Krooninen sairaus

tiivistelmä

4 metyylitiobutyyli isotiosyanaatti (MTBITC), alifaattinen, rikki- yhdistettä

Brassica

vihannekset, hänellä

in vitro

ja

in vivo

antituumorivaikutus. Viime aikoina olemme osoittaneet voimakasta kasvua estävän potentiaalin DNA vaurioittavan aineen MTBITC ihmisen maksan syöpäsoluja. Täällä osoittavat nyt, että MTBITC alas säätelee telomeraasin joka herkistää soluja apoptoosin induktion. Tämä välittyy MAPK aktivoinnin mutta riippumaton reaktiivisten hapen lajien (ROS). Yhden tunnin kuluessa, MTBITC aiheuttama DNA-vaurioita syöpäsolujen korreloivat ohimenevästi nousta hTERT mRNA ilmaisu, joka sitten muuttui telomeraasi tukahduttaminen, ilmeistä mRNA sekä entsyymiaktiivisuuden tasolla. Selventää roolia MAPK varten telomeraasi sääntelyä, maksasyöpä soluja esikäsitellään MAPK-inhibiittoreiden ennen MTBITC altistumista. Tämä osoitti selvästi, että tilapäinen kohoaminen hTERT-mRNA pääasiallisesti välittyy MAPK perheenjäsen JNK. Sen sijaan aktivoitu ERK1 /2 ja P38, mutta ei JNK, viestitti telomerase kumoamiseen ja seurauksena apoptoosin induktio. DNA-vaurioita by MTBITC voimakkaasti myös kumottu MAPK esto. Oksidatiivisen stressin, analysoituna DCF fluoresenssimääritys, elektronin spin resonanssi spektroskopia ja muodostumista 4-hydroksinonenaali löydettiin ole merkitystä tässä prosessissa. Lisäksi N-asetyylikysteiini esikäsittelyä ei vaikuttanut MTBITC aiheuttama telomeraasin tukahduttaminen tai depolarisaation mitokondrion kalvon potentiaalia merkkiaineena apoptoosin. Tuloksemme siis merkitse sitä, että kun DNA-vaurioita by MTBITC, MAPK ovat välttämättömiä telomeraasi- sääntelyä ja seurauksena kasvu heikentynyt maksan kasvainsoluissa ja tämä tieto todennäköisesti tärkeä rooli ymmärtämisessä potentiaalia kemoterapeuttisen tehoa ITC.

Citation: Lamy E, Herz C, Lutz-Bonengel S, Hertrampf A, Márton MR, Mersch-Sundermann V (2013) MAPK Pathway Signals Telomerase modulaatio vastaus isotiosyanaatti indusoitu DNA Damage of Human Liver Cancer Cells. PLoS ONE 8 (1): e53240. doi: 10,1371 /journal.pone.0053240

Editor: Srikumar P. Chellappan, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 2. heinäkuuta, 2012 Hyväksytty: 27 marraskuu 2012; Julkaistu: 31 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Lamy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: E.L. rahoittaa akateemisen avustusta Euroopan sosiaalirahastosta Fond ja tiede, tutkimus ja Arts Baden-Württemberg, Saksa. M-R.M. rahoitettiin osittain tähän projektiin, jonka alakohtaisen toimenpideohjelma ”Human Resources Development 2007-2013” Romanian työ-, perhe- ja sosiaaliministeriö kautta rahoitussopimuksen POSDRU /88 /1,5 /S /60203. Tutkimus oli osittain tukevat avustusta Mattern Foundation, Saksa. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Telomerase tarjoaa lupaava kohde

valikoiva

terapeuttinen lähestymistapa on maligniteettien että 80 90% syöpäsolujen stabiilisti (uudelleen) ilmaisemaan tämä entsyymi, kun se on tukahdutettu useimmissa normaaleissa somaattisten kudosten [ ,,,0],1]. hTERT, katalyyttinen alayksikkö entsyymin, tiedetään käyttää anti-apoptoottisia vaikutuksia ja vuorovaikutuksessa DNA-vaurioita vastereitissä. Tämän seurauksena syöpäsolut ovat vastustuskykyisiä kemoterapeuttisia aineita tai sädehoitoa [2], [3], [4], [5].

Isotiosyanaatit (ITC), luonnollisesti esiintyvät toissijainen kasvin ainesosien perheen

Brassicaceae,

tunnetaan chemopreventive ja -therapeutic toimia sekä

in vitro

ja

in vivo

[6], [7], [8]. Lukuisissa tutkimuksissa on raportoitu kasvua tukahduttamalla ja apoptoosin aiheuttavan vaikutuksen tämän ryhmän syöpäsoluissa ja tutkittu taustalla signalointireitteihin [9]. ITC on osoitettu häiritsevän monia tekijöitä, jotka ovat muuttuneet syöpäsoluissa, kuten vuorovaikutus Bcl-2-perheen, mutta ne on myös osoitettu selektiivisesti vähentää HDAC [10]. Äskettäin ITC näytettiin potentiaalisina telomeraasiestäjät aikana apoptoosin erilaisissa syöpäsoluissa [11], [12], [13], [14]. Sulforaphane (SFN), e. g. tukahdutetaan telomeraasin aikana proliferaation inhibitio MCF-7 ja MDA-MB-231-rintasyöpäsolujen [11]. Telomerase kumottua SFN tai fenyylietyyli ITC myös korreloi ohjelmoidun kuoleman HeLa kohdunkaulan sekä PC-3 syöpäsolujen [13], [14]. SFN lisäksi esti telomerase ihmisen Hep3B maksasyövän solut, jotka rinnastuvat ohjelmoidun solukuoleman [12]. Tämä inhibitio oli sitten ehdotettu välittyvän reaktiivisten hapen lajien (ROS). Muut tutkimukset ovat osoittaneet niin pitkälle, että oksidatiivisen stressin ja aktivointi mitogeeniaktivoidut (MAPK) signalointireitin olivat mukana tappaminen syöpäsolujen ITC [15]. Julkaistut tiedot ovat kuitenkin toistaiseksi merkitse, että ROS riippuvuus solukuoleman sekä MAPK osallistuminen saattaa olla soluspesifistä.

Aiemmissa tutkimuksissa olemme jo osoittaneet tehokkaan kasvun maksan syöpäsolujen ITC [16]. Me tuetaan näin ollen esillä olevassa tutkimuksessa tutkia merkitystä MAPK aktivointi ja oksidatiivisen stressin solukuolemaan ja telomerase sääntelyn ihmisen maksan syöpäsoluja. Siksi käytimme telomeraasin positiivinen HCC solulinjoissa (HepG2, Huh7 ja Hep3B) eroavat niiden kasvainten p53 (TP53) asema sekä ensisijainen terveen ihmisen maksasoluissa, vailla telomeraasin. Tuloksemme vahvistavat aktivointi kaikkien kolmen MAPK (JNK, ERK1 /2 ja P38) mukaan MTBITC käsittely riippumattomia TP53 tai syöpäsairauden tilan soluja. Voisimme lisäksi osoittamaan, että kasvun hidastuminen sekä muutokset telome- taso viestii MAPK mutta eivät liity ROS tuotantoon. DNA-vaurioita laukaisi MTBITC estyi soluihin MAPK oli nimenomaan tukossa.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit

N-asetyylikysteiini (NAC), menadionia, 2 ’, 7 ”dikloorifluoreseiiniliuosta diacetat (DCF-DA), deksametasoni, Tween® 20, bentso [a] pyreeni (B (a) P ja propidiumjodidia (PI) hankittiin Sigma Aldrich (Steinheim, Saksa). DMSO: ssa (puhtaus 99% ) oli peräisin Applichem (Darmstadt, Saksa). β-merkaptoetanolia ja valinomysiiniä hankittiin Fluka (Buchs, Swiss). Dulbeccos Minimal Essential Medium (DMEM), vasikan sikiön seerumia (FCS), trypsiini 10 x (25 mg /ml), trypsiini-EDTA: ta 10 x (5 mg /ml, vastaavasti 2,2 mg /ml), L-glutamiinia ja fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, ilman Ca ja mg) olivat PAA Laboratories GmbH (Cölbe, Saksa). penisilliini-streptomysiiniä (P /S) liuokseen, RPMI-1640, 5,5 ’, 6,6′-tetrakloori-1,1′, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodidia (JC-1), insuliinin-transferriini-selen (ITS) ja SYBR kultaa 10,000 × olivat life Technologies Invitrogen (Darmstadt, Saksa) ,. 4-hydroksinonenaalia (HNE) hankittiin Cayman Europe (Tallinna, Viro). 4-metyylitiobutyyli isotiosyanaattia (MTBITC, erucin) syntetisoitiin Inst. Orgaanisen kemian, University of Giessen, Saksa aiemmin kuvatulla [17].

p38-estäjän SB203580, JNK estäjä SP600125 ja JNK estäjä V ostettiin Santa Cruz, (Kalifornia, USA). ERK1 /2-inhibiittori U0126, p38-estäjän SB202190 ja ERK1 /2-estäjän PB98059 saatiin Cell Signalling (Boston, USA). Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin immunoblottaus: anti-p-ERK1 /2 (Thr202 /Tyr201, 1:2000), anti-p-JNK (Thr 183 /Tyr185, 1:2000, klooni G9), anti-pc-Jun Ser73 ja anti-p-p38 (Thr180 /Tyr182, 1:500) Cell Signalling, anti- 4-hydroksinonenaalia (1:250; klooni 198960) R Cell Quest Pro

© ohjelmisto ja FlowJo ohjelmisto (Treestar Inc, Ashlandd, USA) käytettiin määrittämään prosenttiosuus apoptoottisten solujen ”sub-G1” tai ”hypoploid” huippu.

Kaspaasi 3 /7 pilkkominen Pitoisuus

kaspaasi 3/7 pilkkominen käytettiin parametri apoptoosin induktioon. Tämä määritettiin HepG2-soluissa käyttäen Caspase3 /7-Glo määritystä (Promega, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

arviointi mitokondrion kalvon potentiaali (MMP) B

havaitsemiseksi muutoksia MMP yksisoluvaiheessa tasolla lipofiilinen kationi JC-1 käytettiin. Käsitellyt näytteet kerättiin trypsination, pestiin kahdesti PBS: llä ja suspendoitiin uudelleen 1 ml: aan kasvatusliuosta, johon oli lisätty koettimen JC-1, jonka lopullinen pitoisuus on 2,5 ug /ml. Näytteet suspendoitiin uudelleen ja inkuboitiin soluviljelmässä olosuhteissa 30 min. Ennen analyysiä, solut pestiin kaksi kertaa kylmällä PBS: llä ja sitten analysoidaan suoraan FACSCalibur (BD, Heidelberg, Saksa).

Detection of Cell Vanheneminen by ß-galaktosidaasi Värjäys

Vanheneminen havaittiin käyttäen vanhenemista ß-galaktosidaasi -värjäyspakkausta (Cell Signaling Technology, Boston, USA) valmistajan ohjeiden. Sen jälkeen solu hoidon MTBITC tai hallitsee kuvat otettiin käyttäen kirkas valo mikroskooppi (compact mikroskooppi järjestelmä 8100E, Keyence, Osaka, Japani), jossa objektiivisen Plan Apo 4 × /0,2 ja optinen suurennus 4 × (Nikon, Japani).

Protein Analysis immunoblottauksella

proteiinit analysoitiin immunoblottauksella jälkeen modifioitua protokollaa Burnette [22]. Proteiinipitoisuus määritettiin, kuten on kuvannut Bradford [23]. Immunoblottausta, 20 ug proteiinia sekoitettiin valmiit SDS-sisältävä näyte puskuria, jota oli täydennetty 1% beeta-merkaptoetanolia. Elektroforeesi suoritettiin menetelmän mukaisesti Laemmlin [24]. Geeli siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle märkä blottauksella (0,7 mA /cm

2, 90 min.), Blokattiin 5% vähärasvaista maitoa TBS /Tween 0,1% ja niitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen 1 tunnin ajan RT: ssä tai yön yli 4 ° C: ssa, ja sen jälkeen piparjuuriperoksidaasiin (HRP) -leimattua sekundaarisen vasta-aineen kanssa 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, kukin. Sen jälkeen kun vasta-aineen inkuboinnin kiinnostavia proteiineja havaittiin kemiluminesenssitekniikalla. Digitaalinen kuva western blot valtasivat geeli dokumentointijärjestelmä Molecular Imager® ChemiDoc ™ XRS sytem (Bio-Rad, Munchen, Saksa). Koko likiarvoja otettiin vertaamalla värjättyä bändejä kuin proteiinistandardina ladattu elektroforeesin aikana. Prosessi toistettiin rakenteellisen proteiinin beeta-aktiini. Määrä kohdeproteiinin voitaisiin sitten indeksoitu rakenteellisten proteiinin hallita ryhmien välillä.

Telomerase aktiivisuuden mittaus TRAP-määritys

Telomeraasiaktiivisuus havaittiin käyttäen TeloTAGGG ELISA Kit, joka on kaupallisesti saatavilla Roche (Mannheim, Saksa). Määritys suoritettiin sen jälkeen valmistajan ohjeiden pienin muutoksin. Kokonaisen proteiinin lysaatteja solut hajotettiin käyttämällä solujen lyyttisen reagenssia Sigma Aldrich, joka sisälsi 10 mM PSMF ja 5 mM beeta-merkaptoetanolia, 30 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinipitoisuus määritettiin sen jälkeen, kun menetelmää on kuvannut Bradford [23]. Sillä telomeraasi Reaktion reaktion kokonaistilavuus oli 50 ui yhtä suuret määrät proteiinia, ja 2 x TeloTAGGG reaktioseosta inkuboitiin 25 ° C: ssa 20 min, jota seurasi denaturointi 94 ° C: ssa, 5 min, 30 sykliä (94 ° C: ssa 30 s, 50 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa, 90 s). Lopullinen venymä suoritettiin 72 ° C: ssa, 10 min. Negatiivisina kontrolleina, sama tilavuus lyysiliuosta, nukleaasi vapaa vesi ja lämpöinaktivoitua 0,1% DMSO: ta käsitellyn näytteen (95 ° C 5 min) käytettiin. 5 ui tai 2,5 ui PCR-tuotteita käytettiin ELISA mukaan valmistajan ohjeiden mukaisesti. 30 ui PCR-tuotteita ladattiin 1 x latauspuskuria TBE /12,5% polyakryyliamidi- geelillä; elektroforeesi suoritettiin 50 V: ssa 30 minuuttia ja sen jälkeen 180 V 5-6 h. Geeli värjättiin 1 x SYBR kulta /TBE liuosta 20 minuutin ajan, ja havaitaan UV-valossa. Sillä molekyylipainon määritys, 1 ug 50 emäsparin DNA-tikkaat (Fermentas, St. Leon-Rot, Saksa) käytettiin.

kvantitatiivinen reaaliaikainen PCR Full Length hTERT Transcript

Yhteensä-RNA eristettiin RNeasy mini Isolation kit Qiagen (Hilden, Saksa), jota seurasi puhdistus, jossa käytetään RNaasi-vapaata DNaasia kit Qiagen. Käänteistranskriptio 1 ug kokonais-RNA: ta kustakin näytteestä tehtiin 20 ul: ssa käyttämällä First Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas. 168 emäsparin fragmentti hTERT cDNA monistettiin käyttäen seuraavia oligonukleotideja ilmoitettuina loppupitoisuus: sense 5’GACACCATCCCCCAGGAĆ3 (50 nM) ja antisense 5’TCGTGGAATGTTACGAGCAG3 (50 nM). Kvantitatiivinen reaaliaikainen (qRT -) – PCR-reaktio suoritettiin kokonaistilavuudessa 25 ui, joka sisälsi Maxima SYBR Green qPCR Master Mix 2 x (Fermentas), osoitti pitoisuus eteenpäin ja taaksepäin aluketta ja 2,5 ui cDNA: ta käyttäen 96-kuoppaista 0,2 ml ohutseinämäisille PCR levyt ja MyIQ Reaaliaikainen PCR System (Bio-Rad, München, Saksa). QRT-PCR-olosuhteet olivat: 95 ° C: ssa 10 min, jota seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 10 s, 54 ° C: ssa 60 s. Tiedot kerättiin aikana elongaatiovaihe. Jälkeenpäin sulamiskäyrään toteutettiin tarkistaa spesifisyys alukepareista. Normalisoida määrät viittaus geeni PBDG seuraavien oligonukleotidien käytettiin: sense 5’AGGATGGGCAACTGTACCTG3 (150 nM) ja antisense 5’TCGTGGAATGTTACGAGCAG3 (150 nM). 116 bp: n fragmentti on tuotettu. Vertailevaa ct menetelmää käytettiin laskettaessa suhteellisia määriä hTERT mRNA [25]. Jokainen qRT-PCR-reaktio suoritettiin kolminkertaisena.

Detection of ROS Tuotanto DCF-DA ja Electron Spin Resonance Spectroscopy

ROS havaitseminen käyttäen DCF-DA, MTBITC altistuneet solut kerättiin, suspendoidaan uudelleen tuoreeseen elatusaineeseen ja inkuboitiin välittömästi DCF-DA pitoisuutena 5 nM: ssa 15 minuuttia. 37 ° C: ssa pimeässä. Sitten DCF fluoresenssi mitattiin FACSCalibur.

ROS havaitseminen käyttäen elektronin spin resonanssi (ESR) spektroskopia korkea solun läpäisevä spin anturi 1-hydroksi-3-metoksi-karbonyyli-2,2,5,5 -tetramethylpyrolidine hydrokloridi (CMH, Noxygen Science Transfer Diagnostics GmbH, Elzach, Saksa) ja elektronin spin resonanssi (ESR) spektroskooppi E-Scan varustettu lämpötilan ja kaasun säädin BioIII (Noxygen) käytettiin. Kiinni kasvavia soluja inkuboitiin 1-6 h MTBITC, 100 uM menadionin tai 0,1% DMSO: ta elatusaineeseen. Sen jälkeen solut pestiin kerran Krebs-HEPES-puskuria, johon oli lisätty 25 uM deferoksamiini (DFO) ja 5 uM diethyldithiocarbonate (DETC, Noxygen) ja inkuboitiin 100 uM CMH spin koetin Krebs-HEPES-puskurissa 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa. Supernatantit siirrettiin uusiin reaktiossa putkissa ja pidettiin jäillä. ESR-spektrit mitattiin 50 ul lasi kapillaareja. Sen jälkeen instrumentti asetusta käytettiin: mikroaaltotaajuista 9.772GHZ ja teho 21.120 mW, vastaanotin voitto 1.00e + 003, vaihe 0,20 astetta, harmoninen ja muunnetut amplitudi 2,32 G, signaalikanava muuntaminen 10,240 ms, aikavakio 40,960 ms ja lakaista aika 5.24 s. Määrä skannaa oli 5 20.

virtaussytometria ja laskeuma yksittäisten solujen

Single soluja (HepG2) talletettiin yksittäisiin kuoppiin 96-kuoppalevyillä (Thermo Scientific, Bonn, Saksa ) käyttäen MoFlo solulajittelijaa (Dako, Glostrup, Tanska). Solut lajiteltiin käyttäen eteenpäin (pieni kulma, FSC) versus sivusirontavirtaussytometriaa (90 ° -scatter, SSC) signaalit erottaa elävät ja kuolleet solut ja roskat ja alueen sirontamittari vs. pulssin leveys erottaa yksittäisiä soluja ja soluja liitteenä toisilleen. Ei Solut sijoitettiin rivi 12, ja nämä paikat käytettiin 4 PCR-positiivinen ja 4 negatiiviset kontrollit, vastaavasti.

solujen käsittelyä UV-säteilytys

paljastui 96 astian levyillä, joissa yhden solut altistettiin UV-säteilytystä 10 min. käyttämällä UV puhdistus kammioon. UV lähde oli 30 watin Osram germisidinen lamppu (UVC säteilyteho 200-280 nm 13,4 W). Tehokkuutta UV-säteilytyksen tuhota kaksijuosteisen DNA analysoitiin monistamalla DNA-fragmentteja neljä koot 143 bp 1337 bp.

mtdna Amplification

monistaminen mtDNA peräisin käsiteltyjen ja käsittelemättömien solujen suoritettiin 96-kuoppalevyillä, kuten on saatu yhden solun laskeuman tekniikkaa. Kuhunkin kuoppaan 5 ui PCR master mix, joka sisälsi 1 x Advantage 2 PCR-puskuria (Clontech, BD Biosciences, CA, USA), 0,1 ui Advantage 2 -polymeraasiseosta (Clontech), 200 uM kutakin dNTP: tä (Bioline, Luckenwalde, Saksa) ja 0,4 uM kutakin aluketta (F14816 /R16152, F16197 /R00293, F00314 /R00639 ja F08294 /R08436, vertaa taulukko 1) (Biomers, Ulm, Saksa) lisättiin. PCR-monistus suoritettiin PTC 200 lämpösyklilaitteessa (MJ Research, Waltham, MA, USA), jolla on seuraavat lämpökäsittelyyn olosuhteissa: 95 ° C 2 min, 38 sykliä 95 ° C 15 s, 56 ° C: ssa 30 s , 72 ° C: ssa 90 s, minkä jälkeen lopullinen pidennys-vaiheen 72 ° C: ssa 10 min. Koko reaktio visualisoitiin standardoiduissa olosuhteissa on 2% agaroosigeelillä (50 ml agaroosi 4 ui SybrSafe (Invitrogen Carlsbad, CA), elektroforeesi 25 minuutin ajan 60 V, minkä jälkeen UV-valo 160 ms).

Data Analysis

tulokset analysoitiin käyttäen Graphpad Prism 5 -ohjelmaa (GraphPad Software Inc., LaJolla, USA). Tilastollinen merkitys (p≤0.05, p≤0.01) on MTBITC kohtelu Tutkittujen parametrien HCC-soluissa laskettiin vapaaksi liuotinkontrolliryhmän, 0,1% DMSO. Voit selvittää merkitys MAPK spesifinen esto on tutkittu päätepisteitä MTBITC-käsiteltyjen näytteiden laskettiin vastaan ​​vastaaviin estäjä käsiteltyä vastine käyttäen yksisuuntaista ANOVA seuraa Bonferroni korjausta.

Tulokset

nDNA Vahingoittuneet mukaan MTBITC joka laukaisee Ohimenevä hTERT mRNA Expression

ensin tutkittiin vahinkoa nDNA HepG2-soluissa jälkeen 25pM MTBITC altistumista. 1 h kuluttua, nDNA on MTBITC käsiteltyjä soluja oli merkittävästi vaurioitunut, määritettynä comet (kuva 1a). Tämä korreloi nopean vastauksen solujen suhteen ohimenevän hTERT mRNA ilmaisu kuten havaitaan 1 h (kuvio 1 b). hTERT mRNA ilmaisu oli taas kontrolli tasolle 6 h altistuksen MTBITC (kuvio 1 b) ja solujen altistuminen ITC yli 6 h saatiin aikaan olennainen tukahduttaminen hTERT mRNA transkriptio, joita voitaisiin myös havaittu pitkäaikaista matala- altistus (figure1b).

a) Soluja altistettiin 25 uM MTBITC tai liuotinkontrolliryhmän (0,1% DMSO) 1 h ja tämän jälkeen analysoitiin niiden DNA-vaurioita käyttäen komeetta määritystä. Että% hännän DNA: ta käytettiin vahingoista kvantifiointiin. Palkit ovat keskiarvo ± SD, n = 3. Solut altistettiin 100 uM bentso (a) pyreenin (B (a) P) 1 h, käytettiin positiivisena kontrollina. b) ekspressio täyspitkä hTERT mRNA altistumisen jälkeen MTBITC tai liuotinta ohjaus 1 h 96 h analysoitiin RT-PCR: llä. PBDG käytettiin kaikissa kokeissa viitataan geenin. mRNA: n ekspressio laskettiin suhteessa liuottimen valvonta; palkit ovat keskiarvo ± SD (n = 3).

MTBITC hoito aiheuttaa aktivointi MAPK Pathway

MAPK signaalinvälitysreitti edullisesti aktivoidaan vastauksena ympäristö- ja genotoksinen jännitykset ja on keskeisessä asemassa solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen [26]. Kasvua vajaatoiminta ITC on katsottu johtuvan aktivointi MAPK-reitin eri solussa malleissa ennen [27]. Siksi seuraavaksi tutkitaan vastetta MAPK maksassa syöpäsolujen MTBTIC. Havaitsimme, että kaikissa kolmessa solulinjoissa MTBITC hoito aiheutti merkittäviä aktivoituminen ERK1 /2 klo Thr202 /Tyr204, JNK at Tyr183 /Tyr185 ja P38 at Thr180 /Tyr182 fosforylaatio on aikaa (kuvio 2a), mutta myös pitoisuus riippuvaisella tavalla ( kuvio 2b). Mielenkiintoista on, että terveen ihmisen maksasoluissa vailla telomeraasin, tämän reitin myös aktivoitu (kuvio 2c). Voit sitten päättää, onko tämä aktivaatio heijastuu solu vajaatoiminta, me seuraavaksi käsiteltiin elinkelpoisuutta normaalin ensisijainen ihmisen hepatosyyttien. Kuten kuviossa 2d, vaikka 72 tunnin kuluttua altistuksen MTBITC, ei ole haitallista vaikutusta ei voitu havaita, määritettynä mikroskooppisen havainto solun morfologian.

Solut hajotettiin ja yhteensä lysaatti suoritettiin immunoblottauksella. a) HCC-soluja käsiteltiin 25 uM MTBITC tai liuotin ohjaus (0,1% DMSO) varten ilmoitettuina ajankohtina. HepG2-solut (b) tai ihmisen hepatosyyttien (c) käsiteltiin MTBITC 3 h ilmoitettuina pitoisuuksina. Edustavia blotit näytetään. Kukin blotti uudelleenseulottiin anti-β-aktiini-vasta tasapuolisen Proteiinilisäyksen. d) Ensisijainen normaalia ihmisen maksasolut eivät vaikuta kielteisesti MTBITC, kuten näkyy edustavia kuvia, vangiksi valomikroskoopilla. SC: liuotinkontrolli = 0,1% DMSO. +, Positiivinen kontrolli = 0,01% Triton X-100. Bar = 100 pm. Kaikki paneelit ovat samat suurennos.

rooli MAPK MTBITC välittämän Telomerase asetuksen

määrittämiseksi merkitystä havaitun MAPK-aktivaation telome- modulaatio sekä solujen lisääntymistä, me esikäsitelty HepG2-solujen JNK-inhibiittori (SP600125 tai JNK-inhibiittori V), P38 estäjä (SB203580 tai SB202190), ERK1 /2-inhibiittorin (U0126 tai PB98059) tai niiden yhdistelmää, mitä seuraa käsittely MTBITC. Aktivointi MAPK kautta MTBITC lähes kokonaan poisti esi-inkubaatio estäjien kanssa, kuten on esitetty kuvassa 3a. Esikäsittely HepG2-soluissa joko Inhibiittoreiden – paitsi JNK estäjä V – ei merkittävästi vaikuta MTBITC laukaisema hTERT mRNA ilmaisun jälkeen havaittu 1 h (kuva 3b). Mielenkiintoista on, että yhdistelmä kaikkien kolmen MAPK-estäjät (SP600125, SB203580, U0126 tai SB202190, JNK-inhibiittori V ja U0126) vähensi MTBITC laukaisema hTERT mRNA: n ilmentymisen nousu (kuvio 3b). Tämä voi hyvinkin johtua esto JNK aktivoinnin, joko esikäsittelyä SP600125 tai JNK estäjä V yksin poisti hTERT mRNA tasolla lisälaite (kuva 3b). Lopuksi määritetään merkitystä MAPK varten MTBITC aiheuttama telomeraasiaktiivisuuden entsyymiaktiivisuuden tukahduttaminen. Pitoisuudesta riippuva downregulation entsyymin aktiivisuus oli nähtävissä jo kuluttua 3 h altistumisen MTBITC, arvioituna TRAP-ELISA (kuvio 3c). Tämä voitaisiin selvästi lakkautetaan MAPK esto. Lisäksi valikoivasti estämällä MAPK, voisimme osoittaa, että p38 ja ERK1 /2 mutta ei JNK olivat ainakin osittain vastuussa telomeraasin niin entsyymin esto MTBITC arvioituna 24 h altistuksen (kuvio 3d).

erityinen p38 aktivaation, 10 uM SB203580 tai 20 uM SB202190, JNK aktivointi, 5 uM SP600125 tai 20 uM JNK-inhibiittori V käytettiin, vastaavasti. 10pM U0126 tai 40 uM PB98059 käytettiin ERK1 /2-estoon. Soluja esikäsitelty estäjien kanssa ja valotettiin seuraavaksi MTBITC tai liuotinta ohjaus (0,1% DMSO). a) immunoblot-analyysi osoittaa tehokkaan inhibition kohdeproteiinien. β-aktiini käytettiin latauskontrollina b) Pre-käsiteltyjä soluja analysoitiin täyspitkä hTERT-mRNA: n ekspression sen jälkeen, kun 1 h altistuksen 25 uM MTBITC. PBDG käytettiin viite-geenin. mRNA: n ekspressio laskettiin suhteessa vastaavaan liuottimeen ohjaus (n = 3). c + d) Pre-käsiteltyjä soluja analysoitiin telomeraasiaktiivisuuden entsyymiaktiivisuus kuluttua 3 h (d) tai 24 h (e) MTBITC altistuminen käyttäen TRAP-ELISA-määritystä. Telomeraasiaktiivisuus laskettiin suhteessa vastaavaan liuottimeen valvonta; palkit ovat keskiarvo ± SEM (n = 3). Estäjät 3 ×: yhdistelmä SB203580, SP600125 ja U0126.

rooli MAPK MTBITC välittämän Growth vaimennus

Seuraavassa vaiheessa, pyrimme onko MAPK voisi myös tilin for MTBITC aiheuttama solukierron pysähtymisen HepG2-soluissa. Kuitenkin kaikki inhibiittorit erillisenä osana tai yhdessä ei suojata soluja MTBITC-välitteisen G2 /M pysähtynyt (kuvio 4a). Tämä havainto varmistettiin käyttämällä yhdistelmää toisen inhibiittorin joukko (tuloksia ei ole esitetty). Tutkittaessa apoptoosia subG1 DNA sisällön analyysi, ole merkitystä MAPK varten MTBITC laukaisema solukuolemaa näkyi (kuva 4b). Kuitenkin kvantifiointi apoptoosin suhteen tarkempia kaspaasi 3/7 pilkkominen osoitti, että estää kaikkien kolmen MAPK merkittävästi kumottu MTBITC laukaisema solukuolemaa. Tämä voi johtua ERK1 /2 signalointi, koska esto ERK1 /2 aktivointi voimakkaasti poistettava apoptoosin (kuva 4b). Edelleen vahvistaa yhdistyksen apoptoosin ja DNA-vaurioiden kanssa MAPK signalointi, me määrällisesti vaikutusta MAPK estäjien MTBITC aiheuttaman DNA-säikeen katkoksia. Koska molemmat, HCC-soluissa sekä tervettä hepatosyyttien aktivoitiin heidän MAPK opastinjärjestelmillä MTBITC, mutta vain syöpäsolut toimitettiin apoptoosin, me esiin kysymyksen, onko voisi olla erilainen määrä DNA-vaurioita normaalin ja pahanlaatuisen solut. Kuten kuvassa 4c, DNA katkeamisen olivat todellakin paljon pienempi terveiden hepatosyytti verrattuna HepG2-soluissa. Kun solut on esikäsitelty yhdistelmä kaikkien kolmen estäjien, vahinko väheni kontrolloida tasolle (kuvio 4c).

Pre-käsiteltyjen HepG2-solut altistettiin 25 uM MTBITC tai 0,1% DMSO: ssa 24 h ja sitten valmisteltu) DNA sisältö ja b) subG1 DNA sisällön analyysi (merkkiaine apoptoosin) käyttäen virtaussytometria ja PI-värjäys DNA kuvat kuvaavat edustavia DNA-pitoisuus histogrammit HepG2-soluissa. c) Caspase 3/7 pilkkominen käytettiin parametri apoptoosin induktioon. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus laskettiin suhteessa vastaavaan liuottimeen valvonta; palkit ovat keskiarvo ± SD (n = 3). d) DNA-vaurioita HepG2-soluissa tai ensisijainen ihmisen hepatosyyttien arvioitiin 24 tunnin kuluttua altistumisesta MTBITC käyttäen komeetta määritystä. Vertailla kahden solutyyppien DNA-vaurioita laskettiin suhteessa liuottimen ohjaus (SC, 0,1% DMSO). Baarit ovat keskiarvo ± SD, n = 2. estäjät 3 ×: yhdistelmä SB203580, SP600125 ja U0126.

ROS eivät osallistu MTBITC välittämän Telomerase Modulation tai Growth alentuminen

Jotkut muut luonnolliset yhdisteet on ehdotettu hiljattain välittävän telomerase tukahduttaminen syöpäsoluissa kautta ROS tuotanto [28], [29]. Lisäksi useat tutkimukset tutkivat ITC yhteydessä syöpäsolujen kasvua vaimentava ehdotettu ROS tuotannon alkupään tapahtuma MAPK aktivointia ja solukuoleman ja /tai kasvun pysähtymisen [15]. Yhteydessä Tutkimuksessamme olemme siis pyrkineet selvittämään, ROS olivat mukana telome- modulaatiota MTBITC tai voisi toimia solukuolemaa efektoreina. Solunsisäiset ROS ohjaus- ja MTBITC käsiteltyjä soluja arvioitiin aluksi virtaussytometrialla seuraava värjäys kiinnittyneet kasvava HepG2 solut H

2DCFDA. Yhden tunnin kuluessa MTBITC-altistuksen, ei muutosta ROS tason voitu havaita (tuloksia ei ole esitetty).