Krooninen sairaus

tiivistelmä

XB130, uusi sovitin proteiinia, välittää RET /PTC kromosomi uudelleenjärjestelyn liittyvät kilpirauhasen syöpä solujen lisääntymisen ja selviytymisen kautta fosfatidyyli- inositoli-3-kinaasi (PI3K) /Akt-reitin. Äskettäin XB130 havaittiin eri syöpäsoluja ilman RET /PTC. Sen määrittämiseksi, ovatko RET /PTC vaaditaan XB130 liittyvien syöpäsolujen lisääntymistä ja selviytymistä, WRO kilpirauhasen syöpäsolut (RET /PTC mutaatio) ja A549 keuhkosyövän soluja (ilman RET /PTC) käsiteltiin XB130 siRNA, ja useita Akt alas -stream signaalit tutkittiin. Koputtaa-alas XB130 esti G

1-S-vaiheeseen etenemisen, ja aiheuttama spontaani apoptoosin ja parannettu sisäiseen ja ulkoiseen apoptoottisten ärsyke-solukuolema. Koputtaa-alas XB130 vähensi fosforylaation p21Cip1 /WAF1, p27Kip1, FOXO3a ja GSK3p, lisääntynyt p21Cip1 /WAF1protein tasoja ja pilkkoutuminen kaspaasin 8 ja-9. Kuitenkin fosforylaatiota FOXO1 ja proteiinin tasot p53 ei vaikuttanut XB130 siRNA. Olemme myös löytäneet XB130 voidaan fosforyloida useita proteiinityrosiinikinaaseja. Nämä tulokset osoittavat, että XB130 on substraatti useita proteiinityrosiinikinaaseja, ja se voi säädellä solujen lisääntymisen ja säilymisen kautta moduloidaan valitun alavirtaan signaaleja PI3K /Akt-reitin. XB130 voisi osallistua kasvua ja selviytymistä eri syöpäsoluja.

Citation: Shiozaki A, Shen-Tu G, Bai X, Iitaka D, De Falco V, Santoro M, et al. (2012) XB130 sovittelee Cancer Cell Proliferation ja Survival kautta Useita Signaling Tapahtumat alavirtaan Akt. PLoS ONE 7 (8): e43646. doi: 10,1371 /journal.pone.0043646

Editor: Laszlo Buday, Unkarin tiedeakatemian, Unkari

vastaanotettu: 23 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 24 heinäkuu 2012; Julkaistu: 23 elokuu 2012

Copyright: © Shiozaki et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat toiminta-avustuksia (MOP-13270 ja MOP-42546) Kanadan Institutes of Health Research, tutkimus- apurahoja Uehara Memorial Foundation ja International Society of Heart ja Lung Transplantation Dr. Atsushi Shiozaki ja Associazione Italiana Ricerca sul Cancro (AIRC ). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

XB130 on äskettäin löydetty sovitin proteiinin solunsisäistä viestintää; se on mukana geenisäätelyn, solujen proliferaatiota ja eloonjäämistä, solujen vaeltaminen, ja kasvaimen kehittymisen [1]. Ihmisen

xb130

geeni löydettiin aikana kloonaus prosessi ihmisen

AFAP

geeni [2], [3], [4]. Se koodaa 818 aminohappoa, jonka näennäinen molekyylimassa kooltaan noin 130 kDa. Yleisrakenne XB130 osakkeiden samankaltaisuus AFAP siis tunnetaan myös AFAP1 kuten proteiini 2 (AFAP1L2). Koska sovitin proteiinin N-terminaalisen alueen XB130 sisältää useita tyrosiinifosforyloitumiskohdat ja runsaasti proliinia sisältävä sekvenssi, joka voi mahdollisesti vuorovaikutuksessa SH2 ja SH3 domain sisältävät proteiinit, vastaavasti. Keskiosa satamat kaksi pleckstrin-homologia (PH) verkkotunnuksia, jotka voivat kohdistaa proteiineja solukalvoihin vuorovaikutusten kautta erityisiä fosfolipidejä. C-terminaalinen alue sisältää kelattu kela domeenin, jotka saattavat olla mukana proteiinia oligomerointi ja DNA: ta sitovan [4]. XB130 voivat olla vuorovaikutuksessa ja aktivoivat c-Src-tyrosiinikinaasi, mikä johtaa nousseisiin tyrosiinifosforylaatio useiden proteiinien, mukaan lukien XB130, ja transaktivaation AP-1 ja SRE [4]. Aikana solujen vaeltamiseen, XB130 säätelee aktiinisytoskeletonin uudelleenjärjestely, mikä ilmenee sen translokaatio solun reunoja lamellipodioihin. Hiljentäminen endogeeninen XB130 voi alentavan haavan sulkeminen, estävät matrigeeliä hyökkäyksen, ja vähentää lamellipodial pysyvyys ja solujen leviäminen, jotka viittaavat siihen, että se on tärkeä rooli solun liikkuvuus ja invaasiota [5].

XB130 on mukana kilpirauhassyöpä solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen [1]. Kilpirauhassyöpä on eräänlainen hormonitoimintaa maligniteetin, johon kuuluu useita geneettisiä ja epigeneettiset muutokset johtavat MAPK ja PI3K /AKT signalointireitin aktivaatio [6], [7], [8]. Yleinen mutaatio löytyy kilpirauhassyöpä on RET /PTC kromosomi uudelleenjärjestelyt. Tuotteensa RET /PTC on proteiini, kromosomi järjestelynä yhdistelmä 3 ’osan RET-geenin ja 5’-osan kumppani geenin. Tämä johtaa konstitutiivisesti aktivoitua tyrosiinikinaasin, RET /PTC [9]. RET /PTC näyttelyitä muuttamassa kyky kautta vaikuttavat erilaistumista, mitogeenisesta ja etäpesäkkeiden mahdollisuus kilpirauhassyöpä [10], [11]. RET /PTC aiheuttaa vankka tyrosiinifosforylaatiota XB130, joka edistää sen yhdessä p85α alayksikön fosfatidyyli 3-kinaasi (PI3K). Tämä puolestaan ​​aktivoi Akt. Down-regulation XB130 vuonna TPC1 papillaarinen kilpirauhasen syöpäsoluja, kätkeminen RET /PTC kinaasi, voimakkaasti alentunut Akt-aktiivisuutta, solusyklin etenemisen ja solujen eloonjäämistä [12]. Lisäksi WRO soluissa, toinen kilpirauhassyöpä solulinja RET /PTC-mutaatio [13], jotka on vakaasti transfektoitu XB130 shRNA pienentää kasvaimen kasvua nude-hiirissä. Microarray tutkimuksessa havaittiin, että useiden geenien säätelee XB130 liittyvät soluproliferaatioon tai elinkelpoisuudesta, mukaan lukien monet transkriptio sääntelyviranomaiset [14].

Koska XB130 ilmenee vahvasti kilpirauhasen, se on spekuloitu olevan kilpirauhasen erityinen tyrosiini kinaasin substraatti. Viime aikoina olemme havainneet, ilmentymisen XB130 ruokatorven syöpä [15], ja muut syöpäsolulinjoissa. Esillä olevassa tutkimuksessa pyrittiin määrittämään, onko XB130 tärkeä rooli syöpäsolujen riippumaton läsnä RET /PTC. Lisäksi vaikka PI3K /AKT-reitin on todettu tärkeä XB130 välittämiä solun proliferaation ja eloonjäämisen, alavirran signaalit Akt ovat toistaiseksi määrittelemätön. Niinpä olemme tutkineet näitä tapahtumia WRO soluja, ihmisen kilpirauhassyöpä solulinja RET /PTC uudelleenjärjestelyn, ja A549, ihmisen keuhkojen adenokarsinoomasolulinja ilman RET /PTC.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat, vasta-aineet ja muut reagenssit

Human follikulaarisen kilpirauhassyövän WRO soluja (perustettu Dr GJF Juillard, University of California-Los Angeles School of Medicine, Los Angeles, CA, USA) pidettiin RPMI 1640, täydennetty 10% FBS: ää, 1 mM pyruvaattia ja ei-välttämättömät aminohapot (GIBCO-BRL, Gaithersburg, MD, USA) [13]. Ihmisen keuhkojen A549-soluja, saatiin ATCC: stä (CCL-185, Manassas, VA) [16], kasvatettiin DMEM, jota on täydennetty 10% FBS: ää, 1% penisilliini-streptomysiiniä, ja 1% glutamiinia. Soluja viljeltiin standardi kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa, 5% CO

2.

Ekspressiovektorit RET /PTC3, aktivoitu versiot ABL ja SRC [17], tai EGFR ja erbB2-[18 ], jotka aktivoidaan, kun yli-ilmentyminen on kuvattu muualla. Monoklonaalinen XB130 vasta-aine on tuotettu kuten aiemmin on kuvattu [4]. Vasta-aineet fosfo-Akt (Ser473), Akt, fosfo-GSK-3β (Ser9), p21Cip1 /WAF1, p27Kip1, p53, fosfo-FoxO3a (Thr32), FoxO3a, fosfo-SAPK /JNK (Thr183 /Tyr185), SAPK /JNK, fosfo-p38 MAPK (Thr180 /Tyr182), p38 MAPK, fosfori-p44 /42 MAPK (Thr202 /Try204), phosho-Src (Try416) olivat Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA); monoklonaalinen antifosfotyrosiinivasta-vasta-aineet olivat peräisin Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY, USA) ja anti-c-myc (sc-40) olivat Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Vasta-aineet GAPDH, ERK1, fosfo-p21 (Thr145), kaspaasi-8 ja kaspaasi-9 oli Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Anti-PCNA-vasta-aine oli peräisin Abcam (Cambridge, MA, USA). Anti-Ki-67, klooni Ki-S5, oli Chemiconilta (Temecula, CA, USA). Anti-Src (GD11) ja anti-Fas-mAb: n (klooni CH11) oli Upstate Biotechnology Inc. (Lake Placid, NY, USA). Anti-Phospho-p27Kip1 (Thr157) vasta-aine oli peräisin R 0,05 (verrattuna kontrolli siRNA). (C) Alennettu Ki67 ja PCNA tasoilla XB130 siRNA käsitelty WRO ja A549-soluja, määritettynä western blottauksella.

n

= 3. *

p

0,05 (verrattuna kontrolli siRNA hoidetussa ryhmässä). (D) esiintyminen RET /PTC uudelleenjärjestelyn vahvistettiin sekä TPC-1 ja WRO soluista käyttäen RT-PCR. A549-solut eivät sisällä RET /PTC uudelleenjärjestely.

XB130 Controls Survival syöpäsolujen

määrittämiseksi roolin XB130 syövän solujen eloonjäämistä, käsittelimme WRO ja A549 solut XB130 siRNA ja käytetyt virtaussytometria määrällisesti ja erottamaan ulkoista (kuolema reseptorivälitteisten) apoptoottisen reitin, ja luontaisten (mitokondrion välittämä) apoptoottista reittiin [23]. Down-regulation of XB130 indusoidun varhaisen apoptoosin (anneksiini V, positiivinen /PI-negatiivinen) WRO soluissa 48 h transfektion jälkeen siRNA (Fig. 2A). Edelleen, XB130 siRNA parantaa ulkoisen (FasAb, klooni CH11, 100 ng /ml), ja sisäinen (staurosporiini, 200 nM) apoptoottisten ärsykkeen aiheuttama varhainen ja myöhäinen apoptoosin (anneksiini V /PI kaksinkertainen positiivinen) (Fig. 2A). Toisaalta, A549-soluja viljeltiin alustassa, joka sisälsi 10% FBS: ää, down-regulation of XB130 ei lisännyt spontaaneja eikä staurosporiinia-tai FasAb solukuolema, jopa 500 ng /ml FasAb (Fig. S1A) . Lisäksi, yhdistetty käyttö FasAb (500 ng /ml) ja IFN-γ (100 ng /ml), joka on tila, joka on aiemmin raportoitu indusoimaa solukuolemaa monen muun tyyppisiä soluja [24], [25], ei apoptoosia in A549-solut (Fig. S1B). Western blotting osoitti, että ekspressio endogeenisen Fas A549-soluja on vielä korkeampi kuin WRO solut (Fig. S1C). Kuitenkin alle seerumivapaassa edellytyksellä, XB130 siRNA hoito tehostetun staurosporiinille aiheuttaman varhaisen apoptoosin A549-solut (Fig. 2B). Nämä havainnot osoittavat, että A549-solut ovat resistenttejä sekä ulkoisten ja luonnostaan ​​välittämän apoptoottisia signaaleja. Kuitenkin, XB130 on mukana solujen eloonjäämistä sekä solulinjojen erilaisia ​​koeolosuhteissa.

(A) Down-regulation of XB130 parannettu spontaani ja indusoitu solukuolema WRO soluja viljeltiin 10% FBS: ää. Solut, jotka on transfektoitu valvontaa tai XB130 siRNA käsiteltiin staurosporiini (STS, 200 nM) tai Fas-vasta-ainetta (FasAb, klooni CH11, 100 ng /ml) 24 tuntia. Apoptoosi määritettiin virtaussytometrialla käyttämällä PI /anneksiini V kaksinkertainen värjäys. (B) Down-regulation of XB130 tehostetun staurosporiinin aiheuttaman apoptoosin seerumittomassa kunnossa A549-soluja. A549-soluja, jotka on transfektoitu valvontaa tai XB130 siRNA inkuboitiin seerumivapaassa väliaineessa tai ilman 200 nM STS: ssa 24 tuntia.

n

= 6. keskiarvo ± SEM. *

p

0,05 (verrattuna kontrolli siRNA). (C) XB130 voidaan fosforyloituu proteiinityrosiinikinaaseja muu kuin RET /PTC. Immunosaostus anti-myc-vasta-aineen HEK293-soluissa, jotka on transfektoitu myc-merkittyä XB130 yhdessä RET /PTC3, EGFR, Src, Abl, tai erbB2-, osoitti kasvua XB130 tyrosiinifosforylaatiota käyttäen anti-fosfotyrosiinivasta-aineen.

vaikka A549-soluja ei ole RET /PTC, muiden endogeenisten PTK voisi fosfory- XB130. Näin ollen olemme osoittaneet, dramaattisia tyrosiinifosforylaatio A549-soluja, jotka voidaan tehokkaasti vähentää SRC estäjä, PP2 [26]. Sen testaamiseksi, onko muita proteiinikinaasien voisi fosfory- XB130 tyrosiinin, HEK293-soluja, solu- linja, jota käytetään yleisesti testata proteiini-proteiini-vuorovaikutus, transfektoitiin myc-merkitty XB130 yhdessä RET /PTC3 kontrollina, tai muut membraaniin sitoutunutta ( EGFR, erbB2) tai sytosolin (SRC, ABL) tyrosiinikinaaseiksi. Solulysaatit immunosaostettiin anti-myc-vasta-aineella ja niitä blotattiin anti-fosfotyrosiinivasta-ainetta. Vaikka eri tasoilla, kaikki proteiinityrosiinikinaaseja koekspressoitiin XB130 kasvatti tyrosiinifosforylaation (Fig. 2C).

XB130 sitoutuu p85α alayksikön PI3K ja säätimet Akt Activity in Cancer Cells

kaksi tunnettua signalointiryöpyn, jotka osallistuvat säätelyyn solujen etenemisen ja selviytymisen kautta proteiini fosforylaatio ovat PI3K /Akt ja p38 MAPK polkuja [7]. Testasimme avain signalointi komponenttien näiden kahden reitin ja totesi, että fosforylaatiota Src, JNK ja ERK ei vaikuta XB130 siRNA käsitellyissä soluissa (Kuva. S2). Lisäksi fosforylaatiota p38 oli jopa huomattavasti jälkeen XB130 Siran hoidon WRO soluissa (Kuva. S2), mikä edelleen sulje pois mahdollisuutta p38 kuin alas-stream signaali, joka välittää XB130 liittyvien solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen.

Olemme aiemmin osoittaneet, että XB130 säätelevät kilpirauhassyöpä solusyklin etenemisen ja eloonjääminen kautta vuorovaikutus PI3K, mikä aktivointi Akt. XB130 on YxxM motiivin N-terminaalisessa päässä alkaen tyrosiini 54, joka voi sitoutua joko N-tai C-terminaalinen SH2-domeeni p85α-alayksikön PI3K (Fig. 3A), kuten on osoitettu GST-fuusioproteiini pull down määritykset, samanaikainen immunosaostus, fosfori-peptidi kilpailua, ja käyttö XB130 mutanttien [12]. Äskettäin välinen sitoutuminen XB130 ja p85 myös raportoineet Yamanaka et al. rotan kilpirauhasen FRTL-5-solujen MOLDI-TOF MS-määritys [27]. Sekä WRO ja A549-soluja, välistä sitoutumista XB130 ja p85α alayksikön PI3K osoitettiin samanaikainen immunosaostus (Fig. 3A). Akt on myötävirtaan kohde PI3K, ja sen fosforylaatio Ser 473 on herkkä indikaattori Akt-aktiivisuutta [28]. XB130 siRNA vähentää tehokkaasti XB130 proteiinin tasot; ilmiö liittyy vähentynyt fosforylaatiota Akt sekä WRO ja A549-solut (Fig. 3B).

(A) Kaavamainen esitys proteiinin rakenteiden XB130 ja p85α alayksikköä PI3K. Yhteisvaikutuksia XB130 kanssa p85α havaittiin samanaikainen immunosaostus in WRO ja A549-soluja. (B) XB130 siRNA vähentää tehokkaasti XB130 proteiinin tasot ja Akt-fosforylaation WRO ja A549-soluja. siRNA transfektoidut solut kerättiin 48 tuntia transfektion jälkeen.

n

= 5. *

p

0,05 (verrattuna kontrolli siRNA).

XB130 Controls Cancer solusyklin etenemisen ja Survival kautta Useita Akt Down Stream molekyylit

p27Kip1 ja p21Cip1 /WAF1 osallistuvat säätelyyn solusyklin etenemisen kautta estämällä sykliiniriippuvaisten kinaasien CDK1 ja CDK2. Sykliiniriippuvaisen estäjä p27Kip1 tumaansiirtymiseen voi aiheuttaa G1 pidätystä; Akt pystyy fosforyloimaan p27Kip1, ja siten estää sen translokaation ja toiminta [29], [30], [31]. Sykliiniriippuvaisen kinaasi-inhibiittorin p21Cip1 /WAF1 voi moduloivat negatiivisesti solusyklin etenemistä estämällä aktivaation sykliini /cdk2 kompleksin [32]. Aktivointi Akt voi myös fosforyloida p21Cip1 /WAF1 ja säilytä sitä solulimassa, joka voi olla kriittinen solujen selviytymistä [33]. Jälkeen XB130 siRNA hoidon, fosforylaatiota p27Kip1 ja p21Cip1 /WAF1 vähensi merkittävästi sekä WRO ja A549-solut (Fig. 4A ja B).

(A ja B) Down-regulation of XB130 laski fosforylaation p21 ja P27, ja lisääntynyt ilmentyminen p21 WRO ja A549-soluja. Expressions p27 ja p53 ei vaikuttanut alas-säätely XB130. (C ja D) Down-regulation of XB130 väheni fosforylaatiot FOXO3a ja GSK3p vuonna WRO ja A549-soluja.

n

= 4. *

p

0,05 (verrattuna kontrolli siRNA).

Down-regulation XB130 lisääntyi myös merkittävästi kokonaisproteiinipitoisuus taso p21Cip1 /WAF1 (Fig. 4A ja B). FOXO3a voivat sitoutua ja aktivoida promoottori p21Cip1 /WAF1, joka on forkhead sitovat elementit vieressä Smad-sitova elementti. PI3K /Akt välittämän FOXO3a fosforylaation voi johtaa sen tumasta pois ja myöhemmin estää p21Cip1 /WAF1 geenin ilmentymisen [34]. XB130 pudotus vähensi fosforylaatiota FOXO3a (Thr32), vaikuttamatta yhteensä FOXO3a tasot (Fig. 4C ja D). Tämä vähentynyt fosforylaatio FOXO3a voi auttaa lisäämään p21Cip1 /WAF1 ilme. Niistä FOXO perheenjäseniä, FOXO1 tiedetään stimuloivan transkriptio p27Kip1 [35]. XB130 pudotus oli pysty muuttamaan fosforylaation FOXO1 (Thr24) ja FOXO1 (Ser256) (tuloksia ei ole esitetty). Sattumalta, XB130 siRNA hoito ei vaikuttanut p27Kip1 proteiinin tasot molemmissa solulinjoissa (Fig. 4A ja B).

Toinen mekanismi, joka Akt voi edistää soluproliferaatiota on fosforyloida ja inaktivoida GSK3p, mikä suojaa sykliini D1 , parantamalla CDK4 /CDK6 toimintaa, ja helpottaa solun S-vaiheeseen siirtymistä solusyklin [36]. Fosforylaatio GSK3p oli pienentynyt sen jälkeen, kun XB130 siRNA hoidon (Fig. 4C ja D). Tuumorisuppressorigeenin proteiini p53 on transkriptiotekijä, joka voi aiheuttaa joko kasvun pysähtymisen tai apoptoosin. Sen tasot ja toimintaa kontrolloivat pääasiassa MDM2, joka voi sitoa p53 suoraan ja edistää sen ubikitinaatio ja hajoamista. Akt voi fosforyloivat MDM2 ja siten lisätä p53 hajoaminen [37]. Down-regulation XB130 siRNA, ei kuitenkaan vaikuta p53 tasoja.

Akt voi estää apoptoosia läpi useita mekanismeja. Esimerkiksi, Akt pystyy fosforyloimaan prokaspaasi-9, estää sen lohkaisu osaksi pro-apoptoottisten kaspaasi-9, joka välittää sisäinen signaali käynnisti apoptoosin [38]. Esto Akt tehostetun TRAIL aiheuttama kaspaasi-8, joka välittää ulkoisia signaali vireille apoptoosin [39]. Down-regulation of XB130 lisäsi pilkkominen kaspaasin 8 ja caspease-9 WRO-soluissa (kuvio. 5A ja B). A549-solut, alas-säätely XB130 laski prokaspaasi-8 tason ja kasvoi pilkotaan kaspaasi-9 (Fig. 5A ja B). Aktivointi (pilkkominen) kaspaasin 8 ja kaspaasi-9 ovat välttämättömiä vaiheita ulkoisten ja sisäisten reittien solukuoleman, vastaavasti [23]. Tämä saattaa selittää, miksi molemmat ulkoisten ja sisäisten signaali solukuolema tehostettiin XB130 siRNA hoitoon.

(A ja B) lohkaistaan ​​fragmentteja sekä kaspaasin 8 ja-9 oli selvästi lisääntynyt naputtamalla-alas XB130 vuonna WRO soluja. A549-solut, alas-säätely XB130 laski prokaspaasi-8 ja lisääntyi pilkotaan kaspaasi-9.

n

= 4. keskiarvo ± SEM. *

p

0,05 (verrattuna kontrolli siRNA).

fosforylaatio p21Cip1 /WAF1 mukaan Akt voi aiheuttaa sen soluliman keskittymisen ja edistää solujen eloonjäämistä [40]. Forkhead perheen transkriptiotekijöiden voi laukaista apoptoosin indusoiva geenien ilmentymistä, jotka ovat kriittisiä solukuoleman, kuten Bim ja Fas-ligandin [41], [42]. Akt voi fosforyloida FOXO3a, estää sen translokaatiota alkaen soluliman tumaan, [41]. Näin ollen, down-regulation of XB130 siRNA vähentää fosforylaation p21Cip1 /WAF1 (Fig. 4A ja B) ja FOXO3a (Fig. 4C ja D). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että XB130 osallistuu solujen jakautumisen ja eloonjäämisen useiden eri molekyylien alavirtaan PI3K /Akt-reitin.

Keskustelu

XB130 on todettu olevan alustan ja sitomispartnerin RET /PTC, onkogeenisen proteiinityrosiinikinaasin [12]. Viime aikoina olemme havainneet, ilmentymisen XB130 eri solulinjoissa, jotka ovat peräisin kilpirauhasen, keuhkojen, ruokatorven, haiman ja paksusuolen syöpiä. Esillä olevassa tutkimuksessa osoitimme, että XB130 on mukana leviämisen ja selviytymisen WRO kilpirauhasen syövän soluja (RET /PTC-mutaatio) ja A549-keuhkokarsinoomasoluja (ilman RET /PTC-mutaatio). Down-regulation of XB130 siRNA myös vähentää proliferaatiota ja eloonjäämistä ruokatorven syöpä soluja (tietoja ei esitetty). Nämä tulokset osoittavat, että sen lisäksi, RET /PTC XB130 voi välittää toimintaan muita proteiinityrosiinikinaaseja. Todellakin, kun koekspressoidaan XB130 useita reseptorityrosiinikinaaseja ja ei-reseptorityrosiinikinaasien pystyivät lisäämään merkittävästi fosforylaation XB130. Se on hiljattain osoitettu, että Src-inhibiittorit, PP1 tai PP2, poistetaan cAMP-indusoidun tyrosiinifosforylaation XB130 ja sen vuorovaikutusta p85-PI3K [27]. Näin ollen on todennäköistä, että XB130 voi olla substraatti useita proteiinityrosiinikinaaseja ja se voi välittää solusyklin etenemistä ja eloonjäämistä useissa syöpäsolutyyppien.

XB130 sitoo spesifisesti p85α alayksikön PI3K, joka myöhemmin aktivoi Akt. Akt on keskeinen rooli solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen. Down-regulation XB130 kanssa siRNA vaikuttaa useita molekyylejä alavirtaan Akt. Tämä viittaa siihen, että XB130 on tärkeä säätelijä PI3K /Akt liittyvät syöpäsolujen lisääntymistä ja selviytymistä.

Viime vuosikymmenen aikana on ollut kasvava keskittyminen PI3K /Akt-reitin yhtenä Keski väylät solujen lisääntymisen ja eloonjäämisen [43], [44], [45].

class-Ia

PI3K: t ovat heterodimeerejä sääntelyyn alayksikön (p85α, p85β tai p55δ) ja p110 katalyyttinen alayksikkö (p110α, p110β tai p110δ) [46]. Erityiset fosfotyrosiini jäämien aktivoitu kasvutekijän reseptoreita tai sovittimen proteiinit voivat sitoutua SH2-domeenia ja p85, mikä lisää entsymaattista aktiivisuutta p110 katalyyttisen alayksikön ja rekrytoi myös entsyymin membraaniin, jossa se katalysoi muodostumista rasva-toisiolähetin, PIP3, by fosfory- phosphoatidylinositol-4,5-bifosfaatin (PIP2) 3’kantaa sen inositoli rengas [47] (Fig. 6). Olemme löytäneet konsensus p85 sitoutumiskohta (YxxM) N-terminaaliseen päähän XB130, jotka voivat sitoutua joko N-tai C-terminaalinen SH2-domeenin p85α määritetään GST-fuusioproteiini pull-down määrityksiä, ja että XB130 on co-immunosaostettiin p85α ihmisen kilpirauhaskarsinoomaa TPC-1-soluissa. Fosfo-peptidi, joka sisältää YxxM sekvenssin XB130 (mutta ei sen yksikään-fosforyloitua muotoa) vähennetään XB130 /p85 vuorovaikutuksen ja poistaminen N-pään poistetaan vuorovaikutusta XB130 ja p85 [12]. Tuoreessa tutkimuksessa, Yamanaka et al. löydetty rotan XB130 liittyi p85-alayksikön PI3K, ja he nimesivät sen PI3KAP. Tämä vuorovaikutus on tärkeää parantaa cAMP-aikaansaamaa IGF mitogeenisen aktiivisuuden FRTL-5 kilpirauhasen soluja [27]. Esillä olevassa tutkimuksessa, vuorovaikutus XB130 ja p85 todettiin sekä kilpirauhasen ja keuhkosyövän soluja. Tärkeää on, alas-säätely XB130 vaikutti monien alavirran proteiinien PI3K /Akt-reitin. Nämä todisteet viittaavat siihen, että XB130 on tärkeä säätelijä PI3K-reitin kautta erityinen sitova p85.

aktivointi Akt on ominaisuus kilpirauhassyövän [48], [49], [50]. Keuhkokasvaimia osoittavat myös korkean fosforyloidun Akt [51]. Hoito kilpirauhasen tai keuhkosyöpään solujen PI3K-estäjien, LY294002 tai wortmanniini, alensivat solujen kasvun tai elinkelpoisuuden [48], [49], [50], [52], [53], [54]. Koska sen keskeinen rooli geenin transkription säätelyyn, solusyklin etenemistä, ja selviytyminen, Akt on ollut mukana monissa syöpätyypit [47], [55]. Tunnistaminen XB130 tehokkaana alkupään säätelijänä PI3K /Akt-reitin voi paljastaa uusia terapeuttisia kohteita syöpähoitojen.

onkoproteiineja voi parantaa kasvaimen kasvua muuttamalla solusyklin etenemisen ja /tai normaali solukuolema. Down sääntely XB130 siRNA paitsi lyhentää solusyklin etenemisen vaan myös parannettu solukuoleman, mikä osoittaa, että XB130 on keskeinen ylävirtaan säädin kummankin solun prosesseja. Tuloksemme osoittavat, että XB130 säätelee solusyklin etenemistä ja eloonjäämistä läpi useita molekyylejä, kuten p21Cip1 /WAF1, p27Kip1, FOXO3a, GSK3p, kaspaasi 8 ja kaspaasi 9 (Fig. 6). Vaikka emme tutkia kaikkia tunnettuja substraatteja Akt tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että XB130 kykenee sen sääntelytehtävää solujen lisääntymisen ja selviytymisen kautta PI3K /Akt-reitin. Lisäksi säätely alaspäin XB130 ei vaikuttanut alas-virtauksen säätimet FOXO1 ja p53 mikä osoittaa, että sen lisäksi, XB130 liittyviin Akt-aktiivisuutta, nämä molekyylit voidaan edelleen säädellä muiden viestinvälitystekniikoita, mikä puolestaan ​​takaa spesifisyyden XB130 liittyviä toimintoja.

Yhteenvetona osoitimme että XB130 voisi säädellä solujen lisääntymisen ja selviytymisen kautta moduloimalla PI3K /Akt-reitin kilpirauhasen ja keuhkosyövän soluja. XB130 voisi olla uusi onkoproteiinia useita syöpiä. RNA-interferenssi on tullut tehokas työkalu moduloida geenin toimintaan sekä

in vitro

ja

in vivo

[56], [57]. Kohdistaminen XB130 ilme tällä tekniikalla voisi olla houkutteleva vaihtoehto syövän hoidossa.

tukeminen Information

Kuva S1.

Down-regulation XB130 siRNA ei vaikuttanut apoptoosia A549-soluja, kun läsnä oli 10% FBS: ää. A549-soluja viljeltiin DMEB plus 10% FBS: ää. (A) Down-regulation of XB130 ei tehostanut spontaaneja ja solukuolema. A549-soluja käsiteltiin 200 nM STS, tai 500 ng /ml FasAb 24 tuntia. (B) FasAb (500 ng /ml), IFN-γ (100 ng /ml) ei indusoinut apoptoosia, kuten analysoitiin virtaussytometrialla käyttäen PI /anneksiini V kaksoisvärjäystä.

n

= 3. keskiarvo ± SEM. (C) Expression of Fas vahvistettiin A549 ja WRO solujen western blottauksella.

Doi: 10,1371 /journal.pone.0043646.s001

(TIFF) B Kuva S2.

fosforylaatio tasot Src ja MAPK vuonna WRO ja A549-soluja oli transfektoitu valvontaa tai XB130 siRNA. Fosforylaatiot Src, ERK ja JNK ei vaikuttanut alas-säätely XB130 vuonna WRO ja A549-soluja, kun taas phosphrylation p38 oli kasvua WRO soluissa.

n

= 4. Analyysit suoritettiin Western-blottauksella. Keskiarvo ± SEM. *

p

0,05 (verrattuna kontrolli siRNA).

Doi: 10,1371 /journal.pone.0043646.s002

(TIFF) B