Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Ainutlaatuinen ominaisuuksia kasvain mikroympäristöihin voidaan käyttää kohteina syövän terapiassa. Aryylihiilivetyreseptori ydin- translocator (ARNT) on tärkeä välittäjä syövän etenemisen. Kuitenkin toiminnallista roolia ARNT kemoterapeuttisessa lääkettä saaneissa syöpä on edelleen epäselvä.

Menetelmät /Principal Havainnot

Täällä huomasimme, että knockdovvn ARNT syöpäsoluissa vähensi proliferaationopeus ja muutos kyky näissä soluissa. Lisäksi sisplatiinin indusoiman apoptoosin parannettiin ARNT-vajaiden solujen. Expression of ARNT myös vähentynyt läsnäollessa sisplatiinin kautta proteasomaalisten hajoamisen kautta. Kuitenkin ARNT taso säilytettiin sisplatiinia saaneilla lääkeresistenttiä soluja, mikä esti solun apoptoosin. Mielenkiintoista, reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) on kasvanut dramaattisesti, kun ARNT pudotettiin syöpäsoluissa, parantaa sisplatiinin indusoiman apoptoosin. ROS edistää solukuolemaa estyi käsitellyissä soluissa ROS scavenger, N-asetyyli-kysteiini (NAC).

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tulokset viittaavat siihen, että syövän vastaista aktiivisuutta sisplatiinin johtuu sen tuotannon induktio ROS Arnt hajoamista. Kohdistaminen ARNT voisi olla mahdollinen strategia poistamiseksi lääkeresistenssin syöpäsoluissa.

Citation: Shieh J-M, Shen C-J, Chang W-C, Cheng H-C, Chan Y-Y, Huang W-C, et al. (2014) lisääntyminen reaktiivisia happiradikaaleja säätelemättömyyden ARNT Parantaa Kemoterapia lääkkeen aiheuttama syöpäsolun kuoleman. PLoS ONE 9 (6): e99242. doi: 10,1371 /journal.pone.0099242

Editor: Yu-Jia Chang, Taipei Medicine University, Taiwan

vastaanotettu: 17 helmikuu 2014; Hyväksytty: 13 toukokuu 2014; Julkaistu: 12 kesäkuu 2014

Copyright: © 2014 Shieh et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat apurahan NSC 102-2628-B-006-011-MY3 National Science neuvosto Kiinan tasavallan. Tämä tutkimus tukee osittain päämajassa yliopiston Advancement National Cheng Kung yliopisto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

aryylihiilivetyreseptori ydin- translocator (ARNT), joka tunnetaan myös nimellä hypoksia-indusoituva tekijä (HIF) -1β, on transkriptiotekijä, joka kuuluu perus helix-loop-helix Per-ARNT-Sim (bHLH -PAS) perhe, kuten endoteelin PAS domeenin proteiinia 1 (EPAS1), HIF-1α, ja aryylihiilivetyreseptori (AhR) [1] – [3]. ARNT muodostaa heterodimeerin HIF-1α vastauksena muuttuviin happipitoisuus mikroympäristöihin, ja edelleen edistää solujen eloonjäämistä ja angiogeneesissä [4] – [6]. Lisäksi häiriöt ARNT hiiren alkion kantasoluja aiheuttaa hypoglykemia, angiogeneesin puute sekä kyvyttömyys reagoida hypoksia [7]. Lisäksi ARNT on välittäjänä happiolosuhteissa kun solut kohtaavat haitallisia tekijöitä mikroympäristössä, kuten 2,3,7,8-tetra-klooridibentso [b, e] [1], [4] dioksin (TCDD) tai anti -cancer lääkkeet [8], [9]. ARNT dimerisoituu kanssa aryylihiilivetyreseptori (AhR) ja säätelee SP1 transkription aktiivisuutta, seuraava säätelyä promoottorin P450 subfamily polypeptidi 1 (CYP1A1) vastustaa xenobiotic korostaa esimerkiksi TCDD [3]. Kun säännellään ARNT soluissa, se voidaan stabiloidaan vuorovaikutuksessa BRCA1-proteiinin aikana TCDD stressi [10]. Toisaalta, aktiivinen kaspaasi-3 pilkkoo ARNT apoptoosin aikana vähentää solujen eloonjäämistä signaalit [11]. Menetys HIF-1α ja ARNT myös aiheuttaa lisääntynyttä vastaus sädehoito, vähenemiseen kasvaimen kasvua, ja lasku angiogeneesissä kasvaimissa istutetaan immuuni-hiirillä [12]. Aiemmissa tutkimuksissa, huomasimme, että ARNT vuorovaikutuksessa c-Jun muodostamiseksi c-Jun /ARNT ja c-Jun /ARNT /SP1 komplekseja, jotka edistävät ilmauksia cyclooxygenase (COX) -2, 12 (S) -lipoxygenase, ja p21

WAF1 /CIP1

, vuonna epidermaalinen kasvutekijä (EGF) hoidetun kohdunkaulan syövän solujen normoxic kunnossa [1], [13]. Nämä tutkimukset osoittivat, että ARNT vuorovaikutuksessa HIF-1α vastauksena hypoksinen olosuhteet ja sitoutuu myös erityisiä transkriptiotekijöiden, joilla on kyky käynnistää signaloinnin tumorigeneesin on normoxic kunnossa.

Sisplatiini on merkittävä kemoterapeuttinen lääke käytetään monien syöpien, erityisesti kivesten, munasarjojen, ruokatorven, kohdunkaulan, mahan, eturauhasen, ja ei-pienisoluinen keuhkosyöpä [14]. Sen jälkeen, kun virtaa soluun, sisplatiinin hydrolysoidaan ja tulee sen aktiivisessa muodossa. Ristikytkentäsidosten DNA säikeiden tapahtuu aktiivisesti sisplatiini sitoutumalla DNA: n asemaa 7 guaniinin, joka aiheuttaa syöpää solukuoleman [15], [16]. Lisäksi aiheuttaa apoptoosia indusoimalla sytokromi c vapautumista vasteena DNA stressiä, sisplatiini indusoi myös solujen aiheuttamaa apoptoosia reaktiivisen hapen (ROS) kautta p53-välitteisen p38a-mitogeeniaktivoidun proteiinikinaasin (MAPK) reitti on HCT1116 koolonkarsinoomasoluissa [ ,,,0],17]. ROS jatkuvasti syntyy ja poistuu normaalin fysiologisen ja biologinen toiminta [18]. Aikana oksidanttirasituksen kuten hypoksiaa tai xenobiotic stimulaatio, ROS voidaan poistaa puhdistusjärjestelmä proteiineja, kuten Superoksididismutaasi (SOD) ja glutationiperoksidaasi. Syöpäsolut enemmän oma toleranssi ROS kuin tehdä normaalit solut. Alhainen ROS helpottaa syöpäsolujen ajo solukasvun liittyvien geenien, mutta korkeampi tuotanto ROS aiheuttaa myös solujen apoptoosin [19]. Kuitenkin syöpäsolut sopeutumaan vaurioita sisplatiinia säätelemällä efflux kuljettajat, kuten ATP-sitova kasetti (ABC) kuljettajaan. Monilääkeresistenssiin 1 (MDR1) on jäsenenä lääkevuoto- ABC kuljettajat, jotka pumppaavat syöpälääkkeitä ulkopuolella kalvon [20]. Lisäksi yli-ilmentyminen MDR1 sallii ihmisen KB karsinoomasolut tehokkaasti vastustaa kolkisiini, vinblastiini, ja doksorubisiini [21]. Syöpälääkkeet aiheuttavat syöpäsolut hankkia vastustuskyky kautta yli-ilmentymisen lääkeresistenttiä geenejä. Siksi ymmärtäminen molekyyli- mekanismi mukana säännellä hankintaan vastuksen syöpäsoluissa olisi hyödyllistä tehokas hoito.

Meidän Edellisessä tutkimuksessa havaitsimme, että ARNT vuorovaikutuksessa SP1 säätelemään MDR1 ilmaisun ja suojattu soluja sisplatiinin indusoimaan apoptoosin [9]. ARNT säädelty ulosvirtaus huumeiden havaittiin myös MDR1-voimistunut syöpäsoluja. Nämä tulokset osoittavat, että ARNT on yksi sääntelyviranomaisten ylläpitää syöpäsolujen selviytymisen alle sisplatiinihoitoon. Edelleen jatkaa mahdollisen roolin ARNT ylläpitämisessä solujen eloonjäämistä, vaikutus ARNT tasolla kemoterapia-tehokkuuteen tutkittiin eri syöpätyyppeihin. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että vapauttaminen ARNT paitsi lyhentää solujen elinkelpoisuutta, mutta edistänyt sisplatiinin indusoimaa solukuolemaa tehostamalla tuotantoa ROS. Nämä tulokset osoittivat, että ARNT voisi samanaikaisesti säädellä MDR1 ilmaisun ja alentaa ROS tason suojella syöpäsolujen lääkkeen aiheuttama apoptoosin.

Tulokset

Euroopan ARNT säätelee syöpäsolun lisääntymistä

selventää, että ARNT on välttämätön kasvainsolujen kasvua alle happiolosuhteissa, soluproliferaatiota määritettiin BrdU alle ARNT-pudotus kunnossa. Kuten on esitetty kuviossa. 1A, soluproliferaatioon määrä väheni merkittävästi siARNT soluissa. Tulokset pulssi-merkinnät BrdU (20 min), ja synkronointi-solujen tymidiini-lohkon osoitti, että siARNT vähentää DNA-synteesiä (Fig. 1 B) ja säilytetään soluja S-vaiheessa etenemistä solusyklin (Fig. S1), vastaavasti. Nämä tulokset viittaavat siihen, ARNT säätelee solujen lisääntymistä mahdollisesti säätämällä S-vaiheen etenemisen normoksia.

(A) HeLa-solut transfektoitiin 30 nM ARNT siRNA-oligonukleotidien ja ryntäily oligonukleotidit (SC) lipofekti-. BrdU-määritys suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Virhepalkit ne merkitsevät + SD (n = 3). Tilastollinen merkitys (*** P 0,001; ** P 0,01) välillä ohjaus ja siARNT oligonucleatides käsiteltyjä soluja analysoitiin Studentin

t

testiä. (B) HeLa-solut transfektoitiin 30 nM ARNT siRNA oligonukleotidit ja sekoituskoodin oligonukleotidit (SC) lipofektiolla ja leimattiin 20 nM BrdU: ssa 20 minuuttia tai 24 tuntia. Solut kiinnitettiin ja värjättiin anti-BrdU-vasta-aineiden seurasi anti-hiiri FITC ja DAPI. Prosenttiosuus syöpäsolujen positiivista ydin- ja BrdU värjäytyminen laskettiin laskemalla immunopositiivista solut neljässä satunnaisesti valittu. Virhepalkit ne merkitsevät + SD (n = 4). Tilastollinen merkitys (*** P 0,001; ** P 0,01) välillä ohjaus ja siARNT oligonucleatides käsiteltyjä soluja analysoitiin Studentin

t

testiä.

knockdovvn ARNT inhiboi solutransformaatiota

Tulosten perusteella, että Arnt ilmentyminen edistää syöpäsolujen lisääntymistä, vaikutus ARNT soluproliferaatioon varmistettiin edelleen käyttäen pesäkemuodostusta. Kuten on esitetty kuviossa. 2A, vaikka koko ei vastannut vanhempien solujen määrä pesäkkeen väheni enemmän ilmeisesti ARNT-vajaiden solujen. Pienentynyt proliferaationopeus havaittiin myös ARNT vajavaisten solujen (Kuva. S2). Kiinnostavaa kyllä, havaitsimme, että kasvu shARNT solujen estyi alle 3D-kulttuuri tilassa (kuvio. 2B), mutta ei 2D-viljelyolosuhteissa (Fig. 2A). Nämä tulokset osoittivat, että ehtyminen ARNT vähensi kykyä solun transformaation syöpäsoluja.

(A) Alle normoxic kunnossa, A375 emosoluista (P), shLacZ soluja (Z), ja ARNT-vaiennettu soluja ( shARNT # 1 ja # 2) inkuboitiin tuoreessa viljelyalustassa normoxic kunnossa. 7 päivän jälkeen solut kiinnitettiin ja värjättiin Giemsa tahra. Koe suoritettiin pesäkemuodostusta. (B) ehtyminen ARNT estää solun transformaatio syöpäsoluissa. Solut siirrostettiin pintakerroksen agaralustaa. Kun oli inkuboitu 3 viikon täydentää välineellä solut kiinnitettiin ja värjättiin Giemsa. Koe suoritettiin pehmeä agar-määrityksellä. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

ARNT-pudotus johtaa lääkeresistenttejä soluja herkempiä sisplatiinin

joukossa kemoterapeuttiset lääkkeet, sisplatiinin indusoi solukuoleman muodostamalla sisplatiinipohjaisen DNA addukteja, jotka johtavat DNA-vaurioita ja heikentää etenemistä S-faasin. Mahdollisuus, että ARNT ohjaa solujen lisääntymistä kautta säännellään S-vaiheen etenemisen sai meidät tutkimaan, onko se tuotettu mitään vaikutusta sisplatiinin aiheuttamaa solukuolemaa. Selventää, että on tärkeää ARNT säätelyssä sisplatiinin vastus, käytimme soluparille, hioa-1 ja hioa-1-C15 (Hone-1 sisplatiini-resistentit solut). Vakaa ARNT Knockdown solulinjoja transfektoimalla hioa-1 ja hioa-1-C15 solulinjojen kanssa shARNT vektorin (Fig. S3). Kuten on esitetty kuviossa. 3, sisplatiinin indusoiman apoptoosin oli merkittävä shARNT soluissa kuin vanhempien hioa-1-soluissa. Lisäksi sisplatiinin aiheuttama vähemmän solukuoleman hioa-1-C15 soluissa kuin hioa-1-solut, vaikka korkean pitoisuuden hoitoa. Kuitenkin hioa-1-C15 solut menettivät kestokyvyn käytettäessä ARNT-pudotus tilassa (kuvio. 3). Alle sisplatiinia käsittelyn ARNT oli myös hajoaa vanhempien hioa-1-soluissa, mutta ei resistenttejä hioa-1-C15-soluissa (kuvio. 4). Sisplatiini edistänyt lisää kaspaasi-3-aktivaation hioa-1-soluissa, mutta ei hioa-1-C15-solut, vaikka suuremman pitoisuuden sisplatiinin levitettiin hioa-1-C15-solut (Fig. 4). Kuitenkin sekä hioa-1 ja hioa-1-C15-solut tulivat herkempiä sisplatiinin kun ARNT oli puutteellinen (Fig. 4). Nämä tulokset vahvistivat, että ilmaus ARNT on tärkeä säätelevä tekijä lääkeresistenssin syöpäsolujen.

Hone-1 shLacZ soluja (Z), Hone-1 ARNT-vajaiden solujen (shARNT), Hone-1-C15 shLacZ soluja (Z), ja hioa-1-C15 ARNT-vajaiden solujen (shARNT) käsiteltiin kanssa tai ilman sisplatiinin (20 uM sisplatiinia hioa-1 shLacZ solujen ja hioa-1 ARNT-vajaiden solujen, 80 ja 100 uM sisplatiinia hone -1-C15 shLacZ solujen ja hioa-1-C15 ARNT-vajaiden solujen) 24 tuntia. Apoptoottisia soluja tutkittiin värjäämällä anneksiini V-FITC /propidium- jodidia (PI), ja Virtaussytometriaa käytettiin analysoimaan solujen apoptoosin. Apoptoottisen laskettiin. * Myöhään apoptoosin; # Aikaisin apoptoosin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Hone-1-solut transfektoitiin 50 nM siARNT tai 50 nM stealth RNAi negatiivinen kontrolli (SC) 24 tunnin ajan ja käsiteltiin kanssa tai ilman sisplatiinia (60 uM for hone-1-soluissa ja 80 uM hioa-1-C15-solut) tuoreessa viljeltiin väliaineessa 24 tunnin ajan. Kokonaisproteiinin (myös eläviä soluja ja kuolleita soluja) uutettiin, analysoitiin Western blotting ja havaita ARNT, kaspaasi-3, ja α-tubuliinin vasta-aineita. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Kemoterapia huumeet aiheuttaa ARNT hajoamisen ja solujen apoptoosin

Täsmennetään mekanismi, joka osallistuu downregulation of ARNT sisplatiini- käsiteltyjen herkkien solujen, ilmaus ARNT tutkittiin edelleen erilaisissa syöpäsolulinjoissa. Kuten on esitetty kuviossa. 5A, sisplatiini tuottanut mitään vaikutusta transkription tasosta ARNT messenger (m) RNA. Kuitenkin sisplatiini aiheuttama ARNT vapauttamista purettiin käsitellyissä soluissa proteasomin inhibiittoria (kuvio. 5B). Nämä tulokset osoittivat, että sisplatiini laukaisi ARNT hajoamisen kautta proteasomin riippuvaisten reittien herkkien solujen. Mielenkiintoista, sisplatiinin aiheuttama ARNT sääntelyn purkaminen saattaisi myös olla päinvastainen, kun eri syöpien soluja esikäsiteltiin ROS puhdistusainetta NAC (Fig. S4). Nämä tulokset paljastivat, että tuotanto ROS, ainakin on yksi syy poistaa ARNT sisplatiini- käsiteltyjen syöpäsolujen. Edelleen tutkia vapautumisen ARNT vaaditaan myös muiden kemoterapia lääkkeet, kuten taksolin ja doksorubisiini aiheuttaa solukuoleman, HeLa- ja HeLa sisplatiini kestävä (HeLa R) soluja käsiteltiin näitä lääkkeitä, ja ilmauksia ARNT ja hajanainen DNA tutkittiin . Doksorubisiini ja taksolin esti ARNT ilmaisun ja kasvanut hajanainen DNA HeLa-soluissa (kuvio. 5C 5D). Kuitenkin, ekspressio ARNT ei muuttunut HeLa R-soluissa hoidon jälkeen taksolin tai doksorubisiinin (Fig. 5c), ja nämä tulokset olivat yhdenmukaisia ​​puute fragmentoitunutta DNA: ta havaittiin HeLa-R-soluissa (kuvio. 5D). Lisäksi, shARNT solulinjat olivat myös herkkiä sisplatiinin indusoimaa solukuolemaa (Fig. 3). Nämä tulokset viittaavat siihen, ARNT on keskeinen rooli edistettäessä vastustuskykyä syöpäsoluja eri kemoterapeuttisten. Olemme myös havainneet, että kaspaasi-inhibiittori, ZVAD, esti p53: n ja kaspaasi-3: sisplatiini-käsitellyissä soluissa (kuvio. 5E). Mielenkiintoista, sisplatiinin aiheuttama vapautuminen ARNT palautettiin ZVAD käsitelty herkkien HeLa-soluja (kuvio. 5E). Lisäksi, sisplatiinin aiheuttama kaspaasi-3-aktivaation, ehtyminen ARNT, ja lisäys p53 olivat päinvastaiset soluissa, jotka on esikäsitelty NAC (Fig. S4). Nämä tulokset osoittivat, että sisplatiinin aiheuttama kaspaasi-3-välitteisen ilmentymisen ARNT ja p53. ZVAD estetty kaspaasi-3 ja pelastettiin ARNT ilmentymisen sisplatiinia saaneilla herkkien solujen, viittaa siihen, että kaspaasi-3-aktivaatio on tärkeää sisplatiinin indusoiman solukuoleman herkkien solujen.

(A) HeLa-soluja käsiteltiin sisplatiinin 24 h. Kokonais-RNA uutettiin varten Käänteiskopiointia PCR ARNT ja GAPDH-alukkeita. (B) HeLa-soluja käsiteltiin 10 uM MG132 tai 1 uM laktakystiini 4 h jälkeen annetaan 36 tuntia. Expression of ARNT ja aktiinin analysoitiin Western blotting -analyysillä käyttäen anti-ARNT ja anti-aktiini-vasta-aineita. (C) HeLa ja Helar soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla taksolin ja doksorubisiinin 24 tuntia. Ilmauksia ARNT ja aktiini havaittiin Western blotting -analyysillä käyttämällä anti-ARNT ja anti-aktiini-vasta-aineita. (D) jälkeen 30pM sisplatiinihoitoon HeLa ja HeLa R soluissa, apoptoottinen DNA pirstoutuminen määritettiin kuvatulla tavalla ”Materiaalit ja menetelmät”. (E) Solut transfektoitiin 30 nM ARNT siRNA oligonukleotidit ja salattu oligonukleotidit (SC) lipofektiolla. 30 uM ZVAD hoito 30 min, jota seurasi 30 uM sisplatiinia 36 tunnin, lysaatit solut valmistettiin ja alistettiin SDS-PAGE: lla ja analysoitiin Western-blottauksella vasta-aineita ARNT, prokaspaasi-3, kaspaasi-3, p53, ja aktiinin . Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

lisäys ROS ARNT-knockdown-soluja osallistuu sisplatiinin indusoiman apoptoosin

Lisäksi purkamalla effluksipumppujen, lisääntymistä ROS taso on toinen tapa kemoterapeuttisten apoptoosin. Kuten on esitetty kuviossa. S4, ehtyminen ROS dramaattisesti inhiboivat sisplatiinin indusoiman apoptoosin. Selventää edelleen mekanismi, joka osallistuu ARNT sääntelemättömien sisplatiini vastus, rooli ROS sisplatiinin aiheuttama solukuolema tutkittiin. Ensin tunnistettiin määrä ROS vanhempien (P), shLacZ (Z), ja shARNT soluja. Kiinnostavaa kyllä, huomasimme, että ROS oli ilmeisesti suurempi ARNT-vajaiden solujen kuin vanhempien soluja normoxic olosuhteissa (Fig. 6 ja Fig. S5a). Kasvu ROS pienennettiin shARNT käsitellyissä soluissa NAC (Fig. S5a). Lisäksi, sisplatiini-parannettu ROS määrä putosi käsitellyissä soluissa NAC (Fig. S5B). Sisplatiini indusoi myös suurempi tuotanto ROS shARNT soluissa (kuvio. S5c), ja määrä ROS väheni käsitellyissä soluissa NAC. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ilmaus ARNT esti sisplatiinin-avusteinen ROS tuotanto. Selvittääkseen kasvu ROS shARNT soluissa on tärkeä rooli sisplatiinin indusoiman apoptoosin, NAC käytettiin heikentävistä ROS ja apoptoosin suhde analysoitiin. Kuten on esitetty kuviossa. 7, NAC estivät merkittävästi sisplatiinin indusoimaa solukuolemaa shARNT soluissa (Fig. 7). Nämä tulokset osoittivat, että ARNT suojattu syöpäsolujen sisplatiinin indusoiman apoptoosin, ainakin vähentämällä ROS tuotantoa soluissa.

A375 vanhempien ja shARNT soluja inkuboitiin alla normoxic kunnossa yön yli ja värjättiin karboksi-DCFDA seurata ROS tuotantoon. FL1 fluoresenssi osoitti fluoresenssin arvo karboksi-2 ’, 7’-dikloorifluoresiinidiasetaattia (karboksi-DCFDA). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Soluja esikäsiteltiin 10-asetyylikysteiini (NAC) 1 h ennen kuin A375 emosoluista (P), shLacZ soluja (Z), ja ARNT hiljaiset solujen (shARNT # 1 ja # 2), käsiteltiin 5 uM sisplatiinin, ja sitten inkuboitiin 24 tuntia. Apoptoottisia soluja tutkittiin värjäämällä anneksiini V-FITC /propidium- jodidia (PI), ja Virtaussytometriaa käytettiin analysoimaan solujen apoptoosin. Apoptoottisen laskettiin. * Myöhään apoptoosin; # Aikaisin apoptoosin. Samanlaisia ​​tuloksia saatiin kolmessa riippumattomassa kokeessa.

Keskustelu

Cancer terapeuttisiin sovelluksiin, kuten radikaali hoito yhdistettynä kemoterapia-terapeuttisten lääkkeiden välittämä induktio ROS, ovat tärkeitä tapoja poistaa syöpäsolut [22]. Kuitenkin syöpäsolut pystyvät vastustuskyvyn aiheuttamien vahinkojen ROS aiheuttama apoptoosin vaihtoehtoisin antiapoptoottisia reittejä, kuten Akt, Kras, Braf, ja Myc [23], [24]. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet, että ARNT myönnetty anti-apoptoosin kyky syövän soluissa, joita käsiteltiin anti-syöpälääkkeen, sisplatiinin. Lisäksi sisplatiinin tuotti enemmän ROS sukupolven ARNT-pudotus seinämässä, johtaen parantamiseksi solukuoleman. Samanlaisia ​​havaintomme että Arnt suojattava soluvaurioita vähentämällä ROS tasoilla, leukemia solut olivat herkkiä troglitazone joka myös aiheuttaa apoptoosia kautta solunsisäisten ROS [25]. Kestää leukemiasolujen näytteillä runsaasti ARNT ja myös seurannut säätelyä SOD (SOD2), Nukleaaritekijä erytroidi 2 liittyvä tekijä 2 (Nrf2) transkriptin ja solunsisäinen glutationin pitoisuus [25]. SOD2 vähentää antioksidantteja ja Nrf2 lisää antioksidantti-entsyymin toimintaa [25]. Lisäksi Nrf2 säätelee transkriptiota mir125b estää AhR repressorin (AhRR), joka suojaa munuaisten akuutti vamma [26]. Tämä osoittaa, että muodostuu AhR /ARNT komplekseja voidaan säädellä mir125b [8]. Nämä tulokset viittaavat siihen, että ARNT voi säädellä SOD2 ilmaisu tai ARNT /AhR kompleksin muodostumisen vähentämiseksi solujen aiheuttamaa vahinkoa lisääntynyt ROS.

Mitä sääntelyn ARNT, huomasimme, että sisplatiini voi estää ARNT jollain havaitsematta tavoilla. ARNT hajotettiin annoksesta riippuvalla tavalla ei-resistentit solut sisplatiinia. ARNT puoliintumisaika näytti olevan tärkeä apoptoosin aiheuttaman sisplatiinia. Esimerkiksi, proteasomin inhibiittorit, kuten MG132 ja laktakystiini, estää hajoaminen ARNT aiheuttama sisplatiinia. Kuitenkin sisplatiini kestävä syöpäsolulinjoja osoitti ARNT vakaus ei muuttunut hoidon aikana sisplatiinin. Nämä syöpäsolut jatkuvasti ARNT tasoilla osoitti myös hyvä kyky estää kyky apoptoosin. Nämä tulokset vastasivat aiemman tutkimuksen, jossa ARNT häiriöitä korreloi proteasomaalisten hajoamisen kautta ubikinaa- prosessi [27]. Yhdenmukainen havaintomme että ARNT oli tyhjentynyt, jonka syöpälääkkeet, ARNT myös hajottavat curcumin vuonna normoxic ja hypoksinen olosuhteet eri syöpäsolutyyppien [27]. Lisäksi ilmentyminen ARNT voidaan palauttaa käsittelemällä NAC, joka on ROS scavenger, läsnä ollessa curcumin. Nämä tulokset ovat yhdenmukaisia ​​havaintomme että NAC pelastettu ilmentymistä ARNT sisplatiini- käsiteltyjen herkkiä soluja. ARNT voidaan myös häiritä käyttäen H

2O

2 syöpäsoluissa [27]. Lisäksi ROS ja johdonmukainen sen kanssa, että kaspaasi-3 ja kaspaasi-9 myös katkaisevat ARNT klo Asp 151 aminohapon site in vitro [11], huomasimme, että sisplatiini aiheuttama hajoaminen ARNT tukahdutettiin seuraavat hoidon kaspaasiestäjä ZVAD. Siten sisplatiini-aktivoitu caspases saattaa vapautuminen ARNT huumeisiin herkkien solujen mutta ei resistentit solut. Kemoterapeuttiset lääkkeet, kuten taksolin ja doksorubisiinin voivat myös vastaavasti aiheuttaa syöpäsolujen apoptoosia kaspaasi-10 ja p53 polkuja [28], [29]. Tässä tutkimuksessa taksoli ja doksorubisiini myös parannettu ARNT hajoamista, mikä johtaa apoptoosin herkkien solujen. Nämä tulokset paljastivat, että ARNT on olennaista suojella syöpäsoluissa huumeiden aiheuttamaa vahinkoa. Aiemmassa tutkimuksessa ilmeni myös, että pilkkominen ARNT tehostaa hypoksian indusoiman aktiivisen kaspaasin, ja tämä vaimentua transkriptionaalisen aktiivisuuden säilyminen geenien aiheuttama HIF [27]. Tuotanto ROS on yksi vaikutuksia, joiden kautta sisplatiinia aiheuttaa solukuoleman [17]. On myös raportoitu, että mir-24 aiheuttama ROS aiheuttaa ehtyminen ARNT proteiinia tasolla ihmisen maksasyövän solulinjoja [30]. Yhdessä ROS voitaisiin indusoida ehtyminen ARNT, ja sitten edelleen tuottaa negatiivista palautetta säätelyyn ARNT indusoimalla mirRNA. Siitä syystä, ehkäisyyn ARNT heikkenemistä hoidon alussa huumeiden on tärkeä selviytymisen syöpäsoluja. Kuitenkin onko ROS aiheuttama mir-24 on syynä tukahduttaminen ARNT in sisplatiinin käsiteltyjä soluja olisi tutkittava meidän lisätutkimuksia. Vaikka mekanismi mukana ylösajon ROS tason aiheuttama ehtyminen ARNT oli epäselvä ja se olisi myös tutkittava, me arveltu, että tukahduttaminen ARNT voisi olla yksi mekanismeista vastuussa muuttaa tason ROS sisplatiinin aiheuttama solukuolema.

yleisesti, ARNT voi olla vuorovaikutuksessa HIF-1α säädellä geenejä, jotka edistävät angiogeneesiä, vuorovaikutuksessa c-Jun ja Sp1 moduloimaan MDR1 ilmentymisen, tai säätää EGF-indusoidun ilmentymisen COX-2, 12 (S ) -lipoxygenase, ja p21

WAF1 /CIP1

, jotka tunnistavat muutoksen microenvironmental komponentin [1], [13]. ARNT soittaa myös tärkeä rooli säätelyssä syövän etenemiseen, vieroitus, ja ulosvirtaus syöpälääkkeet, mikä lisää selviytymisen mahdollisuus epäsuotuisissa olosuhteissa [3], [8], [9], [24]. Kemoterapeuttisessa syövän, sisplatiinin kerääntyy syöpäsoluja, joka aiheuttaa DNA-vaurioita ja indusoi apoptoosia. Lääke effluksipumpun, MDR1, on voimistuvan ARNT estää sisplatiinin indusoiman apoptoosin [9]. Lisäksi säännellä lääkeresistenssin aiemmissa tutkimuksessa ARNT myös suojaa soluja microenvironmental myrkyllisyys. Esimerkiksi AhR /ARNT monimutkainen aistii ympäristömyrkyt ja säätelee väyliä vastuussa vieroitus. Esimerkiksi TCDD aiheuttaa lukuisia geenejä välittyy AhR /ARNT kompleksin, kuten sytokromi P450 1A1 (CYP1A1), joka voi puhdistaa polysyklisiä aromaattisia yhdisteitä [8], [31]. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että ARNT pelaa edelleen rooli alas-säätely ROS estää syöpäsolujen kärsivät vahinkoa sisplatiinihoitoon. Yhdessä me arveltu, että ARNT on keskeinen välittäjäaine poistamaan sytotoksisuuden innoissaan ympäristötekijät.

Yhteenvetona tuloksemme paljasti, että ehtyminen ARNT edistetään vaikutus syöpälääkkeiden syöpää solukuoleman. Meidän ymmärrys oli ainakin kaksi mekanismeja ARNT aiheuttamia lääkeresistenssi: MDR1 säätelyä [9] ja ehkäisy ROS tuotanto. Vaikka mekanismi, joka osallistuu säätelyyn ROS tuotannon ARNT ilme on edelleen tuntematon, kehitys antagonistien kohdistaminen ARNT voi tarjota uusia strategioita tuhota resistenttejä syöpäsoluja.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljelmät

Solulinjat ihmisen melanooma (A375) ja ihmisen kohdunkaulan syövän (HeLa) hankittiin American Type Culture Collection. Ihmisen nenänielusyöpä soluja (HONE1 ja hioa-1-C15) oli ystävällisesti toimittanut Dr. Jane-Yang Chang (National Health Research Institutes, Taiwan) [32]. A375 ja HeLa-solulinjat pidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle (DMEM), jossa oli 1% glukoosia (Gibco). Hone-1-soluissa ja niiden johdannainen sisplatiini-variantin, hioa-1-C15, pidettiin RPMI Media 1640 (Gibco). Kaikkia solulinjoja on täydennetty 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Hyclone), 100 ug /ml streptomysiiniä (Sigma-Aldrich), ja 100 U /ml penisilliiniä (Sigma-Aldrich) kasvatusväliaineeseen ja inkuboitiin 5% CO

2 37 ° C: ssa ylläpitoa. Sisplatiini kestävä Hone-1-C15-soluja ylläpidettiin alustassa, joka sisälsi 15 uM sisplatiinia. ARNT puutteesta A375 solulinjat olivat riippumattomia stabiileja solulinjoja infektoitu lentivirusvektori johdettuja ARNT pieni hiusneula (sh) RNA [9]. ARNT-puutteellinen Hone-1 ja hioa-1-C15 solulinjat stabiileja solulinjoja infektoitu lentivirusvektori johdetun ARNT shRNA [9]. Lääkeresistenssideterminantit aikataulut käytettiin kehittää alilinjat vastustuskykyisiä Sisplatiinin [9]. HeLa solut altistettiin sisplatiinin varten 9 kuukauden ajan. Vastus alalinja on saatu tällä menetelmällä on merkitty HeLa R.

trypaanisiniekskluusiolla määrityksessä

Solut maljattiin 5 x 10

4 per kuoppa 24-kuoppalevyille. Sen jälkeen solujen annettiin kiinnittyä yön yli, kasvualusta korvattiin tuoreella kasvualustalla, kanssa tai ilman sisplatiinia. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa hypoksinen ehdon (1% O

2) vielä 24 tuntia, ja ne trypsinoitiin sekoittuu ne seerumia sisältävää elatusainetta. Trypaanisinivärin 20 ui ja 20 ui solususpensiota sekoitettiin mitata määrän eläviä soluja (laimennuskertoimella ja 2). Stained solut laskettiin ja pitää kuolleet solut.

bromideoksiuridiinia (BrdU) sisällyttäminen määritys

DNA-synteesiin lisääntyvissä soluissa havaittiin BrdU (Cell Signaling Technology, Danvers, MA). Vanhempien ja ARNT pudotus solut levitettiin 96-kuoppalevyille ja inkuboitiin 24 tuntia. 5-bromideoksiuridiinia (BrdU) reagenssi lisättiin elatusaineet 0-48 h, 100 ui Kiinnitys Liuos lisättiin soluihin 30 min. Solut pestiin pesupuskurilla ja inkuboitiin 1 h ajan 100 ui 1 x BrdU-vasta-aine. Kun oli lisätty 100 ui 1 x HRP-konjugaatin liuos, 30 min, 100 ui TMB-substraattia lisättiin. Seuraavat 30 min inkuboinnin stop-liuosta lisättiin. OD mitattiin 450 nm: ssä käyttäen levylukijaa. Immunofluoresenssi-, jotka on transfektoitu 30 nM ARNT siRNA oligonukleotidit olivat pulssin leimataan 20 nM BrdU: ssa 20 minuuttia tai 24 tuntia. Solut kiinnitettiin ja värjättiin anti-BrdU-vasta-aineiden seurasi anti-hiiri FITC ja DAPI. Prosenttiosuus syöpäsolujen positiivista ydin- ja BrdU värjäytyminen laskettiin laskemalla immunopositiivista solut neljässä satunnaisesti valittu käyttäen Image J ohjelmisto.

Pesäkkeenmuodostusta määrityksessä

Solut erillisinä single solut 6 kuoppaiset soluviljelmämallissa levyt. Sen jälkeen solujen annettiin kiinnittyä yön yli, solut käsiteltiin tai ei 1 uM sisplatiinia 8 tunnin ajan, ja väliaine vaihdettiin tuoreeseen elatusaineeseen. Viljelyväliaine vaihdettiin joka 2 päivä. Kun oli inkuboitu 7 päivää, solujen pesäke pestiin kahdesti PBS: llä ja kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä (PFA, Sigma-Aldrich). Metanolia (JT Baker) käytettiin tunkeutumisen lisäämiseksi soluihin, ja Giemsa-värjäys (Sigma-Aldrich) käytettiin solujen värjäystä. Colony numerot määritettiin Image J ohjelmisto [33]. Pesäkkeiden muodostuminen vahvistettiin ainakin kolme kertaa.

Soft agar määrityksessä

korkean glukoosin DMEM, joka sisälsi 10% FBS: ää, jossa oli 0,5% agaroosia maljattiin pohjassa (1,5 ml /kuoppa) 6-kuoppaisille levyille. Sen jälkeen, kun pohjapinta agar oli hyytynyttä, 5 x 10

3-solut suspendoitiin uudelleen suuren glukoosipitoisuuden DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää 0,25% agaroosia ja kerrostettiin (1,5 ml /kuoppa) 6-kuoppaisilla levyillä. Soluja inkuboitiin 0,5 ml: lla täydennettynä väliaineen jälkeen agarin kerros oli hyytynyttä. Viljelyväliaine vaihdettiin joka 2 päivä. Kun oli inkuboitu 2 viikkoa, solut pestiin kahdesti PBS: llä ja kiinnitettiin 4% PFA. Metanolia käytettiin tunkeutumisen lisäämiseksi soluihin, ja Giemsa tahra käytettiin solujen värjäystä. Pesäkkeiden muodostuminen vahvistettiin ainakin kolme kertaa.

Käänteinen transkriptio-PCR (RT-PCR) B

Solun RNA uutettiin Trizol (Invriogen) reagenssi, ja sen jälkeen käsin. Kaksi ug RNA: ta päinvastaiseksi IMPROM-II ™ käänteiskopioijaentsyymiä (Promega) ja käytettiin cDNA-templaattia polymeraasiketjureaktion (PCR). 50 ng cDNA: ta templaattina käytettiin PCR 2,5 U Tag-DNA-polymeraasia (MD Bio, Taiwan) [34]. Alukesarjat käytettiin seuraavasti: ARNT (F): 5′-TGGGTCCAGCCATTGCCTCT-3 ’, ARNT (R): 5′-CGAGCCAGGGCACTACAGGT-3′, GAPDH (F): 5’-CCATCACCATCTTCCAGGAG-3 ’, GAPDH (R ): 5’-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3 ’. PCR-reaktiot sitten elektroforeesi 2% SeaKem LE agaroosigeelillä (Lonza, ME, USA).

Western blot-analyysi

Solut kerättiin 1 x CCLR tai RIPA-puskuria (10 mM Tris-puskuria pH: ssa 6,5, 150 mM NaCl, 50 mM EDTA, 1% DOC, ja 1% NP-40, joka sisälsi proteaasi-inhibiittorit).