Krooninen sairaus

tiivistelmä

Leikkaus aiheuttama tulehdus on voimakas promoottori kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäke kolorektaalisyövässä. Hiljattain löydetty perheen Nox entsyymien ovat merkittävä lähde endogeenisen reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) ja nyt vahvasti osallisena kasvainsolun etäpesäkkeitä. Mielenkiintoista, Nox entsyymit voivat olla ”tarkoituksellisesti” aktivoidaan tulehduksellisten sytokiinien ja kasvutekijöiden joita esiintyy runsaasti perioperatiivisena ikkuna. Koska paksusuolen syöpä solut ilmentävät Nox entsyymejä ja Toll-kaltainen reseptori 4 (TLR-4), me oletettu, että LPS saattaa voimistaa kykyä koolonkarsinoomasoluissa lähettää metastaaseja kautta Nox entsyymivälitteisellä redox signalointia. Tämän tueksi hypoteesi, tämä paperi osoittaa, että LPS indusoi merkittävästi, ohimenevää endogeenisen ROS SW480, SW620 ja CT-26 paksunsuolen syöpäsolujen. Tämä lisäys LPS-indusoidun ROS aktiivisuus kumosi kokonaan, jonka NOx-inhibiittori, diphenyleneiodonium (DPI), Nox1 siRNA ja NF-KB: n estäjä, dihydrokloridi. Merkittävä kasvu Nox1 ja Nox2 proteiinin ilmentyminen tapahtuu seuraavan LPS hoitoa. NF-KB: n on myös vaimentaa kasvua Nox1 ja Nox2 proteiinin ilmentymiseen. Sub-solujen sijainti LPS-indusoidun ROS sukupolvi on pääasiassa Endoplasmakalvosto. LPS aktivoi PI3K /Akt-reitin kautta Nox syntyy ROS ja tämä signaali estyy DPI. Tämä LPS aktivoitu Nox mekanismi mahdollistaa merkittävän kasvun SW480 paksusuolen syövän solun tarttumiseen kollageeniin I, joka inhiboituu DPI, Nox1 siRNA ja PI3K-estäjä. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että LPS-Nox1 redox signalointi akseli on keskeinen merkitys helpottamalla paksusuolensyöpä soluadheesion, mikä lisää metastaattisen potentiaalin koolonkarsinoomasoluissa. Nox1 voi edustaa arvokasta kohde, jossa paksusuolen syövän etäpesäkkeiden.

Citation: O’Leary DP, Bhatt L, Woolley JF, Gough DR, Wang JH, Cotter TG, et ai. (2012) TLR-4 merkinanto Nopeuttaa Colon Cancer Cell Adhesion kautta NF-KB välittämä transkriptionaalinen säätely ylöspäin Nox-1. PLoS ONE 7 (10): e44176. doi: 10,1371 /journal.pone.0044176

Editor: Sumitra Deb, Virginia Commonwealth University, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 29, 2012; Hyväksytty: 30 heinäkuu 2012; Julkaistu: 11 lokakuu 2012

Copyright: © O’Leary et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Kirjoittajat ei ole tukea tai rahoitusta raportoida.

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä on toiseksi yleisin syy syövän liittyvä kuolleisuus länsimaissa [1]. Kirurginen resektio edelleen tukipilari parantavaa hoitoa paksusuolensyöpä. Kuitenkin noin 25 35% solmu positiivisten potilaiden kehittää joko paikallisen uusiutumisen tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä viiden vuoden kuluessa leikkauksen jälkeen [2]. Tämä ilmiö johtuu siitä, että inflammatoristen välittäjien vapautumista vasteena kirurgisen trauman, jotka voimistavat metastaattinen kyky verenkierrossa olevia kasvainsoluja ja jäljellä kasvainten soluja. Tämän vaikutukset ilmiön ilmentyy merkittävä väheneminen taudista vapaa ja eloonjäämiseen paksusuolisyövän potilaille.

Syöpäsolujen noudattaminen on olennainen vaihe metastaattisen Cascade. Viimeaikaiset tiedot ovat osoittaneet, kuinka eksogeenista leikkauksen aiheuttama reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) lisäävän verenkierrossa olevia kasvainsoluja noudattaa endoteelivuorauksen luomalla solujen välistä aukkoja, jolloin kasvainsolut noudattamaan suosivasti paljaana solunulkoisen matriisin. Nämä tuhoisia, sytotoksisia vaikutuksia ROS esiintyy korkeilla tasoilla. Kuitenkin alhaisella tasolla, endogeeninen ROS voi edistää solujen eloonjäämistä säätelemällä redox herkkien eloonjäämisreittejä kuten PI3K /Akt, joka on vahvasti osallisena helpottaa kasvainsolujen etäpesäkkeitä.

Nox entsyymit ovat merkittävä lähde endogeenisen ROS: n syntyminen vasteena tulehduksen välittäjäaineiden, kuten sytokiinien, kasvutekijöiden ja hypoksisissa olosuhteissa, jotka kaikki ovat koholla vastauksena kirurgisen trauman [3] – [4]. Nox entsyymit muodostuvat perheen 7 entsyymejä, Nox1-5 ja Duox1,2 [5]. Mielenkiintoista on, että ilmentyminen Nox entsyymien syöpäsoluissa on äskettäin kuvattu ja Nox-johdetut ROS tunnetaan nyt helpottaa metastaattisen prosessin syöpäsoluissa, mukaan lukien paksusuoli-, melanooma, haiman ja mahalaukun syövän soluihin [6] – [8]. Viimeaikaiset todisteet viittaavat siihen, että signalointi vaikutukset Nox-johdettu ROS on yhteydessä riippuvainen, koska ne eivät ainoastaan ​​anna pro-inflammatorisia vaikutuksia vaan niillä on myös rooli solun tulehdusta puolustusmekanismi [9].

Lipopolysakkaridi ( LPS) tai endotoksiinin on voimakas laukaista isännän tulehdusvasteita perioperatiivisena ikkuna. LPS on gramnegatiivisen bakteerin antigeenin, translokoituu poikki suolen seinämän Suuren leikkauksen jälkeen tai sen aikana septinen episodi, tuloksena on endotoxaemia [10]. Recognition LPS Toll-like-reseptori-4 (TLR4) indusoi luontaisen immuniteetin kautta solunsisäinen signalointi cascade on MyD88 riippuvaisilla tai itsenäisesti. Sekä in vitro ja in vivo tutkimukset nyt sotkea LPS-indusoitua TLR-4 signalointi kuin liipaisinta kaikki näkökohdat metastaattisen kaskadin lukien tartunta [11] – [12]. Myös TLR-4 ilmentymistä koolonkarsinoomasoluissa liittyy lisääntynyt riski muodostumisen maksan etäpesäkkeiden paksusuolen syöpäpotilaiden ja annetaan huonompi ennuste [13] – [15].

Kuten viimeaikaiset todisteet viittaavat, onnistunut kasvainsolujen etäpesäkkeiden edistetään tuhoavista vaikutuksista eksogeenisen ROS. Me arveltu, että endogeeninen myrkytön tasot ROS voi myös olla merkittävä rooli orchestrating kasvainsolujen etäpesäkkeitä. Tässä osoitamme, miten LPS-Nox1 signalointi akselin johtaa merkittävään kasvuun liima kyky paksusuolen syöpäsoluja. LPS aktivointi Nox toiminta tapahtuu NF-KB-riippuvaisella tavalla, mikä johtaa ohimenevää solunsisäisten ROS. Tämä ohimenevä nousu solunsisäisen ROS aiheuttaa fosforylaatioon redox herkkien Akt. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että LPS-Nox1 redox signalointi akseli on keskeinen merkitys helpottamalla paksusuolensyöpä soluadheesion, mikä lisää metastaattisen potentiaalin koolonkarsinoomasoluissa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Culture

ihmisen paksusuolen syövän solulinjat, SW480, SW-620 ja CT-26 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VA). Soluja ylläpidetään subkonfluentteja tilassa käyttäen RPMI (Roswell Park Memorial Institute) viljelyväliaineessa, johon on lisätty 10% vasikan sikiön seerumia, 1% penisilliini /streptomysiiniä ja 4 mmol /l L-glutamiinia kaikkea Sigma Aldrich, Dublin, Irlanti . Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2. Solut yli yön ennen LPS käsittelyä, jotta kiinnitys.

Vasta-aineet ja reagenssit

LPS johdettu

E.coli

kanta 055: B5 ostettiin Sigma-Aldrich. Tässä tutkimuksessa seuraavia vasta-aineita käytettiin – Nox1, p22phox, p47phox (Santa-Cruz Biotechnology, Santa-Cruz, CA, USA), Nox2 (Upstate, Milton Keynes, Iso-Britannia), p-Akt (Cell Signaling), IKB-α , p-IKB-α (Cell Signalling), GAPDH (Advanced Immunochemicalsilta, Long Beach, CA, USA). IKK-estäjä (dihydrokloridi) hankittiin Sigma ja PI3K-estäjä (LY294002) hankittiin EMD Chemicals (San Diego, CA, USA). Kohdennettu knockdovvn Nox1 suoritettiin käyttäen siRNA. Kaksi eri konstrukteja käytettiin (Ambion, # s25726, s25727).

Virtaussytometria

5 x 10

4 solua kuoppaa kohti maljattiin yön yli 24-kuoppalevyllä. Soluja käsiteltiin LPS: llä pitoisuudessa 1 ug /ml 0,10,20,30,40,50,60 minuuttia ja 24 tuntia. ROS seuraavat LPS hoidon seurattiin käyttäen 2 ’, 7’ dichlorodihydrofluorescin diasetaatti (DCF) (Molecular Probes, Leidin, Alankomaat). Solut trypsinoitiin, sentrifugoitiin 5 minuutin ajan 1000 rpm: llä ja sitten kerättiin. DCF lisättiin sitten loppupitoisuuteen 50 uM ja näytteitä inkuboitiin 15 minuutin ajan 37 ° C: ssa ennen analyysiä FACScan-virtaussytometrillä (Becton Dickinson, Oxford, UK). Dichlorofluorescin (DCF) fluoresenssi, syntyy, kun DCF vuorovaikutuksessa ROS. ROS oli siis mitattiin fluoresenssikanava 1 (FL-1) (530 nm) virityksen ollessa 488 nm. CellQuest-ohjelmaa (Becton Dickinson) käytettiin analyysiin.

Western-blottaus

Western-blottaus suoritettiin mittaamiseksi proteiinipitoisuus soluja käsiteltiin 1 ug /ml LPS: llä 0,10,20, 30,40,50,60 minuuttia ja 24 tuntia. Tämän jälkeen solut trysinised ja sentrifugoitiin kokoelma. Koko solu-uutteet saatiin sitten. Solupelletit pestiin jääkylmällä PBS: llä ja suspendoitiin sitten soluhajotuspuskurin 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 150 mMNaCl, 1 mMNa3VO4, 1 mMNaF, 1 mMEGTA, 1% Nonidet P-40, 0,25% natriumdeoksikolaatti, joka sisälsi proteaasi-inhibiittoreita ( Roche Diagnostics, Lewes, UK) ja 0,2 mM 4- (2-aminoetyyli) bentseenisulfonyyli fluoria hydrokloridi] ja inkuboitiin jäillä 20 min. Kaikki jäte poistettiin sentrifugoimalla 4 ° C: ssa, ja proteiinin konsentraatio kvantitoitiin käyttäen Bio-Rad proteiinimäärityksellä (Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK) käyttäen naudan seerumin albumiinia standardina. Yhtä suuret määrät proteiinia erotettiin käyttäen denaturoivalla natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidigeelielektroforeesi, jonka jälkeen se siirretään nitroselluloosakalvoille (Schleicher MatTek Corporation, Ashland, MA, USA). Soluja käytetään eläviä kuvantamisen inkuboitiin 50 gM DCF ja 1 uM ER tracker väriainetta (Molecular antureista, Leiden, Alankomaat) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Yksi mikro-molaarinen LPS lisättiin solut, jotka sisältävät väriaineiden 30 minuuttia ennen kuvantaminen. Missä mainittu soluja käsiteltiin 10 uM DPI DCF ja ER Tracker väriaineet 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa ja 1 uM LPS lisättiin soluihin 30 minuuttia ennen kuvantaminen. Tämän inkuboinnin kanssa väriaineet, solut huuhdeltiin ja kuvantaa joko kasvualustaan, joka sisälsi LPS tai LPS ja DPI tai kasvualustaan ​​yksin. Pitoisuudet DPI ja LPS pidettiin kasvualustassa pestä ja samalla solukuvauksessa. SW480-soluja värjättiin myös 8 uM Menadioni 1 tunnin ajan yhdessä 10 uM MitoPY ja 1 uM mitotracker syvän punainen (Invitrogen). Menadioni käytettiin positiivisena kontrollina. Lisäksi, solut värjättiin MitoPY oli käsitelty LPS: llä 1 ug /ml ennen kuvausta. SW480-soluja kuvattiin kanssa multiphoton laserkeilauksen mikroskooppi Flouview1000 MPE (Mason Technology, Dublin, Irlanti), jossa on infrapuna punainen Ti: Sapphire Laser joka on tilassa lukittu. Kuvat otettiin ja visualisoitiin käyttämällä XLPLN 25 x WMP vesiupotukseen tavoite (1,05 numeerinen aukko: Olympus Optical GmbH, Hampuri, Saksa) ja kuvat säilytettiin Olympus flouview1000 ohjelmisto (Mason Technology, Dublin, Irlanti). Aikana yritysostot, havaitsemisasetuksia pidettiin vakiona DCF mahdollistaa suoran vertailun ROS tasoilla, jos solut käsiteltiin LPS verrattiin hoitamattomiin tai LPS ja DPI käsiteltyjä soluja. Kuvat on esittää yhtenä viipale Z-pino projektio.

kvantitatiivinen PCR

Kvantitatiivinen PCR suoritettiin oligo-dT luotu cDNA käyttämällä MJ Research Opticon 2 tunnistusjärjestelmä yhdistettynä Quantitect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Crawley, UK). Alukkeet Nox1, Nox2 ja β-aktiini ostettiin Quantitect Primer määritykset (Qiagen). Seuraavat PCR-parametrejä käytettiin kunkin alukesarjaa: denaturointi 95 ° C: ssa 15 min, jota seurasi 45 sykliä 94 ° C 15 sekuntia, pariutuminen lämpötila 56 ° C: ssa 30 sekunnin ajan ja laajentamisesta 72 ° C: ssa 30 sekuntia . RNA-näytteet analysoitiin kolmena kappaleena ja Nox1 tai Nox2 ilmaisun suhteessa p-Actin määritettiin kautta 2

-ΔΔCt menetelmällä.

Adhesion määrityksessä

96-kuoppaisilla levyillä päällystettiin 150 ul /kuoppa 0,01% kollageenia I yön yli 4 ° C: ssa ja sitten blokattiin 1% BSA: ssa 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa ennen kylvö soluja. 5 x 10

4 solut suspendoitiin uudelleen 100 ul: aan viljelyalustaa ja siirrostettiin jokaiseen kuoppaan. Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 tunnin ajan. Jokainen kuoppa pestiin sen jälkeen PBS: llä ja sen jälkeen 1% kristalliviolettia käytettiin värjäämään soluja 20 minuuttia. Levy pestiin 3 kertaa ja sitten jätettiin yöksi kuivua huoneen tempeture. Kristalliviolettia värjäys liuotettiin sitten 10% etikkahappoa, ja konsentraatio määritettiin mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 570 nm käyttäen spektrofotometristä mikrolevylukijaa.

Tilastollinen analyysi

Tilastollinen analyysi suoritettiin SPSS versio 18.1 Windows (SPSS, Dublin, Irlanti). Tiedot annetaan keskiarvoina ± SD. Tilastollinen merkitsevyys arvioitiin Studentin t-testiä vertailuja ryhmien ja varianssianalyysi (ANOVA). Densitometria Western blot suoritettiin käyttäen ohjelmaa ImageJ (maasta https://rsb.info.nih.gov/ij/download.html). Kuvaajat rakennettiin Microsoft Excel 2010. Kaikki kuvaajan arvot edustavat keskiarvoja +/- keskihajonta. P-arvo 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

LPS-indusoitua TLR-4 signalointi lisää solunsisäisiä ROS tasoilla koolonkarsinoomasoluissa

SW480, SW620 ja CT -26-solut ilmentävät TLR-4 ja näin ollen valittiin tutkia vaikutusta LPS-indusoitua ROS [16]. Määritettynä FACScan-analyysi, ohimenevää solunsisäisen ROS tasoilla nähdään vasteena LPS: lle hoidon jälkeen 40 minuuttia kaikissa solulinjoissa (kuvio 1 (a)). Endogeenisten tasojen ROS ovat lähes verrokkitasojen 60 minuuttia. Tämä data kvantitoitiin käyttäen tietokoneohjelmaa CellQuest mitata geometriset keskiarvot käyrien (kuvio 1 (b)). SW480-solut jatkuvasti tuottaa korkeampaa solunsisäisten ROS verrattuna SW620 ja CT-26-soluissa. Tältä pohjalta SW480-solut ovat pääpaino myöhemmissä kokeissa.

(a) LPS aiheuttama ohimenevää, merkittävää nousua ROS toimintaa SW480, SW620, Ct-26 paksunsuolen syöpäsolujen. SW480, SW620 ja CT-26-soluja käsiteltiin LPS: llä (1 ug /ml) kaksikymmentä, neljäkymmentä ja kuusikymmentä minuuttia. DCF fluoresenssi mitattiin käyttämällä FACScan-virtaussytometrillä ja CellQuest ohjelmistoja. Nämä tulokset on koottu edellä histogrammit. Y-akseli edustaa solujen määrä ja x-akseli mittaa fluoresenssia tasolla. Siirtyminen oikealle pitkin x-akseli edustaa korkeampaa DCF fluoresenssin ja siten ROS. Kaikki histogrammit esittävät (yhtenäinen musta viiva), jonka väri linjan kasvua in DCF fluoresenssin. Vaikutus LPS on ROS toimintaa SW480, SW620 ja CT-26 paksunsuolen syöpäsolujen kvantifioitiin käyttäen CellQuest- mitata geometriset keskiarvot käyrien ja verrattiin käsittelemättömiin kontrolleihin testattu samana päivänä, ja verrattiin pylväsdiagrammi. (B) LPS indusoi annoksesta riippuvaisen ROS murtua 40 minuuttia. Virtaussytometria histogrammi osoittaa annoksesta riippuvainen muutos ROS toimintaa. (Solid musta viiva = käsittelemätön, vihreä = 0,1 ug /ml, punainen = 1 ug /ml, sininen = 10 ug /ml. Annoksesta riippuvat vaikutus määrällisesti ja verrattiin pylväsdiagrammin. * P 0,05. Nämä tiedot ovat edustavia 3 itsenäisen kokeen.

vieressä pyrittiin tutkimaan, jos tämä LPS-indusoidun endogeenisen ROS oli herkkä vaihteluille annoksen LPS. Olemme osoittavat, että annoksen LPS kasvaa, ROS vaste lisääntyy (kuvio (1 b)). Nämä tulokset osoittavat, että SW480-solut tuottavat endogeenistä ROS vastauksena TLR-4 signaloinnin annoksesta riippuvalla tavalla paksusuolen syöpäsoluissa.

LPS-indusoidun ROS: n syntyminen on SW480-soluissa on kumotaan jonka Nox estäjä

Koska TLR-4 signalointi indusoi merkittävää kasvua endogeenisten ROS tasoilla, seuraavan kerran tarkoituksena oli vahvistaa solunsisäisen lähde LPS-indusoidun ROS. LPS-indusoidun ROS aktiivisuuden tiedetään ottamaan TLR-4 välitteistä vuorovaikutus Nox4 alkion munuaissoluissa [17]. kuitenkin solunsisäisen lähde LPS-indusoitua ROS koolonkarsinoomasoluissa ei juuri tunneta. Muita uskottava lähteitä endogeenisen ROS sukupolvi syrjään Nox entsyymejä ovat mitokondrioita ja COX-entsyymejä. Tässä mielessä käytimme suunnattu inhibiittorit estämiseksi ROS sukupolvi SW480-soluissa kaikista näistä lähteistä kuten mitokondrio-estäjä (rotenonin), COX-estäjä (diklofenaakki) ja Nox estäjää (DPI). Esikäsittely rotenone liittyi hieman enemmän ROS tasoilla sopusoinnussa viimeaikaisten raporttien että rotenone voi aktivoida Nox toimintaa [18]. Diklofenaakki ei aiheuta merkittävää laskua LPS-indusoidun solunsisäisen ROS tasoilla (kuvio 2 (a) ja (b)). Mielenkiintoista, esikäsittely DPI aiheuttaa täydellisen kumoamisen LPS-indusoidun ROS aktiivisuutta 40 minuuttia (kuvio 2 (c)). Yhdessä nämä tulokset osoittavat, että NOx-entsyymit ovat todennäköisesti solunsisäisen lähde ROS seuraavista TLR4 signalointia paksusuolen syöpäsoluissa.

(a) heikentyi merkittävästi fluoresenssi havaittiin käsitellyt näytteet DPI ( 2 uM). DCF fluoresenssi mitattiin käyttämällä FACScan-virtaussytometrillä ja CellQuest ohjelmistoja. Kiinteä musta viiva (kontrolli). Punainen viiva (LPS käsitelty). Vihreä viiva (LPS + DPI käsitelty). (B, c) rotenoni ja diklofenaakin ole estävän LPS (1 ug /ml) indusoi ROS aktiivisuus 40 minuuttia. * P 0,05. Nämä tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta.

LPS hoitoon SW480-solujen kohottavat Nox1 ja Nox2 ilmaisun

Kuten DPI johti täydelliseen kumoamisen LPS-indusoidun ROS aktiivisuutta, me halusi tutkia tarkemmin roolia Nox entsyymien LPS-indusoidun ROS sukupolvi SW480-soluissa. Western blotting käytettiin tunnistamaan Nox-entsyymien ilmentymää. Nox1 sekä Nox2 havaittiin ilmentyvän (kuvio 3 (a), (b)). Mielenkiintoista on, että taso Nox1 ja Nox2 ilmentyminen lisääntyy vasteena LPS hoitoon. Nox1 proteiinin ilmentyminen lisääntyy huomattavasti suurempi kuin käsittelemättömien että ilmentymisen tason osalta 40 minuuttia (kuvio 3 (a)). Samanlainen nousu havaitaan ekspressiokuviota Nox2 (kuvio 3 (b)). Korkeus Nox1 ja Nox2 proteiinin ilmentymistä osuu merkittävä nousu LPS aiheuttama-ROS 40 minuuttia nähty virtaussytometrialla.

(a) Käyttäen Western blotting osoitamme, että Nox1 ilmentymistä SW480-soluissa lisääntyy vastauksena ja LPS: ää (1 ug /ml). (B) Western-blottaus osoittaa myös, että LPS lisääntyneen ilmentymisen Nox2 40 minuuttia. (C) p22phox on ilmennetään ja ilmaisun kasvaa aikaisintaan Nox1 ja Nox2. (D) p47phox on ilmennetään, mutta ilme on vakaana ajankohtina. (E) Kvantitatiivinen PCR-analyysi Nox1 ja Nox2 mRNA: n SW480-soluissa, joita käsiteltiin LPS: llä (1 ug /ml) yhden tunnin aikana. Data on edustettuna kertamuutosta suhteessa kontrolliin käsittelemättömiin soluihin tuntia määritettynä 2-ΔΔCt menetelmällä. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona ± SD, ja ne edustavat kolmea riippumatonta koetta. * P 0,05. Nämä tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta.

Nox entsyymi aktivointi on riippuvainen kokoonpano yksittäisten alayksiköitä. Siksi tarkasteltiin myös vaikutusta LPS hoidon proteiinin ilmentymistä p22phox ja p47phox (kuvio 3 (c, d)). Ei ollut mitään muutosta p47phox ilmaisun, mutta lisääntyi vuonna p22phox ilmennetty kaksikymmentä minuuttia ja pysyi jatketaan 60 minuuttia.

tutki tarkemmin kasvu Nox1 ja Nox2 proteiinin ilmentymistä vasteena LPS jälkikäsittely RT-PCR määrällisesti Nox1 ja Nox2 mRNA-tasot vasteena LPS: lle (kuvio 3 (e)). Dramaattinen 6 kertainen lisäys Nox1 mRNA-tasojen ja 5-kertainen nousu Nox2 mRNA-tasot verrattuna käsittelemättömiin kontrolleihin tapahtuu 20 minuutin kuluttua LPS hoidon. Tämä nousu mRNA-tasojen on ohimenevä ja on merkittävä väheneminen 40 minuuttia ja 60 minuutin kuluttua LPS hoitoa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että LPS aktivoi transkriptiotekijä, todennäköisesti NF-KB: n, joka lisää Nox1 ja Nox2 mRNA vasteena LPS: lle. Tämä sitten mahdollistaa kasvu Nox1 ja Nox2 ekspressiota 40 minuuttia, joka ilmenee, jolla on merkittävä kasvu endogeenisten ROS tasoilla SW480-soluissa. Jotta voidaan tarkistaa tämän teorian, meidän piti saada rooli NF-KB LPS-indusoidussa endogeenisen ROS aktiivisuutta.

LPS aiheuttama ROS on NF-KB riippuvainen

Koska on vakiintunut linkki ilmeinen välillä LPS ja NF-KB: n aktivoitumisen kautta MyD88 reitissä tutkimme jos NF-KB ollut merkitystä LPS-indusoitua ROS aktiivisuutta. I-kappa-B-kinaasin (IKK) on entsyymi, joka on tarpeen aktivoida NF-KB: n. IKK-inhibiittoria käytettiin inhiboimaan NF-KB: n aktiivisuus (kuvio 4 (a)). Esikäsittely kanssa IKK-estäjän johti täydelliseen kumoamisen LPS-indusoidun ROS aktiivisuutta 40 minuuttia. IKB-α on estävä alayksikkö NF-KB. Fosforylaatio IKB-α on välttämätön NF-KB: n aktivaation. Tältä pohjalta me katsoimme pIKB-α ilmentymistä vasteena LPS hoitoon. Mielenkiintoista on, että taso pIKB-α on merkittävästi kohonnut 20 minuutin kuluessa tasavertaisesti LPS-käsittelyn (kuvio 4 (b)). On todennäköistä, että NF-KB: n aktivaation 20 minuutin kuluttua LPS-hoidon avulla mRNA: n transkription tarpeen kasvu Nox1 ja Nox2 ilmentymisen nähtiin 40 minuuttia.

(a) kvantifiointi DCF fluoresenssi käyttäen CellQuest-ohjelmaa osoittaa vähentää merkittävästi LPS-indusoidun 40 minuutin ROS aktiivisuus, kun läsnä oli IKK-inhibiittoria (40 ug /ml) sen jälkeen, tasavertaisesti LPS-käsittelyn (1 ug /ml). (B) p-IKB kasvoi ilmentymisessä 20 minuutin kuluttua LPS hoitoa. * P 0,05. Nämä tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta. (C) LPS (1 ug /ml) indusoi Nox1 ilmaus kasvoi 40 minuutin kuluttua LPS hoidon kuitenkin esikäsittelyn kanssa IKK estäjän 1 tunti vähensi ilmentymisen taso käsittelemättömiin tasolle. (D) LPS-indusoitua Nox2 ilmaisu 40 minuuttia on myös vähentää IKK estäjä. * P 0,05. Nämä tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta.

Jotta voidaan osoittaa, että NF-KB: n aktivaatio vaadittiin lisäämään Nox1 ja Nox2 ilmaisun Seuraavat LPS hoitoa, NF-KB estäjä käytettiin taas. LPS-indusoidun Nox1 proteiinin ekspressiota 40 minuuttia vähensi IKK-inhibiittori (kuvio 4 (c)). LPS-indusoidun Nox2 proteiinin ilmentyminen väheni myös merkittävästi 40 minuuttia, kun läsnä on IKK-inhibiittori (kuvio 4 (d)). Näin ollen vaikuttaa siltä, ​​että LPS-indusoitu ROS: n syntyminen on riippuvainen NF-KB: n aktivaatio, joka johtaa siihen, että kasvu Nox1 ja Nox2 ilmaisun SW480.

LPS-indusoidun DCF fluoresenssi co-paikantuu solulimakalvostoon in SW480-soluissa

Viime antioksidantti hoidot ovat tehokkaampia johtuen suuremman hyötyosuuden ja kyky kohdistaa tiettyihin ROS tuottaa soluelimiin kuten mitokondrioita. Koska ei ollut laskua ROS tasoilla käytön rotenonin, me kyseenalaisti subsellulaarisessa joka oli vastuussa ROS sukupolvi vastauksena LPS. Ensin yhteistyö värjätään SW480 solujen DCF ja ER tracker väriaine ja tutkittiin sitten fluoresenssin avulla multiphoton mikroskoopilla. DCF näyttää selvä peri-tumavärjäystä kuvio SW480-soluissa vasteena LPS hoitoon (kuva 5a). Tämä malli on hyvin samanlainen kuin mitä me tarkkailla ER tracker väriaine ja yhteistyötä paikantuu DCF. Tämä viittaa siihen, että kasvu ROS seuraavasti LPS hoidon syntyy ER. Kun SW480-soluja käsiteltiin DPI, tämä vaimentaa DCF fluoresenssi ER, mikä antaa lisänäyttöä, että LPS-indusoidun ROS aktiivisuus liittyy Nox entsyymin ilmentymistä. Nämä kokeet osoittavat, että ROS syntyy vastauksena LPS paikallistaa ER ja yhdessä viimeaikaisten todisteita, jotka osoittavat, että TLR-4 /MD2 kompleksisignaalia läpi ER, osoittavat, että ER: lla on keskeinen rooli TLR-4 signalointi.

Soluja viljeltiin 48 tuntia lasin pohjalla ruokia. (A) Soluja käsiteltiin DCF ja ER Tracker väriaine 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa LPS: ää (1 ug /ml) lisättiin 30 minuuttia ennen kuvantamisen kanssa multiphoton laserkeilauksella mikroskoopilla. (B) Solut värjättiin mitotracker syvän punainen (1 uM) ja (10 uM) MitoPY, ja käsiteltiin Menadioni (8 uM) tai LPS: ää (1 ug /ml) 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Mittakaavapalkki edustaa 20 um.

halusimme seuraavaksi tutkia mitokondriot kuin solunsisäinen lähde LPS-indusoitua ROS. Aikaisempi tutkimus Dickenson et al osoittivat, että peroksipitoisten keltainen (MitoPY), fluoresoiva koetin, voidaan tehokkaasti käyttää kuvan H

2O

2 sisällä mitokondriot elävien solujen [19]. Täällä yhteistyössä värjätään MitoPY kanssa mitotracker syvän punainen ja sitten kohdellaan SW480 solut Menadioni 8 uM 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa (kuvio 5b) [20]. Olemme vahvisti, että MitoPY on suunnattu mitokondrioita ja havaitsee mitokondrion ROS, kun soluja käsiteltiin Menadioni. Sitten käsitelty SW480 solujen LPS ja havaittiin vähäisiä määriä ROS syntyy mitokondrioissa verrattuna positiiviseen kontrolliin, jossa solut käsiteltiin Menadioni.

TLR-4 indusoi ROS säädellä metastaattinen singaalin SW480-soluissa

asetus solun signalointireittien on yksi joukko solunsisäisten vaikutusten johdettu TLR-4 signalointi. Yksittäiset eloonjäämisreittejä lukien PI3K /Akt-reitillä, joka tunnetaan helpottaa kasvaimen etäpesäke, voidaan aktivoida TLR-4-signalointia. Inhiboivaa proteiinit tämän reitin, kuten PTEN, tiedetään olevan redox herkkä. Todettuaan, että SW480-solut tuottavat endogeenistä ROS päässä ER NF-kB riippuvaisella tavalla vastauksena TLR-4 signalointi, me siis selvitettävä, jos LPS aiheuttama endogeeniset ROS voisi olla rooli sääntelyn näiden redox herkkien reittejä. Näemme nousu Pakt 40 minuutin ajan LPS hoito, joka vastaa lisäystä LPS-indusoidun ROS aktiivisuutta myös nähty 40 minuuttia (kuvio 6 (a)). Pakt ilmaisu 40 minuuttia estyy DPI (kuvio 6 (b)). Nämä tulokset osoittavat, kuinka TLR-4 indusoi ROS aktiivisuutta voidaan säädellä metastaattinen signalointireitteihin kuten PI3K /Akt.

(a) LPS (1 ug /ml) käsittely aiheuttaa ohimenevää Akt fosforylaation, maksimaalinen 30- 40 minuuttia. (B) Pakt ilmentyminen lisääntyy vasteena LPS hoitoa 40 minuuttia, ja estää täysin DPI (2 uM). * P 0,05. Nämä tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta.

LPS aiheuttama tartunta helpottuu joka Nox riippuvaisesti

Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että LPS voi lisätä syöpäsolujen sitoutumista, olennainen askel onnistunut etäpesäke [21]. LPS helpottaa tätä kautta ylössäätöä proteiinien kuten β1-integriini [22]. Tärkeimmät signalointireitin vastuussa on PI3K /Akt-reitin, jota olemme osoitettu säännellään LPS aktivoituminen Nox-johdettu ROS. Niinpä halusimme luoda jos Nox signalointi helpotetun LPS paksusuolisyöpäsolulinjassa noudattaminen vastauksena LPS. Merkittävä lisäys SW480 solussa noudattamista Kollageeni I nähdään 1 tunti (kuvio 7 (a, b)). Tämä lisäys sitoutuminen estyy DPI ja PI3K estäjä, LY294002. Tämä viittaa siihen, että mekanismi vastuussa on riippuvainen Nox signalointia. On osoittanut, että LPS indusoi ROS kautta Nox mekanismi, halusimme tutkia tarkemmin johon jäsen Nox perhe oli vastuussa tästä kasvusta ROS aktiivisuuden ja kasvainsolujen tarttumista. Tehokkuutta siRNA ainetta testattiin käyttäen virtaussytometrialla. Toinen siRNA edellyttäen paras vähentäminen ja todellakin aiheutti lähes täydellisen kumoamisen LPS-indusoitua ROS (kuvio 7 (c)). Näin ollen vaikuttaa siltä Nox1 osallistuu useimpien ROS ja ehkä on enemmän toiminnallista roolia kuin Nox2 vasteena LPS hoitoon. Western-blottaus käytettiin tehokkuuden varmistamiseksi kukin siRNA transfektion (kuvio 7 (c)).

(a, b) LPS-hoito johti merkittävään kasvuun SW480 solun tarttumiseen kollageeniin I 1 tunnin kuluttua. Tämä estyi käyttämällä tunnustettu Nox-inhibiittori, DPI (2 uM), ja PI3K-inhibiittori, LY294002 (5 uM). (C) Nox1 siRNA kumoaa LPS aiheuttamaa ROS ja Nox1 knockdown vahvistetaan Western blotting -tekniikalla. (D) kasvu SW480 paksusuolen syövän soluadheesion inhiboitui täysin Nox1 siRNA. * P 0,05. Nämä tiedot edustavat 3 itsenäistä koetta.

Nox1 siRNA käsiteltyjä soluja käytettiin sitten tutkia roolia Nox1 paksusuolen syövän solujen sitoutumiseen. Mielenkiintoista on, että merkittävä väheneminen kasvainsolun kiinnittyminen nähtiin Nox1 siRNA soluissa tasavertaisesti LPS-käsittelyn, mikä osoittaa, että Nox1 johdettu ROS ovat välttämättömiä voimistaa paksusuolen syövän solujen kiinnittyminen vasteena LPS: lle (kuvio 7 (d)).

keskustelu

yhteys systeeminen tulehdus ja edistäminen tuumorimetastaasin on vakiintunut [23]. Tässä tutkimuksessa osoitamme miten Nox-johdettu ROS tarjoavat ”puuttuva linkki” ymmärtämään kuinka tulehdus aktivoi signaalitransduktioreaktioteihin vastuussa kasvaimen uusiutumisen ja etäpesäke. Tämä tutkimus osoittaa, että LPS säätelee PI3K /Akt signalointi kautta Nox-johdettu ROS koolonkarsinoomasoluissa. Näin ollen tämä LPS aktivoitu redox mekanismi tehtävänä on edistää kasvainten noudattamista, potensoiva vaaraa onnistuneen etäpesäke.

Kirurginen tulehdus voimistaa kasvainsolujen etäpesäkkeiden kautta PI3K /Akt signalointi. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet merkittävää nousua keuhkojen etäpesäkkeiden leikkauksen jälkeen ja tämä vaikutus estyy PI3K estäjän [24]. Vastaavasti, Hsu et ai äskettäin osoitettu, että tuumorisolujen adheesio riippuu PI3K signalointia vasteena LPS: lle [11]. Todellakin, LPS: n on osoitettu suoraan aktivoida PI3K /Akt signalointi, mutta meidän tulokset osoittavat, Nox-johdettu ROS on tärkeä rooli hapetus sääntelyn tämän reitin [25] – [26]. Mielenkiintoista, aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että NOx-johdetut ROS aktivoidaan alavirtaan PI3K /Akt signalointi [27].