Krooninen sairaus

tiivistelmä

kysteiiniproteaasiin legumain on mukana useissa biologisten ja patologisten prosessien, ja proteaasi on todettu yli-ilmentää ja liittyy invasiivisen ja metastaattisen fenotyypin useissa kiinteiden kasvainten. Näin ollen, legumain on ehdotettu ennustetyövälineenä markkeri tiettyjä syöpiä, ja mahdollinen terapeuttinen kohde. Kuitenkin tiedot siitä, miten legumain etenee pahanlaatuinen etenemisen ohella sääntelyä sen proteolyyttinen aktiivisuus ovat epäselviä. Tässä työssä, legumain ilmentyminen tutkittiin peräsuolen syövän solulinjoissa. Huomattavat erot määriä pro- ja aktiivista legumain muotoja, sekä erillinen intrasellulaarinen leviäminen, havaittiin HCT116 ja SW620-solut ja vastaavat ihonalainen ksenografteja. Legumain ajatellaan sijoitettava ja käsitellään kohti aktiiviseen muotoon pääasiassa endo-lysosomeihin; kuitenkin, solunsisäisen jakelu pysyy paljolti hyödyntämättä. Analysoimalla subsellulaarisista jakeet, proteolyyttisesti aktiivinen muoto legumain todettiin tumassa molemmissa solulinjoissa, lisäksi kanoninen endo-lysosomaalisen oleskelu.

In situ

analyysit legumain ilmaisun ja toiminnan vahvisti endo-lysosomaalisen ja ydinvoiman lokalisointi viljellyissä soluissa ja mikä tärkeintä, myös osastoja ksenografteissa ja koepalat peräsuolen syöpäpotilailla. Vuonna HCT116 ja SW620 solulinjoissa ydin- legumain havaittiin muodostavat noin 13% ja 17% koko legumain, vastaavasti. Sen samankaltaisuus aikaisempien tutkimusten ydin- variantteja liittyvien kysteiiniproteaasien, legumain osoitettiin käsitellä histoni H3.1. Löytö ydin- lokalisoitu legumain tuo aivan uudenlainen areenan legumain biologian ja toimintoja syöpään.

Citation: Haugen MH, Johansen HT, Pettersen SJ, Solberg R, Brix K, Flatmark K, et al. (2013) Nuclear Legumain Aktiivisuus peräsuolen syövän. PLoS ONE 8 (1): e52980. doi: 10,1371 /journal.pone.0052980

Editor: Matthew Bogyo, Stanford University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 7. kesäkuuta, 2012 Hyväksytty: 22 marraskuu 2012; Julkaistu: 10 tammikuu 2013

Copyright: © 2013 Haugen et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ on avokätisesti tuettu avustuksin Kaakkois-alueellisten terveysviranomaisten [HSO, # 2011142], www.helse-sorost.no; Norja Research Council alle Functional Genomics Program [FUGE, # 158954 /S10], www.forskningsradet.no/fuge; Søren ja Jeanette Bothners perintö ja Norja Cancer Society [# PR-2006-0272], www.kreftforeningen.no; Oslon yliopisto; Anders Jahres perustan edistäminen Science; Astrid ja Birger Torsteds Foundation; ja Nansen Foundation. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Legumain tai AEP (asparaginyyli endopeptidaasi), kuuluu kysteiiniproteaasina perheen C13 klaanin CD mukaan MEROPS Peptidaasistabiloidut Database [1]. Se havaittiin ensimmäisen pavut [2] ja veren onnenpotku (

Halkiomadot mansoni

) [3] ennen Chen ja työtoverit kuvattu nisäkkään versio vuonna 1997 [4]. Nisäkkäiden proteaasi on selvästi homologinen legumain ei-nisäkäslajeista ja säilyttämistä pitkin evoluution linjaa oletettavasti osoittavat toiminnallista merkitystä. Ihmisen pro-entsyymi 433 aminohappojen läpi useita peräkkäisiä cleavages sekä N- ja C-terminaalisesti, joista jotkut vaativat happamassa, ennen kypsä aktiivinen entsyymi muodossa. Kasvuprosessisi on osittain autokatalyyttinen, mutta riippuu myös muita proteolyyttisiä entsyymejä, jotka yhdessä täydellinen ymmärtäminen aktivointi, ei ole täysin selvitetty [5] – [7]. Aktiivinen proteaasi näyttää erittäin spesifinen parempana alustan hydrolyysiä C-terminaalisesti asparagiini ja jossain määrin jälkeen asparagiinihappo useampaan happamissa olosuhteissa. Voimakkaimmat endogeeninen inhibiittorit legumain ovat kystatiini E /M ja kystatiini C [8], [9], kun taas klassinen kemiallinen estäjä kysteiiniproteaasien yhdiste E64, ei vaikuta legumain toimintaan [4].

on olemassa useita raportteja legumain on yli-ilmentynyt useissa kiinteiden kasvainten (esimerkiksi peräsuolen ja rintasyöpiä), ja tämä on myös korreloitu enemmän invasiivinen ja metastaattinen fenotyypin [10] – [12]. Äskettäin seuloimme paneeli Melanoomasolulinjojen ja totesi, että legumain ilmennettiin ja aktiivinen useimmissa solulinjoissa tutkittu [13]. Normaaleissa kudoksissa, legumain eniten näkyvästi ilmentyy istukassa, munuaisissa ja pernassa [10]. Legumain knock-out hiiret syntyneet terveitä ja hedelmällisiä, mutta näyttää alentunut ruumiin paino, poikkeava endo-lysosomeihin kehittymistä munuaisten vajaatoiminta ja ekstramedullaarista hematopoieesia pernassa [14] – [16].

Äskettäin on ollut osoittaneet, että legumain voi olla osallisena solujen lisääntymisen riippumaton endopeptidaasiaktiivisuutta [17]. Lisäksi legumain on osoitettu aktivoida proMMP-2, joka voi osittain selittää havaitun assosiaation legumain ilmaisun ja metastaattista potentiaalia [18]. Tiukka substraattispesifisyys yhdistettynä yli-ilmentyminen eri kasvaintyypeissä on motivoitunut hyväksikäyttö legumain pro-drug aktivaattori syövän hoidossa, esimerkiksi lisäämällä katkaistavissa peptidiketjun doksorubisiinille tai auristatiini [10], [19] ja kohdentamista lääkeaineet käyttäen legumain estäjä [20]. Muita tunnettuja biologisia toimintoja legumain ovat autophagic-lysosomaalisen käsittely hepatosellulaaristen proteiinien [21], käsittely antigeenien luokan II MHC-esittely [22], ja kypsymisen Toll-kaltainen reseptori signalointi [23].

Tässä tutkimuksen legumain ilme ja proteolyyttinen aktiivisuus tutkittiin kahdessa kolorektaalikarsinoomasta (CRC) solulinjat, HCT116 ja SW620. Huomattavia eroja aktiivisuudessa alun perin tunnistettu ja olemme edelleen käyttää näissä solulinjoissa tutkia legumain jakeluun ja aktiivisuus subsellulaariset tasoilla. Suurta kiinnostusta ja melko odottamattomia, ydin- proteolyyttinen aktiivinen legumain paljastui molemmissa solulinjoissa lisäksi odotetun endo-lysosomaalisen lokalisointi. Nämä tulokset edelleen myöntänyt immunofluoresenssilla, immunohistokemia ja

in situ

aktiivisuusmittausten viljellyillä soluissa ja ksenografteissa ja myös dokumentoitu ihmisen CRC kasvainkudoksessa. Lopuksi legumain osoitettiin proteolyyttisesti pilkkomaan histoni H3.1

in vitro

paljastamalla potentiaali toiminnallinen seuraus ydinvoiman lokalisoitu legumain aktiivisuutta.

Materiaalit ja menetelmät

Solulinjat, ksenografteja ja CRC koepaloja

RKO, CO205, SW48, Colo320DM, HT29, SW620 ja HCT116 ostettiin American Type Culture Collection (ATCC). KM20L2 ja HCC2998 (DCTD Kasvaimen /Cell Line Repository) ystävällisesti toimittanut Dr. Michael R. Boyd (National Cancer Institute, Frederick, MD, USA), samoin kuin LS174T [24] ja TC7 [25] solulinjoja Dr. Richard Hamelin (INSERM, Pariisi, Ranska). Solulinja identiteetti vahvistanut lyhyitä tandem uusintaa varten HCT116 ja SW620 solulinjoissa. Soluja viljeltiin RPMI 1640 (BioWhittaker), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Hyclone), 20 mM Hepesiä (BioWittaker) ja 2 mM Glutamax (Invitrogen). Kaikki solulinjat testattiin rutiininomaisesti negatiivinen

Mycoplasma

. Ihonalainen ksenografteissa päässä HCT116 ja SW620 perustettiin ruiskuttamalla 1 * 10

6 solua molemmissa kyljissä paikallisesti kasvatettuja naaraspuolisia BALB /c nude (nu /nu) hiirissä [26]. Asuminen ja kaikki menettelyt, joissa käytetään eläimiä suoritettiin protokollien mukaisesti hyväksymän Oslon yliopistollisessa sairaalassa Animal Care ja Käyttö komitean noudattaen Norja Animal Research Authority ohjeet eläinten hyvinvointia. Ihmisen koepaloja saatiin potilailta aikana ensisijainen leikkaus oletettu tai todennettujen CRC. Tutkimuksen hyväksyi alueellisen eettisen komitean Etelä-Norjan (# S-98080) ja kirjallinen suostumus saatiin potilailta.

Solulysaatit, väliaine korjuu ja subcellular rikastamiseen

saada solulysaateista ja immunoblottauksella, sub-konfluentteja viljelmiä irrotettiin käyttäen EDTA: ta (BioWittaker) ja pestiin 3 kertaa jääkylmällä PBS: llä (BioWittaker) ennen kylmää lyysipuskuria (150 mM NaCl, 50 mM Tris-HCI, pH 7,5, 0,1% NP-40 ) ja proteaasi-inhibiittorin seosta CompleteMini (Roche Diagnostics), lisättiin kuivaan solupelletit ja jätettiin jäille 15 minuutin ajan. Lopuksi näytteet sonikoitiin ja sentrifugoitiin 15000 x g: ssä 15 min solujätteiden poistamiseksi. Näytteissä aktiivisuuden mittausta lyysipuskuria (100 mM natriumsitraatti, 1 mM dinatrium-EDTA, 1% n-oktyyli-beta-D-glukopyranosidi, pH 5,8) ilman proteaasi-inhibiittorit on käytetty. Proteiinikonsentraatiot määritettiin käyttämällä BCA (bikinkoniini- happo) proteiinimäärityksellä (Pierce) tai Bradford-määrityksellä [27]. Kaikki näytteet säilytettiin -80 ° C: ssa. Conditioned solujen väliaine on saatu siirrostamalla 7,5 * 10

5-soluja 6-kuoppaisille levyille ja kasvatettiin yön yli väliaineessa, joka sisälsi seerumia, pestiin sitten ja kasvatettiin vielä 24 tuntia 1 ml: ssa seerumia. Seerumittomassa kasvualustassa sentrifugoitiin 15000 x g: ssä 5 min, ja supernatantti kerättiin. Proteiinit elatusaine konsentroitiin lisäämällä 4 tilavuutta jääkylmää asetonia, jolloin näytteitä jäillä 15 minuutin ajan ja sentrifugoimalla 4 ° C: ssa ja 12000 x g 10 min. Neste poistettiin ja sakka kuivattiin ilmassa huoneenlämpötilassa ennen uudelleen liuottamalla puskureita immunoblottauksella tai aktiivisuuden mittausten mukaan myöhemmin protokollia. Subsellulaariseen rikastuminen lysosomeihin ja ytimet suoritettiin tiheysgradienttisentrifugaatiolla mukainen Brix

et al.

[28] kanssa, erottamalla fraktiot toistettiin kahdesti, jotta varmistetaan korkea puhtaus. Lysis puskureita pH säädettiin arvoon 5,0 ja 7,4 lysosomaalisen ja ydinvoiman jakeet, vastaavasti. Kaikki muut subsellulaarisista rikastus suoritettiin kolmena kappaleena käyttämällä Subsellulaariset Protein fraktiointi Kit Viljellyt solut (Thermo Scientific) 5 * 10

6 HCT116-solut ja 10 * 10

6 SW620-solujen saamiseksi yhtä suuret tilavuudet solupellettien lähtö- materiaali mukaan valmistajan protokollaa, ja lisäämällä pesemällä pelletti kaikkien fraktioiden varmistaa erittäin puhdasta.

Immunoblottausmääritys ja ELISA

Näytteet ajettiin NuPAGE geelit 4-12% ( Invitrogen) 150 V ja huoneenlämmössä mukana toimitetulla MES-puskuri (joka sisälsi SDS) mukaan valmistajan protokollaa, ja sitten blotattiin 0,45 pm polyvinylideenifluoridia (PVDF) kalvoja (Millipore Corp.) X-solun Sure lock ( Invitrogen) 4 ° C: ssa yhden tunnin ajan 20% metanolia, joka sisälsi Tris-glysiini-puskuria. Laatu proteiinin siirto varmistettiin Amidoblack 1D geelejä. Kalvot jälkeen blokattiin yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa 5% kuivamaitoa TBST-puskuriin (Tris-puskuroidussa fysiologisessa suolaliuoksessa Tween 20) ja tutkittiin primaarisen vasta-aineen 5% kuivamaitoa TBST-puskurilla yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa seuraavassa pitoisuudet: legumain vuohen polyklonaalinen vasta-aine (pAb) (1:1000; R R Calbiochem; 219408), kystatiini E /M vuohen pAb (1:500; R Calbiochem, CP06), aryylisulfataasi B (ArsB) hiiren mAb (1 :500, R DakoCytomatation) spesifisiä vastaavan lajin yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa, ja pestiin sen jälkeen 3 kertaa. Kehitys suoritettiin käyttäen SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (Pierce) mukaan valmistajan ohjeiden visualisoitu röntgenapulainen kalvojen (Kodak tai Thermo Scientific) ja muunnetaan TIFF käyttäen taso- filmiskanneri (Canon). Sillä densitometrian analysoi elokuva skannattiin kalibroidun densitometrillä GS-800 (Bio-Rad) ja kvantifioidaan QuantityOne v.4.6.5 (Bio-Rad). Kaikki mitatut määrät normalisoitiin käyttäen vastaavaa latauskontrollina (α-tubuliinin). ELISA mittaukset ihmisen koko legumain (R Fig. 3B). Lisäksi HCT116 ja SW620-soluja käsiteltiin siRNA spesifinen legumain osoitti 70-90%: n lasku legumain aktiivisuuden (tuloksia ei ole esitetty). Todettuaan todisteita erojen määrä vaikuttavaa legumain vuonna HCT116 ja SW620 se oli kiinnostavaa määrittää, onko tämä voisi johtua mutaatioista Asn323 sijaitsee eksonissa 12, jota on väitetty tarpeen katkaisua pro-entsyymin aktiivisen lomake [5], [6], [36]. Kuitenkin, sekvensointi osoitti mutaatioita

LGMN

nukleotidisekvenssi, joka vastaa katkaisuun tunnistuskohta näissä solulinjoissa (tuloksia ei ole esitetty), ja voisi näin ollen voida selittää havaitun eron proteaasiaktiivisuutta. Lisäksi kystatiini E /M on esitetty tehokkain endogeeninen inhibiittori legumain ja tämän proteiinin ilmentymisen vuoksi tutkittiin. Mielenkiintoista on, että solu- ja erittyneet kystatiini E /M havaittiin olevan aivan erilaiset kahdessa solulinjassa. Vuonna HCT116, kaksi muotoa (14 ja 17 kDa) kystatiini E /M havaittiin elatusaineessa (CM, Fig. 2B), jossa on enemmän vaatimaton määrä ja pääasiassa 14 kDa muodossa kokosolulysaattia (TL). Sen sijaan, SW620 ilmaistuna ei sisällä havaittavia määriä kystatiini E /M ole eritetty tai intrasellulaarinen.

(A) Immunoblotit on legumain on lysosomaalisen (L) ja ydin (N) fraktiot rikastetaan HCT116 ja SW620-soluihin käyttäen tiheysgradientti sentrifugoimalla. Kaikki kaistat kuormitettiin 15 ug kokonaisproteiinia kustakin fraktiosta. Puhtaus säätimiä subsellulaarisista jakeet arvioitiin värjäämällä varten ArsB (liukoisen lysosomaalisen proteiinin) ja SP1 (tumatranskriptiotekijä). (B) immunobloteista legumain (top paneelit), kystatiini E /M (toinen paneelit) ja katepsiini L (kolmas paneelit) rikastetun subsellulaaristen eristetty HCT116 ja SW620-soluissa käyttäen kaupallista pakkausta: sytosoliin (C), kalvot /lysosomeihin ( M /L), ydin- liukeneva (NS), ydinvoiman chromatin sidottu (NC), yhteensä lysaatti (TL) ja medium (CM). Kaikki kaistat kuormitettiin 15 ug kokonaisproteiinia kustakin osa, paitsi elatusaineessa proteiineja saostetaan 1 ml ladattiin. Puhtaus valvonta Eri subsellulaarisista jakeet arvioitiin värjäämällä varten α-tubuliinin (sytosolin proteiiniin), ArsB (liukoinen lysosomaalisen proteiinin), lamppu-2 (lysosomifuusio kalvoon liittyvä proteiini), SP1 (tumatranskriptiotekijä) ja histoni H3 (ydin- chromatin sitoutunutta proteiinia). Leikkaamattomat immunobloteista legumain ja katepsiini L (Fig. S2C).

(A) proteolyyttinen aktiivisuus legumain määritetään substraatin katkaisun (Z-Ala-Ala-Asn-NHMec) suhteessa kokonais- proteiinipitoisuus kukin subsellulaarisessa of HCT116 (pisteviiva baaria) ja SW620 (kirjava palkit) solujen jälkeen tiheysgradientilla sentrifugoinneissa. Lysosomaalinen ja ydin- fraktiot valmistettiin ja analysoitiin pH: ssa 5,8 ja 7,4, vastaavasti, mikä osoittaa proteolyyttisen aktiivisuuden legumain sekä lysosomaalisen ja ydinvoiman jakeet molempien solulinjojen sekä pH-olosuhteissa, vaikka korkein lysosomaalisen osaston määritettiin pH 5,8. (B) proteolyyttinen aktiivisuus legumain mitattuna pH: ssa 5,8 subsellulaarisia jakeet valmistettiin kaupallista pakkausta havaittiin olevan korkein M /L jakeet, mutta oli myös selvästi läsnä NS fraktiot ja havaittiin vain vähäisiä toimintaa C jakeet molempien solulinjojen. Solunulkoinen legumain ei osoittanut mitään aktiivisuutta joko solulinjassa (tuloksia ei esitetty). (C) Total legumain määriä (pro- ja aktiivinen muoto) mitattiin ELISA vuonna subsellulaarisia jakeet (eristetty käyttäen kaupallista pakkausta) ja laskettiin suhteessa proteiinin kokonaismäärästä kussakin fraktiossa olivat myös korkeimmat M /L jakeet, mutta selvästi läsnä NS murto.

Aktiivinen legumain on lokalisoitu endo-lysosomaalisen ja ydinaseiden osastoja

legumain pidetään yleensä proteiinin suunnattu ja asuvat endo-lysosomeihin, ja se on myös raportoitu suorittaa tärkeitä solutoiminnoille sisällä tätä erikoistunut osasto [22], mutta sen jakelu ja ominaisuuksia muissa subsellulaarisia osastoissa ei ole selvitetty. Tutkia tätä käytimme kahta menetelmää eristää ja rikastaa proteiineja subcellular osastoista, joista toinen on perustuttava heysgradienttisentrifugoinnilla sakkaroosi puskuriin ja toisen ollessa kaupallisesti saatavissa subsellulaaristen eristyspakkausta. Tutkia jakelu legumain, immunoblottaus suoritettiin 15 ug kokonaisproteiinia lysaatti kunkin rikastettua solunosafraktio lisäksi kokosolulysaattia ja vastaavan ilmastoitu kasvualustaa (Fig. 2). Tämä mahdollisti myös puhtauden valvonta jakeet käyttäen erilaisia ​​proteiineja oletetun jakelun rajoittaminen, joka osoittaa korkea rikastumista kunkin osaston ja lähes ilman havaittavaa ristikontaminaatio (Fig. 2, lokero-markkereita näkyvät alla mustat viivat). Molemmissa subsellulaarisista rikastusmenetelmiä 36 kDa aktiivinen legumain oli läsnä merkittäviä määriä lysosomaalisen (L) ja kalvo /lysosomaalisen (M /L) jakeet, sekä ydin- (N) ja ydinvoiman liukeneva (NS) murto molemmissa molemmissa solulinjoissa. Se oli jälleen havaittu, että yleinen HCT116 verrattuna SW620 solut sisälsivät alemman tason 56 kDa pro-muodossa kaikissa subcellular jakeet, vahvistaa havainnot valmistettu kokosoluliuotteista (Fig. 1 ja 2), kun taas 56 kDa prolegumain oli myös havaittu ydinvoiman jakeet molemmissa solulinjoissa. HCT116-solut näytetään myös pienempiä määriä 36 kDa: n legumain että sytosolisen (C) ja ydinvoiman chromatin sidottu (NC) fraktiot (Fig. 2B ja kuviossa. S2C, keskellä vasemmalla paneelit). 56 kDa: n pro-muoto legumain havaittiin erittyvän ja havaita elatusaineessa (CM, Fig. 2B), mutta vain HCT116. Erityisen kiinnostavaa oli selvä läsnäolo 36 kDa aktiivinen legumain ydinvoiman jakeet molemmista solulinjoista, lisäksi odotettavissa läsnäolo lysosomaalisen fraktioissa. Lisäksi, subsellulaarisista rikastus suoritettiin käyttäen toista kaupallisesti saatavilla subsellulaarinen eristäminen (Qiagen), joka myös osoittaa tumaanohjaussignaali kypsän 36 kDa: n legumain (Fig. S2B). Mitä tulee endogeenisesti ilmaistuna inhibiittori kystatiini E /M, vain pieniä määriä 14 kDa: n muotoon havaittiin sekä M /L ja NS osa HCT116. Lopuksi, subsellulaariseen jakelu katepsiini L arvioitiin myös, ja tämä proteaasi havaittiin olevan paljon vähemmän näkyvästi SW620 verrattuna HCT116-solut (Fig. 2B ja kuviossa. S2C, alempi paneeli), kuten oli nähtävissä myös kokosoluliuotteista (Fig. 1 ja 2B). Vuonna HCT116 oletettu 25 kDa aktiivinen kahden ketjun muodossa katepsiini L [37] oli selvästi läsnä M /L ja NS jakeet sekä TL ja CM, mutta myös jossain määrin C ja NC jakeet. Vaikka läsnä aktiivisessa muodossa CM, tämä jae osoitti myös pro-muodossa katepsiini L tarkastella vahva bändi on noin 38 kDa. Katepsiini L yksiketjuista muotoa 30 kDa pääosin läsnä M /L ja NS murto molemmissa solulinjoissa. Vuonna SW620, heikompi bändejä katepsiini L havaittiin vain M /L ja NS jakeet sekä TL, ja myös jolla on heikko läsnäolon pro-muodossa CM.

Eri subsellulaarisista frak- HCT116 ja SW620-solut analysoitiin sen jälkeen niiden kyky proteolyyttisesti pilkkomaan legumain tietyn peptidisubstraatin suhteessa kokonaismäärään proteiinien läsnä jokaisessa mitattu osa. In lysosomaalisen ja ydinvoiman jakeet erotetaan sakkaroosi tiheysgradientit, aktiivisuus mitattiin sekä pH 5,8 ja 7,4, vastaavasti, jäljittelemään fysiologisia olosuhteita (Fig. 3A). Yhdessä aikaisempien tutkimusten, lysosomaalisen fraktiot osoitettu korkea proteolyyttinen legumain aktiivisuutta, mutta odottamattomia ydin- jakeet molemmissa solulinjoissa mitattuna neutraalissa pH: ssa on myös osoitti huomattavaa legumain aktiivisuutta. Vuonna subsellulaariset fraktiot eristettiin käyttäen kaupallista pakkausta, proteolyyttisen aktiivisuuden legumain mitattuna pH: ssa 5,8 oli myös korkein M /L (Fig. 3B) osa, kuitenkin, vastaten aikaisempien tulosten kanssa, merkittäviä legumain aktiivisuuden havaittiin ydinvoiman jakeet molempien solulinjojen, erityisesti liukoinen fraktiot (NS). Lisäksi legumain ekspressio subsellulaarisia fraktioista saadaan käyttämällä kaupallista pakkausta arvioitiin käyttämällä sandwich-ELISA, joka kykenee havaitsemaan yhteensä legumain (eli sekä pro- ja aktiiviset muodot) (Fig. 3C). Kaikki fraktiot havaittavia määriä legumain (suhteessa proteiinin kokonaismäärästä kussakin fraktiossa) havaittiin, kun taas korkeimmat tasot havaittiin M /L ja NS jakeet, kuten myös nähty immunobloteissa (Fig. 2B). Ennakoimaton tulos oli määrä ja aktiivisuus legumain vuonna subsellulaarisia fraktioissa 10 * 10

6 SW620-soluja, jotka mitattiin olevan noin kaksi kertaa niin suuri kuin murto valmistettu 5 * 10

6 HCT116-solut, vaikka kaikki kaistat kuormitettiin 15 ug proteiinia. Kuitenkin yhteensä lysaatit koko määrä legumain (pro- ja kypsän-muoto) oli lähes yhtä suuri, mutta HCT116-solut oli korkeampi yleinen legumain aktiivisuus kokosoluliuotteista mikä vastaa havaittua määrää aktiivista legumain vuonna immunoblot (Fig. 2B).

in situ

jakelu legumain ilmaisun

tarkastella legumain ilmaisun

in situ

, HCT116 ja SW620-soluja viljeltiin lasilevyille, immunofluorescently värjätään ja visualisoidaan konfokaalimikroskopialla (Fig. 4A-4D ja kuviossa. S3A-S3B). Legumain lähinnä jaetaan perinuclear alueella, mikä voi viitata majorly lokalisointi

trans

-Golgi verkon (TGN) ja endo-lysosomeihin, ja selvimmin näkyvissä HCT116-soluissa (kuvio. 4A), kun taas SW620-soluja legumain sisältävät vesikkelit esiintyi enemmän jaetaan (Fig. 4C). Sekä HCT116 ja SW620 näytetään myös legumain sijaitsee ytimet soluihin. Visualisoimalla vain ydin- lokalisoitu legumain kaikilla kolmella kohtisuoralla tasolla solujen, legumain havaittiin jakaa noin pallomaisia ​​rakenteita, mahdollisesti nucleoli sisällä ytimet (Fig. 4B ja 4D). Käyttäen kuvan aritmetiikka optisille siivuja viisi riippumatonta z-pinoja, joista jokainen sisältää 30-40 immunofluorescently leimattuja soluja, keskimääräinen osuus solunsisäisten legumain tumassa solun arvioitiin 12,8% HCT116 ja 16,5% SW620 (Fig. 5). Muita analyysi kahden solulinjan kasvanut ihonalainen hiirissä paljasti vertailukelpoisia tuloksia immunofluoresenssilla merkintöjä kun immunohistokemiallisesti värjättynä legumain (Fig. 4E ja 4F, ja kuvio. S3C-S3F), HCT116 osoittaa voimakas rakeisia värjäytymistä taas SW620 osoitti paljon hajanaisemman värjäytymistyyppi. Lisäksi ksenografteissa molemmista solulinjoista legumain näytteillä heterogeeninen ilmaisua, jossa voimakkaasti värjätään alueilla, mahdollisesti nekroottista kudosta. Nuclear lokalisointi oli näkyvin soluissa yleisten korkea legumain ilme, mutta täplät legumain värjäytymistä havaittiin myös sisällä ytimien heikompi värjäytyneitä soluja (keltaiset nuolet). Immunohistokemiallinen analyysi parafiiniin kasvainkudoksen CRC potilailla, paljasti myös heterogeeninen ekspressio legumain, joka oli ilmeinen sekä kasvainsoluissa ja ympäröivän strooman solut (Fig. 4G ja Fig. S3G).