Krooninen sairaus

tiivistelmä

Ensimmäinen rivi potilaiden hoitoon kastraatiotason resistenttejä eturauhassyöpä (CRPC) tarkoittaa ensisijaisesti dosetakselista kemoterapiaa. Valitettavasti vastustuskykyä doketakselihoidon on perimmäinen esiintyminen. Muutoksia androgeenireseptorin (AR) ilmaisun ja signalointi liittyvät mekanismit vastustuskykyä doketakselihoidon in CRPC. Lämpöshokkiproteiini 90 (Hsp90) on molekyyli chaperone, joka säätelee aktivointi, kypsymisen ja vakaus kriittisten signalointi proteiineja, jotka liittyvät eturauhasen syöpä, mukaan lukien AR. Tämä tieto ja viimeaikaiset edistysaskeleet yhdiste suunnitteluun ja kehittämiseen ovat korostaneet Hsp90 houkuttelevana terapeuttinen kohde hoitoon CRPC. Olemme äskettäin raportoitu kehittämistä MYC-CaP kastraatiotason resistenttejä (MYC-CaP /CR) elinsiirtoa tuumorin malli, joka ilmaisee monistetaan villityypin AR. Sisällä, raportoimme, että toisen sukupolven Hsp90 estäjä, NVP-AUY922, estää solujen kasvua ja merkittävästi indusoi solukuoleman MYC-Cap /CR ja PTEN-Cap /CE2 solulinjoilla. NVP-AUY922 aiheuttama proteasomin hajoamista AR, vaikka mielenkiintoisesti ei edellytä menetys AR proteiinin inhiboimiseksi AR transkription aktiivisuutta. Edelleen, NVP-AUY922 kasvoi dosetakselia myrkyllisyydestä MYC-Cap /CR ja PTEN-Cap /CE2 solulinjoilla

in vitro

. Lopuksi, NVP-AUY922 /doketakselin yhdistelmähoitoa hiirillä MYC-cap /CR kasvaimia suurempana antituumorivaikutus verrattuna yksi hoitokerta. Tämä tutkimus osoittaa, että NVP-AUY922 nostattaa voimakas aktiivisuus AR signalointi ja täydentää kemoterapia vaste hiirimallissa CRPC tarjoaa perustelut jatkuva kliinisen kehittämisen Hsp90 estäjien kliinisissä tutkimuksissa hoitoon CRPC potilaista.

Citation : Ku S, Lasorsa E, Adelaiye R, Ramakrishnan S, Ellis L, Pili R (2014) esto Hsp90 täydentää doketakselihoidon in nipistämässä Kestää eturauhassyöpä. PLoS ONE 9 (7): e103680. doi: 10,1371 /journal.pone.0103680

Editor: Bandana Chatterjee, University of Texas Health Science Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2013; Hyväksytty: 06 heinäkuu 2014; Julkaistu: 29 heinäkuu 2014

Copyright: © 2014 Ku et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus oli osittain tukee Department of Defense – PC094159 (LE) ja National Cancer Institute – P50 CA58236 (HE). Rahoittajat ei ole roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tekijät haluavat julistaa seuraavaa ristiriitoja: Roberto Pili on ollut maksettu konsultti ja saivat tutkimusrahoitusta Novartis. Sinänsä tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

nipistämässä kestävä eturauhassyöpä (CRPC) on parantumaton ja aggressiivinen eturauhassyöpä (PCa) fenotyyppi. Useiden vuosien ajan, ensisijainen hoitovaihtoehto on CRPC on rajoitettu doketakselille kemoterapiaa, joka ulottuu selviytymisen vaikka vain rajoitetun ajan [1]. Vaikka hoito CRPC on ollut erittäin haastava, 2 viime vuoden on nähnyt dramaattinen muutos hoitovaihtoehtoja tähän tautiin. Toinen rivi kabatsitakseli [2], immunoterapiaa sipuluecel-T [3], androgeenin synteesin estäjän abirateronin asetaatti [4], AR-antagonisti enzalutamide [5], ja radium-223 [6] ovat kaikki saaneet viime FDA varten hoito CRPC. Vaikka nämä uudet hoitomuodot ovat laajentaneet hoitoja vaihtoehtoja potilaille, kestävä tukahduttaminen CRPC kasvu on edelleen ensisijainen haaste ja uusia hoitostrategioita tarvitaan edelleen.

Koska dosetakseli on tehokas hoito, se on edelleen kriittinen komponentti ensilinjan hoitona strategiaa CRPC. Voittaminen sekä hankitaan ja luontainen vastustuskyky doketakselia on ollut merkittävä kliininen haaste ja parantaa hoitotuloksia potilaille doketakselilla vastus on korkea prioriteetti. Kanssa enemmän tietoa taustalla mekanismeja lääkeresistenssi, uusia terapeuttisia mahdollisuuksia syntymässä. Tämä voi luoda mahdollisuuksia monoterapiahoidossa Doketakselin resistenssin CRPC tai mahdollisesti uudelleen herkistää CRPC potilaiden doketakselihoidon kanssa uuden yhdistelmän strategioihin.

Targeting androgeenisäädellyn AR akselilla abirateronin asetaatti [4] ja enzalutamide [5], monoterapiana, jos potilaalla on dosetakselia resistenttejä CRPC on osoittanut kliinistä hyötyä. Vaikka kohdistaminen suoraan AR toimia ensisijaisesti halutaan, välillinen kohdistaminen, estämällä AR liittyy proteiinien on houkutteleva lähestymistapa. Molekyyli- kaperonin Hsp90 on jäsen lämpöshokkiproteiiniperheen [7], ja sen on todettu yli-ilmentynyt useissa syövissä, mukaan lukien PCa. Hsp90 on yli 200 dokumentoitu asiakkaita, kuten AR, jossa Hsp90 estää proteasomin hajoamista ja vakauttaa AR konformaation valmis ligandin aktivointi [7]. Koska Hsp90 on vuorovaikutuksessa useiden asiakkaiden proteiineista, se on koettu, että esto Hsp90 voisi voimistaa enemmän katastrofaalinen antituumorivaikutuksen verrattuna enemmän suoria kohdennettuja hoitoja. Prekliinisissä tutkimuksissa Hsp90 esto yksin [8], [9], tai viime aikoina, yhdessä [10], [11] lupaavilta hoidossa Eturauhassyövän soluja. Valitettavasti ensimmäisen sukupolven Hsp90 estäjiä ei aiheuttanut merkittävää kliinisissä kokeissa [12] – [14]. Nämä ensimmäiset Hsp90 inhibiittorit tunnetaan geldanamysiinistä analogit, 17-allyyliamino-17 demetoksigeldanamysiiniä (17-AAG) ja 17- (dimethylaminotheyl-amino) -17-demetoksigeldanamysiiniä (17-DMAG) johtuivat epäonnistua klinikalla johtuen huonosta liukoisuudesta ja farmakokinetiikka , maksatoksisuus, alttius P-glykoproteiinin ulosvirtausta ja puute metabolian NQO1 /DT-diaforaasi entsyymejä [15].

NVP-AUY922 (AUY922) on resorcinlyic isoksatsoli amidi (Fig. 1A) osoitettu olevan voimakas estäjä Hsp90 [16]. AUY922 on ei-geldanamysiini analoginen, ja ei osoita rajoitukset geldanamysiinistä analogien, niitä joten tämä aine lupaavammalta kliiniseen testaukseen. AUY922 välittää sen vaikutus sitomalla ATPaasi domeenin Hsp90 N-pään estävän chaperoniproteiiniin funktio Hsp90. Tämä toiminta johtaa proteosomal hajoaminen useiden syövän kyseinen asiakas proteiinit [16], mukaan lukien AR [17]. AUY922 on osoittanut, kasvaimen vastaisen aktiivisuuden erilaisissa kiinteän kasvaimen prekliinisten hiirimalleja, mukaan lukien PC3 eturauhassyövän solu, ja ksenografteissa [16], [18]. Viimeksi uuden sukupolven Hsp90-inhibiittorit, mukaan lukien AUY922 on raportoitu saavuttaa biologisia vasteita eturauhasen syöpäsolulinjoissa ja ihmisen eturauhassyövän kudosta verrattuna geldanamysiini analogista 17-AAG [17]. I ja II vaiheen tutkimuksissa hematologisia syöpiä ja kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien rintasyövän ja useita myelooma, kanssa ovat vielä kesken AUY922.

(A) kemiallinen rakenne NVP-AUY922. (B) kastraatiotason resistenttejä (MYC-cap /CR ja PTEN-Cap /CE2) solulinjat käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla AUY922 48 tuntia. Tarttuneet solut kiinnitettiin 70% EtOH. Solujen kasvu arvioitiin värjäämällä kiinnitetyt solut kristallivioletilla ja mittaamalla absorbanssi 570 nm: ssä. Jokainen piste on normalisoida käsittelemätön kontrolli (0) ja edustaa 3 itsenäisestä kokeesta, keskiarvo ± SE. (C) MYC-CaP /CR ja PTEN-CaP /CE2-soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksilla AUY922 48 tuntia. Adherentit ja ei-adherentit solut kerättiin ja pestiin 1 x PBS: ssä. Soluja inkuboitiin propidiumjodidilla ja solukuolemaa arvioitiin virtaussytometrialla. Kukin piste edustaa keskiarvoa ± SE 3 riippumattoman kokeen. * Osoittaa p 0,05 verrattuna käsittelemättömään kontrolliin (0), kaksisuuntaisella t-testillä.

Tämän tutkimuksen tavoitteena oli testata kykyä AUY922 antagonisoida transkription ja /tai proteiini vakaus AR kastraatiotasolle kestävä MYC-CAP /CR ja PTEN-Cap /CE2 eturauhassyövän solulinjoissa sekä elinsiirtoa hiirimallissa viime aikoina kehitetty laboratoriossamme [19], [20]. Lisäksi halusimme tutkia antituumorivaikutuksen ja terapeuttinen teho AUY922 ainoana lääkkeenä ja yhdessä doketakselin kemoterapiaa.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

Institute Animal hoidon ja käytön komitea (IACUC) at Roswell Park Cancer Institute (RPCI) hyväksyi kaikki hiiren protokollia käytetään tässä tutkimuksessa. Meidän hyväksyntä /protokollan ID on 1137M.

Soluviljely ja reagenssit

eristäminen kastraatiotason kestävä MYC-cap solulinjassa.

MYC-cap /CR solulinja oli syntyvät meidän aiemmin raportoitu MYC-Cap kastraatiotason kestävä elinsiirtojen kasvainmuoto [19]. MYC-CAP /CR kasvaimen kappaletta (~ 4 mm

2) pantiin 6 hyvin kulttuuri levylle ja poistaa oltuaan viljeltiin 24 tuntia täydennetyssä DMEM korkea glukoosi media (10% FBS, 1% penisilliini /streptomysiiniä). Kiinnittyneet solut olivat sekapopulaatioon MYC-CaP /CR kasvainsoluja ja fibroblastit. Nämä solut viljeltiin, kunnes noin 80% konfluentteja. Serial siirrostamalla näistä heterogeeninen kulttuurien suoritettiin, kunnes homogeeninen yksikerroksista MYC-cap /CR soluissa oli läsnä. MYC-CaP /CR solulinjaa viljeltiin sen jälkeen DMEM-alustassa (Gibco), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiinillä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2. PTEN-CaP /cE2cE2 solut olivat ystävällinen lahja Dr. Roy-Burmanin (University of California, Los Angeles) ja niitä viljeltiin DMEM-alustassa (Gibco), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiinillä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2. PC3-solut saatiin American Type Culture Collection (ATCC) ja pidettiin RPMI 1640 media (Gibco), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja 1% penisilliini /streptomysiinillä, 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

in vitro

kokeissa NVP-AUY922 (Novartis) liuotettiin dimetyylisulfoksidiin (DMSO) valmistamiseksi kantaliuoksia (10 mM). Synteettiset androgen, metyylitrienolonia (R1881, Sigma-Aldrich), liuotettiin etanoliin varten varastoliuosten valmistusmenetelmä (10 mM). Proteasomin inhibiittoria, MG132 (Sigma-Aldrich), liuotettiin DMSO: iin valmistamiseksi kantaliuokset (10 mM). Käännöksen estäjä, sykloheksimidiä (Sigma-Aldrich), liuotettiin etanoliin valmistamiseksi varastoliuosta (5 mg /ml). Vasta-aineita käytetään immunoblottauksella ja /tai immunohistokemia (IHC) olivat anti-androgeenireseptorin (Santa Cruz), GAPDH (Cell Signaling), c-MYC (Epitomics) ja aktivoitu kaspaasi 3 (Cell Signaling). Sillä

in vivo

tutkimuksissa dosetakselilla saatiin Roswell Park Cancer Institute apteekki ja laimennetaan 1 mg /ml PBS: ssä ennen antamista eläimille. NVP-AUY922 liuotettiin 5% glukoosi tislatussa vedessä (D5W), jonka pitoisuus on 4 mg /ml.

Solun kasvua ja solun kuolemaan määritykset

MYC-CaP /CR tai Pten- CaP /CE2-soluja (4 x 10

4 /ml), jätettiin kiinni yön yli 24-kuoppalevyillä (BD Biosciences) ja inkuboitiin ilmoitetuilla pitoisuuksilla NVP-AUY922 24 ja 48 tuntia. Solukasvu mitattiin kiinnitys ja värjäys kiinnittyneet solut 10% metanolia kristalliviolettia 30 minuuttia. Stained solut tehtiin liukenee absoluuttista metanolia ja absorbanssi havaittiin päästöjen pituus 570 nm. Elinkelpoisuus (solukuolema) mitattiin inkuboimalla pysyvä ja tarttumattomat solut 1 ug /ml propidiumjodidia (Sigma-Aldrich) oton ja kvantitoitiin FACS Caliber virtaussytometria.

Western blot

MYC-CaP /CR tai PTEN-CaP /CE2 solut pestiin PBS: ssä ja lyysattiin RIPA-puskuriin (Sigma-Aldrich), joka sisälsi 1 x proteaasi ja fosfataasi-inhibiittorit (Sigma-Aldrich). Yhtä suuret määrät proteiinia, erotettiin elektroforeesilla käyttäen 4-15% SDS-PAGE-gradienttigeeleillä (Bio-Rad), ja proteiini siirrettiin nitroselluloosamembraaneille (Biometra). Toissijainen HRP konjugoidut vasta-aineet olivat Dako. Detection suoritettiin käyttäen kemiluminesenssi reagenssit (PerkinElmer).

Androgeenireseptorin transkription aktiivisuutta

androgen reagointikykyä asema MYC-cap /CR soluihin määritettiin käyttäen kaupallisesti saatavilla lentiviraalinen-pohjainen lusiferaasireportteriplasmidin kit (Cignal Lenti AR Reporter (Luc) sarja; SABioscience) mukaisesti valmistajan ohjeiden.

Quantitative real-time PCR

Kokonais-RNA uutettiin TRIzolia (Invitrogen) mukaisesti valmistaa ohjeita. Yksi mikrogramma RNA: ta käytetään suorittamaan cDNA-synteesin iScript cDNA-synteesi kit (Bio-Rad). Yksi mikrolitra cDNA-synteesin jälkeen reaktio suoritettiin PCR-monistus käyttämällä iQ SYBR green kit (Bio-Rad). PCR-signaalit tallennettiin ja analysoitiin Bio-Rad CFX Connect reaaliaikainen PCR-tunnistusjärjestelmä. Sekvenssit alukkeet ovat: FKBP5 eteenpäin, 5 ’GCCGACTGTGTGTGTAATGC 3’, ja kääntää, 5 ’CACAATACGCACTTGGGAGA 3’; GAPDH eteenpäin, 5 ’GTCTTCACCACCATGGAGAAG 3’, ja kääntää, 5’CAAAGTTGTCATGGATGACCTTGG 3 ’. ΔΔCt arvot laskettiin ja käytettiin määrittämään kertamuutoksia mRNA.

Histologia /immunohistokemia

Hiiret lopetettiin CO

2 tukehtumisen määrätyissä ajankohtina. Kasvainkudoksessa kiinnitettiin 10% puskuroituun formaliiniin yön yli, jota seuraa vielä 24 tuntia 70% etanolia. Antigeenin haku, diat keitettiin 10 minuuttia 10 mM natriumsitraattia, pH 6 ratkaisu kaikille vasta-aineille. ImmPRESS tunnistusjärjestelmä (Vector Laboratories) käytettiin tunnistaa kaikki ensisijainen vasta-aineita. Värjäytyminen visualisoitiin 3,3′-Diaminobenzidine (DAB) (Sigma, Saint Louis, MO, FAST 3,3′-diamino bentsidiinin) ja liukuu vasta- värjättiin hematoksyliinillä. Kvantitoimiseksi IHC värjäyksen edustavat kuvat (3-6) saatiin käyttämällä Zeiss valomikroskoopilla (Zeiss). Positiivinen tumavärjäystä c-MYC ja aktivoitu kaspaasi 3 kvantifioitiin Aperio ImageScope (v11.1.2.760).

In vivo

Eläinkokeissa

Institute Animal Care ja Käytä komitean Roswell Park Cancer Institute hyväksyi kaikki hiiren protokollia käytetään tässä tutkimuksessa. Hiiriä pidettiin eläimen laitos pidettiin 12 tunnin valo /pimeä sykli, tasaisessa lämpötilassa (22 ± 2 ° C) ja suhteellisen kosteuden (55 ± 15%). Vesijohtovesi ja ruokaa oli saatavilla

halun

. FVB uroshiirillä (4-6 viikkoa vanhoja) hankittiin NCI Frederick (Maryland, USA). SCID-hiiriä ostettiin in house siirtomaa ylläpidetään Roswell Park Cancer Institute. Kaikki hiiret kirurgiset kastroitu enintään 10 päivää ennen kasvaimen istuttamisen jälkeen. Kirurgisen kastraation suoritettiin ajamalla leikkauskohtaan. Viilto tehtiin kivespussin ja tunica kivesten saksilla. Kiveksissä, Siemenjohdin ja liitetty kivesten rasva pad poistettiin viillon kautta sivuston. Viillon sivusto suljetaan kirurgisella niittejä. LuCaP23 androgeeniriippumattomaksi (AI) ksenograftimallia [21] oli antelias lahja tri Robert Vessella (University of Washington, Seattle WA). Tämä malli ylläpidettiin sarja siirrostamalla kasvainkudoksen ennalta kuohitsemattomat SCID uroshiirillä.

Therapy tutkimuksia.

Pre-kuohittu uros FVB koirashiirien istutettiin MYC-cap /CR soluja ( 1 x 10

6) suspendoitiin PBS: ään injektiona ihon alle. Samoin valmiiksi kastroitu uros SCID hiiriin istutettiin kanssa PC3 (1 x 10

6) solut suspendoitiin PBS: ään injektiona ihon alle, tai istutettiin LuCaP 23 AI kasvaimen kappale (4 mm

2) ihon alle. Dosetakseli yksi hoitokerta tutkimuksissa kasvaimen hiirille saivat doketakselihoidon (10-50 mg /kg kerran viikossa; i.p. injektio). Yhdistelmähoidossa tutkimuksia, syöpäkasvaimia sisältävistä eläimet saivat ajoneuvo (D5W), doketakseli (10 mg /kg, kerran viikossa, i.p. injektio), NVP-AUY922 (40 mg /kg, 5 päivää 2 vapaapäivää; i.p. injektio) tai yhdistelmä. Kaikissa tutkimuksissa hiiret punnittiin viikoittain seurata myrkyllisyyttä. Kasvaimen kasvu arvioitiin sarja mittaharppimittauksilla kahdesti viikossa.

Tilastollinen analyysi

Data näytetään keskimääräisenä ± SE. Erot määritettiin käyttämällä yhtä tai kaksisuuntainen ANOVA ja kaksisuuntaisia ​​parillista t testeissä, joissa on osoitettu, käyttämällä GraphPad Prism-ohjelmiston. P-arvot alle 0,05 jaettiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

reaktio kastraatiotason resistenttien eturauhasen syöpäsolujen AUY922 hoito

in vitro

MYC-CAP castrate resistenttejä (MYC-CaP /CR) ja PTEN-CaP kastraatiotason resistenttejä (PTEN-CaP /CE2) solut altistettiin 48 tunnin ajan kasvavien pitoisuuksien AUY922. Kuten on esitetty kuviossa. 1B, alhainen nanomolaarisia pitoisuudet AUY922 riittivät estää kasvun MYC-CAP /CR ja PTEN-Cap /CE2 soluja. Edelleen AUY922 indusoi annosriippuvaisen kasvu solukuolema MYC-CAP /CR ja PTEN-Cap /CE2 soluja pitoisuuksissa 50-500 nM perustuu PI otto analyysiin (p 0,05; Fig. 1 C).

AUY922 indusoi proteasomin hajoamista AR ja inhiboi AR transkriptionaalista aktiivisuutta MYC-Cap /CR ja PTEN-cap /cE2Pten-cap /CE2 solujen

on dokumentoitu, että Hsp90 esto johtaa usein proteasomista hajoamista sen asiakas proteiinit [16]. Olemme niitä halusimme selvittää AR proteiinin stabiiliuden ja /tai transkriptioaktiviteettia lievitti AUY922 meidän kastraatiotason kestävä malleja. MYC-CaP /CR ja PTEN-CaP /CE2-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla AUY922 48 tuntia osoitti annoksesta riippuva menetys AR-proteiinin, selvimmin pitoisuuksina 100 nM ja 500 nM (Fig. 2A ja 2C). Samanaikainen hoito AUY922 ja proteasomin estäjä, MG132 (0,5 uM), vahvistettiin, että AUY922 rustokadon AR proteiinin suoritettiin proteasomin hajoaminen (Fig. 2A). Vaikutus AUY922 on AR-transkriptionaalista aktiivisuutta arvioitiin käyttäen MYC-Cap /CR solujen stabiili ilmentyminen lusiferaasireport- ohjaa androgeenien vaste elementtejä (ARE-Luc). MYC-CaP /CR /ARE-Luc-soluja inkuboitiin kasvavien pitoisuuksien kanssa AUY922 ja 1 nM R1881 samanaikaisesti yön yli tai esikäsitelty 1 nM R1881: ssa 4 tuntia ja sen jälkeen lisäämällä pitoisuuksia AUY922 yön yli. Johtuen konstitutiivista ilmentämistä lusiferaasin PTEN-CaP /CE2 soluja, arvioimme mRNA: n ilmentymisen taso AR alavirran geenin, FKBP5, tutkimaan vaikutusta AUY922 on AR-transkriptionaalista aktiivisuutta. Tuloksemme osoittavat, että AUY922 estää AR transkriptioaktiviteettia alhaisissa nanomolaarisina pitoisuuksina molemmissa castrate resistenttejä solulinjoja (Fig. 2B ja 2C). Edelleen, nämä tulokset osoittavat myös, että AR proteiinien hajoaminen ei tarvita AUY922 suututtaa AR transkriptio. Lisäksi käytimme Sykloheksimidin estää uusien proteiinisynteesiä edelleen ehdottaa, että alhainen nanomolaarinen AUY922 pystyy vähentämään AR transkriptionaalista aktiivisuutta vaikuttamatta AR proteiinin taso (Fig. 2D).

(A) MYC-CAP kastraatiotasolle resistenttejä -soluja käsiteltiin 48 tunnin ajan kasvavien pitoisuuksien kanssa AUY922 tai kasvavia pitoisuuksia AUY922 samanaikaisesti proteasomin inhibiittoria MG132 [0,5 uM]. Expression of AR-proteiinin arvioitiin western blot. (B) MYC-CaP /CR solulinjat, joilla on stabiili transfektio AR reportteriplasmidilla (ARE-Luc) inkuboitiin androgeenin köyhdytettyä soluviljelmässä olosuhteissa 6 tunnin ajan. Soluja käsiteltiin samanaikaisesti 1 nM R1881 ja osoitetut pitoisuudet AUY922 yön yli tai esikäsitelty 1 nM R1881: ssa 4 tuntia ennen kuin lisätään ilmoitetut pitoisuudet AUY992 Luminescence intensiteetti mitattiin ja määrä määritettiin. Pylväät edustavat 3 itsenäistä koetta; keskiarvo ± SE. (C) PTEN-CaP /CE2-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla AUY922 48 tuntia. Expression of AR-proteiinin arvioitiin western blot. Transkriptionaalista aktiivisuutta AR suoritettiin mittaamalla FKBP5 mRNA: n ekspression taso. Soluja inkuboitiin androgen köyhdytettyä soluviljelmässä olosuhteissa 6 tunnin ajan, ja sitten sitä käsiteltiin samanaikaisesti 1 nM R1881 ja osoitetut pitoisuudet AUY922 yön yli. Kokeet ovat 3 itsenäisestä kokeesta, keskiarvo ± SE. (D) MYC-CaP /CR ja PTEN-CaP /CE2-soluja käsiteltiin samanaikaisesti 5 ug /ml sykloheksimidiä ja kasvavat konsentraatiot AUY922. Expression of AR-proteiinin arvioitiin western blot. GAPDH toimi Proteiinilisäyksen ohjaus. Densitometrian suoritettiin kuva j analyysi. Numerot olivat alla kaistojen suhteessa kontrolliin soluihin.

Co-hoitoon AUY922 ja doketakselin lisää solukuolemaa MYC-CAP /CR ja PTEN-Cap /CE2 solujen

ensin tutkittiin herkkyys MYC-CAP /CR ja PTEN-Cap /CE2 solujen kasvun estäminen kykyjä dosetakselia. Lääkehoitoa osoittivat kykyä inhiboida solun kasvua alhaisissa nanomolaarisina pitoisuuksina sekä solulinjoissa (Fig. 3A-B).

nipistämässä resistenttejä solulinjoja käsiteltiin osoitetulla pitoisuudet doketakselin ja /tai AUY922 48 tuntia. MYC-CaP /CR (A) ja PTEN-CaP /CE2 (B) solulinjoja käsiteltiin osoitetulla pitoisuudet dosetakselin 48 tuntia. Tarttuneet solut kiinnitettiin 70% EtOH. Solujen kasvu arvioitiin värjäämällä kiinnitetyt solut kristallivioletilla ja mittaamalla absorbanssi 570 nm: ssä. MYC-CaP /CR (C) ja PTEN-CaP /CE2 (D) soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuudet AUY922 ja /tai doketakselin 48 tuntia. Solut trypinized ja pestiin 1 x PBS: ssä ja inkuboitiin propidiumjodilla (PI). Prosenttiosuudet kuolleita soluja (PI-positiivisia soluja) määritettiin virtaussytometrialla. Pylväät edustavat keskiarvoa ± SE, * tarkoittaa merkittävästi suurempi yhdistelmä verrattuna hoitoon kunkin lääkkeen yksinään (p = 0,03 määritettynä yksisuuntainen ANOVA).

Valitsimme hoitoon MYC-CAP /CR soluja 48 tunnin ajan 10 nM AUY922 (pitoisuus, jossa AR-proteiini ei hajoa, vaan AR transkriptionaalista aktiivisuutta estyy) ja 100 nM AUY922 (pitoisuus, jossa AR-proteiini on huonontunut ja AR transkriptionaalinen aktiivisuus estyy) 500 nM: n kantaliuoksen. Kuva. 3C esittää, että yhdistelmä 10 nM AUY922 dosetakseliannoksella lisää merkittävästi solukuolemaa verrattuna hoitoon joko lääkkeellä yksin. Yhdistelmä 100 nM AUY922 dosetakseliannoksella edelleen lisääntynyt solun tappaminen verrattuna kunkin yksittäisen hoidon vaikka ei ollut merkittävä. Edelleen, me käsiteltiin PTEN-CaP /CE2 solujen 30 ja 40 nM AUY922 (pitoisuudet AUY922, jotka eivät merkittävästi vaikuta AR proteiinin ekspressio) ja 500 nM doketakselin, joka osoittaa, että nämä yhdistelmä hoitoja AUY922 ja doketakselin kykenevät indusoimaan suurempi solukuoleman verrattuna kunkin yksittäisen hoidon (Fig. 3d). Nämä tiedot osoittavat, että Hsp90 on mahdollisesti mukana transkriptionaalista aktiivisuutta AR ja jotka häiritsevät AR vuorovaikutusta Hsp90 kautta eston merkittävästi antagonisoi AR aktiivisuutta MYC-Cap /CR ja PTEN-Cap /CE2 soluista riippumattomia AR proteiinin ilmentymisen, mahdollistaa suuremman solukuoleman induktioon yhdessä doketakselin.

MYC-cap /CR kasvaimet ovat vastustuskykyisiä doketakselihoidon

in vivo

arvioimiseksi kyky dosetakselin antituumorivaikutus

in vivo

kohti MYC-cap /CR kasvaimia, kastroitu FVB hiirillä MYC-cap /CR kasvaimia käsiteltiin vaihtelevilla annoksilla dosetakselia. Kontrolleina, myös käsitelty kastroitu SCID-hiirissä, joilla on ihmisen ksenograftikasvaimissa, LuCaP23.1 AI ja PC3, joiden tiedetään vastata doketakselihoidon

in vivo

. Kuva. 4B ja 4C osoittaa, että LuCaP23.1 AI ja PC3 kasvaimet olivat herkkiä dosetakselihoidon. Lisäksi jokainen annos ei aikaansaada merkittävää myrkyllisyyttä hoidon aikana (Fig. 4E ja 4F). Sen sijaan, MYC-CaP /CR kasvaimet olivat resistenttejä kaikilla annoksilla doketakselihoidon (Fig. 4A) ja myrkyllisyyttä osoitettu hiirissä, joita hoidettiin 50 mg /kg doketakselia (Fig. 4D).

(A ) MYC-cap /CR-solut (5 x 10

6), (B) LuCaP23.1 AI kasvain möhkäle (-5 mm

2) ja (C) PC3-solut (5 x 10

6) injektoitiin tai sijoittaa ihon alle kylkeen kuohittu uros FVB (MYC-cap /CR) tai SCID (LuCaP23.1 AI ja PC3) hiirillä. Hoito aloitettiin, kun kasvaimet mitattiin noin 50 mm

2. Dosetakseli saatiin apteekista RPCI vesiliuoksena (20 mg /ml) ja laimennettiin 1 mg /ml 1 x PBS: ää päivittäin. Hiiriä käsiteltiin doketakselia annoksilla 10, 25 ja 50 mg /kg kerran viikossa intraperitoneaalisena (i.p.) injektiona kesto 2 sykliä (MYC-cap /CR) tai 3 jaksoa (LuCaP23.1 AI ja PC3). Kasvaimen kasvua seurattiin järjestysnumeroa mittaharppimittauksilla toinen viikko. Kasvaimen koko laskettiin L x W. Kaikki hoitoryhmään koostuivat 3-4 hiirillä. Jokainen hoitoryhmä oli normalisoitu esikäsittely mittaukset ja muunnetaan prosenttia kasvaimen kasvua. Kukin piste edustaa keskiarvoa kasvaimen koon ± SE. (D-F) Kaikki hiiret punnittiin 2 kertaa /viikko seuraamaan doketakselia myrkyllisyys. Myrkyllisyys katsottiin esiintyvän, kun hiiren ruumiinpaino väheni ≥20%. Kukin pylväs edustaa 3-4 yksittäiset hiiret /kohtelu ja edustettuina prosenttia painon muutosta verrattuna hoitoa edeltävät mittaukset, keskiarvo ± SE.

AUY922 pienenee AR ilmentymistä MYC-cap /CR kasvaimia ja yhdistyy doketakselin lisätä terapeuttisen tehon

antituumorivaikutuksen of AUY922 ja doketakselin

in vivo

tutkittiin käsittelemällä kastroitu FVB hiirten MYC-cap /CR kasvaimia. Kasvaimen kantavaa hiirtä sai vehikkeliä (D5W; 5d päälle 2d pois), AUY922 (40 mg /kg ip: 5d päälle 2d pois), doketakseli (10 mg /kg ip: kerran viikossa) tai yhdistelmä 2 sykliä (14 päivää) . Mitään merkittävää toksisuutta havaittiin kaikissa terapiaryhmät esitetyllä painon mitat (kuvio. 5B). Kuten nähdään Fig. 5A verrattuna ajoneuvon käsittely, kahden viikon hoidon AUY922 tai doketakselin yksinään ei merkittävästi vähentää kasvaimen kasvua. Erityisesti yhdistelmä AUY922 kanssa doketakselihoidon merkittävästi kumosi kasvua MYC-cap /CR kasvaimissa verrattuna kunkin yksittäisen hoidon (AUY922, p = 0,002; doketakseli, p = 0,009). Edelleen, histokemiallinen analyysi käsitellyn MYC-CAP /CR kasvainkudoksen AR ilmaisun ilmi, että sekä ajoneuvon ja doketakselin käsitellyt tuumorit näkyy vahva AR tumavärjäystä (Fig. 5C). Mielenkiintoista, AUY922 kertahoitona ja yhdistettynä doketakseliin osoittivat, että Hsp90 esto oli heterogeeninen vaikutus yleiseen kasvaimen AR ilme. Kuva. 5D ja 5E edustava immuunivärjäystä MYC-cap /CR tuumorisektioiden, jotka osoittavat osat kasvain thatremained positiivisia AR ydin- ilmaisun, kun taas viereisten osien kasvainten näytteillä menetyksen ydin- AR ilmaisun.

(A) MYC- CAP /CR-solut (5 x 10

6) injektoitiin ihon alle kylkeen kastroitu uros FVB hiirillä. Hoito aloitettiin, kun kasvaimet mitattiin noin 50 mm

2 (P × L). Hiiriä käsiteltiin ajoneuvo (D5W, ip,

n = 6

), doketakseli (10 mg /kg, viikoittain, ip,

n = 7

), AUY922 (40 mg /kg, 5d päälle 2d pois, ip,

n = 5

) tai yhdistelmä (

n = 6

) 2 viikkoa. Kasvaimen koko seurattiin sarja- mittaharppimittauksilla puolikuukausijulkaisu. Tuumorin koko on laskettu L x W. Jokainen hoitoryhmä oli normalisoitu esikäsittely mittaukset ja muunnetaan prosenttia kasvaimen kasvua. Kukin piste edustaa keskiarvoa kasvaimen koon ± SE. Kaksisuuntainen ANOVA: ** p = 0,009 dosetakselin vs. yhdistelmä, p = 0,002 AUY922 vs. yhdistelmä. (B) Weekly painon mittausten perusteella hoitoa ei ollut myrkyllinen. Jokainen piste edustaa keskiarvo ± SE. (C-E) Tuumorikudos kerättiin päätteeksi hoidon, kiinnitettiin 10% tavallista puskuroituun formaliiniin ja upotettiin parafiiniin. Neljä mikronia (4 uM) kohdat kasvainkudoksen arvioitiin immunohistokemiallisesti varten androgeenireseptorin ilmaisua. Suurennus (x40), asteikko bar = 500 uM. Positiivinen tumavärjäystä AR kvantifioitiin käyttäen Aperio imagescope analyysi 6 satunnainen kenttien x40 suurennuksella. Asteikko bar = 500 uM. Parittomia kaksisuuntainen t-testi Welchin korjaus: **** p 0,0001 yhdistelmä doketakselia; ** P = 0,0016 doketakselia vs. AUY922.

AUY922 pienenee AR transkriptionaalista aktiivisuutta MYC-cap /CR kasvaimet ja yhdistyy doketakselin lisäämään kasvainsolun kuoleman

aktiivisuuden arvioimiseksi AUY922 on vaimennus transkriptionaalista aktiivisuutta

in vivo

, käytimme immunovärjäyksellä ekspression määrittämiseksi c-MYC siirtogeenin, joka tässä kasvainmuodossa ohjaa AR transkription kautta probasiinipromoottorin [22], [23 ]. Doketakselihoidon ei indusoinut menetys c-MYC ilmentymistä (42,3%) verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kasvaimia (41,2%, Fig. 6A), joka oli yhdenmukainen AR ilmentymistä tuumorikudoksessa. Sen sijaan kasvaimet, käsiteltiin AUY922, näkyy merkittävä lasku c-MYC ilmentymisen verrattuna vehikkelillä (42,3% jae 24,6%; p 0,0001) ja doketakselihoidon (41,2% jae 24,6%; p = 0,006). Lisäksi yhdistelmähoito osoitti samankaltaisia ​​menetys c-MYC ilmentymisen verrattuna AUY922 yksi hoitokerta, ja oli merkittävä verrattuna dosetakselia kertahoitona (28,7% jae 41,2%; p = 0,03; Fig. 6A).

( A) Edustavia c-MYC immunovärjäyksellä. Positiivinen tumavärjäystä c-MYC kvantifioitiin käyttäen Aperio imagescope analyysi 6 satunnainen kenttien x40 suurennuksella. Asteikko bar = 500 uM. Kaksisuuntainen t-testi: **** p 0,0001 AUY922 vehikkeliä; ** P = 0,006 AUY922 doketakselia; * P = 0,03 yhdistelmä doketakselia. (B) edustaja lohkaistaan ​​kaspaasi-3 immunovärjäyksellä. Positiivinen tumavärjäystä varten lohkaista kaspaasi-3 kvantifioitiin käyttäen Aperio imagescope analyysi 6 satunnainen kenttien x20 suurennuksella. Asteikko bar = 500 uM. Kaksisuuntainen t-testi: **** p 0,0001 yhdistelmä verrattuna yhden hoitoja.

Kudokset seuraava arvioitiin induktion solukuoleman immunstaining varten lohkaistaan ​​kaspaasi-3. Alhainen solukuolemaa havaittiin vehikkelikäsitellyt kudoksessa (3,3%) ilman merkittävää kasvua solukuoleman dosetakselihoidossa (2,1%) tai AUY922 (4,4%) yhden hoitoja. Kuitenkin yhdistelmähoito merkittävästi lisännyt pilkkoa kaspaasi-3-positiivisia kasvainsoluja verrattuna doketakselin (14,5% jae 2,1%; p 0,0001) ja AUY922 (14,5% jae 4,4%; p 0,0001) yksittäinen hoitoja (Fig. 6B) .

keskustelu

Doketakseli kemoterapia on edelleen ensisijainen standardi hoitoa potilaille, joilla kastraatiotason resistenttejä eturauhassyöpää. Valitettavasti tauti etenee huolimatta doketakselihoidon tai ei vastaa lainkaan. Siksi tunnistaminen uusia lääkkeitä, jotka voivat parantaa tai herkistää potilaat doketakselille kemoterapiaa, on suuresti tarvitaan. Mekanismeista vastustuskykyä doketakselia on osoitettu olevan monitekijäinen solulinjoissa ja kliinisissä näytteissä eri kasvaintyypeille [24]. Tunnistetut mekanismit ovat vähentynyt solujen kertyminen johtuu ulosvirtausta proteiineja, kuten P-glykoproteiinin (P-gp) /MDR1 ja MDR2 [25] ja mutaatiot, jotka estävät doketakselia suoraan sitovaa β-tubuliinin [26]. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että toisen sukupolven Hsp90 estäjä AUY922 indusoi voimakkaita esto AR transkription liittyy antituumorivaikutus, ja lisää solukuolemaa yhdistettynä dosetakselia kastraatiotason kestävä eturauhassyövän solulinjoissa. Lisäksi osoitamme, että AUY922 /doketakselin yhdistelmähoitoa aiheuttaa huomattavia antituumorivaikutus.