Krooninen sairaus

tiivistelmä

Isotiosyanaatit kasveista tilauksen

Ristikukkaismaiset

pidetään lupaavana syövän kemoterapia-fytokemikaalit . Niiden selektiivinen sytotoksisuus maksasyövän on tuskin tutkittu. Siksi esillä olevassa tutkimuksessa olemme systemaattisesti tutkittu kemoterapeuttisen teho 4 metyylitiobutyyli isotiosyanaatti (MTBITC). Valikoiva myrkyllisyys tutkittiin vertaamalla sen vaikutus maksan syöpäsoluja ja niiden solunsalpaajaresistentti -alapopulaatioiksi normaaliin maksasoluissa ja maksakudosta viipaleiksi. Lisäksi, ensimmäisen arvioinnin,

in vivo

siedettävyyttä MTBITC tutkittiin hiirillä. Kasvu pidätyksen G2 /M ja apoptoosin induktio oli ilmeistä kaikissa

in vitro

syövän mallien hoidettu MTBITC, kuten väestön syöpään aloittamista ominaisuuksia. Tämä todettiin riippumaton TP53; mutta solukuolemaa viivästyi p53 vaarantunut soluissa verrattuna wt-p53-soluja, jotka oli johtunee differentiaalisen BH3 vain geenisäätelyn i. e. Noxa ja sen antagonisti A1. Normaalissa maksasoluissa, ei apoptoosin tai nekroosin voitiin havaita toistuvasti annon jopa 50 uM MTBITC. Hiirillä, oraalisesti MTBITC oli hyvin siedetty yli 18 päivää hoidon jopa 50 mg /kg /päivä, suurimmalla testatulla annoksella. Lopuksi voisimme osoittaa tässä, että tappaminen vaikutus MTBITC on selvä selektiivisyys syöpäsoluissa yli normaali maksan soluihin ja sen sytotoksisuus jopa hakee solunsalpaajaresistentti syövän aloittamista soluja. Tutkimuksemme voitaisiin ymmärtää paremmin kemoterapeuttisen ominaisuuksien isotiosyanaattien ihmisen maksasta peräisin syöpäsoluja.

Citation: Lamy E, Hertrampf A, Herz C, Schüler J, Erlacher M, BERTELE D, et ai . (2013) Prekliiniset arviointi 4 metyylitiobutyyli Isotiosyanaatti maksaan ja syövän kantasolut eri p53 tila. PLoS ONE 8 (8): e70846. doi: 10,1371 /journal.pone.0070846

Editor: Manlio Vinciguerra, University College London, Iso-Britannia

vastaanotettu: 7. 2013 Hyväksytty: 23 Kesäkuu 2013; Julkaistu: 02 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Lamy et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: EL on rahoittama akateemisen avustusta Euroopan sosiaalirahastosta Fond ja tiede, tutkimus ja Arts Baden-Württemberg, Saksa. A. B. tukivat tätä tutkimuksen avustusta Alexander von Humboldt Foundation Fellowship kokeneille tutkijoille. Artikkelissa käsittelymaksu rahoitti Saksan Research Foundation (DFG) ja Albert Ludwig yliopiston Freiburg että rahoitus ohjelmassa Open Access julkaiseminen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Torsten Giesemann ja Julia Schueler ovat toimihenkilöitä Oncotest GmbH. Tämä työllisyys ei muuta niiden noudattamista kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

maksasolusyövän (HCC) on yleisin syöpä ruoansulatuskanavan Kaakkois-Aasiassa ja Saharan eteläpuolisessa Afrikassa; lisääntynyttä esiintymistä ollaan myös huomannut teollistuneessa maailmassa [1]. Ennuste potilaille, joilla on suuri tai multifokaali HCC on huono, ja 5 vuoden pysyvyys on alle 5% [2]. Tämä johtuu pääasiassa ei-vastata kemoterapiaa ja sädehoitoa hoidossa HCC ja heikentynyt TP53 toiminta on todettu tärkeä tekijä tämän [3]. TP53 on avainasemassa kasvun pysähtymisen ja apoptoosin [4] ja yksi yleisimmin mutatoitunut tuumorisuppressorigeeneille HCC [5]. Lisäksi käsite, että erittäin hoidolle resistentin syövän kantasoluja (kasvaimen aloittamisesta solut, TIC) on keskeinen rooli patogeneesissä HCC on viime aikoina kuvattu paljon huomiota. TIC pystyvät itseuudistuvien, erottaa, ja ylläpitää kasvaimen kasvua ja heterogeenisuus. Yhteinen syöpähoitoihin kuten säteily ja kemoterapia eivät hävittää enemmistön erittäin kestävä TIC [6]. Niinpä etsivät vaihtoehtoista hoitoa strategioiden tehokkaasti vaikuttavat näihin alapopulaatioiden, jolloin tuotteita kasvain vastus eivätkä vedota ehjä p53 syövän solujen tappaminen on erittäin tärkeää [7].

Isotiosyanaatit (ITC) kasveista jotta

Ristikukkaismaiset

hetkellä erittäin kiinnostavia, koska niiden potentiaalisia käyttömahdollisuuksia ehkäisyyn ja syövän hoitoon. Lukuisat tutkimukset osoittavat, että luonnossa esiintyviä ITC ja niiden synteettiset analogit hidastamaan tai estämään kasvainsolujen kasvua, sekä

in vitro

ja

in vivo

[8], [9]. Vielä tärkeämpää on, osoitettiin hiljattain, että ITC voi tukahduttaa aldehydi (ALDH) -positiivinen TIC rintojen [10] ja eturauhasen [11]. Kuitenkin tehoa ITC vastaan ​​TIC muissa elimissä, kuten maksassa, on vielä määritettävä. Yleensä tiedot sytotoksisen ja sytostaatit mahdollisuudet ITC kasvainsoluihin maksan on vähäistä [12] – [14]. Se on edellytys, että potentiaaliset terapeuttiset aineet on alhainen myrkyllisyys normaaleille kasvain ympäröivään kudokseen, mutta vain hyvin vähän tietoa olemassa vaikutuksista ITC terveitä kudoksia. Tässä kuvaamme antineoplastinen aktiivisuus 4-metyylitiobutyyli isotiosyanaattia (MTBITC, erucin) ja selektiivisen kasvainsolujen tappamista ja TIC kautta p53-riippumaton mekanismi. MTBITC saadaan entsymaattisella hydrolyysillä glucoerucin, eristetty raketti kasvilajeista (

Eruca sativa Mill

. Ja

Diplotaxis tenuifolia L

.). Lisäksi se on johdettu

in vivo

metabolinen vähentäminen isotiosyanaatin sulforaphane, mikä on ominaista parsakaali (

Brassica oleracea

L.). Meidän tutkimukset, käytimme joukko

in vitro

malleissa koostuu HCC solulinjojen, solunsalpaajaresistentti TIC, ensisijainen normaali maksasoluihin tarkkuus leikattu maksakudosta viipaleita (PCLS) potilaista peräisin tutkia syöpään selektiivinen sytotoksisuus MTBITC . Meidän havainnot sitten esitetty todennettua mekanistinen tutkimukset ero TP53 reitin aktivointi päälle MTBITC hoitoa. Perustuu

in vitro

tulokset vihdoin tutkineet siedettävyyttä MTBITC hiirimallissa.

Materiaalit ja menetelmät

Eettinen linjaus

Normal hepatosyyttien olivat saatiin potilailta jälkeen kirjallinen suostumus päässä Dept. of Surgery, Freiburg University Medical Center, Saksa. Tämä osa on hyväksytty eettinen komitea yliopiston Freiburg (Ethik-Kommission der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg /Ethic provision Albert-Ludwigs-Universität Freiburg). Kudosten viipalointi kokeita ihmisen maksan ja maksan kasvainten resectates saatiin potilailta jälkeen kirjallinen suostumus päässä Dept. of General, Sisäelinten Elinsiirtokirurgiaa, University Hospital, Tübingen, Saksa. Tutkimuksen protokolla hyväksyi paikallinen eettinen komitea (Ethik-Kommission der Medizinischen Fakultät der Eberhard-Karls-Universität und am Universitätsklinikum Tübingenin /Ethic provision lääketieteellisen tiedekunnan Eberhard-Karls-yliopistossa ja yliopistollisessa sairaalassa sairaala Tübingenin). Eläinkokeet suoritettiin ohjeiden mukaan Saksan Animal Welfare Act (Tierschutzgesetz) ja alle luvalla numerot Regierungspräsidium Freiburg, Saksa G-10/05 ja 35-9185,64 /1. Eläinten terveys tutkittiin ennen satunnaistamista varmistaa, että vain eläimiä ilman mitään sairauden oireita valittiin tulla testausmenetelmiä. Kokeiden aikana eläimet tarkkailtiin kahdesti päivässä koskien yleiskunto, ruoan ja veden saanti.

Kemikaalit

DMSO, verapamiili-hydrokloridi, deksametasoni, erysoline, etanoli, propidiumjodidi (PI) ja neutraali red (ET) hankittiin Sigma Aldrich (Steinheim, Saksa). Dulbeccos Minimal Essential Medium (DMEM), vasikan sikiön seerumia (FCS), trypsiini 10 x (25 mg /ml), trypsiini-EDTA: ta 10 x (5 mg /ml), Hanks Balanced Salt (HBSS, ilman Ca ja Mg) ja fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS, ilman Ca ja Mg) olivat PAA Laboratories GmbH (Cölbe, Saksa). Penisilliini-streptomysiini (P /S) liuosta ja Hoechst 33342-liuosta (10 mg /ml), RPMI 1640, insuliini-transferriini-selen (ITS), kollagenaasi tyyppi IV, ja 5,5 ’, 6,6’-tetrakloori-1 1 ’, 3,3’-tetraethylbenzimidazolcarbocyanine jodidia (JC-1) oli Life Technologies Invitrogen (Darmstadt, Saksa), WST-1-reagenssia Roche (Mannheim, Saksa). Accumax ostettiin eBioscience (Frankfurt, Saksa), kollageeni G alkaen Schubert Weiss (Munich, Saksa), kollagenaasin CLS II alkaen Biochrom (Berliini, Saksa) ja EDTA peräisin Serva Elektroforeesilaitteet (Heidelberg, Saksa). CaCl

2, glukoosi, EGTA, etikkahappoa (puhtaus 100%), Roti®-fenoli /kloroformi /Isoamylalkohol ja kloroformi /Isoamylalkohol hankittiin Carl Roth (Karlsruhe, Saksa), Kamptotekiini (CPT) Tocris (Eching, Saksa), kaspaasi 3/7 GLO reagenssia Promegalta (Mannheim, Saksa) ja Triton X-100 Merck (Mannheim, Saksa). Rompun® 2%, ja xylazinchloride ostettiin Bayer (Leverkusen, Saksa), ketanest 10% ja ketaminiumchloride Essex Tierarznei (München, Saksa). 4-metyylitiobutyyli isotiosyanaattia (MTBITC, erucin) syntetisoitiin Inst. Orgaanisen kemian, University of Giessen, Saksa aiemmin kuvatulla [15]. Valinomysiiniä hankittiin Fluka, (Buchs, Sveitsi). ITC liuotettiin steriiliin DMSO.

HCC Cell Lines, eristäminen ja viljely HCC Eksplan- ja maksasolut

HCC solulinjoissa.

HepG2 (wt-53) ja Hep3B ( null-p53) solulinjat saatiin saksalaiseen mikro-organismien ja Cell Cultures (DSMZ), Braunschweig, Saksa. Huh-7-soluissa (mut-p53) alun perin perustettu Nakabayashi et al. [16] oli ystävällisesti toimittanut H. Blum (University Medical Center Freiburg, Saksa). Soluja viljeltiin vähän glukoosia DMEM 15% (HepG2) tai 10% (Huh7, Hep3B) FCS ja 1% P /S: ssa 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa, kunnes 70% konfluenttisuuden ja myöhemmin talteen trypsiinillä. Solulinja tarkastus tehtiin mikroskoopilla tarkistamalla solujen morfologia ja suorittamalla kasvukäyrä analyysi säännöllisesti. Vain solut jakolukuun neljästä kymmeneen käytettiin. Soluviljelmää lisäksi testattu negatiivisiksi mykoplasmakontaminaation.

HCC eksplanttien.

Ihmisen maksan kasvain engraftments (LIXF, maksasyöpä ksenografti Freiburg), alun perin perustettu Oncotest GmbH, Saksa, kasvatettiin ihon alle nude-hiirissä, kuten on kuvattu muualla [17]. Eksplantaatit lähetettiin laboratorioomme heti leikkauksen jälkeen, välttäen jäähdytys- tai muulla tavoin. Menettely valmistamiseksi kulttuureissa oli mukaisesti Patrawala

et al.

[18].

Ensisijainen ihmisen hepatosyyttien.

Normal maksasolut eristettiin 2 tunnin sisällä. Arviointi ei-tuumori- maksaparenkyymi suoritettiin vanhempi patologi perehtynyttä maksan sairaus. Hepatosyytit eristettiin käyttäen kaksivaiheista kollagenaasiperfuusiolla tekniikan mukaisesti modifioidun protokollan Guguen-Guillouzo

et al.

[19] ja Strom

et al.

[20]. Sitten solut suspendoitiin lopuksi uudelleen RPMI-1640, johon oli lisätty 15% FCS: ää, 2 mM L-glutamiinia 1% P /S, 1% sen, 100 nM deksametasonia, ja viljeltiin 5% CO

2-ilmakehässä 37 ° C: ssa 20 h.

Hiiren hepatosyyteissä.

Hiiren maksasolut vasta eristetty samanlaisella perfuusio kuvattua tekniikkaa ihmisen hepatosyyttien ja viljeltiin 5% CO

2 ilmakehässä 37 ° C: ssa 10 h.

Precision-cut Tissue Leikkelekoneet (PCLS) B

Leikkelekoneet alkoi tunnin kuluessa resektio vibratomilla VT1200S (Leica, Wetzlar, Saksa) aiemmin kuvatulla [21] viipaletta inkuboitiin hapetetussa Williamin E alustassa, joka sisälsi 25 mM glukoosia ja 50 ug /ml gentamysiiniä (Lonza Bioscience, Verviers, Belgia) käytettäessä happipitoista ilmakehässä (80% happea, 5% CO

2).

määritys Drug vaikutus syöpäsoluissa

kokeissa, syöpäsolut ympättiin täydennettynä elatusaineeseen ja inkuboitiin 48 tuntia 37 ° C: ssa. Tämän jälkeen subkonfluenteista solut altistettiin ITC 24 h 96 h. Altistumista 24 h, viljelyalusta, joka sisälsi ITC korvattiin 24 tunnin välein.

Detection of Sytotoksisuus

Neutral red säilyttäminen määrityksessä.

neutraalipuna säilyttäminen määritys määrittää kertyminen neutraalin punaisen väriaineen lysosomeihin elinkykyisten, vahingoittumaton soluja, jota käytettiin toisen parametrin havaitsemista sytostaasi /sytotoksisuutta. Seuraava yhdiste altistuminen, soluja inkuboitiin 3 h NR väriainetta (50 ug /ml) liuotettuna vastaavaan elatusaineeseen. Sitten solut pestiin varovasti esilämmitetyllä PBS: llä ja 150 ui kiinnittäminen väliaineessa (EtOH: AcCOOH: aan deionisoitua vettä, 50%: 1%: 49%) lisättiin, mitä seurasi varovasti ravistellen 20 min. Absorbanssi rekisteröitiin 540 nm käyttäen Tecan mikrolevylukijaa.

Detection Apoptoosin ja kasvun pysähtymisen

kaspaasi 3/7 pilkkominen määrityksessä.

Apoptoosin solulinjoissa ja ensisijainen solut määritettiin käyttäen Caspase3 /7-Glo määritystä (Promega, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti.

apoptoosi maksakudosta viipaleita määritettiin inkuboimalla 50 uM

n

asetyyli-Asp-Glu-Val-Asp-aminometyylikumariinia (Ac-DEVD-AMC, Biomol, Hampuri, Saksa) määrityspuskurissa (50 mM HEPES, pH 7,4, 1% sakkaroosia, 0,1% CHAPS, 10 mM DTT). Alustan lohkaisu mitattiin kineettisesti mukaan spektrofluorometrialla. Kaspaasi 3/7 aktiivisuus määritettiin kulmakerroin tuloksena lineaarisen taantumat ja ilmaistu mielivaltainen fluoresenssiyksiköinä per minuutti.

Arvio mitokondrion kalvon potentiaali (MMP).

muutosten havaitseminen MMP on yhden solun tasolla, lipofiilinen kationi JC-1 käytettiin, kuten on kuvattu muualla [14].

SubG1 DNA-pitoisuutta ja solusyklin jakautuminen.

havaitsemiseksi solusyklin jakautuminen PI-värjäys DNA jälkeen kiinnitys on käytetty, kuten muualla on kuvattu [14].

havaitseminen Necrosis

propidiumjodidia (PI) oton määritystä.

määritys perustuu määrittämistä koskevat PI värjättyä nekroottisen soluja. Näin ollen, kun yhdistettä altistuksen, PI (2 ug /ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan 96-mikrotiitterilevyjen 5 min RT: ssa jatkuvasti ravistellen. Seuraavaksi levyt sentrifugoitiin 189 g (3 min, RT). Solunsisäinen PI-fluoresenssi mitattiin käyttäen Tecan mikrolevylukijalla Ex: 525 nm /Em595 nm.

LDH: n vapautuminen määritys kudosleikkeitä.

prosenttiosuus laktaattidehydrogenaasin (LDH) vapautumista supernatanttiin kuin korvikkeena kalvon eheys määritettiin käyttäen LDH Mono-P-määritys (Analyticon, Lichtenfels, Saksa) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. LDH: n määrä päästettäisiin supernatantti määritettiin ja normalisoitiin proteiinipitoisuuden yksittäisten viipaleita, joka määritettiin Pierce BCA-määrityksellä (Thermo Scientific, Dreieich, Saksa).

eristäminen ja analyysi Side Population (SP ) solut

SP ja ei-SP solut analysoitiin ja eristetty Huh7 soluista edellä kuvatulla tavalla [22]. Lyhyesti, Huh7-solut trypsinoitiin, laskettiin ja miljoona solua /ml suspendoitiin uudelleen DMEM w /o fenolipunaista, joka sisälsi 2% FCS: ää ja 10 mM HEPES. Solut värjättiin 20 ug /ml Hoechst 33342 yksinään tai yhdessä verapamiilin (50 uM) 37 ° C: ssa 90 min. Sitten solut pestiin kerran jääkylmällä HBSS: llä, joka sisälsi 2% FCS: ää ja 10 mM HEPES. Analyysi ja lajittelu SP ja ei-SP-soluissa suoritettiin käyttäen MoFlo (DakoCytomation). Sen jälkeen solut pestiin HBSS: llä, laskettiin ja ympättiin viljelyastioihin vielä 24 tuntia. Sitten solut altistettiin MTBITC ja sen jälkeen käytetään analyysiä varten.

havaitseminen Aldehydedehydrogenase

Expression entsyymin Aldehydedehydrogenase (ALDH) analysoitiin käyttämällä ALDEFLUOR Kit StemCell Technologies (Grenoble, Ranska) mukaan ja valmistajan ohjeiden mukaisesti. Positiivisena kontrollina, ALDH estäjä DEAB, joka toimitettiin kitin käytettiin.

Cell Migration (scratch) Pitoisuus

tyhjästä määritys suoritettiin kuten muualla on kuvattu [23]. Valomikroskooppinen kuva saadaan kutakin näytettä analysoitiin kvantitatiivisesti käyttämällä computing ohjelmisto Image J (https://rsbweb.nih.gov/ij/index.html). Kunkin kuvan, etäisyydet yhdellä puolella alusta, ja muut mitattiin. Vertaamalla kuvia ajanjakson 0 viimeisen kerran pisteen (72 h) etäisyyden kunkin tyhjästä sulkeminen saatiin ja puoli-aika gab sulkemista laskettu.

Cell Synkronointi mukaan seerumideprivaation ja DMSO

solun synkronointi G0 /G1, väliaine poistettiin HepG2-soluissa ja korvataan elatusainetta ilman FCS: ää 96 tunnin ajan. Tämän ajan jälkeen solut joko altistetaan DMSO: ssa tai MTBITC vielä 24 h elatusaineessa, joka sisälsi eri FCS pitoisuuksia. Sitten solut kerättiin ja analysoitiin niiden DNA sisällön jakeluun.

Toisessa koesarjassa, 2% DMSO: ta, lisättiin elatusaineeseen tarttuvien kasvaa HepG2-soluissa 72 tuntia. Seuraavaksi solut mukana tuoreella viljelyalustalla, joka sisältää joko DMSO: ssa tai MTBITC 24 h, tämän jälkeen kerättiin ja analysoitiin niiden DNA sisällön jakeluun.

In vivo

siedettävyys MTBITC

Crl: NU-Foxn1mice (nude-hiiriin) ostettiin Charles River, Erkrath, Saksa ja saatu microisolators in este olosuhteissa. Käsittely tehtiin päivittäin suun letkuruokinnalla ajoneuvon tai MTBITC keskeytetään ajoneuvojen 18 päivää.

geeniekspressioanalyysiä p53 käyttää Quantitative Real Time PCR

Kokonais-RNA eristettiin RNeasy mini Isolation Kit Qiagen (Hilden, Saksa), jota seuraa puhdistusvaihe käyttäen RNase-free DNase kit Qiagen (Hilden, Saksa). Yhteensä 2 ug RNA: ta kustakin näytteestä käytettiin cDNA-tuotantoon käyttämällä First Strand cDNA Synthesis Kit Fermentas (St. Leon-Rot, Saksa). CDNA-näytteet laimennettiin sitten 1:02-01:05 ja monistettiin LightCycler FastStart DNA Master

PLUS SYBR Green I Kit Roche (Mannheim, Saksa). p53: n cDNA monistettiin käyttäen sense 5′-CCTTCCCAGAAAACCTACCA-3 ’, ja antisense 5′-TCATAG GGCACCACCACACT-3′ oligonukleotidit, jotka tuottavat 371 bp: n fragmentti. Viittaus geeni beeta-mikroglobuliinin cDNA monistettiin käyttämällä sense 5’-AGGCTATCC AGCGTACTCCA-3 ’ja antisense 5′-ACGGCAGGCATACTCATCTT-3’ oligonukleotidit, jotka tuottavat 248 emäsparin fragmentti. Kaikki alukeparia cross introni /eksoni rajat ja siten, PCR tuotteet eivät genomista DNA saastuminen. PCR-olosuhteet olivat: ensin 95 ° C: ssa 10 min, mitä seurasi 40 sykliä 95 ° C: ssa 10 s, 59 ° C: ssa 10 s ja 72 ° C: ssa 30 s. Monistustuotteet määrällisesti ohjelmiston Lightcycler 2,0 Roche, Mannheim, Saksa, valmistamalla standardikäyrä käyttäen tunnettuja laimennoksia standardin cDNA. Normalisoida p53 mRNA ilmaisu näytteen ja näytteen eroja RNA input, RNA laatu, ja käänteistranskriptaasia tehokkuuden viittaus geeni beeta-mikroglobuliinin monistettiin rinnakkain. Kaikki kokeet suoritettiin kolmena rinnakkaisena.

Gene Expression Analysis käyttäen signalointireitin Array

RNA: n eristämistä 10

6 solua näytettä kohti suoritettiin RT

2 qPCR -laadun RNA Isolation Kit (SABioscience, Frederick, Maryland, USA). cDNA syntetisoitiin käyttäen RT

2 PCR Array First Strand Synthesis Kit (SABioscience, Frederick, Maryland, USA). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR ihmisen p53-signalointireitin RT

2 Profiler ™ Array (luettelonro .: PAHS-027, SABioscience, Frederick, Maryland, USA) suoritettiin käyttäen MyiQ Single-Color Real-Time PCR Detection System (Bio-Rad, München, Saksa). Tietojen analysointi web-pohjainen RT

2 Profiler ™ PCR Array Data Analysis käytettiin. Tiedot analysoitiin ”2

-ΔΔCt menetelmä” ohjelmiston avulla valmistajan toimittamat. Kullekin geenille, kertamuutosta laskettiin ero geeniekspression kahden ryhmän välillä. Tulokset ilmaistaan ​​keskiarvona 3 itsenäisen kokeen.

Protein Analysis immunoblottauksella

Proteiinipitoisuus määritettiin, kuten on kuvannut Bradford [24]. Immunoblottausta, 20 ug proteiinia sekoitettiin valmiin SDS sisältävä näyte puskuria, täydennettynä 0,5% β-merkaptoetanolia. Elektroforeesi suoritettiin menetelmän mukaisesti Laemmlin [25]. Geeli siirrettiin sitten nitroselluloosakalvolle säiliön blottauksella. Epäspesifinen sitoutuminen estettiin 5% vähärasvaista maitoa TBS /T, ja inkuboitiin ensisijaisen, ja sen jälkeen piparjuuriperoksidaasiin (HRP) -leimattua sekundäärisen vasta-aineen 1 h tai yön yli. Sen jälkeen kun vasta-aineen inkuboinnin kiinnostavia proteiineja havaittiin kemiluminesenssitekniikalla. Digitaalinen kuva western blot vangitsi CCD-kamera. Koko likiarvoja otettiin vertaamalla värjättyä bändejä kuin proteiinistandardina ladattu elektroforeesin aikana. Prosessi toistettiin rakenteellisen proteiinin β-aktiini.

vaiennettu p53 RNAi

HepG2-solut kerättiin trypsination ja 2,5 × 10

5 solut altistettiin kääntää transfektio Transpass R1 (no .: M2551S) NEB (Frankfurt a. M., Saksa). Transfektiota, 10 ui TransPass R1 sekoitettiin 240 ui DMEM ja inkuboitiin 15 minuuttia huoneenlämpötilassa ennen kuin lisättiin siRNA oligomeerien (p53 ShortCut siRNA Mix, ei .: N2011S, NEB, Frankfurt a. M., Saksa; hallita siRNA kissa. no. sc-37007, Santa Cruz Biotechnologies, Santa Cruz, USA; fluoreseiini konjugoitua ohjaus siRNA, ei .: N2100S, NEB, Frankfurt a. M., Saksa), jonka lopullinen pitoisuus on 25 nM, jota seurasi toinen inkubointivaihe RT 15 min 250 ui transfektion monimutkaisia ​​siirrettiin sitten kuhunkin kuoppaan ja HepG2-soluja, jotka sisälsivät DMEM + 15% FCS w /o antibiootteja jälkeen sitä inkuboitiin monimutkainen 24 h tavanomaisissa soluviljelyolosuhteissa. Sitten solut pestiin kahdesti PBS: llä ja johon oli lisätty tuoretta DMEM, joka sisälsi 15% FCS: ää vielä 24 tunnin ajan ennen altistusta testiaineen 24 h.

RT-MLPA ja qPCR

RT MLPA käytettiin analysoimaan mRNA: n ilmentymisen Bcl-2-perheen jäseniä. RNA: HepG2 ja Hep3B-solut eristettiin, kuten yllä on kuvattu. RT-MLPA (MRC Holland, kit RM002, R011-C1) suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Lyhyesti, spesifiset mRNA: t olivat käänteisesti cDNA: ksi ja sitoo kaksi oligonukleotidia siten liitettiin lämmönkestävää ligaasia. Jokainen anturi synnyttää monistustuotteen ainutlaatuisia pituuden erotetaan kapillaarisen sekvensseri (Genescan-). Analyysi suoritettiin GeneMapper (Applied Biosystems). Summa kaikkien huippu data asetettiin 100% normalisoimaan vaihtelut eri näytteiden, ja yksi huiput laskettiin suhteessa 100%. Analyysi mRNA sääntelyn Bcl-2 ja BMF ei ollut mahdollista teknisistä syistä.

Data Analysis

Tulokset laskettiin käyttäen Graphpad Prism 5.0 ohjelmisto (La Jolla, CA). Mediaani kasvua estävä pitoisuus (IC50) laskettiin normalisoinnin jälkeen vasteen ja logaritminen muutos seuraavalla kaavalla: Y = 100 /(1 + 10

∧ ((LogIC50-X) * HillSlope)). Varianssianalyysi ryhmien välillä suoritettiin yksisuuntainen ANOVA ja merkitys ero valvonnan ja hoitoryhmien analysoitiin Dunnettin monivertailukoetta. Erot p≤0.05 (*) tai p≤0.01 (**) katsottiin tilastollisesti merkitsevä.

Tulokset

sytotoksisuus ITC Liver tuumorisoluissa verrattuna Normaali Hepatosyyttejä

Käytimme NR retention määritystä arvioitaessa MTBITC sytotoksisuus syöpäsolujen verrattuna normaaleihin hepatosyyttien. Tämä määritys on raportoitu niinkin korkea herkkä sytotoksisuus parametri [26]. Keskittymä riippuva elinkelpoisuuden menetys, määritettynä heikentynyt lysosomaalisen NR retentiokyky havaittiin kaikilla testatuilla syöpäsoluissa jälkeen MTBITC hoitoa 24 h (kuvio 1a). Sen sijaan ihmisen maksasoluissa, ei asiaa elinkelpoisuushävikki nähtiin 24-72 tuntia käsitelty 50 uM MTBITC (kuvio 1 b). Hiiren hepatosyyttien, MTBITC laukeaa Joissakin prosesseissa laajentaa neutraalin punaisen akkumulointitehon lysosomien jälkeen 72 h MTBITC hoitoa (kuvio 1 b). Tulosten perusteella johdettu kuluttua 24 h MTBTIC hoitoa, IC 50-arvot laskettiin klo 23.18 uM (HepG2), 20.89 uM (Huh7), 31.97 uM (Hep3B), 13,11 uM (LIXF), 72.09 (ihmisen maksasoluissa) ja 47.81 (hiiren maksasolujen) .

MTBITC hoidon valikoivasti vaimentaa solun eloonjäämistä maksan kasvainsolujen (a) verrattuna maksasoluissa (b). Solujen elinkelpoisuus arvioitiin käyttäen NR säilyttäminen määrityksessä altistuksen jälkeen MTBITC 24-72 tuntia. Tulokset ilmaistiin suhteessa kontrolliin (0,1% DMSO), palkit ovat keskiarvo + SD, (lukumäärä itsenäisen kokeen on annettu alla kuvissa). Positiivinen kontrolli (+), 0,01% Triton X-100. ** ≤p 0,01 verrattuna DMSO.

Kasvu pidätys ja apoptoosin Human HCC Cells and Normal maksasolut /PCLS

arvioimiseksi luonteen elinkelpoisuuden vajaatoimintaa havaittiin MTBITC- painotti HCC-soluissa, olemme pyrkineet selvittämään tämä johtui pysähtyi solujen kasvuun, apoptoottisten tai nekroottisen prosesseja (kuvio 2 ja 3). Ensin analysoidaan solujen kaspaasi 3/7 aktivointia erityisinä apoptoosin merkki. 24 h, MTBITC indusoi merkittävän apoptoosin 25 uM, mutta vain p53-p- (HepG2-solut); ei kasvua voidaan pitää p53-mut (Huh7-solut), p53-null (Hep3B) soluja tai LIXF (kuvio 2a). Normaali maksasoluihin pysyi vaikuta hoitoon, kuten tutkittiin ihmisen tai hiiren solujen 24 h (kuvio 2c). Emme löytäneet mitään merkkejä siitä, että MTBITC indusoi nekroottisen reaktion pahanlaatuisia tai normaaleissa soluissa, jopa 50 uM, määritettynä PI solujen värjäytymisen (kuvio 2b ja d). Ehdot toistuva altistuminen (jopa 72 h), kuten olisi asia alle kemoterapiaa, ei vielä herkistää terveellistä hepatosyyttien apoptoosia (kuvio 2c) tai kuolio (kuvio 2d). Havainnot tehdään normaalissa maksasolut edelleen todentaa PCLS. Tämä

ex vivo

malli mahdollistaa kattavan monimutkaisuus maksan rakenteen ja moninaisuus aineenvaihdunnan, homeostaattista, hormonaaliset ja biotransformaatio toimintoja. Siksi paremmin korkean biologisen organisaation elimen [27]. Altistaminen PCLS 25 uM MTBITC ei lisännyt apoptoosia (kuvio 2e) tai kuolio (kuva 2 f) korko terveessä kudoksessa vaan tukahdutetaan se, verrattuna hallita viipaleita. Sen sijaan positiivinen kontrolli, 1 ug /ml aktinomysiini D yhdistetään 100 ng /ml TNF indusoi syvällinen maksan apoptoosiin (kuvio 2e).

vaikutus MTBITC apoptoosiin (a, c, ja e) tai kuolion (b, d ja f) induktion pahanlaatuinen ja terveitä soluja. Selvät apoptoosin induktio arvioitiin käyttämällä kaspaasi 3/7 toimintaa sen jälkeen solujen hoidon MTBITC 12 72 tuntiin. Positiivinen kontrolli (+): 10 uM CPT tai staurosporiini (a, c), 1 ug /ml aktinomysiini D /100 ng /ml TNF: n (ActD /TNF) (e). Nekroosia induktio kvantifioitiin käyttäen tiettyjä ottoa PI eristetyissä soluissa (b ja d) tai LDH vapautuminen PCLS (f). Positiivinen kontrolli (+): 0,2% Triton X-100. Tulokset ilmaistiin suhteessa liuottimeen (0,1% DMSO). Baarit ovat keskiarvo + SD, (lukumäärä itsenäisen kokeen on jäljempänä luvut; kokeet suoritettiin PCLS tehtiin kolmena kappaleena.).

G2 /M pidätys (a-d) ja apoptoosin (e ) induktio käsittelyn jälkeen HCC-solujen MTBITC, määritettynä PI värjäämällä DNA: n ja virtaussytometria-analyysi. Vaikutus MTBITC tai 0,1% DMSO: ta (liuotin) määritettiin 24 tunnin jälkeen (LIXF) tai 72 h (HepG2, Huh7, Hep3B). Palkit ovat keskiarvo + SD (n = 3).

Sitten mitataan vaikutus MTBITC solusyklin. SubG1 huippu oli näin käytettiin apoptoosin indikaattori. 24 tunnin kuluttua altistuksen MTBITC, vahva konsentraatiosta riippuvaisen G2 /M-pidätys oli ilmeistä LIXF (kuvio 3a) ja kaikki HCC testatuissa solulinjoissa, mutta jälleen ilman mitään selviä merkkejä apoptoosin p53-mut tai p53-null-soluissa (tietoja ei ole esitetty). Sitten analyysimme laajennettiin 3 päivän ajan MTBITC altistuksen, koska olimme jo todettu, että pitkäaikainen MTBITC hoito ei lisännyt vahinkoa terveitä soluja. Kuten kuviossa 3b-d, G2 /M lohko säilytetään ITC hoito ja tämä oli järjestyksessä p53-null-solut p53-mut solujen p53-p- soluissa. Vaikka 24 h, p53-alentunut soluissa ei tapahtunut solukuolemaa, 72 h-hoidon MTBITC laukaista apoptoosin kaikissa testatuissa solulinjoissa (kuvio 3e).

vaikutus MTBITC on TIC Solut

tutkimme seuraavaksi vaikutus MTBITC on solunsalpaajaresistentti SP-soluissa, jotka on eristetty Huh7-soluja käyttämällä DNA: ta sitovien väriainetta Hoechst 33342 ja virtaussytometrialla. Toisin kuin HepG2-solulinja, joka sisälsi vähemmän kuin 0,3% SP solujen Huh7 solulinja sisälsi SP-soluja pitoisuutena noin 1,5%, ja sen vuoksi niitä käytetään myöhemmissä kokeissa (kuvio 4a). Asianmukaiset SP syrjintä Huh7 soluissa suoritettiin ABC transporter esto-ohjaus kokeet, joissa käytetään verapamiili (kuvio 4a), joka onnistuneesti estetty Hoechst dye ulosvirtausta. Luonnehdinta lajitellut solupopulaatioiden osoitti, että i) kyky SP solujen pumpata Hoechstin väriaine katoaa suurimmaksi osaksi viikon soluviljelmässä (kuva 4a), kuten on osoitettu uudelleenanalysoinnissa lajitellun SP soluja. ii) SP solut kasvoivat huomattavasti nopeammin kuin NSP soluja samoissa käsittelyolosuhteissa, määritettynä jälkeen 72 (kuva 4b). iii) siirtyminen SP-solujen oli suurempi kuin koko Huh7 solupopulaation, arvioi tyhjästä määrityksessä (tuloksia ei ole esitetty). Migration käytettiin myös toisen parametrin tutkia kemoterapeuttisen teho MTBITC. Kuten kuviossa 4c, 48 h, ohjaus solut olivat lähes kokonaan siirtynyt kohti avaamista uusille gab ja sulki ”tyhjästä”. Sen sijaan perustetaan täydellisen solu-solu kosketuksiin ollut vielä selvää kuluttua 72 h MTBITC käsitellyissä soluissa. Solujen maahanmuuttoluku osoitti, että alle MTBITC hoito SP soluja tarvitaan 44,1 h lähelle gab 50%, kontrolli soluista 26,2 tuntia. Ei huumeiden herkkyys eroja kasvun eston jälkeen havaittiin MTBITC kohtelun SP ja NSP soluja (kuvio 4d). Meidän lisäksi analyysi paljasti, että MTBITC pidätetty ei-SP sekä SP subfraktioita G2 /M ja työnsi ne ohjelmoidun solukuoleman, vaikkakin vähemmässä määrin SP-soluissa verrattuna niiden ei-SP vastine (kuvio 4e ja f). Me tutkimme seuraavaksi kyky MTBITC vähentää ALDH-positiivisia soluja HepG2 ja Huh7 solulinjat. Kuten kuvassa 4g, MTBITC-hoito keskittyminen riippuvasti johti kumoamisen tämän merkin;