Krooninen sairaus

tiivistelmä

Adrenomedulliini (AM) on 52 aminohapon peptidi, alun perin eristetty ihmisen feokromosytooma. AM ilmaistaan ​​erilaisia ​​pahanlaatuisia kudoksia ja syöpäsolulinjoissa, ja sen osoitettiin olevan mitogeenisen tekijä, joka kykenee stimuloimaan kasvua useiden syöpäsolutyyppien. Lisäksi AM on eloonjäämistekijä tiettyjä syöpäsoluja. Jotkut tiedot viittaavat siihen, että AM voisi olla mukana etenemisen syövän etäpesäkkeiden kautta angiogeneesiä ja solujen vaeltaminen ja invaasion valvontaa. Ohimenevä Receptor Potential kanava TRPV2 tiedetään edistävän eturauhassyövässä solujen vaeltamiseen ja invasiivisia fenotyypin ja korreloi vaiheessa ja arvosana virtsarakon syöpään. Tässä työssä osoitamme, että AM indusoi eturauhasen ja uroteelisyöpä solumigraatio ja invaasion kautta TRPV2 translokaation plasmamembraanin ja myöhemmin nousu lepää kalsiumia tasolla.

Citation: Oulidi A, Bokhobza A, Gkika D, Vanden Abeele F, Lehen’kyi V, Ouafik L, et ai. (2013) TRPV2 välittää Adrenomedulliini Tutkijoiden Eturauhasen ja uroteelisyöpä Cell Adhesion, Migration and Invasion. PLoS ONE 8 (5): e64885. doi: 10,1371 /journal.pone.0064885

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 21. 2013 Hyväksytty: 19 huhtikuu 2013; Julkaistu: toukokuu 31, 2013

Copyright: © 2013 Oulidi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale (INSERM), Ligue Nationale Contre le Cancer, Region Nord Pas de Calais ja katolisen yliopiston de Lille. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Adrenomedulliini (AM) on 52 aminohapon peptidi, joka on eristetty ihmisen feokromosytooma [1], joka kantaa monitekijäinen sääntely ominaisuudet vaihtelevat indusoimaan verisuonten laajeneminen ja moduloimaan solujen kasvua [2]. Toiminnot AM välittyvät spesifisten reseptorien kautta, joka käsittää kalsitoniinin kaltaista reseptoria (CLR) ja reseptorin aktiivisuutta muuntavien proteiini (RAMP); kun koekspressoitu RAMP2 tai RAMP3, CLR toimii erityinen AM reseptori [3]. AM ja sen reseptorit ovat erittäin ilmaistaan ​​eri syöpäsolulinjoissa ja syövät haima-, keuhko-, munuais-, rinta-, munasarja- ja eturauhas-. Useat tutkimukset ovat sekaantuneet AM (erittyy endogeenisesti tai annetaan eksogeenisesti) kasvaimen kasvussa, etenemisessä ja etäpesäkkeiden kautta vaikutuksia angiogeneesiin, soluproliferaatioon, apoptoosin ja muuttoliike [4] – [6]. Kuitenkin molekyylitason mekanismit nämä vaikutukset AM syövän solujen kasvua ja etäpesäkkeiden pysyvät ristiriitaisia ​​ja huonosti.

Solun maahanmuutto on keskeinen rooli syövän eteneminen ja metastaasit. Monet komponenteista solumigraatiota koneiden säätelevät solunsisäistä kalsiumia (Ca

2 +) pitoisuus [7]. Olennainen osa solunsisäistä Ca

2 + generoidaan transmembraaninen tulva solunulkoisen Ca

2+ pääasiassa esiintyvien kautta kationisia kanavien erottuva Ca

2+ valikoivuus. Ei-viritettävissä soluja, Ca

2+ merkintä on järjestetty ionikanavia, jotka aktivoituvat erilaisten kemiallisten ja fysikaalisten ärsykkeitä. Jotkut näistä Ca

2 + merkintä kanavat ovat jäseniä ”ohimenevä reseptorin potentiaali” (TRP) perhe kationisia kanavien [8]. TRP kanavat on raportoitu liittyvän syövän synnyssä [9] – [11], ja niiden joukossa TRPV2 kanava, on osoitettu erikseen osallisena etenemisen eturauhasen ja virtsarakon syöpien kovenevaan fenotyyppiin. Itse asiassa viimeaikaiset tutkimukset meidän laboratorio on osoittanut osoittavat, että TRPV2 ilmaistaan ​​aggressiivisempi eturauhassyöpä solujen ja stimuloi muuttoliike ja invasiivisia Näiden solujen fenotyyppi [12], [13]. Mielenkiintoista, TRPV2 ilmentymistä virtsarakossa on myös osoitettu korreloivan luokan ja vaihe syöpä [14], mutta ei ole tietoa sen mahdollisen roolin virtsarakon syövän solujen vaeltamiseen /invaasion.

Tässä työssä olemme tutkineet osallistuminen TRPV2 vaikutuksessa AM on monivaiheinen prosessi hyökkäyksen kahteen erittäin invasiivisia solulinjat: PCA (Eturauhassyöpä) solut PC-3 ja UC (urothelial karsinooma) solut T24 /83. Tuloksemme osoittavat, että AM voi lisätä tarttumista, muuttoliike ja hyökkäyksen kautta Focal Adhesion Kinase (FAK) ja integriini-β1 aktivointi, ja stimulaatio TRPV2 translokaation plasmamembraanin. Siten tuloksemme uusia näkymiä rooliin AM ja TRPV2 eturauhasen ja virtsarakon syöpää sairastavilla.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

Ihmisen PCa solulinja PC- 3 saatiin ATCC ja pidettiin viljelmässä RPMI 1640: ssä (Life Technologies), jota oli täydennetty 10% FCS: ää ja 5 mM L-glutamiinia (Sigma). Urothelial tasyöpäsolulinja T24 /83 saatiin ECACC ja pidettiin viljelmässä McCoyn 5A Glutamax® (Life Technologies), jota oli täydennetty 10% FCS.

käänteistranskriptio-PCR

Yhteensä mRNA eristettiin soluista, kuten aikaisemmin on kuvattu [12]. DNA: n monistuksen olosuhteet sisälsivät alkuperäisen denaturoinnin 7 minuutin vaihe 95 ° C: ssa; 35 sykliä 30 s 95 ° C: ssa, 30 s 60 ° C: ssa, ja 30 s 72 ° C: ssa; ja lopuksi 7 min 72 ° C: ssa. Alukkeita sekvenssit ja kokoisia palasia oli RAMP2: eteenpäin 5′- CTCAGCCTCTTCCCACCAC-3 ’, käänteinen 5′-TTCCAGCAAAATTGGACAGC-3′, 84 emäsparia; ja RAMP3 5’-ATCTCGGTGCAGTTGGTGA-3 ’ja 5′-AAGGTGGACGTCTGGAAGTG-3′, 77 emäsparia; for CLR 5’-CATGGACAAATTATACCCAGTGT-3 ’ja 5′-TCCAATTATGGTCAGGTAAAACAA3′, 86 emäsparia; ja Actin 5’-CAGAGCAAGAGAGGCATCCT-3 ’ja 5′-GTTGAAGGTCTCAAACATGATC-3’, 209 bp.

Sirna transfektio

PC-3 ja T24 /83-soluja transfektoitiin 50 nM pieni häiritsevä RNA (siRNA) vastaan ​​TRPV2 (siTRPV2 sekvenssi: 5′-UAAGAGUCAACCUCAACUAdT-3 ’, syntetisoitiin Eurogentec) käyttäen HiPerFect transfektioreagenssia (Qiagen) seuraten valmistajan ohjeita.

Soluadheesiokoe

solut kerättiin ja ympättiin 3 * 10

4 ja 1,5 * 10

4 solua /kuoppa PC3 ja T24 /83 vastaavasti peruselatusaineessa täydentää tai ei AM (200 nm) fibronektiinin (10 ug /ml) ennalta päällystetty 96-kuoppalevyille. 45 min jälkeen inkuboinnin 37 ° C: ssa, kiinni solut kiinnitettiin 15 minuuttia metanolissa kylpyamme ja värjättiin Hoechst (5 mg /ml PBS: ssä), kuvat otettiin Leica DMIRE2 mikroskooppia (x 5) ja solut laskettiin käyttämällä NIH image analyysin ohjelmisto (ImageJ).

Cell Migration ja invaasiomääritys

Solun muuttoliikettä ja invaasiota määritettiin Transvvell- määrityksessä. Lyhyesti, solut ympättiin päälle Transwell soluviljelmässä lisätään 8 um huokoskoko (Falcon) tiheyteen 60000 kuoppaa kohti PC-3 ja 30.000 T24 /83 (24-kuoppaformaatti) seerumittomassa elatusaineessa. 1 tunnin kuluttua kiinnostava molekyyli, lisättiin molemmille puolille Transwell suodattimen. Sillä invaasiomääritys, ylempi osasto päällystettiin 50 ug Matrigelillä (BD Biosciences) matriisin muodostamiseksi esteen. Alempi osasto täytettiin alustalla, joka sisälsi 10% FCS, kuten kemoattraktantti. 8 tunnin kuluttua migraatiokokeessa ja 24 h invaasio, ei-muuttavien solut poistettiin ylhäältä suodattimen raaputtamalla, kun taas solut, jotka olivat vaeltaneet suodattimen läpi huokoset alapintaan insertit kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä ja Hoechstilla (5 mg /ml PBS: ssä) ja laskettiin käyttämällä Leica DMIRB mikroskooppia (x 200).

Ca

2+ Mittaukset käyttäen Fura-2 AM

Ennen fluoresenssimittauksissa, solut trypsinoitiin ja maljattiin lasi liukua. Elatusaine vaihdettiin joka 48 h. Soluja käytettiin 3 vuorokauden kuluttua trypsinaation. Elatusaine korvattiin HBSS, joka sisälsi 142 mmol /L NaCl, 5,6 mmol /l KCI: a, 1 mmol /l MgCI2: ta, 2 mmol /L CaCl2: a, 0,34 mmol /L Na2HPO4, 0,44 mmol /l KH2PO4, 10 mmol /L HEPES, ja 5,6 mmol /l glukoosia. Osmolaarisuus ja Tämän liuoksen pH säädettiin 310 mOsm /l, ja 7,4, vastaavasti. Väriaine- saavutettiin siirtämällä solut tavalliseen HBSS, joka sisälsi 1 mmol /L Fura-2 asetoksimetyyliesteri (Calbiochem) ladattu (45 min) 40 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Sen jälkeen solut pestiin kolme kertaa samalla väriaine-free ratkaisu. Pääliliuskalle siirrettiin sitten päälle verenkierron salissa Olympus IX70 mikroskooppi varustettu fluoresenssi. Fluoresenssi oli vaihtoehtoisesti innoissaan 340 ja 380 nm monokromaattorin ja vangittiin suodatuksen jälkeen läpi pitkän ylipäästösuodattimen (510 nm), jonka MicroMax 5 MHz CCD-kamera (Princeton Instruments, Evry, Ranska). Ja analyysiä suoritettiin Metafluor 7.7.4.0 ohjelmiston (Universal Imaging Corp., West Chester, PA). Solunsisäisen kalsiumin pitoisuus oli peräisin suhde fluoresenssivoimakkuudet kunkin viritysaallonpituuksia (F340 /F380) ja yhtälön Grynkiewicz. Solut jatkuvasti huuhdeltiin HBSS ratkaisun kautta koko-kammion perfuusiojärjestelmällä ja kemikaaleja lisättiin kautta perfuusiosysteemissä. Virtausnopeus koko kammion perfuusio järjestelmä asetettiin 1 ml /min ja kammion tilavuus oli 500 ui. Kaikki tallenteet on tehty 37 ° C: ssa.

biotinylointi ja Western-blottauksella

Kokeet suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [15]. Käytetyt vasta-aineet olivat kanin polyklonaalista anti-VRL-1 (TRPV2, 1/200, Santa Cruz), anti-FAK (1/500, Abcam), anti-FAK fosfori Y397 (1/1000, Abcam), anti-integriini beta 1 fosfo T788 + T789 (1/1000, Abcam), ja anti-integriini beeta 1 (1/200, Santa Cruz), ja hiiren monoklonaalinen anti-beeta-aktiini (1/2000, Sigma-Aldrich).

Data Analysis

tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SE. Tontit tuotettiin Excelillä. Jokainen koe toistettiin vähintään 3 kertaa. n ilmaisee solujen määrä per koe. N osoittaa kokeiden lukumäärästä riippumatta. Turkin-Kramer testiä käytettiin tilastollisen vertailun keskuudessa keinoja ja eroja, ja P 0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

Adrenomedulliini Lisäykset PC-3 ja T24 /83 Cell Adhesion, Migration ja Invasion

varmistettuaan ensin RT-PCR ilmentymistä AM reseptorien eturauhasen ja uroteelisyöpä solulinjoissa PC3 ja T24 /83. Kuten kuviossa 1A, PC-3 ilmaisee kahden AM-reseptoreihin, CLR /RAMP2 ja CLR /RAMP3, kun taas T24 /83 ilmaisee ainoastaan ​​CLR /RAMP3.

(A) RT-PCR-koe osoittaa RAMP2, RAMP3 ja CLR ilmentymistä PC-3 ja T24 /83-soluissa. (B) PC-3 (vasen paneeli) ja T24 /83 (oikea paneeli) soluadheesiota tutkittiin ymppäämällä 3 * 10

4 ja 1,5 * 10

4-soluissa per kuoppa 96-kuoppalevyille ennen päällystetty fibronektiinin, ja inkuboitiin 45 min kanssa tai ilman AM (200 nM) (N = 3, * P 0,05 verrattuna kontrollisoluihin). β1-integriinin fosforylaatio tutkittiin western-blotting on yhteensä proteiineihin uutettu PC-3 ja T24 /83-solut ympätään fibronektiiniin päällystetyillä levyillä ja käsitelty tai ilman AM. (C) PC-3 ja T24 /83 migraatiota tutkittiin TranswellTM määrityksen jälkeen 8 h hoidon (N = 3, * P 0,05 verrattuna kontrollisoluihin). FAK fosforylaatio tutkittiin western-blotting on yhteensä proteiineihin uutettu PC-3 ja T24 /83 soluja käsitelty tai ilman AM. (D) varten invaasiomääritys, siirtokuoppaan kalvo oli esipäällystetty 50 ug matrigeelin, ja PC-3 ja T24 /83-soluja anna hyökätä 24 tuntia (N = 3, * P 0,05 verrattuna kontrollisoluihin).

Sitten tutkittiin solun tarttumista merkittävä osa tyvikalvon, fibronektiiniä. Lisätty 200 nM AM kasvanut sekä PC-3 ja T24 /83-solujen 26% ja 34% tässä järjestyksessä (Kuva. 1 B). Yksi tärkeimmistä molekyyli pelaajat muuttamalla solun substraatti tartunta on integriini-reseptoreiden superperheen, jotka koostuvat heterodimeerien α- ja β- alayksiköistä tunnistamaan eri soluväliaineen (ECM) proteiineja. Mielenkiintoista, β1-integriini on yleisin alayksikkö ilmaistuna PCa soluissa ja joka kykenee muodostamaan heterodimeerejä sitoutumisen fibronektiiniin [16], kun taas lisääntynyt β1-integriinin ilmentyminen korreloi invasiivisia ja metastaattinen virtsarakon syövän [17]. Aktivointi β1-integriinin johtaa sen fosforylaatio, jota voidaan tutkia western blottauksella. Siksi testataan onko AM voisi aktivoida β1-integriini tutkimalla sen fosforylaatio Thr-788-789 kanssa fosfo-spesifistä vasta-ainetta. Havaitsimme, että AM käsittely lisäsi merkitsevästi tasolle fosforyloidun β1-integriini vaikuttamatta ilmentymistä kokonaisproteiinista muodossa (Fig. 1 B, alempi paneeli).

muuttaminen tartunta voitaisiin edistää maahanmuuton ja hyökkäys: kaksi tärkeää pahanlaatuisuuteen liittyviä fenotyyppejä. Joten, tutkimme vaikutus AM hoidon seuraavilla fenotyyppien avulla Transvvell- määrityksiä. Lisäksi 200 nM AM lisääntynyt migraatio PC-3 45% ja T24 /83-soluissa 40% (Fig. 1 C). Useat tutkimukset osoittivat, että koskettaessa osien ECM, integriinien ryhmittyneet johtaa aktivoitumiseen fokaalisen adheesion kinaasin (FAK) by autofosforylaatio klo Tyr397. Aktivointi FAK säätelee solujen liikkumiseen ja muodon [18]. Tutkimme siis aktiivisuus FAK western-blottauksella spesifistä vasta-ainetta vastaan ​​fosfo-Tyr397 FAK. Kuten on esitetty kuviossa. 1C (alempi paneeli), fosforyloitu FAK on merkittävästi kasvanut AM hoito koko FAK kun koko FAK ilme pysyi ennallaan.

Lisäksi olemme tutkineet vaikutus Keskiyö hyökkäyksen potentiaali kahden solun linjojen siirtokuoppaan määritys, jota varten siirtokuoppaan suodatin päällystettiin Matrigel. AM käsittely lisäsi kykyä soluinvaasiota kautta Matrigel pinnoitettu kalvo 54% PC-3-solujen ja 61% vuonna T24 /83-soluissa (kuvio. 1 D).

TRPV2 sovittelee Adrenomedulliini edistäminen Migration ja Invasion PC-3 ja T24 /83 Cells

koska olemme aiemmin osoittaneet, että TRPV2 oli mukana PCa solujen vaeltamiseen ja invasiivisuus [12], [13] ja koska tämä kanava myös osallisena virtsarakon syövän synnyn [ ,,,0],14], testasimme TRPV2 on osallisena kasvu solumigraation ja hyökkäyksen AM. Ensin tarkistetaan TRPV2 ilmentymisen kahdessa solulinjassa, ja sen downrerulation siRNA. Western-blot-analyysi, jossa TRPV2-spesifisellä vasta-aineella ovat osoittaneet, että TRPV2 proteiini ekspressoituu PC3 ja T24 /83-soluja, ja että proteiinin ekspressiota voidaan tehokkaasti estää solujen käsittely siRNA-TRPV2 (50 nM, 48 h, Fig. 2A). Hiljentäminen TRPV2 siRNA-TRPV2 ei ainoastaan ​​vähentynyt tarttuvuus PC-3 ja T24 /83-soluissa 35% ja 29% vastaavasti, mutta myös poistetaan stimuloivia vaikutuksia tarttumista AM käsittely (200 nM). AM lisäksi solut käsiteltiin kontrolli siRNA pystyi tehostamaan fibronektiiniin tarttumisen 29% PC-3 ja 25% T24 /83-soluissa (kuvio. 2B).

(A) Western-blottauksella analyysi TRPV2 proteiinin tason PC-3 ja T24 /83 soluja käsitellään joko siCTL tai siTRPV2 (50 nM, 48 h). Vaikutus TRPV2 hiljentämisen (siTRPV2, 50 nM, 48 h) (B) PC-3 ja T24 /83 soluadheesiota fibroncectin inkuboitiin tai ei ole AM ​​(200 nM, 45 min) (N = 3, * P 0,05 verrattuna ohjaus- solut;

# P 0,05 verrattuna kontrolli käsitellyissä soluissa AM); (C) PC-3 ja T24 /83 migraatiota tutkittiin siirtokuoppaan määrityksessä 8 h inkubaation kanssa tai ilman AM (N = 3 *, P 0,05 verrattuna säätökennoja;

# P 0,05 verrattuna kontrollisoluihin käsitelty AM); (D) PC-3 ja T24 /83 soluinvaasiota kautta matrigeelin (AM 200 nM, 24 h) (N = 3 *, P 0,05 verrattuna säätökennoja;

# P 0,05 verrattuna kontrolli käsitellyissä soluissa AM).

vieressä tutkineet vaikutus knock alas TRPV2 solujen migraatiota Transvvell- määrityksessä. Downregulation TRPV2 ilmaisun laski paitsi PC-3 solujen vaeltamiseen, mutta myös T24 /83, 55% ja 60% vastaavasti. Kuten osoitettiin tarttumista, AM hoito soluilla käsitelty siRNA-TRPV2 ei enää kyennyt edistämään muuttoliikettä (Fig. 2C).

Lopuksi tutkimme hyökkäyksen PC-3 ja T24 /83-soluissa kautta Matrigel päällystetyn kalvon ja sillä havaittiin tarttumista ja muuttoliike, siRNA-TRPV2 aiheuttama lasku sekä PC-3 ja T24 /83 invaasio, 52% ja 67%. Lisääminen AM voinut nostaa hyökkäyksen PC-3 ja T24 /83 solut käsiteltiin siTRPV2 (Fig. 2D).

AM indusoi TRPV2 translokaatio tällä solukalvon kautta PI3K Pathway

ottaen TRPV2 osallisuudesta AM vaikutusta solujen vaeltamiseen, me seuraavaksi tutkittiin kalsium- kuvantamisen jos AM voisi aktivoida TRPV2. Akuutti soveltaminen AM PC-3 ja T24 /83 ei aiheuttanut solunsisäisten Ca

2+ pitoisuus ([Ca

2 +]

i) lyhyellä aikataululla (ts muutamassa minuutissa ), kuten voisi odottaakin tehostetun TRPV2 välittämää Ca

2+ entry (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin pitkäaikainen 45 min pitkä hoito molempien solulinjojen AM indusoi kasvua pohjapinta [Ca

2+] i taso (PC-3: kontrollista arvosta 100 nM 140 nM läsnä ollessa AM; T24 /83:139 200 nm; Fig. 3A). Vaiennettaisi TRPV2 siRNA (50 nM, 48 h) pienensi pohjapinta [Ca

2 +]

i (PC-3: sta 70 nM; T24 /83: 86 nM) viittaa siihen, että vakaan tilan TRPV2 välittämä Ca

2+ tulva myötävaikuttaa lepää sytosolin Ca

2+ pitoisuus. Lisäksi TRPV2 hiljentäminen myös esti kasvua pohjapinta [Ca

2 +]

I vastauksena AM hoitoon (Fig. 3A), johdonmukaista sen havainnon, että pitkittynyt inkubointi PC-3 ja T24 /83-soluissa johtaa epäsuoraan aktivointi TRPV2 AM kautta signalointireitin, joka vaatii jonkin verran aikaa sen vaikutukset.

(A) vaikutus AM (200 nM, 45 min) ja TRPV2 hiljentäminen (siTRPV2, 50 nM, 48 h ) on pohjapinta sytosolin kalsiumin PC-3 ja T24-83 solut tutkittiin kalsium- kuvantaminen. (N = 120 soluja, N = 4, *, P 0,05 verrattuna säätökennoja;

# P 0,05 verrattuna kontrolli käsitellyissä soluissa AM). (B) TRPV2 läsnä solukalvon tutkittiin biotinylaatio on T24 /83-solujen valvonnan tai hoidettiin joko AM (200 nM, 45 minuuttia) tai AM ja PI3K-estäjä LY294.002 (10 uM, lisättiin 5 minuuttia ennen AM). (C) vaikutus LY294.002 PC-3 ja T24 /83 migraatiota tutkittiin siirtokuoppaan määrityksessä 8 h inkubaation kanssa tai ilman AM (N = 3 *, P 0,05 verrattuna säätökennoja;

# P 0,05 verrattuna ohjaus solut;

# P 0,05 verrattuna kontrolli käsitellyissä soluissa AM).

on tunnettua, että AM voi aktivoida PI3K [19] ja että PI3K aktivaatio voi johtaa TRPV2 translokaatio plasmaan kalvo [12]. Niin, tutkimme seuraavaksi, jos läsnä TRPV2 solukalvolle riippuu AM ja eheyden PI3K signalointireitin. Voit tehdä T24 /83-soluja käsiteltiin joko AM (200 nM 45 minuuttia) tai AM plus PI3K estäjä LY294.002 (10 uM, lisättiin 5 min ennen AM), ja solukalvon lokalisointi analysoitiin biotinylaation. Kuten kuviossa 3B, AM lisääntynyt TRPV2 läsnäolo kalvo, ja tämä vaikutus voidaan estää LY294.002, mikä viittaa siihen, PI3K signaloinnin AM vaikutus TRPV2.

Siksi tutkittiin transwell-määritys, onko LY294.002 voisi heikentää PC-3 ja T24 /83 solujen vaeltamiseen. Olemme osoittaneet, että LY294.002 (10 uM) esti stimuloiva vaikutus AM sekä PC-3 ja T24 /83-soluissa, kun se ei ole muuttanut pohjapinta näiden solujen vaeltamiseen (Fig. 3C). Lisäksi AM muuttoliikkeelle läsnäollessa siTRPV2 ei vaikuttanut LY294.002 sovelluksen sekä PC-3 ja T24 /83 solut, jotka tukevat spesifisyyden di pIK3 osallistumisesta AM vaikutus TRPV2 kanavalla.

keskustelu

AM stimuloiva aktiivisuus taudin etenemiseen on osoitettu lukuisissa syövissä, mukaan lukien eturauhasen mutta ei virtsarakon syöpä. Tähän mennessä kaksi mahdollista mekanismia, joilla AM tukee kasvaimen kasvua on oletettu. Ensimmäinen mahdollisuus on, että AM edistää kasvaimen kasvua stimuloimalla angiogeneesiä [5], [6]. Toinen mahdollinen mekanismi on, että AM suoraan edistää kasvaimen leviäminen ja selviytymistä. Tuoreessa raportissa osoitettiin, että AM antagonisti inhiboivat ja invaasion haimasyövän soluja, jotka ilmentävät AM reseptoreja in vitro [20]; kuitenkaan ole vaikutusta ole koskaan kuvattu eturauhassyövän solumigraatioon /invaasion ja ei lainkaan virtsarakon syöpä.

Tässä tutkimuksessa me raportoimme ensimmäistä kertaa, että UC solulinja T24 /83 myös ilmaista AM reseptoria (CLR /RAMP3) ja AM voi lisätä paitsi PCA solulinja PC-3, mutta myös UC solulinjan T24 /83 invasiivisia fenotyyppi samalla tavalla, stimuloimalla soluadheesion ja maahanmuuton β1-integriini ja FAK aktivointi vastaavasti.

Kalsium on tärkeä tekijä prosessissa muuttoliike [7]; tutkimukset laboratoriossamme osoittavat, että Ohimenevä Reseptori Potential kanava TRPV2 ilmaistaan ​​etäpesäkkeisessä PCa solulinjoissa, mukaan lukien PC-3-solut, ja trpv2 transkriptipitoisuuksissa ovat 12 kertaa suuremmat metastasoituneen syövän (vaihe M1) verrattuna ensisijaisen kiinteitä kasvaimia ( vaiheet T2a ja T2b). Pohjapinta aktiivisuuden tämän kanavan sekä aiheuttama, edistää PCa solujen vaeltamiseen ja invasiivisen fenotyypin [12], [13]. Lisäksi TRPV2 ilmentyminen lisääntyi myös korkeampi virtsarakon syövän vaiheessa [14]. Osoitamme tässä, että hiljentäminen tämän kanavan myös vähentää merkittävästi migraation ja invaasion UC solulinjan T24 /83. Mutta tärkein havainto on, että TRPV2 moduloi AM stimulaation solun liikkuvuus ja invaasio, kuten puuttuminen AM vaikutus tarttuvuus, muuttoliikettä ja invaasio kun TRPV2 ilmaisua tippuu alas. AM, vaikuttamalla TRPV2 translokaation solukalvon lisäsi lepää kalsiumtaso molempien solulinjojen, mikä osaltaan sen vaikutus PC-3 ja T24 /83 solujen vaeltamiseen.

Nämä tiedot viittaavat siihen, että AM ja TRPV2 korreloi ilmentyminen voi osaltaan luoda parhaat edellytykset metastaaseja potilaalla on eturauhasen tai virtsarakon syöpä ja se voisi olla mahdollinen prognostinen markkeri ja mahdollinen terapeuttinen tavoite lisätä elinajanodotetta potilaista.