Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

AKT1 (v-akt hiiren thymoma viruksen onkogeenin homologi 1) kinaasi on yksi yleisimmin käytössä lisääntynyt ja selviytymistä reitin syövän. Äskettäin on osoitettu, että E17K mutaatio Pleckstrin Homologia (PH) domeenin AKT1 proteiinin johtaa syövän vahvistamalla fosforylaation ja membraanilokalisaatiota proteiinia. Mutantti osoitti vastustuskykyä AKT1 /2-inhibiittori VIII lääkeainemolekyylin. Tässä tutkimuksessa olemme osoittaneet yksityiskohtaiset rakenne- ja molekyylitason seuraukset liittyvät toiminnan säätelyyn mutantti proteiini.

Methods

telakka pisteet osoittivat merkittävän vähennyksen vuorovaikutuksen affiniteetti AKT1 /2-estäjä VIII lääkeainemolekyylin. Lisäksi molekyylidynamiikan simulaatiotutkimuksia esitti näyttö nopeasta konformationaalisten drift havaittu mutantti rakenne.

Tulokset

Ei ollut vakauden menetystä mutantti verrattuna natiivin rakenteen ja pääkationina-π vuorovaikutus osoitettiin myös säilytettävä. Lisäksi aktiivinen osallistuvat tähteet membraanilokalisaatiota proteiinin näytteillä merkittävää nousua NHbonds muodostumiseen mutantti. Nousu NHbond muodostumiseen aktiivisessa tähteiden osuus 4-kertaiseksi membraanilokalisaatiota potentiaalia proteiinia.

Johtopäätös

yleinen tulos viittaa siihen, että, vaikka mutaatio ei aiheuttanut vakautta tappio rakenne, niihin liittyvät patologiset seuraukset saattanut ilmetä johtuu nopeasti konformationaalisia ajelehtii havaittu mutantti AKT1 PH domain.

Yleiset merkitys

menetelmät toteutetaan ja tulokset saatu tähän työhön tulee helpottaa määritettäessä ytimessä molekyylimekanismeihin syöpään liittyvät mutaatiot ja suunnittelemaan niiden potentiaali lääke-inhibiittorit.

Citation: Kumar A, Purohit R (2013) Cancer Associated E17K mutaatio aiheuttaa Rapid Conformational Drift in AKT1 Pleckstrin Homologia (PH ) Domain. PLoS ONE 8 (5): e64364. doi: 10,1371 /journal.pone.0064364

Editor: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, Ranska

vastaanotettu: 30 tammikuu 2013; Hyväksytty: 12 huhtikuu 2013; Julkaistu: 31 toukokuu 2013

Copyright: © 2013 Kumar, Purohit. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Nämä kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

AKT1 (v-akt hiiren thymoma virus- onkogeeni homologin 1) kinaasi kuuluu mahdollisesti useimmin aktivoitu lisääntymistä ja selviytymisreittiin syövässä [1] – [6]. AKT geeniperheen jäsenistä ovat syövän ihmisen; erityisen merkittävä on geneettinen monistuminen AKT2. Pistemutaatio AKT1 on havaittu Proteus syndrome [2], kohdun limakalvon karsinoomat [4], [7] ja leukemia [5], [8] – [9], geenivahvistus yhdessä mahakarsinoo- pois näytön enemmän kuin 225 ihmisen erilaisiin maligniteettien [10] ja 1 gliosarcoma ulos 103 pahanlaatuisten glial syöpiä [11]. Toisessa tutkimuksessa todettiin, että AKT1 -kinaasiaktiivisuus usein koholla useita korkean, myöhäisvaiheen syöpiä [12], vaikka tarkkaa mekanismia näiden havaintojen ovat vielä epäselviä. Aktivointi AKT1 ohjaavat membraanilokalisaatiota, joka puolestaan ​​on aloittanut sitoutumisen pleckstrin homologia (PH) verkkotunnuksen fosfatidyyli-3,4,5-trisfosfaatti (Ptdlns (3,4,5) P3) tai phosphatidylinositol- 3,4-bifosfaatin (PtdIns (3,4) P2), jota seurasi fosforylaatio sääntely aminohappojen seriini 473 (Ser 473) ja treoniinia 308 (Thr 308) [3], [13]. Patologinen AKT: n kanssa solukalvon on yhteinen tekijä, joka yhdistää AKT syöpään [1] – [7], [14] – [15]. Onkogeeninen käyttäytyminen Gag-AKT fuusioproteiinin hiiren leukemia retrovirus AKT8 (v-akt hiiren thymoma viruksen onkogeenin homologi 8) vaatii kalvon kohdistus myristoylaatio- signaalin ensimmäisen oletetun todisteita siitä, että patologinen kalvo lokalisointi AKT1 kinaasiaktiivisuuden voidaan muuttaa hiirillä [16]. Lisäksi on tärkeää AKT ihmisen syövässä on suurelta osin päätellä yleisesti esiintyviä mutaatioita entsyymien, joka säätelee aktiivisuus näiden toisiolähetin fosfolipidit (Ptdlns (3,4,5) P3, PtdIns (3,4) P2) ja lopulta aiheuttaa aktivointi AKT kautta kalvon rekrytointi [1], [3], [17], [18]. Kasvaimet näytteitä potilaista, joilla rinta-, paksusuolen ja peräsuolen syöpä ja leukemiaa on osoitettu usein satamaan aktivoivat somaattiset mutaatiot AKT1 [1], [5]. Lisäksi menetys liittyy vuorovaikutuksessa jäsenten kuten fosfataasi ja tensin homologi (PTEN) rasva-fosfataasiaktiivisuus on raportoitu glioblastooma, eturauhas- ja kohdun limakalvon syöpiä somaattisten mutaatioiden [11], tai rintasyöpä avulla epigeneettiset hiljentäminen [12], joka on vaihtoehtoinen epäsuora mekanismi aktivoimiseksi AKT. Siksi AKT1 näyttää olevan ratkaiseva, joskin passiivinen rooli syövän synnyssä ja toimii epäsuora välittäjänä mutatoitunut ylävirran säätelyproteiineihin ja loppupään molekyylejä.

onkogeenisia aktivointi AKT1 voidaan saada aikaan monin tavoin, yleisimmin esiintyviä joko johtuen kompromissi sen kalvoon kohdistamista PH domain vuoksi tai patologisten konformaatiomuutoksiin tapahtuvat mutantti rakenteessa. Geneettinen mutaatiot PH domain on aiemmin raportoitu häiritä lokalisointi käyttäytymistä ja herkkyyden menetystä kohtaan PtdIns ja johtanut merkittäviä vaikutuksia sen funktionaalisen käyttäytymisen [1]. Vaikka seulonta syihin havainto, laskennallinen lähestymistapa muodostaa merkittävän selkäranka ja palvelee kuljettaa innokas koehavainnot edullisia panos. Pistemutaatio nukleotidin 49, joka johtaa lysiiniä substituutio glutamiinihapolla aminohapon 17 (AKT (E17K)) on liitetty syövän tapauksissa [1], [3], [19] – [21]. Molekyyli syy takana liittyvien onkologian lopputulos ei ole vielä tutkittu yksityiskohtaisesti. On tunnettua, että sitoutuminen Fosfoinositidien että PH domain aktivoi AKT1. Apo konformaatio, Glu 17 sijaitsee fosfoinositidi-sitova tasku ja muodostaa vetysidosten verkon. Työssä Carpten et al. (2007), osoitettiin, että Lys 17 substituutio johtaa siirtymä pintavarauksesta ympäri taskun negatiivinen Glu 17 tehokkaasti neutraaleja mutantti [1]. Tämä mutaatio on johtanut tehostettuun AKT fosforylaatio Thr 308 ja Ser 473 verrattuna villityypin. AKT1 (E17K) kinaasiaktiivisuutta osoitettiin olevan noin neljä kertaa suurempi kuin AKT1 (WT), mikä viittaa siihen, että mutaatio on muuttanut AKT1 asetuksen ja näin ollen se parantaa solun toimintaa [1]. Lisäksi se on myös ehdotettu, että mutaatio aiheuttaa suuren affiniteetin lisäystä PI (4,5) P2, joka on välttämätön konstitutiivinen solukalvon kohdentaminen mutantti PH-domeenin ja siten kasvaimia synnyttävän luonne täyspitkän E17K AKT1 proteiinin [3]. Lisäksi ehdotettiin myös, että E17K PH domain mutaatio aiheutti rakenteellisia muutoksia PH domain, mikä edelleen estäneet sen vuorovaikutusta AKT1 /2-estäjä VIII [1]. Kaikki nämä havainnot viittaavat vahvasti siihen, että vahingollinen konformaatiomuutoksia mutantti PH domain saattanut aiheuttaa tällaisen patologisen tuloksia.

Molecular dynaaminen simulointi (MDS) on lupaava lähestymistapa tutkia konformaatiomuutoksia mutantti proteiinin rakenne suhteessa sen natiivin konformaation [22] – [29]. Tiedämme, että muutos konformationaalinen suunta proteiinimolekyylin vaikuttaa sen vuorovaikutus ligandin sekä biologisen kanssa. Tässä työssä keskitytään tutkimuksessamme tutkimiseen muutoksia dynaaminen käyttäytyminen AKT1 PH domain aiheuttama syöpää aiheuttavat E17K mutaatio. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että E17K mutaatio on mahdollinen rooli indusoimisessa merkittävää muutosta AKT1-PH domain konformaatiossa sekä indusoinnissa vastustuskykyä AKT1 /2-estäjä VIII [1]. Teimme MDS ajatus päätellä konformaatiomuutoksiin tapahtuvat mutantti rakenne, joka voi selittää havaitun molekyylitason muutoksia ja niihin liittyviä patologisia tuloksia. Lisäksi telakka tutkimukset apuna määritettäessä muutokset ligandin vuorovaikutuksen affiniteetti proteiinia. Kaiken kaikkiaan tuloksemme tarjosi vahvan näyttöä merkittävästä konformationaalisten drift occuring vuonna mutantti proteiinin verrattuna natiivi.

Materiaalit ja menetelmät

Tietoaineistot

Valitsimme kiderakenteet native PH (ATE ID: 1UNP), E17K rakenne (PDB ID: 2UZS) ja rakenne AKT1 /2-estäjän VIII (ATE ID: 3O96) Brookhaven Protein Data Bank [30] meidän tutkimuksessa. Saadut rakenteet olivat energiaa minimoida käyttämällä GROMOS96 43a1 voimakentän läpi Gromacs 4.5.4.package [31].

Kationinvaihtokolonni π vuorovaikutukset

Kationinvaihtokolonni π vuorovaikutuksia laskettiin käyttäen seurantaohjelma [32]. Kationeja π vuorovaikutus proteiinien rakenteet tunnistettiin ja arvioitiin käyttämällä energiaa perustuva valintaperuste merkittävä sivuketjun paria. Prosenttiosuus koostumus tietyn aminohappotähteen edistää kationi-π vuorovaikutukset saadaan yhtälöstä: jossa ”i” tarkoittaa, että viisi tähdettä (Lys, Arg, Phe, Trp, Tyr),

n

cat-π on tähteiden lukumäärä osallisena kationi-π vuorovaikutusta, ja

n

(i) on tähteiden lukumäärä tyyppi ”i” on harkittava proteiinin rakenteita.

Furthere kationi-π vuorovaikutus tunnustetaan yhä tärkeä ei-kovalenttisen sitoutumisen vuorovaikutus merkitystä rakenteellisen biologian. Se käyttää muunnelma optimoitu mahdollisuudet nestemäisten simulaatiot (OPLS) voimakenttä tarjota energinen arvio kaikkien mahdollisten kationia π vuorovaikutukset proteiini. Sähköstaattinen energia () lasketaan kaavalla: missä ja ovat maksut atomien

i

ja

j

vastaavasti ja on niiden välisen etäisyyden. Van der Waalsin energia saadaan:

Missä ja; ja ovat van der Waalsin säde ja hyvin syvyys, vastaavasti.

Jos ≤-2.0 kcal /mol, pari lasketaan kationi-π vuorovaikutus. Jos -1,0 kcal /mol, rakenne hylätään. Jos -2,0 ≤-1,0 kcal /mol, rakenne säilyy vain, jos ≤-1,0 kcal /mol.

ligandisitoutumismääritys Cavity Analyysi

ligandin sitoutumisen onteloon AKT1 PH domeenin rakenne tutkitaan CASTp työkalulla [33]. CASTp toteuttaa inkrementaalinen säännöllisesti triangulations, jota kutsutaan yleisesti painotettuna Delaunay kolmiointi ja alfa-kompleksin mittaamiseksi muoto täydentävyys tietyn makromolekyylin. Se mittaa myös pinta pääsee taskuihin ja sisätilojen onkalot ovat saavuttamattomissa. Toimenpiteet seuraa analyyttiset laskelmat tunnistaa ala ja tilavuus jokaisen taskussa ja ontelon [33].

Täydentävä Analysis

Käytimme www-palvelin PatchDock [34] laskea täydentävyys AKT1 /2-estäjän VIII ja AKT1 PH domain. Perusperiaatteena Tämän palvelimen perustuu molekyylien muoto edustusta, pinta laastari yhteensovitus plus suodatus ja pisteytys. Sen tarkoituksena on löytää telakointi muutoksia, jotka tuottavat hyviä molekyyli kunnossa täydentävät. Tällaisia ​​muunnoksia, kun sitä sovelletaan, aiheuttaa sekä laaja vuorovaikutusalueilla ja pieniä määriä steerisen yhteenottoja. Segmentointialgoritmi on implementated havaitsemiseksi geometristen laastaria. Laastarit suodatetaan siten, että vain laastareita ”hot spot” tähteet säilytetään. Edelleen, hybridi geometrinen hajautus ja Pose-Clustering matching tekniikkaa implimented vastaamaan laastaria. Kaikki komplekseja hyväksyttävää läpiviennit atomien reseptorin atomien ligandin hylätään. Lopuksi loput ehdokkaat on luokiteltu geometrisen muodon täydentävät pisteet. 3D koordinaatit natiivin ja mutantin rakenteet altistettiin telakoitumisen AKT1 /2-estäjä VIII.

Telakka Analysis

Molecular telakoinnin tutkimukset suoritettiin tutkia roolia mutaation vaikuttavien AKT1 /2-estäjä VIII sitova aktiivisuus kinesiinin verkkotunnuksen avulla AUTODOCK 4.0 [35]. AutoDockTools 1.4.6 käytettiin määritettäessä Autogrid kohdat sekä visualisointi telakoituna ligandista aminohapon rakenteita [35]. Grid kartta keskitetty ligandien sitoutumiskohdat natiivin ja mutantin rakenteita rakennettiin kattaa AKT1 /2-estäjä VIII sitova taskuihin. Lamarckian geneettinen algoritmi käytettiin suorittamaan molekyylitason telakointisimulaatioiden. Simuloinnit suoritettiin käyttäen jopa 2,5 miljoonaa energiaa arviointien enintään 27000 sukupolville. Pienin energia konformaatioita pidettiin sitoutumisen konformaation välillä AKT1 /2-estäjä VIII ja PH domain.

Molecular Dynamics Simulation

Molecular Dynamics Simulation suoritettiin käyttäen Gromacs 4.5.4 paketti [31] . Rakenteet natiivin ja mutantin PH käytettiin lähtökohtana MD simulaatioita. Järjestelmät solvatoitiin suorakulmainen laatikko TIP3P vesimolekyylien 10 marginaalinen säde. Fysiologisen pH rakenteet todettiin negatiivisesti varautuneita, mikä jotta simulointijärjestelmän sähköisesti neutraaleja, lisäsimme 2 kloridi-ioneja (CL

-) simuloinnissa ruutuun käyttäen ”Genion” työkalu mukana kanssa Gromacs paketti . Aluksi liuotinmolekyylit helpotettiin taas kaikki liuenneen aineen atomit olivat harmonisesti hillitty alkuperäisille paikoilleen voimalla vakio 100 kcal /mol 5000 vaiheita. Emtol lähentymiskriteeri 1000 kcal /mol ja fourierspacing 0,12 nm käytettiin. Tämän jälkeen koko molekyyli järjestelmä saatettiin energian minimointi käyttämällä konjugoitua gradienttimenetelmää. Berendsen lämpötila kytkin menetelmä [36] käytettiin säätää lämpötilaa laatikon sisällä. Isotrooppinen paine kytkentä suoritettiin käyttäen Parrinello-Rahman menetelmällä. Sähköstaattisia vuorovaikutuksia laskettiin käyttäen Particle Mesh Ewald menetelmä [37]. Ionisaatio valtiot jäännökset asettaa asianmukaiset arvoon 7 kaikki histidiinin oletetaan neutraali. Paine pidettiin 1 atm kanssa sallitaan kokoonpuristuvuus valikoiman 4.5e

-5 atm. SHAKE algoritmia käytettiin rajoittaa sidospituudet mukana vetyä, joka sallii aika vaihe 2 fs. Van der Waalsin ja Coulombin vuorovaikutusta lyhennettiin 1,0 nm. Ei-sidottu pari Luetteloa päivitetään 10 askelta ja konformaation varastoitiin joka 0.5 ps. Sijoitus turvalaitteen simulointi 2000 ps toteutettiin sallimaan liuottimen molekyylien syöttää onkaloon alueen rakenteen. Lopuksi järjestelmiä alistettiin MD simulointi 50 ns. Me lasketaan vertaileva analyysi rakenteellisten poikkeamien kotimainen ja mutantti PH rakenne. RMSD, RMSF, SAS ja Rg analyysi suoritettiin käyttäen g_rms, g_rmsf, ​​g_sas ja g_gyrate työkalu vastaavasti. Useita eri vetysidosten muodostettu erityiset tähteet muita aminohappoja proteiinin simuloinnin aikana (NHbond) laskettiin käyttäen g_hbond. NHbond määräytyy sekä luovuttaja-vastaanottaja etäisyys pienempi kuin 0,35 nm ja luovuttajan-vety-vastaanottajana. Käyrät piirrettiin käyttäen Grace GUI Toolkit 5.1.22 versio.

Tulokset ja keskustelu

Carpten et al. (2007) ehdotti, että E17K mutaatio oli aiheuttanut suurta nousua AKT1 toimintaa [1]. Mukaan johtopäätökset esitetään työssään, mutaatio aiheuttaa merkittävän muutoksen konformaatiossa AKT1 PH domain mikä lopulta johtaa yli fosforylaatioon, 4,5 kertainen nousu sen membraanilokalisaatiota taipumus ja korkeus kinaasiaktiivisuuden, joka voi johtaa syöpään [1] – [6]. Lisäksi mutaatio aiheuttaa menetystä sitova AKT1 /2-estäjä VIII. Vaikka kokeelliset tulokset ovat esittäneet marginaalinen katsauksen molekyylimekanismin liittyy E17K mutaatio, vielä puuttuu yksityiskohtainen selvitys havaitun fenotyypin molekyylitasolla ja atomitasolla. Jotta ymmärtää liittyvien rakenteellisten ja molekyylitason muutoksia, teimme molekyyli telakointi ja molekyylidynamiikan simulointi. Saadut tulokset tutkimuksessamme saatu kiinnostavia johtopäätöksiä, osoittaa kohti nopea konformationaalisia drift E17K PH domain. Ensin tarkasteltiin helpoimmin ligandia sitova ontelo AKT1 PH domain avulla CASTp työkalu. Vuodesta CASTp tuloksista oli selvää, että tähteet 38-52 ja 77-87 aminohappoasemat muodostaa helpoimmin ontelon alueita ligandin vuorovaikutusta. Tutkia muutosta sitoutumisaffiniteetti natiivin ja mutantin proteiini, me suoritettiin edelleen täydentävyys analyysin avulla patchdock avulla. Vuonna patchdock tuloksia koko telakointi pisteet mutantti kanssa ligandin todettiin olevan pienempi verrattuna natiivi rakenne (taulukko 1).

Molecular telakointi analyysi suoritettiin käyttäen AUTODOCK 4.0 paketti purkaa muutoksiin AKT1 /2-estäjä VIII sitoutumisaffiniteetti mutantti rakenteeseen verrattuna natiivi. Merkittävä menetys vuorovaikutuksen affiniteetin havaittiin mutantti rakenteeseen verrattuna natiivi. Natiivi optimaalinen sidosenergia oli -12,32 kcal /mol, kun taas mutantti todettiin olevan -3,87 kcal /mol (taulukko 1). Parempi käsitys muutoksen molekyylien vuorovaikutus voidaan nähdä kuvassa. 1. Kaikkiaan 6 aminohappotähteen vuorovaikutus AKT1 /2-estäjä VIII havaittiin natiivin rakenteen, kun taas mutantti oli vain yksi vuorovaikutus löydetty. Lisäksi kuviot natiivia yhteisvaikutuksia ei ole säilytetty mutantti rakenteessa. Jäännökset Met 1, Ser 2, Asp 3, Gin 59, Gin 79 ja Arg 86, jotka osallistuvat aktiivisesti estäjä vuorovaikutukseen natiivin, ei osoittanut mitään merkitystä mutantti rakenteen (Fig. 1). Nämä molekyylivuorovaikutusten paljasti haitallisia seurauksia mutaation AKT1 /2-estäjä VIII vuorovaikutuksen affiniteetin PH domain.

Rakenne vasemmalla näkyy natiivi Ph AKT1 /2-estäjä VIII monimutkainen ja rakenne on esitetty luettelo mutantti PH ( E17K) – AKT1 /2-estäjä VIII monimutkainen.

proteiini ligandivuorovaikutuksien usein liittyy merkittäviä muutoksia niiden konformaatiossa. Täten tutkimaan perussyy AKT1 /2-estäjän VIII sitoutumisaffiniteetin menetystä mutantin rakenteen ja ymmärtää rakenteelliset seuraukset E17K mutaatio, teimme molekyylidynamiikan simulointi natiivin ja mutantin AKT1 PH domain. Tutkimme RMSD, RMSF, Rg, SASA ja NHbond vaihtelua, ja etäisyys vaihtelut tärkeitä vuorovaikutuksessa tähteiden natiivin ja mutantin rakenne. RMSD kaikille Ca atomit alkuperäisestä rakenteesta laskettiin joita pidetään keskushermostoperäisen proteiinin mittaamiseksi järjestelmän. Tässä RMSD mittaa välinen keskimääräinen etäisyys atomien proteiinin kahden peräkkäisen valtiota. Kuviossa. 2 ja Fig. 3, kotimainen ja mutantti PH proteiini osoitti selvästi muoti poikkeaman till 13 ns niiden lähtö- rakenteesta, jolloin selkäranka RMSD ~0.3 natiivi ja ~0.4 in mutantti. Kun 13 ns, mutantti PH proteiini osoitti äärimmäistä poikkeama kuvio loppuun simulointi verrattuna natiivi. At 13137 ps mutantti rakenne osoitti äkillinen nousu RMSD arvo voi olla jopa 3,36 nm ja edelleen palasi 0,44 nm 16078 ps (Fig. 2, Fig. 3). Tämä suuntaus vaihtelua jatkui mutantti rakenteessa loppuun asti ja osoittivat erittäin suuret poikkeamat verrattuna natiivi. Lisäksi mutantti saavutti jopa korkeimman RMSD tasolla 35931 ps, saavuttaa jopa 4,9 nm. Kaikki nämä tiedot on esitetty, että mutantti rakenne oli tehty selvä konformationaalinen drift koko simulaatio, nämä kielteiset ilmiöt ei havaittu natiivi rakenteessa. Yllä havaitut konformationaalisia kielteiset ilmiöt olivat edelleen yhdenmukaiset tuloksia on saatu analyysin aikariippuvien sekundaarirakenteissa vaihteluita DSSP analyysi. Mutantti rakenne terminaalin tähteiden osoittivat konformationaalisia drift alfa-Helix taipua muotoon, kun taas tällaista ajautuminen ei nähty natiivi rakenne (Kuva. 2). Lisäksi äärimmäinen konformationaaliset kielteiset ilmiöt havaittiin mutantti välillä 25 ns-35 ns. Määrä mutkia huomattavasti lisääntynyt sen jälkeen 34 ns timestep mutantissa rakenteen (Fig. 2). Erityisesti jäännös alueella 80-105, erillinen muoti konformationaalisten ajelehtiko alfaheliksi- taipua ja kelamuodossa havaittiin mutantti rakenteen (Fig. 2), ja on esitetty kuviossa. 4. Kaikki tulokset olivat tiiviisti yhdenmukaiset sen RMSD poikkeamat (Fig. 2, Fig. 3, Fig. 4). Olemme myös osoitti päälle rakenteita natiivin ja mutantin alussa simulointi ja tietyn ajan askeleen, jossa konformationaalinen ajelehtii tapahtui suurempi alue (Fig. 2). Näytti siltä, ​​että nopea ajautuminen oli myös aiheuttanut joitakin domain siirtymiä ja konformaatiomuutoksia mutantti rakenteessa, erityisesti C-terminaalin alueella PH domain, verrattuna natiivi.

Kuva ylinnä edustaa natiivi ja mutantti DSSP juoni. Keskellä, päällek- käin natiivi ja mutanttien rakenteet on esitetty. Tässä natiivi näkyy vihreällä ja mutantti punaisena. Tällä Alhaalla RMSD juoni näkyy. Native näkyy mustana ja mutantti punaisella.

Native näkyy mustana ja mutantti punaisella.

Tässä natiivi näkyy vihreällä ja mutantti punaisena.

Koska tavoitteena on onko mutaatio vaikutti dynaaminen käyttäytyminen jäämien ja tutkimaan aiheuttaa tällaisia ​​konformationaalisia kielteiset ilmiöt havaitaan RMSD ja DSSP tuloksia, RMSF arvot natiivin ja mutantin selkäranka jäännökset laskettiin ( kuva 5). RMSF arvot mutantin tähteiden havaittiin olevan huomattavasti korkeampi mutantti rakenne verrattuna natiiviin (Fig. 5). Tämä osoitti, että havaitut ajautuminen seurasi kasvu atomien vaihtelut mutantti rakenteessa. Jäyhyyssäde (Rg) määritellään massan painon tehollisarvo päässä kokoelma atomien yhteisen massan keskustaa. Siten se antaa käsityksen kokonaismitta proteiinia ja on avustanut tutkimalla käsitettä nopean konformationaalisten kielteiset ilmiöt havaittu mutantti rakenteessa. Jäyhyyssäde tontti Ca atomien proteiinia vs aika 300 K on esitetty kuvassa. 6. Rg vaihtelut mutantti rakenne oli hyvin samanlainen kuin edellä havaittujen RMSD muutoksia. Sen jälkeen 13137 ps äkillinen nousu Rg arvojen mutantti rakenteessa havaittiin, saavuttaa jopa korkeimmillaan 4,1 nm, kun taas Rg arvo natiivin rakenteen pysyi 1,5 nm. Lisäksi on 35931 ps se pääsi jopa maksimiarvo 5,62 mutantissa. Lopussa simulointi, mutantti rakenne osoitti Rg arvo 4,16, kun taas natiivi todettiin olevan 1,42.

Native näkyy mustana ja mutantti punaisella.

( a) Täydellinen Rg vaihtelut. (B) rajoitettu korkeintaan ylempään Rg raja 6 nm. Native näkyy mustana ja mutantti punaisella.

liuottimelle pinta-ala osuus bimolecular pinta arvioitavissa liuottimelle molekyylejä. Nousu SASA arvo mutantti rakenne merkitsee se suhteellisen laajenemisen verrattuna natiivi. Muutos SASA natiivin ja mutantin proteiini ajan on esitetty kuviossa. 7. Mutanttiproteiini osoitti suurempi arvo SASA ajan, kun taas natiivi osoitti pienempi SASA arvo. Pidemmät vaihtelu Rg juoni osoitti, että mutantti proteiini sekä ATP sitova alue voi olla käynnissä merkittäviä rakenteellisia siirtyminen. Tämä tuki lisäksi SASA tulos, jossa mutantti havaittiin olevan suuri SASA verrattuna natiivi. Kaikki nämä havainto yhdessä ehdotti, että mutantti saattanut tehty ajautuminen joka lopulta johti sen siirtyminen avoimeen konformaatioon ja saattanut johtunut vakaus tappioita proteiinien rakenteeseen. Niinpä selvittämiseksi, jos mutaatio oli aiheuttanut mitään vahinkoja rakenteellista vakautta proteiinin prosessin aikana drifting, tutkimme kokonaisenergia vaihtelu koko simulointi. Tulokset osoittivat hyvin lievä nousu kokonaisenergian arvo mutantti rakenne, joka sulki pois käsite vakauden tappioiden aiheuttama mutaatio (Fig. 8).

Native näkyy mustana ja mutantti punaisella.

Native on esitetty mustalla ja mutantti punainen.

Vetysidoksen on tärkeä tekijä säilyttää natiivin konformaation proteiinin ja proteiinin joustavuus on suoraan verrannollinen molekyylin sisäinen NHbonds välillä aminohappotähteiden [38] – [40]. Intramolecular NHbond analyysi natiivin ja mutantin proteiinit tehtiin ajan suhteen, jotta ymmärtää suhde joustavuuden ja vetysiltamuodostuksen. Mutant rakenne oli huomattavasti vähemmän useita NHbond muodostumisen simulaation aikana verrattuna natiivin rakenteen (Fig. 9). Tämä havainto oli yhdenmukaiset noususta Rg ja SASA arvoja mutantti ja erittäin suositeltavaa, että havaitut konformationaalisen kielteiset ilmiöt ja kasvu atomi vaihtelut saattavat ovat herättäneet johtuu menetys NHbond muodostumista proteiinia. Lisäksi aminohappotähteet K30, K32, W36, R38, R40, Q53, R56, K57 ja V58 oli osoitettu olevan aktiivisia komponentteja niiden paikallistaminen kalvo [41]. Näin ollen olemme laskettu määrä NHbond muodostavat nämä tähteet tutkia vaikutusta mutaatio membraanilokalisaatiota. Vaikka kokonaismäärä NHbonds muodostettu mutantti rakenteessa olivat merkittävästi alhaisemmat verrattuna natiivi, kokonaismäärä NHbonds muodostuu nämä jäämät eivät kärsi mitään suuria tappioita asettamat mutaatio. Menetys NHbond muodostuminen havaittiin jäämiä K30 ja Q53, kun taas muut tähteet on joko osoittivat suuremman määrän NHbonds tai säilytti natiivi lasken NHbonds koko simulointi mutantti rakenteen (Fig. 10). Nämä tulokset olivat myös voimakkaan vastaavuustaulukkoa havaintoon raportoitu Carpten et al., (2007) [1], jossa se on esitetty, että mutaatio oli aiheuttanut merkittävää nousua membraanilokalisaatiota mahdollisia proteiinia. Nousu NHbond muodostumiseen nämä jäämät voivat olla vahva tekijä selittää nousu membraanilokalisaatiota potentiaalin mutantti proteiini.

Native näkyy mustana ja mutantti punaisella.

(a) K30 (b) K32 (c) W36 (d) R38 (e) R40 (f) Q53 (g) R56 (h) K57 (i) V58. Native näkyy mustana ja mutantti punaisella.

tärkeys kationia π vuorovaikutus oli tarkasteltu useita tutkimuksia niiden vastaavia tehtävä alueiden vakauden proteiineja. Tutkimme yhteensä 3 energeettisesti merkittäviä kationi-π vuorovaikutusta ja siihen Arg86-Phe55 (Fig. 11), Lys8-Trp99 (Fig. 11b) ja Arg69-Trp22 että AKT1 PH domain (Fig. 11c). Sen tutkimiseksi, jos kationi-π vuorovaikutukset säilyvät mutantti rakenteessa, me tutki tarkemmin sidospituutta vaihtelut näiden kaukaisten kationi-π vuorovaikutus. Se oli huomattava havainto, että kationinvaihtokolonni π vuorovaikutus native sekä mutantti olivat säilyneet. Lisäksi Arg69-Trp22 vuorovaikutus osoitti selvästi vaihtelua mallia ja ehkä pelaa merkittävä asema asiakkuutta konformationaalisia drift (Fig. 11c). Kollektiivisesti tutkimalla kaikki rakenteelliset ja molekyylitason muutokset AKT1 PH domain voimme sanoa, että havaitut konformationaalisten drifting, nousu atomi vaihtelut ja menetys koko NHbonds mutantissa rakenteessa merkittävästi edistänyt aiheuttaa havaittu patologisia seurauksia asettamat E17K mutaatio. Lisäksi 4-kertainen nousu membraanilokalisaatiota potentiaali on saattanut aiheuttama nousu NHbonds aktiivisessa lokalisoinnin tähteiden PH domain. Nämä havainnot johtivat siihen johtopäätökseen, että syöpä liittyy fenotyyppi havaittu tapauksessa AKT1 PH domain E17K mutaation aiheuttama raportoitu molekyyli- ja konformaatiomuutoksiin joka myös aiheuttaa resistenssiä AKT1 /2-estäjän VIII indusoimalla muoto ajelehtii sen vastaavan sitova tasku .

(a) Arg86-Phe55 (b) Lys8-Trp99 (c) Arg69-Trp22. Native näkyy mustana ja mutantti punaisella.

Johtopäätös

aminohappovarianttien tavallisesti indusoi patologisia vahingoittamalla natiivin konformaation proteiinia. E17K mutaatio AKT1 PH domain oli raportoitu aiheuttavan syöpää ja kestävyys AKT1 /2-estäjän VIII. Tarkastelemaan yksityiskohtaisen molekyylimekanismin takana tällaista lopputulosta, teimme molekyyli telakointi ja molekyylidynamiikan simulointi natiivin ja mutantin rakenne. Vakaus ja tärkeä aminohappo vuorovaikutukset jäivät mutantti rakenne, joka sulki pois mahdollisuuden vahingollista vaikutusta mutaation. Lisäksi äkillinen nousu RMSD arvojen ja konformationaalisten kielteiset ilmiöt havaittiin mutantti sructure. Lisäksi kestävyys AKT1 /2-estäjä VIII voimin oli aiheuttanut muutoksia konformaatiorakenteesta sitovan taskun. Johtopäätöksenä kokonaistulosta exaplained että molekyyli syy 4 kertainen nousu mutantti proteiini lokalisointi ja kinaasiaktiivisuutta, joka on viime kädessä aiheutti syöpään liittyviä fenotyyppejä.

Kiitokset

Kiitämme hallintaan Vellore Institute of Technology yliopiston ja prof Riccardo Zecchina peräisin HuGeF-Torino tarjota tilat tämän työn suorittamiseksi.