, ja johtaa apoptoosin, mikä viittaa keskeinen rooli tämän transkriptiotekijän solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen [9]. NF-KB: llä on tärkeä rooli solujen lisääntymisen ja pahanlaatuisiin eri soluissa, sitoutuminen DNA-kohteeseensa sivustoja homo- tai heterodimeerin vaikuttaa alavirran geenin ilmentymistä [10], [11].

CRC uskotaan esiintyy seurauksena vaiheittain kertyminen geneettisiä muutoksia eri geenien joka parantaa genomin epästabiilisuuden. Tällaiset muutokset on suora vaikutus etäpesäkkeitä liittyvien geenien, onkogeenien ja tuumorisuppressorigeeneille [12], [13]. Lisäksi on lisääntynyt tunnustetaan, että lisäksi geneettisiä tapahtumia CRC, muutokset geenien ilmentymisessä saattaa välittää epigeneettisellä muutoksia kuten poikkeava metylaatio DNA, histonimodifikaation ja chromatin remodeling [14], [15]. Lisäksi epäsuhta korjaus (MMR) järjestelmä on keskeinen rooli oikoluku DNA-synteesiä virheitä aikana solunjakautumista. Vaurioituminen MMR järjestelmä aiheuttaa geneettinen epävakaus, joka johtaa muutoksiin solun fenotyyppiin, tekee solun alttiimpia neoplastisen muutoksen ja kehittämisen helpottaminen kemoterapeuttisen resistenssin. DNA MMR proteiineja, kuten hMSH2, hMSH3, hMSH6, hMLH1, hPMS2 ja hMLH3 tärkeä rooli sekä Satunnaista ja perinnöllistä lajikkeiden ihmisen CRC [16], [17], [18], [19]. Itse asiassa palauttaminen MMR vika uudelleen ilmentäminen hMLH1or hMSH2 kromosomi siirto antaa tuotteelle lisääntynyt herkkyys tekijöille [20], [21].

CRC on ehkäistävissä sairaus ja vaikuttavat voimakkaasti ympäristöön , elintapojen ja ruokavalion tekijät. Tässä yhteydessä on olemassa kasvava määrä kirjallisuutta viittaa siihen, että useita luonnollisia esiintyviä aineita ravintolisiä voi vähentää syöpäriskiä ja on raportoitu järjestää keskeinen rooli kehitettäessä anti-kasvain huumeet [22], [23]. Luonnontuotteet kyky estää aktivoinnin tumatranskriptiotekijä NF-KB voi olla terapeuttista potentiaalia vastaan ​​kasvainten kehittymiseen kuten CRC. Curcumin (diferuloylmethane) on biologisesti aktiivinen phytochemical komponentti läsnä mauste kurkuma (

Curcuma longa

), ja sen on osoitettu olevan tehokas estäjä NF-KB: n aktivaation useissa solutyypeissä myrkytöntä pitoisuuksina ihmisissä [ ,,,0],24]. Anti-kasvain ominaisuus curcumin, johtuu osittain pidätyksen syöpäsolujen S, G2 /M solusyklin vaihe sekä apoptoosin. Lisäksi kurkumiini estää niiden kasvun DNA MMR-vajaiden paksusuolen syövän soluja [25], [26]. On myös raportoitu, että curcumin alas-säätelee konstitutiivisesti aktivoitua kinaasi PI-3K /AKT reittejä T-solujen leukemian soluja, mikä hillitsee ja indusoi kaspaasiriippuvaisen apoptoosin [27].

Koska peräsuolen syöpäpotilaat DNA mismatch korjaus puute eivät hyödy 5-FU kemoterapian, käytimme pari isogeenisten solulinjojen, HCT116 (MMR-puutteellisia hypermetylaatiota MLH1 geeni) ja HCT116 + CH3 (MMR-taitava, koska vakaa siirrosta kromosomi 3 laakeri villityypin kopion MLH1 geeni). Tutkimuksen tavoitteena oli tutkia tutkia Chemosensiti- mahdollisuuksia curcumin 5-FU-kemoterapiaan in MMR puutteesta ja -proficient CRC soluja.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta

Vasta-aineet MMP-9 (MAB 911) ja aktiivisen kaspaasin 3 (AF835) saatiin R Zeiss). Määrällisesti morfologiset arviointien ja määritellä ajankohdan, jossa 50% soluista osoitti mitokondrion muutokset (MC) ja /tai ne olivat apoptoottisia määrä solujen morfologisia piirteitä apoptoottisen solukuoleman, kuten MC määritettiin pisteyttämällä 100 solua 20 eri mikroskooppikentästä.

Cell Cycle Analyysi virtaussytometria

HCT116-soluja (1 x 10

6) maljattiin 60 mm: n kudosviljelymaljoille, ja sen jälkeen noin 80%: n konfluenssiin soluja käsiteltiin 20 uM curcumin, 5 uM 5-FU, tai niiden yhdistelmän (5 uM kurkumiinin ja 1 uM 5-FU), 12 ja 24 h. Erillisessä kokeessa, HCT116 + CH3-soluja käsiteltiin 5 uM curcumin, 1 uM 5-FU, tai niiden yhdistelmän (5 uM kurkumiinin ja 0,1 uM 5-FU), 12 ja 24 h. Käsittelyn jälkeen solut kiinnitettiin käyttämällä jääkylmää 70% etanolia, pestiin 2 x PBS: llä ja suspendoitiin sitten uudelleen propidiumjodidilla (10 ug /ml) ja ribonukleaasi A (0,1%) PBS: ssa 30 min. Soluja inkuboitiin 30 minuuttia pimeässä huoneen lämpötilassa. Fluoresoiva tapahtumia propidiumjodidista-DNA-kompleksit kvantitoitiin sen jälkeen, kun laser heräte fluoresoivan väriaineen fluoresenssin soluerottelijalla (FACS) (Becton Dickinson, CA) ja solumäärän 10000 solua per näyte. Lopuksi, DNA-pitoisuus solujen eri vaiheissa solusyklin määritettiin käyttämällä Cell Quest -ohjelmistoa (Becton Dickinson). Kokeet ja analyysi tehtiin kolmena kappaleena.

valmistaminen ydin- ja sytoplasmisen otteet arvioida NF-KB translokaatio

ydin- uutteet valmistettiin kuten aiemmin on kuvattu [31]. Lyhyesti, solut suspendoitiin 400 ul: aan hypotonista hajotuspuskuria, joka sisältää proteaasi-inhibiittoreita: ssa 20 minuuttia. Sitten solut hajotettiin 12,5 ui 10% Nonidet P-40. Homogenaattia sentrifugoitiin 1,5 minuuttia, ja supernatantti (sytoplasminen uutteet) säilytettiin pakastettuna -70 ° C: ssa. Sitten 25 ui jääkylmää ydin- uuttopuskuria lisättiin pellettien ja inkuboitiin 30 minuuttia ajoittain sekoittaen. Uutteet sentrifugoitiin ja supernatantti (tumauutteiden) siirretään ennalta jäähdytetty putket varastointia varten -70 ° C: ssa.

eristäminen mitokondrioiden uutteet havaitsemiseksi sytokromi c: n vapautumisen

Solut pestiin 1 ml: lla jääkylmää PBS: ää ja laitettiin jääkylmään mitokondrioiden eristämisen-puskuria (0,25 M sakkaroosi, 0,2 mM EDTA, ja 10 mM Tris-HCl, pH 7,8) 30 minuutin ajan, minkä jälkeen homogenisointi käyttäen ennalta jäähdytetty lasi-homogenisaattoria. Solulysaatit sentrifugoidaan 1000 g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa ja supernatantti sentrifugoitiin 12000 g: ssä 15 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Eristetyt mitokondriot suspendoitiin uudelleen mitokondrioissa erillään puskuria, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita (5 ug /ml leupeptiiniä, 5 ug /ml pepstatiinia, 10 ug /ml aprotiniinia, 1 mM PMSF, 1 mM DTT, 100 mM natriumortovanadaatti, 10 mM natriumfluoridi, ja 10 mM fenyyliarsiinioksidin oksidi).

Western blot-analyysi

vaikutusten määrittämiseksi kurkumiinin, 5-FU tai kurkumiini /5-FU on HCT116 ja HCT116 + CH3-soluja, kokosolulysaateista, sytoplasmisen , mitokondrioiden ja ydinvoiman otteet yksikerrosviljelmiä valmistettiin ja fraktioidaan SDS-PAGE: [29], [32]. Proteiinin kokonaismäärän konsentraatio solu-uutteiden määritettiin käyttäen bikinkoniini- happoa määritysjärjestelmä (Uptima, Interchim, Montlucon, Ranska) käyttäen BSA: ta standardina. Yhtä suuret määrät (500 ng proteiinia kaistaa kohti) koko proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla (5%, 7,5%, 12% geelit), pelkistävissä olosuhteissa.

Immuunikompleksi kinaasimääritys

Immune Monimutkainen kinaasimääritys suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu yksityiskohtaisesti [33]. Lyhyesti, testata vaikutusta kurkumiinin ja PI-3K estäjä (wortmanniinin) 5-FU-indusoidun IKK aktivointi, immuunikompleksisairaudet kinaasimääritykset suoritettiin. IKK kompleksi immunosaostettiin kokosolulysaateista vasta-aineilla IKK-α ja IKK-β ja sen jälkeen inkuboitiin proteiini A /G-agaroosi-helmiä (Pierce, Saksa). 2 tunnin kuluttua inkubaation jälkeen helmet pestiin lyysipuskurilla ja suspendoitiin uudelleen kinaasimääritys, joka sisälsi 50 mM HEPES (pH 7,4), 20 mM MgCI2, 2 mM ditiotreitolia, 10 uM leimaamatonta ATP: tä ja 2 mg IKK substraatin GST-IκBα ( aminohappo 1-54) ja inkuboitiin 30 ° C: ssa 30 minuutin ajan. Tämän jälkeen keittämällä SDS-PAGE-näytepuskurissa 5 minuutin ajan. Proteiinit erotettiin SDS-PAGElla pelkistävissä olosuhteissa, kuten edellä on kuvattu. Fosforylaatio GST-IκBα arvioitiin käyttämällä spesifistä vasta-ainetta vastaan ​​fosfospesifisiä IκBα (Ser 32/36). Osoittaa kokonaismäärät IKK-α ja IKK-β kunkin näytteen, koko solun proteiinit erotettiin SDS-PAGE: lla pelkistävissä olosuhteissa kuten edellä on kuvattu. Detection of IKK-α ja IKK-β suoritettiin immunoblottauksella joko anti-IKK-α tai anti-IKK-β-vasta-aineita.

Tilastollinen analyysi

Numeeriset tulokset on ilmoitettu keskiarvoina ( +/- SD) on edustava koe suoritettiin kolmena kappaleena. Välineet verrattiin käyttäen opiskelijan t-testiä olettaen yhtä suuri varianssit. Erot katsottiin tilastollisesti merkitsevä, jos P-arvo oli alle 0,05.

Tulokset

Tämä tutkimus suunniteltiin tutkimaan, kuinka curcumin estää leviämisen CRC-solujen ja voimistaa vaikutukset kemoterapeuttinen aine 5-FU käytettäessä

in vitro

malli ihmisen CRC soluja. Lisäksi tutkimme mekanismi (t), jolla curcumin lisää antiproliferatiivisia vaikutuksia 5-FU, erityisesti vaikutukset NF-KB: n ja Src aktivointi, NF-KB-säänneltyjä geenituotteiden, ja solujen kasvua CRC soluissa. Kaksi ihmisen CRC soluja (HCT116 ja HCT116 + CH 3) käytettiin tässä tutkimuksessa.

Curcumin herkistää HCT116 ja HCT116 + CH3 koolonkarsinoomasoluissa 5-FU-hoidon mikä alentaa solujen elinkelpoisuuden ja lisääntymistä

vaikutuksia 5-FU: n ja /tai kurkumiinista solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-määritys HCT116 ja HCT116 + CH3-solut (Fig. 1). Sen näiden mittausten perusteella, IC

50-arvot (50% solujen kasvua estävät pitoisuudet) yksittäisten ja yhdistettyjen huumeita HCT116 ja HCT116 + CH3 paksusuolensyöpä solujen elinkelpoisuus määritettiin. Solut altistettiin eri pitoisuuksia kurkuma tai 5-FU (0, 1, 5, 10, 20, 40 ja 80 uM), ja solujen elinkelpoisuus arvioitiin MTT-analyysi, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät (Fig. 1A 1C ). Yksittäiset IC

50 curcumin ja 5-FU oli noin 20 uM ja 5 uM HCT116-soluissa ja 5 uM ja 1 uM HCT116 + CH3 soluja, tässä järjestyksessä (

p

0,05). Nämä tulokset viittaavat siihen, että kurkuma ja 5-FU on voimakas antiproliferatiivisia vaikutuksia CRC soluissa ja että nämä vaikutukset ovat voimakkaampia HCT116 + CH3 kuin HCT116-soluissa.

V: HCT116-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla curcumin tai 5-FU (0, 1, 5, 10, 20, 40 ja 80 uM) 24 tunnin ajan, ja solujen elinkyky mitattiin käyttäen MTT-menetelmällä. Pitoisuuksia curcumin ja 5-FU johtaa 50%: n kasvu esto ilmaistiin yksittäisinä IC

50-arvot. B: HCT116-soluja esikäsiteltiin kurkumiini (5 uM 4 h), altistetaan sitten 5-FU: n eri pitoisuuksilla (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 ja 5 uM) 24 tunnin ajan ja arvioitiin MTT: llä. IC

50 5-FU hoidossa yhdistelmähoito määritettiin 50%: n kasvua estämällä HCT116-soluja. Sama esitetyissä kokeissa (A) ja (B) suoritettiin HCT116 + CH3-soluja. IC

50-arvot single (C) ja yhdistelmä hoito (D) on laskettu MTT mittauksia. Tulokset esitetään keskiarvoina kanssa keskihajonnat vähintään kolmesta itsenäisestä kokeesta. Verrattiin kontrolliin ja tilastollisesti merkitsevä arvot p 0,05.

vaikutuksen tutkimiseksi yhdistetyn kohtelun kurkuma ja 5-FU, HCT116 tai HCT116 + CH3 solut esikäsiteltiin 5 uM curcumin 4 tuntia ja sitten yhteistyössä käsiteltiin eri pitoisuuksilla 5-FU: ta (0, 0,1, 1, 2, 3, 4 ja 5 uM) 24 tunnin ajan (Fig. 1 B 1D). MTT-analyysi suoritettiin ja IC

50-arvot määritettiin. Mielenkiintoista, esikäsittely 5pM curcumin pienentää IC

50-arvot 5-FU 1 uM HCT116 ja 0,1 uM HCT116 + CH 3 (

p

0,05) soluja. Nämä tulokset osoittavat, että solut esikäsitelty curcumin olivat herkempiä 5-FU kuin soluissa, joita käsiteltiin 5-FU yksin ja käyttöönotto kromosomin 3 HCT116-solut osoittivat lisääntynyttä herkkyyttä solujen hoitoon 5-FU: n ja /tai curcumin verrattuna HCT116 villityypin.

yhdistelmä vaikutus kurkuma ja 5-FU apoptoosin HCT116 ja HCT116 + CH3 solujen

onko estävä vaikutus kurkuma ja 5-FU solujen elinkykyä ja solujen kasvua liittyy apoptoosin induktion, HCT116 ja HCT116 + ch3 solut värjättiin Hoechst 33258 (DAPI). Tämä fluoresenssipohjaiset värjäys menetelmä paljastaa apoptoottisia kappaleita sisältävä ydin- pirstoutumista ja chromatin tiivistymisen apoptoottisia soluja. HCT116 ja HCT116 + ch3 solut altistettiin eri pitoisuuksia kurkuma tai 5-FU (0, 1, 5, 10 ja 20 uM) tai yhdistelmä kurkuma (5 uM) ja 5-FU (0,1, 1, 2 ja 3 uM). Applied pitoisuudet laskettiin IC

50-arvot kurkuma ja 5-FU määritettiin MTT määrityksiä. Kuten on esitetty kuviossa. 2, määrä apoptoottisten tumien lisääntyi merkittävästi soluissa yhdistelmä hoitoryhmässä. Tämä vahvisti tulokset kuvassa. 1B 1D ja paljasti, että kurkuma herkistää HCT116 paksusuolen syövän soluja 5-FU: n indusoiman apoptoosin. Lisäksi palauttaminen hMLH1 aktiivisuuden HCT116-soluissa, jonka käyttöönotto kromosomi 3, liittyi lisääntynyt herkkyys 5-FU ja 5-FU: n indusoiman apoptoosin.

HCT116 ja HCT116 + CH3 soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla kurkuma tai 5-FU (0, 1, 5, 10 ja 20 uM) tai niiden yhdistelmän kurkuma (5 uM) ja 5-FU (0,1, 1, 2 ja 3 uM) 24 tuntia. Yksikerrosviljelmiä värjättiin Hoechst 33258 (DAPI) paljastaa apoptoottisten muutoksia solutumien.

Curcumin parantaa 5-FU aiheuttamaa mitokondrioiden muutoksia ja apoptoosin HCT116 ja HCT116 + CH3 solujen

Kuten kuviossa. 3, HCT116 paksusuolen syövän soluja käsiteltiin kurkumiini (20 uM), 5-FU (5 uM) tai molempia (kurkuma 5 uM ja 5-FU 1 uM) 12, 24, 36, 48, 60 ja 72 h, vastaavasti. Elinkelpoisuus ja morfologisia muutoksia solujen määritettiin Mikroskooppitutkimus tutkimus transmissioelektronimikrokoopilla. HCT116 koolonkarsinoomasoluissa vertailuviljelmissä näytteillä pyöristetty /pallomainen morfologia pieniä soluliman prosessit, suuret ytimet (enimmäkseen euchromatic) erottuva nucleoli ja hyvin organisoitu solulimassa koko hoitojakson ajan (Fig. 3, ohjaus: A-F). Hoito HCT116 viljelmien curcumin tai 5-FU yksinään jopa 36 tuntia johti rappeuttavat, kuten ulkonäkö useiden Vakuoleissa turvotus mitokondrioita ja karkea ER ja rappeutumista muiden soluorganellit (Fig. 3, 5-FU, Cur : A-C). Pidemmät itämisaika kanssa curcumin tai 5-FU (60 ja 72 tuntia) johti enemmän solunrappeuman. Tämä sisältyi alueita tiivistyneen heterochromatin solun tumaan ja useita, autophagic soluliman vacuoles; soluista muuttui apoptoottinen (Fig. 3, 5-FU: F, Cur: E-F). Esikäsittely HCT116 viljelmien curcumin (5 uM) 4 h, jonka jälkeen yhteistyö käsittelemällä 5-FU (1 uM) samana ajanjaksona tuotiin esiin merkittävä vaikutus. Laajat morfologiset rappeuttavat ominaisuuksia, mitokondrion turpoaminen ja apoptoosin havaittiin niinkin aikaisin kuin 36 h HCT116-soluissa ja jatkoi kerääntyä kunnes 72 h (Fig. 3, Cur + 5-FU HCT116: C). Verrattuna HCT116-soluja, tutkimukset suoritettiin myös HCT116 + CH3-soluja käsiteltiin yhdistelmällä 5 uM kurkumiinin ja 0,1 uM 5-FU. Täällä nämä vaikutukset olivat entistä tärkeämpi ja apoptoottisia soluja paljastetun 12 tunnin kuluttua hoidon (Fig. 3, Cur + 5-FU HCT116 + CH 3: A). Nämä tulokset vahvistivat, että herkkyys 5-FU tehostettiin esikäsittelemällä curcumin ja että tämä oli pahentavat HCT116 + CH3 soluja.

HCT116-soluja käsiteltiin curcumin (20 uM), 5-FU (5 uM) tai molempien yhdistelmä (5 uM kurkumiinin ja 1 uM 5-FU) 12, 24, 36, 48, 60 ja 72 h. Käyttämällä eri lähestymistapaa HCT116 + ch3 soluja käsiteltiin yhdistelmällä 5 uM kurkumiinin ja 0,1 uM 5-FU: n 12, 24, 36, 48, 60 ja 72 h. Ultraohuet leikkeet valmistettiin ja arvioitiin transmissioelektronimikroskopialla. Micrographs esitetään edustavat kaikki kulttuurit arvioidaan. Aikaisintaan ajankohta, jolloin apoptoosi havaittiin ensimmäisen kuvat ovat korostettu nuolin. Mitokondrioiden muutokset (nuolenpäät) esitetään. Suurennus: X5000, bar = 1 pm.

kvantifiointi ja tilastollinen arviointi Mikroskooppitutkimus tietojen selvästi esiin ajan funktiona vaikutukset kurkuma ja /tai 5-FU-hoidon mitokondrion muutoksista (MC) ja apoptoosin in HCT116 ja HCT116 + CH3 soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 4A B, yli 50% soluista osoitti MC tai apoptoottisia piirteitä 24 tunnin inkubointiaika on yhdistelmä kokeissa HCT116-solujen ja 12 tuntia yhdistelmä kokeissa HCT116 + CH3 solut (

p

0,05) . Jälleen tämä viittaa siihen, että curcumin herkistää HCT116 ja HCT116 + CH3 soluja 5-FU: n indusoiman apoptoosin. Tulokset osoittavat, että on hyvin pieni määrä 5-FU: ta (0,1 uM), on tarpeen tukahduttamaan solujen elinkelpoisuuden yhdistettynä hienoiseen annoksen curcumin (5 uM). Lisäksi nämä havainnot vahvistavat, että kromosomin 3 HCT116-soluissa merkittävästi lisää herkkyyttä solujen hoitoon 5-FU ja /tai curcumin verrattuna HCT116 soluihin.

määrällisesti Mikroskooppitutkimus havaintojen HCT116 (A) ja HCT116 + CH3 (B) käsitellyt viljelmät, kuten on kuvattu kuviossa. 3 tutkittiin apoptoottinen ja mitokondrioiden muutokset (MC) laskemalla 100 solua 20 mikroskooppikentäs-. Tarkastelu suoritettiin kolminkertaisena ja tulokset annetaan keskiarvoina kanssa keskihajonnat SD (

p

0,05) kolmesta itsenäisestä kokeesta.

vaikutukset kurkuma ja /tai 5-FU solusyklin ja apoptoosin HCT116 ja HCT116 + CH3 solujen

tutkia mekanismeja, joilla curcumin ja /tai 5-FU inhiboimaan HCT116 ja HCT116 + CH3 soluissa, tutkimme ja vertailivat vaikutus kasvuvauhti eston ja tasot apoptoosin. Niinpä määritettiin käyttäytymistä näiden kahden CRC-solujen eri vaiheissa solusyklin virtaussytometrisellä analyysillä (Fig. 5A /B). HCT116-soluja käsiteltiin 20 uM kurkuma tai 5 uM 5-FU tai niiden yhdistelmän (5 uM kurkumiinin ja 1 uM 5-FU), 12 ja 24 h. Erillisellä kokeella, HCT116 + CH3-soluja käsiteltiin 5 uM kurkuma tai 1 uM 5-FU tai niiden yhdistelmän (5 uM kurkumiinin ja 0,1 uM 5-FU), 12 ja 24 h. Käsitellyt solut otettiin talteen ja käsiteltiin virtaussytometria-analyysiä. Merkittävin vaikutus sekä yhden ja yhdistetty hoito oli ajasta ja pitoisuudesta riippuvainen väheneminen solujen G1-vaiheen ja kerääntyminen solujen S-vaiheen solusyklin. Tämä vaikutus oli vielä selvempi HCT116 + CH3 soluissa kuin HCT116-soluissa. 12 tunnin kuluttua hoidon, mikä oli ensimmäinen kerta vaiheessa emme tutki vaikutukset curcumin ja /tai 5-FU solusyklin olivat jo hyvin selvästi. Lisäksi muutokset G1-S-vaiheessa jakelun, solujen lukumäärä apoptoosin oli merkittävästi koholla hoitoon. Mielenkiintoista, vaikutukset yhdistelmähoidon selvästi korkeammat kuin yhden hoitoja. 24 tunnin käsittelyn vaikutusta solusyklin tuli yleinen selvempi molemmissa koolonkarsinoomasoluissa, mutta oli vielä selvemmin HCT116 + CH3 soluissa kuin HCT116-soluissa. Kuten on esitetty kuviossa. Kuten on esitetty kuviossa.