Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Hedgehog (HH) signalointi on keskeinen rooli normaalissa solun prosesseissa, normaalissa nisäkkään ruoansulatuskanavan kehitystä ja erilaistumista ja kasvaimen synnyssä ja ylläpito pahanlaatuisen fenotyypin ihmisen erilaisten syöpien. Lisääntyvä todistusaineisto edelleen syytöksiä osallistumisesta HH signalointi kasvaimen synnyssä ja metastaattisen käyttäytyminen paksusuolen syöpiin. Kuitenkin genomiikan lähestymistavat selvittämään roolin HH signaloinnin syöpiä yleensä puuttuvat, ja tietojen johdetut HH signalointi paksusuolen syöpä on erittäin rajoitettu.

Menetelmät /Principal Havainnot

tunnistaa ainutlaatuisia alavirtaan tavoitteita GLI-geenien transkription säätelijöinä HH signaloinnin yhteydessä paksusuolen karsinooma, käytimme pienmolekyylisalpaaja- sekä GLI1 ja GLI2, GANT61, kaksi ihmisen paksusuolen syövän solulinjat, HT29 ja GC3 /c1. Solusyklin analyysi osoitti kertymistä GANT61 käsiteltyjen solujen G1 /S rajan. cDNA microarray geenien ilmentymisen profilointi 18401 geenien tunnistettu ilmennetty eri Genes (DEGS) sekä yhteinen ja ainutlaatuinen HT29 ja GC3 /c1. Analyysit käyttäen GenomeStudio (tilastot), Matlab (lämpö kartta), kekseliäisyyttä (kanoninen koulutusjakson analyysi), tai qRT-PCR, jonka tunnuksena p21

CIP1 (CDKN1A) ja p15

Ink4b (CDKN2B), joka osansa G1 /S tarkastuspiste, kuten säädelty geenien G1 /S rajan. Geenit, jotka määrittävät edelleen solusyklin etenemistä osoitteessa G1 /S kuten E2F2, sykliini E2 (CCNE2), CDC25A ja CDK2, ja geenit, jotka säätelevät kulun soluihin G2 /M (sykliini A2 [CCNA2], CDC25C sykliini B2 [CCNB2], CDC20 ja cdc2 [CDK1], olivat alassäädetty. lisäksi uusien geenien mukana stressin vastaus, DNA-vaurioita vastaus, DNA: n replikaatio ja DNA korjaukseen tunnistettiin inhiboitu HH signaloinnin.

Johtopäätökset /merkitys

Tässä tutkimuksessa määritetään geenejä, jotka osallistuvat HH-riippuvaisen soluproliferaation paksusuolen syöpäsoluissa, ja sen jälkeen inhibitio, geenit, jotka säätelevät solusyklin etenemistä ja tapahtumia alavirtaan G1 /S rajan.

Johdanto-osan : Shi T, Mazumdar T, DeVecchio J, Duan ZH, Agyeman A, Aziz M, et al. (2010) cDNA Microarray geeniekspressioprofilointi Hedgehog-signalointireitin inhibitio in Human Colon Cancer Cells. PLoS ONE 5 (10): e13054. doi: 10,1371 /journal.pone.0013054

Editor: Terence Lee, University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 6. kesäkuuta, 2010 Hyväksytty: 02 syyskuu 2010; Julkaistu: 01 lokakuu 2010

Copyright: © 2010 Shi et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Taloudellinen tuki National Cancer Institute palkintoja RO1 CA 32613 (JAH), RO1 108929 (JAH), ja Cleveland Clinic. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Hedgehog (HH) signalointi on kriittinen rooli erilaisissa normaalin solun prosesseja. Se on keskeinen alkionkehityksen sääntely epiteelin-to-mesenkymaalitransitioon, kuvioinnin monipuolista selkärankaisten rakenteiden erilaisia ​​elimiä, ylläpito aikuisten kudosten homeostaasin, kudosten korjaamiseen, soluproliferaation ja solujen eloonjäämistä [1] [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8], [9]. Kanoninen HH reitti on myös kriittinen normaalia nisäkkään ruoansulatuskanavan kehitys, jossa se on mukana koordinoida sääntelyn eriyttäminen normaalin suoliston villi [10], [11], [12]. Näin ollen normaali maha-suolikanavan, HH ligandeja indusoituu erilaistuneita soluja ympärillä villous pinta, tuottaa negatiivisen takaisinkytkentäsilmukan inhiboimaan kanoninen WNT signalointia tyvisolut crypt, minkä vuoksi se suojaa erilaistuneita soluja päässä proliferatiiviset vaikutukset WNT [ ,,,0],13]. Aktivointi kanoninen HH signalointireitin käsittää sitoutumisen HH ligandien kalvoon reseptoriin Patched (PTCH1), joka omaksutaan johtaa aktivoinnin signalointimolekyylin smoothened (SMO) kautta vapautuminen PTC-välitteisen suppression. SMO aktivoi ratkaisee viimekädessä HH signalointi, GLI perheen transkriptiotekijöiden, jotka sitoutuvat GACCACCCA kaltainen konsensus sitova tekijä promoottorisekvenssit kopiointia säännellä HH kohdegeenien [3], [14], [15]. GLI1 ja GLI2 transkription aktivaattoreita HH signalointi, hallussaan erillisiä sekä päällekkäiset toiminnot, joissa aktivaattori (GLI1 ja GLI2) tai repressori (GLI2) toiminta [16]; kuitenkin niiden roolit säätelyssä HH-odotuksiin solujen lisääntymistä, eloonjääntiä tai solukuolemaan prosessit ovat huonosti tunnettuja. Historiallisesti GLI1 on pidetty luotettavimpana markkeri HH signalointia, kuitenkin GLI2 näyttää olevan ensisijainen aktivaattori HH signalointi, jossa GLI1 transkription kohteena GLI2 [3], [7], joka johtaa augmentation HH signaloinnin sekä määrällisesti sekä laadullisesti [16]. Tärkeä ominaisuus GLI proteiineja on, että niiden biologinen aktiivisuus on kontekstisidonnaisia, vaikuttaa solun ympäristöön [17], [18].

aktivointi kanonisen HH signalointiryöpyn on poikkeavasti aktivoituu ja tunnettu pelata kriittinen rooli syövän synnyssä ja ylläpito pahanlaatuisen fenotyypin useita erilaisia ​​ihmisen syövissä. Tällainen aktivointi sisältää monistaminen GLI1 tai GLI2, mutaatiot PTC tai SMO, tai säädeltyyn geenin ilmentymisen [3], [4]; nämä pahanlaatuiset solut ovat myös herkkiä pienmolekyylisalpaaja- joka kohdistuu SMO, syklopamiini [4], [19], [20], [21], [22], [23]. Paksusuolikarsinoomat uskotaan johtuvan konstitutiivisen aktivaation WNT signalointi mutaatio APC tai β-kateniinin geenejä, kun taas osallistuminen HH signalointireitin ei ole yhtä selvä. Ruoansulatuskanavan maligniteetit, transkription säätely ylöspäin HH ligandien on todettu hallitseva aktivaattori HH signalointi näissä sairauksissa (tarkistetaan [3]). Lisäksi on näkyvillä merkkejä siitä HH signalointi on osallisena peräsuolen syövän synnyn [24], [25], paksusuolen karsinooma kantasolujen itseuudistumiseen, ja metastaattisen käyttäytymisen kehittyneiden koolonsyöpien [26]. Kuitenkin genomiikan lähestymistavat selvittämään roolin HH signaloinnin syöpiä yleensä puuttuvat, säätelygeenit alavirtaan GLI1 ja GLI2 jotka toimivat solujen lisääntymistä, eloonjääntiä ja ylläpito pahanlaatuisen HH fenotyyppi pysyvät epätäydellisesti tunnettu [5], ja tiedoista voidaan päätellä on HH signalointi paksusuolen syöpä on erittäin rajoitettu.

solujen lisääntyminen ohjaavat myös solujen solusyklin läpi, joka koostuu peräkkäisten läpikulun G1, S, G2 ja M vaiheissa. Sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK) assosioituvat Sykliineiksi ajaa solusyklin koneita [27], [28]. Siten CDK2 kumppaniaan sykliini E G1 /S siirtyminen ja sykliini aikana S-vaiheen, CDK4 ja CDK6 sitoutuvat sykliini D aikana progressio G1 /S, kun taas cdc2 komplekseja sykliini A G2, ja sykliini B aikana G2 /M siirtyminen. CDC25 perheenjäsenet myös säätelevät solusyklin etenemisen kautta defosforyloimalla CDK [29], [30]. CDK-inhibiittorit, mukaan lukien p21

CIP1 [29], [31] ja p15

Ink4b [[32], sitoutuvat sykliini-CDK-komplekseja solusyklin aikana siirtymistä, erityisesti G1 /S (p21

CIP1, p15

Ink4b; [32]) ja G2 /M (p21

CIP1; [29]), ja se voi myös aiheuttaa solusyklin pysähtymisen G1 /S rajaa seuraavat sytostaatit signaaleja toiminnallinen estämällä cyclin- CDK-komplekseja. E2F perheen transkriptiotekijöiden myös säätelee geenien ilmentymistä tarvitaan G1 /S siirtymisen erityisesti osallistuvien geenien aktivoitumisen DNA-replikaation koneita, ja DNA: n korjaukseen [33].

cDNA microarray-teknologia edellyttäen opiskelukykyä ilmaisun tuhansien geenien samanaikaisesti, ja se on tärkeä väline leikkelyn signaalinvälitysreittien. Sillä HH signalointikaskadin, HH /GLI kohdegeenin ilmentymistä on tutkittu seuraavasti EGF stimulaation [6], tai indusoitavissa GLI1 [16], tai GLI2 [9] geenin aktivoitumista ihmisen keratinosyyttien, tai GLI1-indusoidun solun transformaatio [7]. Tunnistamaan ainutlaatuinen alavirtaan tavoitteita GLI-geenien, jotka toimivat solun proliferaation yhteydessä paksusuolen karsinooma, käytimme pienmolekyylisalpaaja- sekä GLI1 ja GLI2, GANT61, tunnistetaan soluun perustuva pieni molekyyli näytön inhibiittorit GLI1-välitteisen transkriptio [34]. GANT61 toimii tumassa estää GLI1 toiminto, estää sekä GLI1- ja GLI2- välittämän transkription, ja osoittaa suurta selektiivisyyttä HH /GLI signalointi [34]. Siten GANT61 toimii alavirtaan syklopamiinin (kohdistaminen SMO) estämään lopullisen tekijöitä HH transkription säätelyyn.

Kahdessa ihmisen paksusuolen sinoomasolulinjoja, HT29 ja GC3 /c1, estämällä HH signalointireitille käyttäen GANT61 vähentynyttä ilmentymistä of GLI1, GLI2 ja HH ligandin reseptori, PTCH1, ja esti leviämisen indusoimalla solujen kerääntyminen G1 /S rajan 24 tunnin käsittelyn jälkeen, määritetään virtaussytometrianalyysillä. On lisäksi yksityiskohtaisen analyysin avulla cDNA microarray geeniekspressioprofilointi ja määrällinen Real-Time PCR, p21

CIP1 (CDKN1A) ja p15

Ink4b (CDKN2B), joka voi saada G1 /S tarkastuspiste, olivat sääteli, kun taas geenit, jotka edelleen määrittävät merkintä G1: stä S-vaiheeseen kuten E2F2, sykliini E2 (CCNE2), CDC25A ja CDK2 määrä väheni ilme. Samanaikainen alentuneen G1 S-vaiheen etenemisen, vähentynyt ilmentyminen sykliini A2 (CCNA2), CDC25C sykliini B2 (CCNB2), CDC20 ja cdc2 (CDK1), jotka säätelevät kulkua solujen läpi G2 /M osoitettiin myös. Muihin uusia geenejä, jotka osallistuvat stressin vastaus, ja vasteena DNA-vauriolle, joita ei ole aiemmin tunnistettu päättymisen jälkeen HH signaloinnin ihmisen syöpäsoluja, ovat alussa muuniresponssigeeneinä DDIT2 (GADD45G), DDIT3 (GADD153), DDIT4 (REDD1), PPP1R15A (GADD34) ja ATF3 jotka olivat huomattavasti sääteli. Geenien DNA-synteesin ja korjaus (TYMS, TOP2A, TK1, napa, POLE2), ja lisäksi uusien geenien mukana S-vaiheen etenemisen tai DNA-vaurion vasteet, jotka olivat merkittävästi alassäädetty, sisältävät KIAA0101 (p15 [PAF]), replikointi tekijä C-variantit 2, 3, 4, 5, CDT1, E2F transkriptiotekijöiden CDCA4 ja TFDP1, MDC1, FANCD2, PCNA, ja geenejä, jotka osallistuvat DNA: n korjaukseen, RAD51C (XRCC3), RAD54B, RAD51 ja HELLS. Tutkimus on siis tunnistettu geenejä, joita säännellään lopettamisen aikana HH-riippuvaisen solujen lisääntymistä ja eloonjäämisen koolonkarsinoomasoluissa, ja siihen liittyviä geenejä G1 /S-vaiheen pysähtymisen, DNA-vaurioita ja stressistä.

Tulokset

GANT61 indusoi alassäädetty ilmentymistä GLI geenien ja kertymistä ihmisen koolonkarsinoomasoluja at G1 /S

HT29 ja GC3 /c1 soluja käsiteltiin GANT61 (20 uM) enintään 48 hr, ilmaus kohdegeenien GLI1 ja GLI2 olivat molemmat alassäädetty, ja myös HH ligandireseptori PTCH1, määritettynä qRT-PCR (Kuva 1A). Sen jälkeen, HT29 tai GC3 /c1-soluja käsiteltiin kahtena kappaleena, ja GANT61 (20 uM) ja sen jälkeen PI-värjäyksellä ja virtaussytometria-analyysi määrittämiseksi solusyklin jakautuminen G1, S ja G2 /M-vaihetta (kuvio 1 B). Molemmissa solulinjoissa, solut kertynyt G1, 24 tuntia käsittelyn jälkeen GANT61. In GANT61 käsiteltyjen HT29, 20% lisäys G1-vaiheen solut liittyi vastaavan vähennyksen solujen G2 /M vaiheessa (14%) ja S-vaiheessa (5%), sopusoinnussa G1 /S tarkistuspiste pidätys. In GC3 /c1-soluja, 8% lisäys G1-vaiheen solut 24 tunnin kuluttua GANT61 hoidon myös vastasi samanlaisella väheneminen solujen G2 /M-vaiheen solusyklin (kuvio 1 B).

soluja käsiteltiin jopa 48 tunnin kanssa GANT61 (20 uM) tai 0,2% DMSO (ajoneuvon kontrolli). (A) qRT-PCR GLI1, GLI2 ja PTCH1 geenit aika 0-48 tuntia. (B) DNA uutettiin 24 tunnin käsittelyn jälkeen, värjättiin propidiumjodidilla, ja sen jälkeen analysoitiin vaikutuksia inhibition HH signaloinnin vaiheesta jakelu solujen solusyklin virtaussytometrialla.

cDNA microarray analyyseja tunnistaa muutoksia geenien ilmentyminen sekä yhteinen ja ainutlaatuinen HT29 ja GC3 /c1 seuraavat GANT61 hoidon

hahmottelevat muutoksia geenien ilmentyminen HT29 ja GC3 /c1 ihmisen paksusuolen sinoomasolulinjoja vastauksena hoitoa GLI1 /GLI2 antagonisti, GANT61, ilmentymisen 18401 ihmisen geenien profiloitu ohjaus soluissa, joita käsiteltiin vehikkelillä (0,2% DMSO) ja solut käsiteltiin GANT61 (20 uM) 24 tunnin ajan. Geenit, joiden False Discovery Rate (FDR) -adjusted p-arvo 0,001 ja taita muutos 1,5 katsottiin ilmentyvät eri geenit (DEGS) aiheuttama GANT61 ajoneuvon suhteen valvontaa, joista 1368 geenit ilmentyvät differentiaalisesti HT29 ja 1002-geenien GC3 /c1-soluja (kuvio 2). 755 geenejä tai 558 geeniä säädellään ylöspäin, ja 613 tai 444 geeniä alassäädetty, in HT29 ja GC3 /c1 soluja, tässä järjestyksessä. 763 ja 397-geenit ilmentyvät differentiaalisesti ja ainutlaatuinen HT29 tai GC3 /c1, vastaavasti. Niistä 763 DEGS ainutlaatuinen HT29, 459 (60%) oli säädelty ja 304 (40%) oli alassäädetty. Samoin on 397 DEGS ainutlaatuinen GC3 /C1, 262 (66%) oli säädelty ja 135 (34%), alassäädetty. Sen sijaan 605 geenit eli 3,4% kaikista geenit ilmentyvät differentiaalisesti, jotka ovat yhteisiä molemmissa solulinjoissa; Näistä 296 oli säädelty (49%), ja 309 (51%) oli alassäädetty (kuva 2). Kaikki geenit yhteinen sekä HT29 ja GC3 /c1, jotka olivat merkitsevästi säädelty tai alassäädetty (p 0,001) on lueteltu taulukoissa 1 ja 2, vastaavasti.

Soluja käsiteltiin GANT61 (20 uM) tai pelkästään vehikkeliä (0,2% DMSO) 24 tunnin ajan, ja kokonais-RNA uutettiin kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät. Muutoksia geenien ilmentyminen määritettiin cDNA microarray geeni profilointi käyttäen Illumina Human-ref8 V3.0 Helmi-Chip array. Geenit, joiden False Discovery Rate (FDR) -adjusted p-arvo (p 0,001) ja taita muutos 1,5 katsottiin degs. Ylempi paneeli: jopa geenien. Alempi paneeli: alas geenien. Differential lauseke koko, ainutlaatuinen säädelty, ainutlaatuinen alassäädetty, yhteinen säädelty, ja yhteiset alassäädetty DEGS, näkyvät.

Modulation of kanoninen signalointi polkuja eston HH signaloinnin

Genes merkittäviä muutoksia ilme seuraavissa GANT61 hoidon jaettiin eri kanoninen signalointireittien ja alistettiin Ingenuity Pathway Analysis (IPA), jossa aikaansaatu 1368 DEGS vuonna HT29 ja 1002 degs in GC3 /c1 kartoitettiin verkkoihin määritelty IPA-tietokannan (kuvio 3). Sillä kartoitettu DEGS lukien sekä ylä- ja alas- geenien, 15 eniten merkittävästi muuttunut kanoninen reittejä HT29 osoitti -log (p-arvo) vaihtelevat 2,045-9,025 ja GC3 /C1 2,32-7,509. Niistä 15 reittejä, joihin liittyy geenien merkittävästi alassäädetty, 12 olivat yhteisiä molemmissa solulinjoissa. 3 yhteiset reitit, joilla on suurimmat ero alassäädetty ilme ovat geenit osallistuvat DNA-vaurioita vastaus, solusyklin Checkpoint ohjaus, ja mitoosin. Muut reitit alassäädetty mukana G1 /S ja G2 /M DNA-vaurioita tarkistuspisteitä, DNA esiaste aineenvaihduntaa ja solujen signalointi osallistuu eri reittejä osallistuvat henkilöt mukaan lukien syöpien, mikä myös osoittaa 3 allekirjoituksia ainutlaatuinen joko HT29 tai GC3 /c1 (kuva 3 ). Niistä 15 polkuja, joissa geenit, jotka ovat kaikkein merkittävästi säädelty, 8 ovat yhteisiä HT29 ja GC3 /c1 ja 7 edustavat ainutlaatuista väyliä kunkin solulinjan, jotka osoittavat enemmän monimuotoisuutta malleja sääteli geenin ilmentymistä (kuvio 3 ). Ylös-säädellään väyliä yhteisiä sekä solulinjoja ovat aineenvaihduntaa liittyviä, kuten steroideja, pyruvaattia, glykolyysi glutationia tai glyserolipidi, ja jotka eivät suoraan liity valvontaan soluproliferaation.

15 parasta kanoninen signalointireittien , määräytyy IPA, jotka olivat merkitsevästi säädelty tai alas-säädellä GANT61 hoitoa HT29 ja GC3 /c1 soluja, on esitetty. 1368 DEGS in HT29 ja 1002 DEGS in GC3 /C1 kartoitettiin että IPA- määriteltyjen verkon. Merkitys p-arvoja, jotka määrittävät todennäköisyys, että assosiaatiota geenien aineisto ja kanonisen polku on sattuman laskettiin Fisherin testiä, ja ilmaistaan ​​-log (p-arvo). A. Pathways rikastettua alas geenien. B. Pathways rikastettua up geenien. Blue: Pathways yhteinen sekä HT29 ja GC3 /c1. Red: Pathways ainutlaatuinen joko HT29 tai GC3 /c1. Keltainen neliöt: suhde määrän DEGS että kartta tietyn kanonisen reitin jaettuna määrä geenejä, jotka muodostavat että polku.

geenit osoittavat ero kertainen muutos kuvioita GANT61 saaneilla HT29 ja GC3 /c1 solujen

Taita muutos malleja korkeimmin DEGS vuonna HT29 ja GC3 /c1 valittiin, analysoidaan ja näytetään että karttaa arvioida ja vertailla samankaltaisuutta ja eroja differentiaalikaavojen kahden solulinjoista käsitelty GANT61 (kuvio 4). Sen lisäksi, että geenejä erilaisia ​​toimintoja, jotka eivät liity suoraan HH-riippuvaisen proliferaation, up-geenien, jotka vaikuttavat G1 /S siirtymistä ja sen jälkeen solusyklin etenemisen, ja jotka ovat yhteisiä molemmille solulinjoja, ovat CDKN1A, ja DNA- -damage-indusoituva selostukset 3 ja 4 (DDIT3 ja DDIT4). Huomattavasti suurempi määrä osallistuvien geenien solujen lisääntymistä ja solusyklin siirtyminen läpi G1 /S rajan, S-vaihe etenemiseen ja G2 /M siirtymä, oli merkitsevästi alassäädetty ilmentymisessä, ja yhteinen molemmille solulinjoja. Näitä ovat Cdc6 (osallistuvat G1 /S), kolme geeniä, jotka ohjaavat pääsyä ja läpikulun S-vaiheen (CCNE2, E2F2) ja G2 (CCNA2), liittyvien geenien DNA-replikaatioon ja korjaukseen (TYMS, POLE, TOP2A, TK1, POLE2), ja kaksi geeniä, jotka säätelevät mitoosin (AURKB, CDC20, kuvio 4, tähdellä).

lämpöä kartta syntyi Matlab (Mathworks), ja vertaa taita muutos malleja korkeimmin DEGS vuonna HT29 ja GC3 /c1 soluissa, sen jälkeen GANT61 hoidon. Pisimmälle DEGS osoittanut differentiaalikaavojen p-arvo p 0,001 välillä auton ohjaus (0,2% DMSO) ja GANT61 käsiteltyjä soluja. Vasen paneeli (punainen): up geenien. Oikea paneeli (vihreä): alas geenien. Geenit merkitty tähdellä määritellä niitä geenejä, joilla on erityisiä rooleja G1 /S siirtymä, S-vaihe etenemisen, DNA: n replikaatio tai korjata tai sääntely G2- tai M faasitransitioiden. Kertamuutoksia kaikista alassäädetty DEGS ja kaikki paitsi yksi sääteli DEG ovat ≤8 (keskeinen värikirjo bar).

Niistä 296 up-geenien lisäksi geeneissä vertailukelpoisesti edustettuina lämpöä kartta, joka sisältää DDIT3 (GADD153) ja DDIT4 (REDD1), lisää uusia DNA-vaurioita indusoitavissa transkriptien todettiin myös ja ne sisältävät DDIT2 (GADD45G), PPP1R15A (GADD34) ja ATF3 (taulukko 1). TP53INP1, joka voi säädellä solusyklin pysähtymiseen, ja TP53INP2, tunnistettu solukuoleman vasteet olivat myös sääteli. Niistä 309 geenien merkittävästi alassäädetty vastauksena GANT61, uusia geenejä tunnistettiin kuuluvat KIAA0101 (p15 [PAF]), replikointi tekijä C variantteja 2, 3, 4, 5, CDT1, E2F transkriptiotekijöille CDCA4 ja TFDP1, MDC1, PCNA , FANCD2, ja geenejä, jotka osallistuvat DNA: n korjaukseen, RAD51C (XRCC3), RAD54B, RAD51 ja HELLS (taulukko 2).

differentiaalisesti ilmentyvien geenien mukana G1 /S ja G2 /M siirtyy

edelleen arvioimiseksi osallistuvia geenejä solusyklin etenemisen ihmisen paksusuolen karsinoomasoluja seuraavat GANT61 hoidon, 10 liittyvät geenit G1 /S tai G2 /M-siirtymiä, tunnistetaan IPA, valittiin jatkotutkimuksiin. Geenit vaaditaan G1 /S rajan G1 /S siirtymä, tai induktion G1 /S tarkastuspiste seuraavat sytostaatit signaaleja, kuuluu kaksi sykliiniriippuvaisen estäjät, p21

CIP1 (CDKN1A) ja p15

Ink4B (CDKN2B), jotka ajan säännelty 5.2- ja 3.1- kertainen, 24 tunnin kuluttua GANT61 annon (taulukko 3). Muita geenejä tarvitaan G1 /S siirtymä jotka alassäädetty sisältävät E2 transkriptiotekijä E2F2 (-4,2-kertainen), ja muut kriittiset geenejä, jotka olivat alas-säädellä 2.1- ja 3.2- kertaiseksi, sisältyvät sykliini E (CCNE2) , CDK2 ja CDC25A. G2 /M, GANT61 indusoidun säädelty ilmentyminen CCNA2 (sykliini A2), sykliini B1 (CCNB1), sykliini B2 (CCNB2), CDK1 (cdc2), ja CDC25C jonka 2.3- ja 3.1- kertaisesti (taulukko 3).

määrittämiseksi luotettavuutta cDNA microarray geeniekspressioprofilointi käsittelyn jälkeen HT29 ja GC3 /c1 solujen GANT61 (20 uM) 24 tunnin ajan, qRT-PCR käytettiin määrittämään muutoksia ilmentyminen valitun ryhmä 10 DEGS määritettiin cDNA mikrosiruja. Osallistuvia geenejä ja alukkeet syntetisoitiin on esitetty taulukossa 4. qRT-PCR suoritettiin cDNA muodostetaan käyttämällä kokonais-RNA: ta riippumatta eristetty GANT61-käsiteltyjen HT29 ja GC3 /c1 soluja 0 h, 16 h, 24 h, 38 h ja 48 h hoidon jälkeen. GAPDH käytettiin normalisoimaan kaikki qRT-PCR tietoja. Geenit määräytyy qRT-PCR sisältyi ilmaisun E2F2, CCNE2, CDC25A ja CDK2 at G1 /S, joka oli alassäädetty, säätely ylöspäin CDKN1A ja CDKN2B at G1 /S, ja alas-säätely CCNA2, CDC25C, CCNB2 ja CDK1 G2 /M (kuvio 5). Ylös säädelty tai alassäädetty muutoksia geenien ilmentyminen seuraavissa GANT61 hoidon ja määritettiin cDNA microarray profiloinnin varmistettiin qRT-PCR (kuva 5).

Soluja käsiteltiin pelkällä vehikkelillä (0,2% DMSO) tai GANT61 (20 uM) 16 tunnin ajan, 24 tuntia, 38 tuntia tai 48 tuntia. Kokonais-RNA uutettiin ja qRT-PCR suoritettiin, kuten on kuvattu Materiaalit ja menetelmät käyttäen alukesarjoja taulukossa 2. Tiedot ovat keskiarvoja ± SD 4 määrityksen, ja GAPDH käytettiin normalisoimaan suhteelliset mRNA-tasot.

keskustelu

HH signalointireitin aktivoituu erilaisissa ihmisen syövissä seuraavista mutaatioita geeneissä, jotka säätelevät kanoninen HH signalointi, mukaan lukien reseptorin PTC, ja HH signalointi molekyyli, SMO, ja voidaan myös aktivoida transkription säätely ylöspäin HH ligandien (tarkistetaan [3]). Tämä polku on tulossa yhä tärkeämpää vuoksi saada käsityksen sen näkyvä monissa kehitys- prosesseja ja ylläpito pahanlaatuisen fenotyypin monenlaisia ​​ihmisen syövissä, joiden kasvu on havaittu estettävä estävät selektiivisesti konstitutiivisen HH signalointia [14], [35], [36]. Kasvaimet aivoissa, eturauhas-, iho-, haima-, ja munuaisten ovat osoittaneet vaatimus HH-GLI signalointia, ja ovat vastanneet inhibitio HH signaloinnin kohdemolekyylin SMO syklopamiinilla tai SMOshRNA [4], [19], [20] , [21], [22], [23].

kopiointiaktivaattorit HH signalointi käsittää jäsenten GLI perheen transkriptiotekijöiden, GLI1 ja GLI2, joka on sekä erillisiä sekä päällekkäiset toiminnot [16 ]. Aktivointi GLI proteiinien on monivaiheinen prosessi, johon liittyy muutoksia ja vuorovaikutuksia useita myönteisiä ja kielteisiä polku sääntelyviranomaisten ja ei täysin ymmärretä [1], [14], [35]. Kohdegeenien säätelee HH signalointireitin eroavat kudoksissa ja solutyypeissä, samoin kuin on vaikuttaa läsnäolo tai puuttuminen säätelytekijöiden koekspressoitiin GLI proteiineja, jotka lopulta määräävät transkription ohjelmat aktivoidaan HH signaloinnin [6], [37 ]. Siten onkogeeninen signalointireitteihin lähentymässä kanoninen HH signalointi tasolla GLI transkriptiotekijöiden sekä tarpeen kohdegeenien alavirtaan GLI1 ja GLI2 edelleen ajaa HH signalointireitille solujen selviytyminen pahanlaatuinen kasvain [6], [7], [20 ], [38], [39], [40]. HH signalointi fenotyyppi on siksi vaikuttanut merkittävästi ja lopulta määräytyy ilmentäminen rinnakkain lisäsääntely tekijät, eli siis solun yhteydessä geenin ilmentymisen.

HH signalointi on rooli erilaistumista ohjelmaan normaalin suoliston villi [11], [12], [41], ja se on esitetty, äskettäin, että ihmisen paksusuolen syövän epiteelisolujen näyttää HH-GLI signalointi akselin karsinogeneesin prosessiin [24], [25]. Expression of HH-GLI polku komponenttien johdonmukaisesti osoitettiin analyysi 40 ensisijaisen ihmisen paksusuolikarsinoomat ja kasvainten metastaattista maksaan [26], sopusoinnussa havaintojen aikaisempien tutkijoiden [25], [42], [43]. Siten, käyttäen qRT-PCR: n ilmentyminen GLI1, PTCH1, GLI2 ja SHH määritettiin kaikissa ihmisen koolonin karsinoomat tutkittiin. Vaatimus sekä GLI1 ja GLI2 kestävän proliferaatiota ja eloonjäämistä ihmisen paksusuolen karsinooman solulinjoissa in vitro, mukaan lukien HT29, osoitettiin käyttäen siRNA tekniikkaa [26]. Lisäksi, pudotus SMO jonka SMOshRNA esti HT29-solujen kasvuun SCID-hiirissä, kun taas p- HT29 ihonalainen ksenografteja vastasi syklopamiinille pelkistämällä kasvaimen tilavuuden [26]. Näin ollen, kanoninen aktivointi GLI1 ja GLI2 kautta SMO on tärkeä selviytymisen ja proliferaation ihmisen paksusuolen karsinoomasoluja in vivo.

Nykyisessä tutkimuksessa toiminto sekä GLI1 ja GLI2 alavirtaan SMO on estyy läsnä GANT61, pieni molekyyli estäjä, jonka on havaittu solusta-pohjainen näyttö estämään spesifisesti GLI1-välitteisen transkription, mutta esti myös toiminto GLI2 [34]. Tämä aine valittiin nimenomaan estää lopullinen arbiters HH signalointi, GLI transkriptiotekijät, vuonna selvittäminen loppupään kohdegeenien jotka määrittelevät HH-riippuvaista proliferaatiota ihmisen koolonkarsinoomasoluja. Kaksi solulinjojen, hyvin tunnettu meidän laboratorioissa, HT29 ja GC3 /c1, käsiteltiin GANT61 (20 uM) 24 tunnin ajan, ja ilmaus GLI1, GLI2 ja PTCH1 mRNA alassäädetty. Lisäksi vaikutukset soluproliferaatioon määritetty jakelu solujen solusyklin ja virtaussytometria-analyysi osoitti kertyminen solujen G1 hoidon jälkeen, jossa on samanaikainen lasku solujen G2 /M-osastoon, ja siinä tapauksessa, HT29 myös S-vaiheessa, mikä viittaa induktio G1 /S tarkastuspiste.

HT29 ja GC3 /c1-soluja käsitellään myöhemmin GANT61 (20 uM) 24 tunnin ajan, RNA eristettiin, ja muutoksia geenien ilmentyminen määritettiin Illumina cDNA microarray profilointia. Seuraavat tilastolliset analyysit, 1368 geenien HT29 ja 1002 geenien GC3 /c1, todettiin olevan merkittävästi moduloidaan GANT61 hoito (FC 1,5; p 0,001). Geenejä, jotka olivat säädellään ylöspäin ilmaisua, 296 geenit olivat yhteisiä sekä solulinjoja, ja alas geenien, 309 geenit olivat yhteisiä molemmissa solulinjoissa. Saarto solujen G1 /S raja on osoituksena sääteli ilmentymistä p21

CIP1 ja p15

Ink4b että osittain säätelevät G1 /S siirtyminen. p15

Ink4b on jäsen Ink4 perheen CDK-inhibiittorit, indusoituu vasteena sytostaatit signaalit [32], [44], ja komplekseja sykliini D /CDK4 tai sykliini D /CDK6 välittäjänä G1-vaiheen pysähtymisen G1 /S siirtyminen tietyissä järjestelmissä [30], [32]. p21

CIP1 voi sitoutua laajan sykliini-CDK-komplekseja, joissa on mieluummin ne, jotka sisältävät CDK2 (katsaus [31], [45], ja normaalin solusyklin, helpottaa aktiivisen sykliini-CDK kompleksin muodostumisen edistämiseksi soluproliferaatiota. kuitenkin kun yliekspressoituina p21

CIP1 muodostaa estävän kompleksin sykliini E /CDK2, mikä johtaa G1 ja siten S- vaiheen pysähtymisen, muodostaen siten G1 /S tarkastuspiste [46], [47]. Suunnitelman ajoitusta Sykliini E, A ja B, jotka ohjaavat solusyklin etenemistä, näkyy merkittäviä muutoksia vaiheissa solusyklin. sykliini E ilmentyy maksimaalinen tasoilla soluissa meneillään G1 S siirtyminen, taantuvat aikana S- vaihe etenemistä, niin että G2 /M-solut ovat sykliini E-negatiivinen (tarkistetaan [30]). sykliini A ilmaistaan ​​myöhään G1, osoittaa voimakas ilmaisu aikana S-vaiheen, ja kasvaa, kun solut edetä kohti G2, joissa hajoaminen aikaisin mitoosin; B tyypin sykliinien alkavat ilmaistaan ​​myöhään S-vaiheen ja aja solut vaikka G2- ja M- vaiheissa solusyklin [30]. CDK2 ohjaa G1 /S siirtymisen komplekseja sykliini E, ja aktivoidaan CDC25A, joka defosforyloi CDK2 [48]. Cdc2 ohjaa solun tuloa mitoosin G2 /M siirtymä, jolloin muodostuu komplekseja sykliinejä A ja B aktivoidaan CDC25C, ja on alassäädetty lopulla M-vaiheen [29]. Kaikki nämä geenit ovat alaspäin säädeltyjä ilmentyminen vasteena inhibitioon GLI1 /GLI2 toiminto (taulukko 2). Siten signaalit herättivät edistää solujen kerääntyminen G1 /S lukemiin tukahduttaminen geenit, jotka säätelevät edelleen solusyklin etenemistä, ja p21

CIP1 ilmentyminen on osoitettu heikentävistä geenien, jotka säätelevät DNA: n replikaatio ja korjaus, ja mitoosin [49], [50], [51]. Nykyisessä tutkimuksessa nämä geenit sisältävät Cdc6 (aktiivinen G1 /S siirtyminen ja olennaisia ​​aloittamisen DNA replikointi), TYMS, TOP2A, TK1, vapa ja POLE2 (S-vaihe), sekä AURKB ja CDC20 (mitoosi [52] , [53]), määritetään lämmön kartalla analyysi. Kaavamainen esitys osallistuvien geenien GANT61 inhiboivan vaikutuksen solusyklin etenemisen G1-/S, S-vaiheen etenemisen, ja asetuksen aikana G2- ja M-vaiheisiin, tunnistettu cDNA mikrosiruja, lämpöä kartta analyysi, ja qRT-PCR: llä , on esitetty kuviossa 6, ja siihen liittyy 5 12 yhteisen signalointireittejä määritetään IPA-analyysillä.

cDNA: n mikrosiru, lämpöä kartta, ja qRT-PCR-analyysit, liittyvien geenien eri vaiheissa solusyklin mukaan lukien G1 /S siirtymä, ja etenemisensä S- G2- ja M- vaihetta, on esitetty. Geenit nimetty esimerkiksi CDK-inhibiittorit, jäsenet CDK ja CDC perheiden sykliinit, liittyvien geenien DNA-replikaatioon ja korjaukseen, ja geenit, jotka säätelevät sukkularihmaston, ja mukana 5 12 yhteisen signalointireittejä määräytyy IPA analyysi. Red: Up geenien. Vihreä: Down geenien. Vaalea sävy → tumma sävy, kasvava ero ilme.

Kattavat cDNA microarray geeni profilointi analyysi geenien, jotka määräävät HH signalointi fenotyyppi on tehty vain ei-syöpäsolujen malleja. Näissä järjestelmissä, GLI aktivointi on EGF hoitoon [6], vakaa GLI1 tai HA-RAS ilmentymistä [7], tai ekspressiota konstitutiivisesti aktivoitua GLI2 [16]. Näissä tutkimuksissa, sykliini D [6], [7], GADD153 [7], CDKN2B, CDKN1A, CDK2, PCNA, TOP2A, CCNB1, XRCC1 [16], on tunnistettu geenejä aktivoituu alavirtaan GLI.