Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tavoitteet

kasvutekijän reseptorin (EGFR) tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) ovat osoittaneet dramaattinen kliinistä hyötyä kehittyneiden ei-pienisoluinen keuhkosyöpä (NSCLC); kuitenkin, vastus on edelleen vakava ongelma kliinisessä työssä. Tässä tutkimuksessa analysoitiin mTOR-signaloinnin-reitin erot EGFR-TKI-herkkä ja kestävä NSCLC solulinjojen ja tutkinut mahdollisuutta kohdistaminen mTOR erityisiä mTOR-estäjä EGFR-TKI resistenttien NSCLC soluja.

Methods

valittu neljä erilaista EGFR-TKI-herkkä ja kestävä NSCLC-solut: PC9, PC9GR, H1650 ja H1975 solujen malleja havaitsemiseksi mTOR-signaloinnin-reitin erot western blot ja immunosaostus ja arvioidaan antiproliferatiivinen vaikutus ja solusyklin pidätyksen ku-0063794 MTT menetelmällä ja virtaussytometria.

tulokset

Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että mTORC2 liittyvä Akt Ser473-FOXO1 signalointireitistä peruselatusaineessa tilassa oli suuresti aktivoituu resistentit solut.

In vitro

mTORC1 ja mTORC2 kinaasiaktiivisuudet määritykset osoittivat, että EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC solulinjoissa oli korkeampi mTORC2 kinaasiaktiivisuutta, kun taas herkät solut oli korkeampi mTORC1 kinaasiaktiivisuutta basaalieritykseen tilassa. ATP-kilpailukykyinen mTOR-estäjä ku-0063794 osoittivat dramaattisia antiproliferatiivisia vaikutuksia ja G1-solukierron pysähtymisen sekä herkkien ja resistenttien solujen. Ku-0063794 on IC

50 pitoisuus esti tehokkaasti sekä mTOR ja p70S6K fosforylaation tasoja; jälkimmäinen on mTORC1 substraatti eikä upregulate Akt Ser473 fosforylaatio, joka indusoida rapamysiini ja johti estämällä osittain FOXO1 fosforylaation. Havaitsimme myös, että EGFR-TKI-herkkä ja kestävä kliininen NSCLC kasvain näytteet oli suurempi koko ja fosforyloituu p70S6K ekspressiotasoja.

Johtopäätös

Tuloksemme osoittavat mTORC2 liittyvän signalointi-koulutusjakso on hyperactivated EGFR TKI-resistenttejä soluja ja kohdistaminen mTOR erityisiä mTOR estäjät todennäköisesti hyvä strategia potilaille, joilla on EGFR mutantti NSCLC jotka kehittävät EGFR-TKI vastarintaa; mahdolliset erityiset roolit mTORC2 EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC-solut olivat vielä tuntemattomia ja niitä pitäisi tutkia edelleen.

Citation: Fei SJ, Zhang XC, Dong S, Cheng H, Zhang YF, Huang L, et al . (2013) Targeting mTOR voittamiseksi epidermaalisen kasvutekijän reseptori tyrosiinikinaasi-inhibiittori Resistance in Non-pienisoluinen keuhkosyöpä solut. PLoS ONE 8 (7): e69104. doi: 10,1371 /journal.pone.0069104

Editor: Jingwu Xie, Indiana University School of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 14 helmikuu 2013; Hyväksytty: 5. kesäkuuta 2013. Julkaistu: 16 heinäkuu 2013

Copyright: © 2013 Fei et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia National Natural Science Foundation of China (nro 30772531 ja nro 81071699, www.nsfc.gov.cn), Guangdong sosiaalinen kehittäminen tieteen ja teknologian suunnitelma (n: o: 2011A030400010, www.gdstc.gov .cn /). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat sai Gefitinibi AstraZenecalta in vitro kokeissa niiden lab. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

kasvutekijän reseptorin (EGFR) signalointireitin on keskeinen rooli kehitettäessä ja etenemisen keuhkosyövän [1]. EGFR tyrosiinikinaasin estäjät (TKI) gefitinibi ja erlotinibi ovat tehokkaita kliinisissä hoitoja potilaille, joilla on edennyt NSCLC, jotka ovat EGFR-aktivoitu mutaatioita verrattuna standardi ensilinjan solunsalpaajahoidosta [2] – [4]. Huolimatta nämä dramaattiset hyödyt EGFR TKI, kaikkia näitä potilaita väistämättä vastustuskykyiseksi gefitinibin ja erlotinibin, yleensä 6-12 kuukauden ajan aloittamisesta TKI hoidon [5]. Useat mekanismit, kuten T790M mutaation EGFR, MET vahvistusta, ja yli-ilmentyminen hepatosyyttien kasvutekijän (HGF), indusoi kehittynyt resistenssi palautuvia EGFR-TKI varten NSCLC EGFR-aktivoivia mutaatioita [6] – [8]. Keino voittamiseksi TKI vastuksen edelleen haaste kliinisessä työssä. Yleensä strategioita vastustus harkita vastus itse mekanismin [7], [9], [10], kun taas vaihtoehtoinen strategia on tunnistaa uusia molekyylejä tai mekanismeja, voittaa vastus, kuten mTOR.

mTOR on konservoitunut seriini /treoniini-kinaasi, joka esiintyy mTORC1 ja mTORC2 kompleksit [11]. Se yhdistää signaaleja kasvutekijöitä, ravinteiden saanti, ja energian tila aktivoida solujen kasvua, ja ylössäädellään erilaisissa syövissä [12]. Siksi tutkimukset kohdistuvat mTOR syövän hoitoon on saanut huomiota viime vuosina. Kuitenkin kliininen vaste rapamysiiniä ja sen analogit on heikko [13]. Useat tutkimukset ovat osoittaneet mekanismeja sen huono vaste sekä

in vitro

ja

in vivo

[14] – [16]. Meidän edellinen raportti osoitti myös, että kaikki NSCLC solulinjat meidän lab ovat vastustuskykyisiä RAD001 (rapamysiinianalogin) [17]. Itse asiassa, rapamysiini vain osittain estää mTORC1 toimintoja ja sen sijaan aiheuttaa Akt Ser473 fosforylaation [16] ja ei estä mTORC2 lainkaan [18]. Uudemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että mTORC2 säätelee solujen eloonjäämistä ja solun tukirangan organisaatioon säätämällä fosforylaatioon sen substraattien, Akt hydrofobinen motiivi (HM) päällä (Ser473) ja PKC-a-HM-sivusto (ser657) [19], [20]. mTORC2 kinaasin aktiivisuus kasvaa joissakin kasvaimissa; Näin ollen, kohdistaminen mTORC2 voi estää syöpäsolujen kasvua ja lisääntymistä [21] – [23]. Siksi me arveltu, että mTORC2 tärkeä rooli solujen kasvun ja lisääntymisen ja että kohdistaminen mTOR erityisiä mTOR-inhibiittorit tuottaisi paremman antituumorivaikutuksia jälkeen TKI-kehittynyt resistenssi.

Ensin analysoidaan eroja mTOR- liittyvä signalointi polkuja välillä EGFR-TKI-herkkä ja kestävä NSCLC solujen pohjapinta tilassa

in vitro

. Sitten me analysoitiin mTORC1 ja mTORC2 kinaasiaktiivisuudet

in vitro

. Lopuksi arvioitiin antiproliferatiivisia vaikutuksia ja solusyklin pidätyksen ku-0063794 ja analysoitiin ilmentyminen koko ja fosforyloidun p70S6K kasvaimen yksilöitä.

Materiaalit ja menetelmät

Vasta-aineet ja Regents

Ku-0063794 (TOCRIS, Minneapolis, MN, USA) ja puhdas gefitinibi, ystävällisesti AstraZeneca, valmistettiin DMSO: hon ja laimennettiin elatusaineeseen ennen käyttöä. mTOR (# 2983), p-mTOR (# 2971), Rictor (# 2114 ja # 5379), Raptor (# 2280 ja # 5382), Akt (# 9272), p-Akt Ser473 (# 4060), p-p70S6K (# 9208), p-4EBP1 (# 9459), FOXO1 (# 2880) ja p-FOXO1 (# 9461) vasta-aineiden western blot ja immunosaostuksella olivat kaikki ostettu CST (Beverly, MA, USA). p70S6K (# ab47504) ja p-p70S6K (# ab60947) vasta-aineiden Western blot ja immunohistokemia ostettiin Abcam (Cambridge, MA, USA). Ei aktiivinen Akt1 /PKB1 (# 14-279) ja 4E-BP1 (# 10022-H07E) ostettiin Millipore (Bedford, MA, USA) ja Kiinan biologinen (Peking, Kiina), tässä järjestyksessä.

Cell Lines

ihmisen keuhkon adenokarsinooman solulinjoja PC9, H1650 ja H1975 (ATCC, Manassas, VA, USA) toimitti ystävällisesti Dr. Tony Mok, Kiinan University of Hong Kong. PC9 solut satama EGFR eksoni 19-kehyksen poisto ja ovat erittäin herkkiä EGFR TKI. H1650-solujen satama EGFR-eksoni 19-kehyksen poisto, ja ne ovat vastustuskykyisiä EGFR-TKI. H1975-solut kantavat EGFR L858R-T790M mutaation ja ne kestävät EGFR-TKI. PC9GR osti gefitinibin vastarintaa krooninen altistuminen PC9 soluja alustassa kasvaa gefitinibin pitoisuuksia. Lyhyesti, PC9 solut altistettiin 10 nM gefitinibin, joka sisälsi 10% FBS: ää, ja pitoisuus kasvoi vaiheittain. Solut, jotka pystyivät kasvamaan 1 uM gefitinibin saatiin 6 kk kuluttua ensimmäisen valotuksen.

Western Blot analyysi

Soluja viljeltiin 25 cm

2 kulttuuri pulloa ilman lääkkeitä ja korjatut log-kasvuvaiheessa proteiinin uuttamalla. Solut lyysattiin RIPA-lyysipuskuria, joka sisälsi 1 x PMSF ja 1 x fosfataasin estäjä cocktail. Proteiinipitoisuus Kunkin lysaattia määritettiin käyttämällä bikinkoniini- happoa määrityksessä. Näytteet SDS-PAGE: lla. Proteiinit havaittiin käyttäen tehostettua kemiluminesenssia kit (Thermo, Rockford, IL, USA).

määrän proteiinia tasoilla, kalvot skannattiin ja analysoitiin labwork ohjelmisto. Suhteellinen proteiinin tasot laskettiin käyttäen verrattuna PC9 soluun.

immunosaostus ja Kinaasimääritykset

Solut log-kasvuvaiheessa lyysattiin 0,5 ml: ssa jääkylmää lyysipuskuria (40 mM Hepes pH 7,5, 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 x fosfataasinestäjällä cocktail, 1 x EDTA-vapaa proteaasi-inhibiittori cocktail, joka sisälsi 0,3% [w /v] CHAPS) [24]. Supernatantti siirrettiin uuteen putkeen. 10 ul: n näyte immobilisoitiin helmi-konjugaatti, jossa on esitetty vasta-ainetta lisättiin ja inkuboitiin rotaatiossa 90 minuuttia huoneen lämpötilassa. Immunosaostumat pestiin neljä kertaa CHAPS lyysipuskuria ja kerran kanssa Rictor-mTOR kinaasipuskurissa (25 mM Hepes pH 7,5, 100 mM kaliumasetaattia, 1 mM MgCI

2). Immunosaostumat inkuboitiin lopullisessa tilavuudessa 15 ui 20 minuuttia 37 ° C: ssa Rictor-mTOR kinaasipuskuria, joka sisältää 500 ng aktiivinen Akt1 /PKB1 tai 4E-BP1 läsnä ATP kinaasireaktion. Reaktio pysäytettiin lisäämällä 200 ui jääkylmää entsyymi laimennuspuskuria (20 mM MOPS, pH 7,0, 1 mM EDTA, 0,01% [w /v] Brij 35, 5% glyserolia, 0,1% 2-merkaptoetanolia ja 1 mg /ml BSA: ta). Lyhyen sentrifugoinnin jälkeen supernatantti poistettiin Sepharose helmi konjugaatilla ja analysoitiin immunoblottauksella. Immunosaostumat denaturoitiin ja erotettiin SDS-PAGE, ja geelit värjättiin hopeavärjäyksellä kit.

arviointi antiproliferatiivisia vaikutuksia

Solujen elinkyky määritettiin kautta MTT-määritystä, noudattaen menetelmä Mosmannin ja Carmichael [25], [26], ja lineaarisuuden välillä solujen määrä ja optinen tiheys arvojen perustettiin. Antiproliferatiivinen yhden aineella arvioitiin yhdessä monokerrokset, soluja kasvatettiin 96-kuoppaisilla levyillä. Solujen lukumäärä kuoppaa kohti oli 2000 PC9, 2000 PC9GR, 1200 H1650, ja 3000 H1975-soluissa. IC

50-arvo oli tuottavan pitoisuuden 50% solujen kasvun esto jälkeen 72 tunnin altistuminen huumeiden verrattuna käsittelemättömissä kontrolli soluissa.

virtaussytometrianalyysin Cell Cycle Distribution

Solut ympättiin kuuteen-kuoppalevyille tiheyteen 1 x 10

5 per kuoppa ja annettiin laskeutua yön yli. Sitten soluja käsiteltiin 72 tuntia kanssa ku-0063794 IC

50 pitoisuus. Solut trypsinoitiin, laskettiin, pestiin ja suspendoitiin uudelleen. Sitten solut pelletoitiin ja kiinnitetty tipoittain 70% jääkylmää etanolia, varastoidaan PBS: llä ja suspendoitiin sitten uudelleen propidiumjodidiliuoksella (180 ug /ml) ja analysoitiin virtaussytometriaa käyttämällä.

Potilaat, joilla on NSCLC

Kasvain yksilöitä gefitinibi tai erlotinibi saaneilla potilailla saatiin Guangdongin General Hospital (Guangzhou, Kiina). Tutkimuksen hyväksyi eettinen komitea Guangdongin General Hospital. Kaikki potilaat toimitti kirjallisen tietoon perustuvan suostumuksen. Läsnäolo EGFR mutaatio kustakin näytteestä vahvistettiin eksoni-spesifinen monistuminen (eksonit 18-21), jonka jälkeen suoralla sekvensoinnilla tai Scorpion vahvistusta tulenkestävä mutaatio järjestelmän [27]. MET monistaminen analysoitiin kvantitatiivisen suhteellinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio [28].

p70S6K immunohistokemia

immunohistokemiaallisesti koko ja fosforyloituu p70S6K suoritettiin positiivisesti varautuneet lasilevyille sisälsi 5-um osat formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettu kudokseen. Objektilasit poistettiin parafiini, jonka jälkeen nesteytys kanssa sarjatuotantona vähenee etanolikonsentraatiot, ja sitten upotettiin 3% H

2O

2 estävän endogeenisen peroksidaasin. Seuraavat antigeenin haku 1 mM EDTA-puskuriin, pH 8,0, kudoksen leikkeitä inkuboitiin estopuskurilla (TBST /5% normaalia vuohen seerumia) 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sitten leikkeitä inkuboitiin yli yön 4 ° C: ssa primaarisen vasta-aineen laimennetaan 1:100 vasta-laimennusainetta. Envision Detection System käytettiin visualisointi, mukaan valmistajan ohjeiden. Osiot vastavärjättiin Harris hematoksyliinillä, kuivattu ja kiinnitetty pysyvästi.

arviointi immunohistokemiallinen värjäys

Kaikki objektilasit arvioitiin erikseen kaksi patologit jotka sokaisi tapauksiin. Tapauksissa värjäämällä 10% soluista pidettiin positiivisina. Immunohistokemiallinen reaktiivisuus luokiteltiin asteikolla 0-3 mukainen värjäytymisen voimakkuuden ja prosenttiosuus immunopositiivista solujen seuraavasti: 0, ei värjäystä; 10% positiivisia soluja; 1, heikko värjäytyminen 10% syöpäsolujen tai kohtalainen värjäystä 10-40% tuumorisolujen; 2, kohtalainen värjäytyminen 40% syöpäsolujen tai vahvaa värjäytymistä 10-40% tuumorisolujen; 3, vahva värjäytyminen 40% syöpäsoluja [29].

Tilastot

Tulokset esitetään keskiarvoina ± keskivirheet vähintään kolmen kokeen.

Tulokset

Akt Ser473-FOXO1 Signaling Pathway in EGFR-TKI-resistentti NSCLC Cells oli erittäin aktivoidaan Basal valtiossa

ymmärtäminen mTOR-signaloinnin-reitin eroja EGFR-TKI-herkkä ja kestävä NSCLC-solujen on kriittinen kohdentamiseksi mTOR voittaa potilaan vastustuskyky jälkeen TKI hoidon. Kuitenkin tieto erot signalointipolkujen välillä EGFR-TKI-herkkä ja kestävä NSCLC solujen puuttuu. Täällä ensimmäinen valittu neljä erilaista NSCLC solulinjoilla että satama eri EGFR mutantteja, ja jotka eroavat toisistaan ​​herkkyys TKI, koska solu malleja analyysi signalointi-reitin eroja on pohjapinta tilassa Western blot. Kuten on esitetty kuviossa. 1, koko ja fosforyloitu mTOR, Raptor, ja Rictor proteiinit olivat korkeammat perusekspression tasoa kaikissa neljässä NSCLC solulinjoissa. Sitten me havaittu eroja mTORC2 liittyviä signalointireitin määrittämällä fosforylaatio aseman Akt Ser473 ja FOXO1. Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että EGFR-TKI-resistenttejä solulinjoja erityisesti H1650-soluja (kätkeminen EGFR deleetion 19 eksonissa ja jotka kestävät TKI) oli korkeampi p-Akt Ser473 tasoilla kuin ei-TKI-herkkien solujen (PC9 solut) ja p-Akt Ser473 ilmentymisen taso PC9GR soluissa (gefitinibi-hankittu resistentti solulinja) oli myös melko suuri. Tämä tulos oli yhdenmukainen raportti, joka PC9GR solut ovat vähentäneet fosfataasi ja tensin homologi ilmaisun, joka johti ylössäätely p-Akt Ser473 tasolla [30]. FOXO1 fosforylaatio tila, joka on positiivisesti säätelevät Akt HM sivusto (Ser473) fosforylaation tila ja estää solujen apoptoosin [31], oli lähes yhdenmukainen p-Akt Ser473 tasot neljän solulinjoissa. Olemme myös havainneet ilmaus fosforyloidun ja koko p70S6K joka on substraatti mTORC1 ja totesi, että kaikki neljä solulinjoissa oli korkeammat p70S6K fosforylaation tasoja. Yhdessä tuloksemme osoittivat, että EGFR mutantti NSCLC-solut oli korkeammat perusekspression tasoja mTOR, Rictor ja Raptor ja mTORC2 liittyvä Akt Ser473-FOXO1 signalointireitistä oli hyperactivated resistenttien soluissa.

Soluja viljeltiin täydellisessä media ilman lääkehoitoa. Proteiinit erotetaan soluista log-kasvuvaiheessa ja solulysaatit immunoblotattiin havaitsemiseksi merkitty proteiineja. Koe, toistettiin kolme kertaa, tulokset olivat samanlaiset.

EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC solulinjojen oli Korkeampi mTORC2 kinaasiaktiivisuutta, kun taas herkät solut oli Korkeampi mTORC1 kinaasiaktiivisuutta Basaali valtiossa

edellä esitetyn perusteella tuloksia, meidän hypoteesi, että EGFR-TKI-herkkä ja kestävä soluilla on eri mTORC2 kinaasiaktiivisuutta. Sitten määritettiin mTORC2 kinaasiaktiivisuuden neljän NSCLC solulinjat immunosaostuksella. Ensinnäkin, käytimme erityinen Rictor vasta-kaatamaan mTORC2 osaksi immuunisaostumassa. SDS-PAGE hopeavärjäyksellä (Fig. 2A) osoitti, että immuunisaostukset olivat onnistuneita, jotka myös varmistettiin western blot immunosaostumien (Fig. S1). Akt Ser473 oli yksi tunnistettu substraattien mTORC2 ja useita asiakirjoja käytti sitä korvike edustamaan mTORC2 toimintaa [21], [24]. Niin, käytimme aktiivinen rekombinanttiproteiinia, Akt1 /PKBα, substraattina reagoida immuunisaostumassa

in vitro

, ja sitten havaittiin p-Akt Ser473. Kuten on esitetty kuviossa. 2B, vaikka solulysaattia proteiinipitoisuus H1650 solun immuunisaostumassa oli pienempi kuin kolme muuta solulinjat, mTORC2 kinaasiaktiivisuuden oli korkein. Kuviosta. 2B, voimme myös nähdä, että mTORC2 kinaasiaktiivisuuden PC9-soluissa oli matalin, ja että PC9GR ja H1975-solut oli välituotetta kinaasiaktiivisuutta. Nämä tulokset olivat lähes yhdenmukaisia ​​p-Akt Ser473 tason edellä. Olemme myös havainneet mTORC1 kinaasiaktiivisuutta

in vitro

vertailla eroja mTORC2 ja mTORC1 kinaasin toimintaa EGFR-TKI-herkkiä ja resistenttejä NSCLC soluja. Kuva. 2C osoitti, että olemme myös menestyksellisesti vedetty alas mTORC1. Kuten on esitetty kuviossa. 2D, vaikka proteiinipitoisuus PC9 solussa immuunisaostumassa oli pienempi kuin muissa kolme solua, mTORC1 kinaasiaktiivisuuden oli korkein. mTORC1 kinaasiaktiivisuutta oli matalin H1650 ja H1975 soluja. Vuodesta Fig. 2B ja 2D, voisimme myös nähdä, että samalla soluihin mTORC2 -kinaasiaktiivisuus voimistunut mTORC1 kinaasiaktiivisuutta olisi vaimentua osoittaa, että onko mTORC1 ja mTORC2 olemassa dynaamisessa tasapainossa. Yhdessä tuloksemme osoittivat, että vaikka sekä EGFR-TKI-herkkä ja kestävä NSCLC-solut olivat korkeammat mTORC1 ja mTORC2 ilmaisun pohjapinta tilassa, EGFR-TKI-resistenttien solujen oli korkeammat mTORC2 kinaasiaktiivisuutta, kun taas EGFR-TKI-herkkien solujen oli korkeammat mTORC1 kinaasi toimintaa.

(A, C) SDS-PAGE-proteiinin hopeavärjäys, että mTORC2 ja mTORC1 immunosaostumat valmistettiin PC9 solulysaateista kanssa Rictor (D16H9) Rabbit mAb (Sepharose Bead Conjugate) (# 5379) ja Raptor (24C12 ) Rabbit mAb (Sepharose Bead Conjugate) (# 5382) ostettiin CST, vastaavasti. (B, D) ensimmäinen sarake edustaa Rictor ja Raptor proteiinin pitoisuuksia, vastaavasti, solulysaateissa. Suhteellinen proteiinin tasot lasketaan käyttäen verrattuna PC9 soluun, joka on määritelty 1,00. Immunopresipitaatit käytettiin kinaasimäärityk- täyspitkä villityypin rekombinantti ihmisen Akt1 /PKB1 ja 4E-BP1 substraatteina. Immunoblottaus käytettiin havaitsemaan Akt /PKB-fosforylaation at ser 473 ja 4E-BP1 klo thr 37/46, vastaavasti. Suhde arvot p-Akt Ser473 /t-Rictor ja p-4EBP1 /t-Raptor ovat kinaasiaktiivisuuden mTORC2 ja mTORC1 vastaavasti. Koe, toistettiin kolme kertaa, tulokset olivat samanlaiset.

Ku-0063794 Inhibioitu Cell Proliferation ja johtivat G1 solukierron pysähtymisen EGFR-TKI-herkkä ja kestävä NSCLC Cells

valikoiva mTOR-inhibiittorit, kuten ku-0063794, estävät sekä mTORC1 ja mTORC2 eri solulinjoissa [32]. Tässä tutkimuksessa arvioimme antiproliferatiivisia vaikutuksia ku-0063794 EGFR-TKI-herkkä ja kestävä NSCLC soluja verrattuna gefitinibin jotka raportoitiin aiemmin meidän lab [17], [33]. Data osoitti annos-vaste kasvun estäminen vaikutuksia PC9, PC9GR, H1650 ja H1975 soluja. Taulukko 1 ja kuvio. 3A osoitti, että ku-0063794 esti solujen lisääntymistä sekä EGFR-TKI-herkkä ja kestävä NSCLC soluja nanomolaarisilla (nM) pitoisuuksia, kun taas gefitinibi esti vain PC9 soluihin nM pitoisuuksina. Suurempi gefitinibin pitoisuuksia (uM) tarvittiin saavuttamaan IC

50-arvon EGFR-TKI-resistentit solut, jotka ylittävät selvästi huippupitoisuus plasmassa potilailla [34]. Olemme myös arvioinut solusyklin käsittelyn jälkeen ku-0063794 IC

50 taso virtaussytometrialla ja totesi, että kaikki neljä solulinjat blokattiin G1 vaiheessa, kun 72 tunnin ku-0063794 hoito, erityisesti PC9 ja PC9GR solujen verrattuna kuin vertailuryhmässä soluissa ilman lääkehoitoa (Fig. 3B).

(A) esto tehokkuutta ku-0063794 neljässä NSCLC solulinjat. (B) Ku-0063794 aiheuttama solukierron pysähtymisen sekä EGFR-TKI-herkkä ja kestävä soluja. Ylempi paneeli edustaa tyvisolusyöpä sykli jakaumat PC9, PC9GR, H1650 ja H1975 solulinjoissa, vastaavasti, ja alapaneeli edustaa solusyklin jakaumat PC9, PC9GR, H1650 ja H1975 solujen käsittelyn jälkeen IC

50 pitoisuudet ku-0063794 72 tuntia.

Koska ku-0063794 näytteillä dramaattisia antituumorivaikutukset, me analysoitiin edelleen sen antiproliferatiivista aktiivisuutta IC

50 pitoisuus western blot. Ensin havaitsimme mTOR fosforylaatiotilaa hoidon jälkeen ku-0063794 on IC

50 pitoisuuksia kaikissa neljässä solulinjoissa, vastaavasti (kuvio. 4A). Sitten vielä analysoineet fosforylaatiota tilan mTOR signalointireitin liittyviä proteiineja (Fig. 4A). Kautta proteiini määrällinen labwork ohjelmisto, analysoimme suhde fosforyloidun proteiinin yli kokonaisproteiinia pohjapinta tilassa ja käsittelyn jälkeen ku-0063794 on IC

50 pitoisuuksia kaikissa neljässä solulinjoissa (Fig. 4B). Kuten on esitetty kuviossa. 4A ja 4B, ku-0063794 tehokkaasti inhiboi mTOR fosforylaatiotilaa ja sitten vahvasti inhiboi fosforylaatiota p70S6K, joka on substraatti mTORC1. Kuviosta. 4B, voisimme myös nähdä, että ku-0063794 on IC

50 pitoisuudet eivät merkittävästi lisätä p-Akt Ser473 ilmentymisen erityisesti PC9 ja PC9GR soluja, jotka voivat indusoida rapamysiini [16]. Itse asiassa suhde p-Akt Ser473 /t-Akt in H1650 ja H1975-solut vähenivät jolloin vähennetään suhde p-FOXO1 /t-FOXO1 näissä soluissa verrattuna, että pohjapinta tilassa. Siten ku-0063794, uutena ATP kilpailua mTOR-estäjä, osoitti selvästi antiproliferatiivisia vaikutuksia ja indusoi G1 solukierron pysähtymisen sekä EGFR-TKI-herkkä ja kestävä NSCLC-solujen

in vitro

.

(A) Soluja käsiteltiin 72 tunnin ajan, joissa ku-0063794 on IC

50 pitoisuuksia, ja solulysaatit immunoblotattiin havaitsemiseksi merkitty proteiineja. Koe, toistettiin kolme kertaa, tulokset olivat samanlaiset. (B) suhdeluvut mTOR signalointireitin liittyy fosforyloidun proteiineihin yhteensä proteiinien pohjapinta tilassa ja käsittelyn jälkeen ku-0063794 on IC

50 pitoisuuksia kaikissa neljässä solulinjoissa.

Analyysit Kliinisen EGFR-TKI-herkkä ja kestävä Lung Adenokarsinooma kudokset Osoitti Korkeampi Yhteensä ja fosfory- p70S6K ilmentäminen sekä herkkä ja kestävä Syövät

Koska ku-0063794 on IC

50 pitoisuus esti p70S6K fosforylaation tasoa molemmissa herkkiä ja resistenttejä NSCLC-solut, nämä tulokset osoittivat, että ku-0063794 voinut käyttää suurempaa antituumorivaikutukset kasvaimissa, jotka ilmentävät korkeita koko tai fosforyloidun p70S6K. Tutkimme kasvain yksilöitä gefitinib- tai erlotinibin saaneilla potilailla, joilla EGFR-mutantti NSCLC (Fig. 5). Kaikilla potilailla oli osittainen kliininen kasvaimen vaste gefitinibi tai erlotinibi hoitoon ja myöhemmin kehittyi kliininen lääkeresistenssin. Arvioimme ilmaus koko ja fosforyloidun p70S6K viidellä potilaalla immunohistokemiallisesti; yksi pariksi näytteet on saatu ennen ja jälkeen geftinib hoidon, kaksi huumeiden herkkiä yksilöitä, ja kaksi lääkeresistentissä yksilöitä. Olemme havainneet tilan T790M mutaation ja MET vahvistusta kaikissa lääkkeille vastustuskykyiset yksilöitä. Sekä huumeiden herkkä ja lääkkeille vastustuskykyisiä kasvain näytteet olivat korkeammat yhteensä p70S6K ilmaisu (kuvio. 5B ja 5C). Olemme myös löytäneet korkeampi fosforyloituu p70S6K ilmentymistä näissä kasvaimissa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että sekä huumeiden herkkä ja kestävä syövät olivat korkeammat koko ja fosforyloituu p70S6K ilmaisun, ja jotka p70S6K voi olla hyvä ennustaja vastaus ku-0063794.

(A) Yhteenveto kasvaimia gefitinibi ja erlotinibi hoidetuista potilaista, joista kolme huumeisiin herkkä ja kestävä tapauksissa vastaavasti. Tapaus 3 oli pariksi näyte ennen ja jälkeen TKI hoidon. ADC edustaa adenokarsinooma. (B) ilmentäminen kokonais- ja fosforyloidun p70S6K että EGFR-TKI-arkaluontoisissa tapauksissa. Ylempi paneeli edustaa yhteensä p70S6K, ja alapaneeli edustaa fosforyloitua p70S6K. (C) Expression of koko ja fosforyloidun p70S6K että EGFR-TKI-resistenttejä tapauksissa. Ylempi paneeli edustaa yhteensä p70S6K, ja alapaneeli edustaa fosforyloitua p70S6K. ADC edustaa adenokarsinooma; S ja R ovat herkkiä tapauksessa ja kestävä kotelo vastaavasti. Mittaviivat 50 pm.

Keskustelu

EGFR signalointireiteissä osallistuvat kehittymistä ja etenemistä keuhkosyöpään. Sitovat EGFR sen EGF-ligandi johtaa dimeroitumi- ja aloittaa sarjan alavirran signalointikaskadien kautta PI3K-Akt-mTORC1, Erk, ja STAT3 reitit [35]. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että signalointi kuviot aktivoidaan EGFR mutantit eroavat ligandin aktivoimien villityypin EGFR, ja että EGFR-mutantteja, jotka johtuvat EGFR signaloinnin aktivoivat konstitutiivisesti ja paeta negatiiviseen säätelyyn [36] – [39]. EGFR-herkkiä mutaatioita tuli parantava vaikutus ennustavat TKI, ja dramaattinen kliinistä hyötyä TKI perustuvat paljolti syvä ymmärrys EGFR-mutantti signalointireitteihin. Siksi ymmärrys muutokset signalointipolkujen jälkeen potilaille kehittyy vastustuskykyä EGFR TKI on varsin tärkeää vastustus. Useat TKI resistenssimekanismeja on osoitettu viime vuosina, kuten T790M-mutantti [40], MET-monistus [7], ja HGF yliekspressio [8]. Useimmat nykyiset strategiat voittamiseksi TKI-hankittu resistenssi joihin liittyvät kohdistettu vastus itse mekanismin. Esimerkiksi toisen sukupolven peruuttamattomia TKI kuten BIBW 2992 potilaille, joiden T790M mutaatio ja MET-inhibiittorit yhdistettynä EGFR TKI markkinatalouskohtelupyyntö vahvistusta [7], [9] – [10]. Täällä, me tarjosi uuden näkökulman etsimään uusia molekyylikohteista voittamiseksi vastus eritelty järjestelmällisesti signalointireitin erot EGFR-TKI-herkkä ja kestävä NSCLC-solujen

in vitro

. Tuloksemme osoittivat, että mTORC2 liittyvä Akt Ser473-FOXO1 signalointireitistä oli erittäin aktivoituu EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC solujen perus tilassa ja

in vitro

mTORC1 ja mTORC2 kinaasiaktiivisuudet todentaa nämä tulokset. (Fig. 1 ja 2). Nämä tulokset osoittavat, että kohdistaminen mTOR lukien mTORC2 voisi paremmin antituumorivaikutukset.

mTOR on keskusohjaimena solun kasvun, proliferaation, aineenvaihduntaa, ja angiogeneesi; kuitenkin, nykyinen mTOR-inhibiittorit, kuten RAD001, osoittavat vain vähän kliinistä aktiivisuutta esikäsitelty NSCLC [14]. Itse asiassa rapamysiinin suunnattu vain osa solunsisäisen toiminnan mTORC1. Rapamysiini allosterically estää mTORC1 kinaasiaktiivisuuden sitomalla FKBP12 soluproteiini distaalisesti kinaasin aktiiviseen kohtaan [15]. Joissakin tapauksissa, mTORC1 on herkkä rapamysiinin ja estää täysin mTORC1-välitteisen S6K1 fosforylaation. Kuten raportoitu aiemmin, rapamysiini indusoi Akt Ser473 fosforylaation, mikä vähentää sen antituumorivaikutus kautta Akt Ser473-FOXO1 signalointireitistä johtuen helpotus palautetta S6K-IRS-PI3K signalointi [16], [41]. Oikeastaan ​​Akt Thr308 fosforylaation säätää positiivisesti PI3K-PDK1 ja Akt Ser473 fosforylaation positiivisesti ohjataan mTORC2 [20], mikä viittaa siihen, että onko esto mTORC1 edistäisi mTORC2 kinaasiaktiivisuutta. Tuloksemme osoittavat dynaamisen tasapainon mTORC1 ja mTORC2 sitä olisi vahvistettava seuraavan tutkimuksissa (Fig. 2B ja 2D) ja selittää, miksi RAD001 välittyvät vaikutukset ovat heikkoja kaikissa NSCLC solulinjoissa

in vitro

. Tulokset viittaavat siihen, että sekä mTORC1 ja mTORC2 olisi kohdennettava.

Uudet ATP kilpailua mTOR estäjät (

e

.

g

., Torin1, PP242, ku-0063794 ja WAY-600), jotka estävät sekä mTORC1 ja mTORC2, aiheuttavat merkitty vaikutukset proteiinisynteesiä, solujen kasvun ja solujen lisääntymisen, ja edistävät voimakkaasti autophagy eri syöpäsolutyyppien

in vitro

[32], [ ,,,0],42]. Nämä mTOR inhibiittorit ovat vielä varhaisessa vaiheessa arviointi; näin, niiden terapeuttista potentiaalia syövän edelleen epävarma. Itse asiassa uusi mTOR-inhibiittorit, kuten Torin1 ja PP242, on antiproliferatiivisia vaikutuksia, jotka välittyvät pääasiassa täydellisen inhibition mTORC1, mutta ei mTORC2 [43], [44]. Aikaisemmat paperi ja paperin La Monica ovat molemmat osoittaneet, että EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC-solut tunteeton everolimuusille (RAD001), ja everolimuusin voisi synergoida gefitinibin jossa säädettiin toinen vaihtoehto strategia voittaa EGFR-TKI vastus [17], [45] . Tutkimuksessamme havaitsimme, että kohdistaminen mTOR kanssa ku-0063794 myös tuottanut paremmin antituumorivaikutuksia ja vähentää G1 solukierron pysähtymisen sekä herkkien ja resistenttien solujen MTT-määritys ja virtaussytometria analyysi, joka olisi edelleen vahvistettava pesäkkeiden muodostumisen kapasiteetti (CFC) määritykset tulevaisuudessa; emme löytäneet merkittäviä G1-solukierron pysähtymisen vaikka soluproliferaatiota estyi H1975 soluissa ku-0063794, joka ehkä johtuen ensisijaisesti muita solukuoleman kuten apoptoosin tai autophagy. Indikaattorit apoptoosin ja /tai autophagy olisi tutkittava tarkemmin tulevaisuudessa (Fig. 3B); seuraavia antiproliferatiivisia vaikutuksia kohdistaminen mTOR osoitti, että ku-0063794 ei ainoastaan ​​inhiboi p70S6K fosforylaation tasoja, vaan myös inhiboivat osittain FOXO1 fosforylaation tasoja eikä upregulate Akt Ser473 fosforylaation tasoja (Fig. 4). Yhdessä meidän tiedot ja ne aiemman raportin [46] viittaavat siihen, että puute lisääntyminen Akt Ser473 fosforylaation tasoja on saattanut estämällä mTORC2; mikä edistää antituumorivaikutukset. Oikeastaan, mahdollinen erityiset roolit mTORC2 EGFR-TKI-resistenttejä NSCLC-solut olivat vielä tuntemattomia ja sitä pitäisi tutkia tarkemmin seuraavassa tutkimuksissa. Lisäksi olemme havainneet, että EGFR-TKI-resistenttien solujen oli korkeammat Akt Ser473 fosforylaation. Kuten raportoitu aiemmin, Akt estäjä perifosine ovat osoittaneet parempia antiproliferatiivisia vaikutuksia uusiutunutta /refraktorista Waldenströmin makroglobulinemia [47] ja Jeong et ai kertoi myös, että Akt estäjä ja mTORC1 estäjä synergistisesti lisääntynyt solukuoleman NSCLC soluissa [48]. Kaikki nämä viittaavat siihen, että Akt inhibiittorit voivat olla toinen hyvä vaihtoehto hoitoa TKI tunteeton kasvaimia.