PLoS ONE: Scalable In situ -hybridisaatio on Tissue Arrays varten validointi Novel Syöpä ja Tissue-Specific Biomarkers
tiivistelmä
Tissue lokalisoinnin geenien ilmentymisen on yhä tärkeämpää tarkka tulkinta suuren mittakaavan aineistoja peräisin ilmaisun ja mutaatioanalyysit . Tätä varten olemme (1) kehitti vankka ja skaalautuva menettely sukupolven mRNA hybridisaatiokoetinten tarjoamalla 95% ensikierron onnistumisaste koetin sukupolven mihinkään ihmisen kohdegeenin ja (2) hyväksyi automatisoitua värjäystä menettely analyysit formaliinilla kiinnitetyt paraffiiniin upotetut kudokset ja kudossiruina.
in situ
mRNA ja proteiinin ilmentyminen kaavoja geenien kanssa tunnetaan sekä tuntematon kudosekspressiotutkimuksen kuvioita analysoitiin normaaleissa ja pahanlaatuisten kudosten arvioida menettelyn spesifisyys ja onko
in situ
hybridisaatiota voidaan käyttää validointi uusia vasta-aineita. Osoitamme välistä yhdenmukaisuutta
in situ
transkriptio ja proteiinin ilmentyminen malleja tunnettu patologia biomarkkerit
KRT17
,
cHga
,
MKI67
,
PECAM1
ja
VIL1
, ja tarjota riippumatonta validointi uusia vasta-aineita on biomarkkerit
BRD1
,
EZH2
,
JUP
ja
SATB2
. Tämä tutkimus antaa pohjan kattavan
in situ
geeni määrittää tai transcriptome analyysejä ihmisen normaalia ja tuumorikudoksissa.
Citation: Kiflemariam S, Andersson S, Asplund A, Pontén F, Sjöblom T (2012) Scalable
In situ
hybridisaatio on Tissue Arrays varten validointi Novel Syöpä ja Tissue-Specific Biomarkers. PLoS ONE 7 (3): e32927. doi: 10,1371 /journal.pone.0032927
Toimittaja: Rakesh K. Srivastava, University of Kansas Medical Center, Yhdysvallat
vastaanotettu: 19 syyskuu 2011; Hyväksytty: 05 helmikuu 2012; Julkaistu: 08 maaliskuu 2012
Copyright: © 2012 Kiflemariam et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.
Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Ruotsin Syöpäsäätiön [11 0186] ja Beijer säätiötä TS, ja Knut ja Alice Wallenbergin säätiön [2002,0087] FP. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.
Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.
Johdanto
Tarkka ja tietyssä kudoksessa lokalisoinnin geenien ilmentyminen on tärkeä edellytys oikea tulkinta transcriptome tietojen monimutkainen kudoksista kuten potilaiden kasvaimia. Nopea kertyminen exome mutaation tietojen kasvaimia tuottaa myös uusia oletetun terapeuttisia kohteita, ja se on näin ollen arvokasta tutkia kudosta geeniekspression ennustaa vaikutuksia ja sivuvaikutuksia uusien syöpähoitojen. Spesifisyys validointi diagnostisia ja terapeuttisia vasta-aineita on toinen sovellus, jossa
in situ
geeniekspression analyysit voivat edistää olennaista tietoa. Jotta optimaalinen käyttö tällaisten
in situ
geenien ilmentyminen analysoidaan syöpäbiologian, yksi tarpeisiin (1) menetelmät helpon ja tehokkaan sellaisten koettimien mihin tahansa geenin kohde, ja (2) automatisoitu ja tehokkaita menettelyjä värjäykseen formaliinilla kiinnitetyt, parafiiniin upotettuja (FFPE) kudoksiin ja kudossiruina (TMA).
in situ -hybridisaatio (ISH) tekniikoita työllistävät leimattuja RNA-koettimia ekspression analysoimiseksi ja lokalisointi spesifisten mRNA-transkriptien kudoksissa solutyypissä resoluutio . Tällaiset koettimet muodostetaan tyypillisesti
in vitro
transkription plasmidi- tai RT-PCR-tuotteita, kun läsnä on hapteeni konjugoidun emäksen, kuten digoksigeniini-UTP. Hybridisaation jälkeen sidottu koettimet havaitaan kromogeenisella anti-hapteeni immunohistokemia. Kun taas kudosjääleikkeitä useimmiten käytetään mRNA ISH, arkistointia FFPE kudosten ja kudossiruina voidaan myös käyttää [1]. Kuten mRNA ISH on teknisesti vaikeaa ja sisältää monia Vaiheet, useita erilaisia automaatio muodoissa on kehitetty. Tecan GenePaint järjestelmä on avoin robotti, joka on menestyksekkäästi käytetty kartoittaa hiiren transcriptome jäätyneessä kudoksissa [2], [3]. Lyhyesti, esihybridisaatio, hybridisaatio ja signaalin havaitseminen reaktiot suoritetaan läpivirtaus- kammiossa, jossa automaattisen liuotin järjestelmä lisää erilaisia ratkaisuja rinnakkain. Tämä järjestelmä yhdessä havaitseminen teknologia mahdollistaa päivittäinen suoritusteho jopa kaksisataa dioja [4]. Proteomi laajuinen ponnistelut ovat jo osoittaneet toteutettavuudesta laajamittaisen FFPE immuunivärjäysmenetelmällä [5], [6]. Joka korreloi proteiini ja mRNA: n ilmentymisen antaa itsenäinen validointi työkalu niin immunohistokemia (IHC) ja ISH, ja mahdollistaa löytyminen vääriä positiivisia kummankaan menetelmän.
Jos haluat saada joustavasti analysoida kudosilmentämisen suurten geenin sarjaa in FFPE kudossiruina, loimme yksinkertainen ja skaalautuva PCR-pohjainen menettely sukupolven mRNA koettimien mihin tahansa kohdegeenin samassa cDNA-kirjastosta ja edelleen kehitettiin automatisoitu värjäys järjestelmä, jossa 48 geenejä voidaan käsitellä 48 kudoksissa tai TMA on yhdellä ajolla. Sitten validoitu spesifisyys ja skaalautuvuus tämän lähestymistavan rinnakkaisten ISH ja IHC kohdistaminen tunnettujen biomarkkereiden patologian. Lopuksi osoitamme vasta-aineiden spesifisyys uusia kudosspesifisiä tai syöpä biomarkkereita käyttämällä
in situ
-hybridisaatio.
Tulokset
Teknologia optimointi
Seventeen geenit valittiin edustamaan vakiintunutta patologia biomarkkerit tai uusien kudosspesifisiä tai syöpä biomarkkereita löysi sisällä Human Protein Atlas hankkeen [5]. Näihin sisältyvät bromodomain sisälsi 1 (
BRD1
), kromograniinilla-A (
cHga
), histoni-lysiini N-metyylitransferaasin (
EZH2
), perheen kanssa sekvenssin samankaltaisuus 174 jäsen B (
FAM174B
), glutamaatti dekarboksylaasin 1 (
GAD1
), Janus-kinaasi 3 (
JAK3
), risteykseen plakoglobin (
JUP
), keratiini 17 (
KRT17
), v-kyllä-1 Yamaguchi sarkooma viruksen liittyvä onkogeeni homologin (
LYN
), MIX1 homeobox kaltainen 1 (
MIXL1
), antigeeni Ki 67 (
MKI67
), fosfodiesteraasi 6A (
PDE6A
), verihiutaleiden endoteelin adheesiomolekyyli 1 (
PECAM1
), proteiinityrosiinifosfataasi tyypin C (
PTPRC
), erityisiä AT-rikas sekvenssi-sitovan proteiinin 2 (
SATB2
), villin1 (
VIL1
) ja sinkki sormi proteiini 473 (
ZNF473
). Haluttu PCR-tuotteet ja RNA-koettimet saatiin kaikkien geenien (kuvio S1).
Seuraava ratkaistava, onko RNA-koetin pituus vaikuttaa herkkyys tai spesifisyys ISH signaaleja kahdella eri lähestymistapoja. Ensimmäisessä lähestymistavassa, RNA-koettimia
cHga
ja
KRT17
pilkottiin kahtena käyttäen alkali- ja metalli-ionin katalysoima menetelmiä tutkia sitä lyhyemmän koettimen pituudesta antaisi suuremman signaali johtuu paremmin kudostunkeutuminen. Molemmat pöytäkirjat sovitettu käytettäväksi DIG-UTP-leimattuja RNA-koettimia. Mitään merkittävää eroa signaalin voidaan nähdä välillä hajanainen ja fragmentoimattoman koettimet arvioitaessa värjäytyminen normaalissa paksusuolen, munuaisen, maksan, pernan ja nielurisojen (tietoja ei ole esitetty). Toinen lähestymistapa oli tutkia, pidemmät koettimet olisi vaikutusta ISH-signaalin. Kolme eri koettimia kohdistaminen
PDGFRB
(verihiutaleperäinen kasvutekijäreseptori beta), jossa on 500 bp, 1000 bp ja 1500 bp syntyi. Mitään merkittävää eroa signaalin välillä koettimen pituuksia voidaan nähdä, kun arvioidaan värjäämällä munuaisten glomerulusten, mutta taustalla nostettiin 1000 bp ja 1500 bp koettimet verrattaessa sense- ja antisense-RNA-koettimia (tuloksia ei ole esitetty) [7].
hyväksyminen GenePaint järjestelmä ihmisen kudosmatriisien
helpottamiseksi laajamittainen lähestymistavan optimointi proteinaasi K pitoisuuden suoritettiin. Kolme geeniä erilaisia ekspressiotasoja,
PDGFRB, KRT17
ja beeta aktiini (
ActB
), valittiin ja arvioitiin kudoksen microarray normaali paksusuoli, munuaiset, maksa, perna ja nielurisojen. Testatuilla pitoisuuksilla olivat 2,5, 5, 10, 20, 40, 60, 80 ja 100 ug /ml. Sillä
ActB
pitoisuudeltaan 40 ug /ml riitti antamaan selkeää ja erillistä signaalia vaikuttamatta kudosmorfologia. Sillä
KRT17
ja
PDGFRB
, proteinaasi K pitoisuus 60 ug /ml oli optimaalinen, kun verrataan kaikkia eri kudosten array ja valittiin siksi lisäkokeita. Visualisoida geenit ilmentyvät alhaisella tasolla, kaksinkertainen sykliä tyramide perustuvan signaalin vahvistus otettiin käyttöön. Lisäksi on tärkeää tuoreen kudosleikkeiden on varmistettu, koska vähän tai ei lainkaan signaalia nähtiin kudosleikkeiden yli 3 viikkoa (tuloksia ei ole esitetty).
validointi ISH värjäytymisen kudosmatriisien
Peräkkäiset kudoksen leikkeitä värjättiin käyttäen sense koetin ISH, antisense koetin ISH ja immunohistokemia verrata geenin ilmentymisen mRNA ja proteiini tasolla. Jotta osajoukko analysoitiin geenien (
cHga
,
KRT17
,
LYN
,
MKI67
,
PDE6A
,
PECAM1
,
PTPRC
ja
VIL1
), immunohistokemia-pohjainen proteiini ilmentymiskuviot ovat tunnettuja ja vakiintuneita. Nämä tavoitteet käytettiin vertaamaan ilmentymistä proteiinin ja vastaavan selostukset validointiin skaalautuva ISH menettelyä. Välituote hehkulanka proteiini KRT17 oli, kuten odotettua, ilmentyy voimakkaasti laaja valikoima eriytetyn epiteelisolujen, kuten on osoitettu värjäämällä nielurisojen (kuvio 1, A-C ja kuvio S3) ja keuhkoputki (kuva S3). CHga, markkeri neuroendocrine erilaistumista, osoitti vahvaa värjäytymistä neuroendokriinisoluissa suolen (kuvio 1, D-F), haiman saarekkeiden ja umpirauhasille kuten lisäkilpirauhasen (kuva S3). Hyvin tunnettu leviämisen marker Ki-67 on ilmaistu G1, S, G2 ja M vaiheissa solusyklin ja usein käytetään arvioimaan lisääntyvien solujen kasvaimiin. Lisääntyvät solut pohjaan normaalin paksusuolen kryptissa (kuvio 1, G-I), peräaukon häpy ja nielurisojen (kuva S3) esitetään. ISH signaali Ki-67 paikallistettiin tietyille alueille tuman kanssa hiiren tiedot luetaan [8]. PECAM1 ilmentyi endoteelisolujen useimmissa elimissä, esimerkkinä runsaasti verisuonittunut istukan (kuvio 1, J-L), kohdun limakalvon (pre vaihdevuodet) ja imusolmukkeesta (kuvio S3). VIL1 on proteiini ilmentyy brush border epiteelin ja siten erittäin ilmaistu munuaistiehyessä ja rauhasten solujen ruoansulatuskanavassa, kuten paksusuolen (kuvio 1, M-O), liite ja pohjukaissuolen (kuvio S3). Lisäksi sillä
cHga
,
PECAM1
ja
VIL1
, kaksi riippumatonta RNA-koetin paria (taulukko S1) käytettiin rajat validointi koetin spesifisyys. Kudos ja solujen jakaantumiskuvio ilmaisun sekä mRNA ja proteiini olivat samanlaiset näille viidelle geenien, vahvistaa herkkyys ja spesifisyys automaattisen in situ -hybridisaatiolla FFPE TMA. Sillä PDE6A, IHC osoitti värjäämällä keuhkorakkuloihin, luurankolihasten, keuhkoputken ja solujen munuaiskerästen. mRNA ja proteiini korrelaatio havaittiin ainoastaan kahdessa tapauksessa luustolihasten. Perustettu vasta-aineita LYN ja PTPRC osoitti erillinen kalvomainen ja sytoplasmista värjäytymistä imukudos- ja rauhasten solujen ruoansulatuskanavassa, ja valikoiva sytoplasmista värjäytymistä imukudoksessa, vastaavasti. Ei korreloi proteiinin ja mRNA: n ilmentymisen (kuva S5). Sillä
PTPRC
puute ISH värjäytyminen rajat validoitu kaksi erillistä RNA koetinparia (taulukko S1).
ISH signaalit nähdään sininen /violetti värjäys ytimien vastavär- metyyli vihreä, kun taas IHC signaalit ovat ruskeat hematoksyliinillä vastavärinä.
A-C
: Keratiini 17 (
KRT17
) in nielurisojen,
D-F
: kromograniini a (
cHga
) paksusuolen,
G-I
: Ki-67 (
MKI67
) paksusuolen,
J-L
: Verihiutaleiden endoteelin adheesiomolekyyli 1 (
PECAM1
) istukassa
M-O
: villiiniä-1 (
VIL1
) paksusuolen. Kudosmatriisien hybridisoitiin sense-ohjaus koettimilla (A, D, G, J, M), antisense-koettimia (B, E, H, K, N), tai immuno- vasta-aineiden kanssa (C, F, I, L, O) kohdistaminen kunkin transkriptien tai proteiini tuotteita. Kaikki kuvat on saatu diat skannattiin 40 × tavoite.
validointi uuden vasta-aineen biomarkkereiden mukaan ISH on kudosmatriisien
Vasta-johdettu ilmentymisen Human Protein Atlas Ehdotettiin joko kudosspesifisiä ilmentymistä tai kliinisen käyttökelpoisuuden syöpädiagnostiikassa tai terapiaa romaani otaksuttu biomarkkerit
BRD1
,
EZH2
,
FAM174B
,
GAD1
JAK3
,
JUP
,
MIXL1
,
SATB2
ja
ZNF473
. Siksi analyysi niiden
in situ
mRNA ja proteiinin ilmentyminen normaaleissa kudoksissa voisi tarjota validointi Vasta-aineen spesifisyyden. BRD1 tiedetään immunohistokemiallisesti ilmentyvän Purkinjen ja hermosoluissa CNS solut seminiferus kanaviin kiveksissä, rauhas solujen eturauhanen, lisämunuaisen ja liite, ja makrofagit keuhkoissa, joka vahvistettiin ISH (kuvio 2, A-C ja kuvio S4). EZH2 on potentiaalinen syövän biomerkkiaine, kuten yli-ilmentyminen ydin- proteiinin nähdään erilaisia aggressiivisia syöpiä, mukaan lukien rintasyöpä, eturauhassyöpä ja glioblastoma multiforme [9]. Geenien ilmentyminen havaittiin molemmissa transkripti (sytoplasminen värjäys) ja proteiini (tumavärjäystä) rauhas soluissa liitteessä (kuvio 2, D-F), pohjukaissuoli ja munanjohtimen (kuva S4), solut seminiferus kanaviin kiveksissä ja myosyyteistä heart lihaksia. JUP ehdotti IHC olla kudosspesifisiä biomarkkereiden ilmaistuna adnexal ja orvaskeden solujen ihon, joka vahvistettiin ISH (kuvio 2, G-I) ja squamous epiteelisoluissa nielurisojen (kuva S4). SATB2 on uusi biomarkkereiden ja peräsuolen syöpään [10], jossa geeniekspressioprofilointi on osoittanut yhdistys transkription downregulation metastasiaa ja huonon ennusteen [11]. Vasta-aineita SATB2 osoittivat tuman värjäytymisen rauhas soluissa alemman maha-suolikanavan, mukaan lukien paksusuolen imukerässoluista (kuvio 2, L). Samanaikainen array ISH vahvisti SATB2 transkriptin ilmentymistä sytoplasmassa rajoittuu epiteelin liite, paksusuoli (kuvio 2, J-K) ja peräsuolen (kuva S4), mutta ei muihin elimiin. Validointi näistä neljästä uusien biomarkkereiden, kaksi riippumatonta RNA-koetin paria käytettiin kutakin geeniä (taulukko S1). GAD1 osoittivat samanlaisia ISH ja IHC värjäyksen Purkinjen soluissa ja solujen molekyyli kerros pikkuaivot, mutta ei korrelaatiota ei havaittu muissa kudoksissa. Spesifisyys uusia vasta-aineita on
FAM174B
,
JAK3
,
MIXL1
ja
ZNF473
ei voitu todentaa ISH (kuva S5). Sillä
JAK3
puute ISH värjäytyminen rajat validoitu kaksi erillistä RNA koetinparia mutta
FAM174B
,
MIXL1
ja
ZNF473
, vain yksi anturi pari voitaisiin suunnitella johtuen joko liian lyhyt proteiinia koodaavat alueet tai liian suuri homologia muiden geenien (taulukko S1).
ISH signaalit nähdään sininen /violetti värjäys ytimien vastavär- metyyli vihreä, kun taas IHC signaalit ovat ruskeat hematoksyliinillä vastavärinä.
A-C
: Bromodomain sisältää 1 (
BRD1
) in lisämunuaisen,
D-F
: histoni-lysiini N-metyylitransferaasin (
EZH2
) liitteessä (ydin- ja sytoplasmista värjäytymistä proteiinia ja mRNA, vastaavasti),
G-I
: Junction plakoglobin (
JUP
) ihon,
J-L
: Special AT-rikas sekvenssi-sitovan proteiinin 2 (
SATB2
) paksusuolen (ydin- ja sytoplasmista värjäytymistä proteiinia ja mRNA, vastaavasti). Kudosmatriisien hybridisoitiin sense ohjaus koettimilla (A, D, G, J), antisense (B, E, H, K), tai immuno- värjättiin vasta-aineilla (C, F, I, L) kohdistaminen vastaavaan transkriptien tai proteiinituotteiden . Kaikki kuvat on saatu diat skannattiin 40 × tavoite.
Parallel analyysejä SATB2 proteiinin ja transkripti ilme FFPE peräsuolen syövän paneelit
Proteiinin ja mRNA ilmentymistä SATB2 arvioitiin kolorektaalisyövissä käyttäen erilaisia kattaa 60 primaarikasvaimille kahtena kappaleena. Lisäykset suoritettiin perustuu kolmen luokan mittakaavassa. Yksi pari ei sisältänyt kasvain kudosta, ja jäljellä 59 näytettä, 44 osoitti täydellistä vastaavuutta välillä IHC ja ISH ilmentymistä rauhas soluissa (kuva 3). Kaksitoista osoitti semi konkordanssin kuin värjäytyminen havaittiin mutta eriasteisesti taas 3 näytettä ei osoittanut korrelaatiota. Välinen sopimus proteiinin ja mRNA: n ilmentymisen malli havaittiin yhteensä 56 näytettä (Cohenin kappa testi, κ = 0,68).
ISH signaalit nähdään sininen /violetti värjäys ytimien vastavär- metyyli vihreä, kun taas IHC signaaleja ovat ruskeat hematoksyliinillä vastavärinä. Kudosmatriisien hybridisoitiin sense kontrollikoettimen (A, D, G, J), antisense-koetin (B, E, H, K) tai immunovärjättiin vasta-ainetta (C, F, I, L). Kaikki kuvat on saatu diat skannattiin 40 × tavoite.
Keskustelu
skaalaus ISH lähestymistapoja geeniperimä tai exome laajuinen analyysit vaatii putkistojen koetinsynteesimenetelmiä, hybridisaatio, analysointi ja merkintä. Kun taas paljon kentällä työtä on tehty osana suuri vapautus transcriptome tutkimuksia jäädytetty kudoksia, muutokset ovat tarpeen onnistuneen ja toistettavissa ISH FFPE materiaaleja. Sillä facile koetinsynteesimenetelmiä, voimme päätellä, että huolellinen tietotekniikan yhdistettynä käyttämällä yhdistettyä ihmisen cDNA-kirjastosta (MegaMan) merkitsee korkea ensikierron onnistumisaste anturi malliin sukupolvi. Tämä cDNA-kirjasto sisältää mRNA 32 ihmisen kudoksista ja 34 ihmisen syövän solulinjoista takaa hyvän edustuksen selostukset monipuolisia ekspressiotasot ja silmukointivariantit. Samanaikaisesti projekteja, tämä lähestymistapa on onnistuneesti käytetty tuottamaan yhteensä 700 koettimien kanssa ensikierron onnistumisprosentti 95% (dataa ei ole esitetty) .Essential tekijöitä onnistuneen värjäys, jotka poikkeavat aikaisemmin julkaistujen menetelmien mukaisesti käyttämällä pakastetut kudokset käyttö juuri leikattu kudos, koska vähän tai ei lainkaan värjäytymistä havaittiin vanhemmat FFPE kudosleikkeiden johtuen mahdollisesti hapettumisen RNA avoimelle pinnalle tai epätyydyttävä kiinnittäminen, jotka koskevat RNA laatu, suurempi pitoisuus proteinaasi K, ja kaksi sykliä tyramide biotiini -pohjainen signaalin vahvistus. Vaikka tämä voi aiheuttaa hieman korkeampi taustatasoja, se on kokemuksemme kätevä tapa lisätä signaalin voimakkuutta.
spesifisyys ja herkkyys ISH on arvioitu perusteellisesti värjäämällä peräkkäistä leikettä samasta TMA kattaa ~ 40 normaalin kudoksen tyyppejä ihmiskehossa. ISH ja IHC värjäytymiskuvioissa
KRT17
,
cHga
,
MKI67
,
PECAM1
ja
VIL1
olivat identtisiä poikki kudosta tyyppejä, valikoima edustavia näytteitä on esitetty kuviossa 1 ja kuviossa S3, jolloin saadaan vahva validointi ISH lähestymistapaa. Tämä korkea konkordanssia hyväksyy aiempien havaintojen hiiren transcriptome projekteja. Kuitenkin paljon tarvitaan parannusta mahdollistaa tehokkaamman tietojen louhinta ISH ja IHC on standardoitu ontologian varten merkinnästä ihmiskudosten, analogisesti EMAP hiiren anatomia ontologian [3].
Vasta herkkyys ja tarkkuus on tärkeä huolenaihe immuunihistokemiallisessa, erityisesti suuren mittakaavan hankkeissa, joissa useat vasta-aineita tuotetaan kohti tavoitteita tuntemattomalla ilme kuvioita. Spesifisyys validointi vasta diagnostisten grade voidaan suorittaa saamalla hyvin samanlainen värjäyskuvion vasta-aineen kanssa eri epitooppiin saman antigeenin [6], menetys signaali knock-out hiiriä tai muu malli organismista tai hyvin samankaltainen värjäyskuvion jossa
in situ
hybridisaatio. Me täällä osoittaa toteutettavuus jälkimmäisen lähestymistavan organismin mittakaavassa ihmisen, koska TMA kattaa lähes kaikki normaaleissa kudoksissa voidaan analysoida yhdessä ainoassa kokeessa. Pystyimme tarkistaa spesifisyys uusien vasta-aineiden
BRD1
,
EZH2
,
JUP
ja
SATB2
, ja kaksi riippumatonta RNA koetin paria, vahvistetaan, että ISH voi tarjota riippumatonta spesifisyyttä validointi. Valikoima edustavien näytteiden nähdään kuvioissa 2 ja S4. Samanaikaisesti kokeissa emme pystyneet vahvistamaan spesifisyyden uusia vasta-aineita on
FAM174B
,
JAK3
,
MIXL1
ja
ZNF473
(kuva S5) . Puoliksi korrelaatio mRNA ja proteiini ilmaisun
GAD1
ja
PDE6A
voi johtua joko vasta-ominaisuuksien tai eroja transkription ja translaation prosesseja. Puute korrelaatio mRNA ja proteiini ilmaisun
LYN
ja
PTPRC
voi johtua biologisista ja teknisistä syistä. Vasta-aineet ja
LYN
ja
PTPRC
kohdistaminen kaikki tunnetut isoformit proteiinien ja RNA-koetin parit sijaitsevat alueilla, jotka ovat läsnä kaikissa tunnetuissa selostukset. Myös PTPRC, kaksi riippumatonta RNA-koetin paria käytettiin, mikä osoittaa puute ISH värjäytymisen välillä muun TMA jäljittelee. Olemme siis sitä mieltä, että puute korrelaatio mRNA ja proteiinin ilmentyminen on todennäköisesti johtuu biologisista syistä, kuten transkription jälkeinen, translaatio- ja translaation jälkeiset modifikaatiot vaikuttavat mRNA ja proteiini. Myös mRNA rappeutuminen ja proteiinin puoliintumisaika voi olla vaikutusta mRNA ja proteiini korrelaatio. Muut lähteet poikkeavat toisistaan IHC ja ISH voi olla puute herkkyys tai spesifisyys joko yksi lähestymistavoista; Tämä mahdollistaa tulkinta yhtäpitävät värjäyskuviot tukevan vasta spesifisyyden ja discordant kuviot spesifisyyden puutteen. Suuren mittakaavan ponnistelujen vasta kanssa yhtäpitävät ISH värjäyskuviot tulee priorisoida jatkotutkimuksiin vastakohtana vasta-aineiden ristiriitainen tai puuttuu ISH värjäystä.
SATB2
, ydinvoima matriisi liittyvän transkriptiotekijän ja jäsen perheen erityisen AT-rikas sitovia proteiineja, on äskettäin osoitettu olevan ilmentyy normaaleissa soluissa alemman maha-suolikanavan ja syöpäsoluissa kolorektaalisen alkuperää. Johtuen erittäin spesifinen ydin- ekspressiota normaaleissa ja pahanlaatuisten solujen ruoansulatuskanavassa, SATB2 proteiinin ilmentyminen on ehdotettu kliinisesti käyttökelpoinen diagnostinen biomerkkiaine ja peräsuolen syövät, kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä maailmassa [10]. Cohenin Kappa suoritettiin määrittämään välisen IHC ja ISH värjäys, joka osoittaa välisten hyvien Räter luotettavuutta. Skaalautuvaa teknologia Tässä esitetyt mahdollistaa geeniperimä ilmentyminen analysoidaan ihmisen kudosmatriisien. Me kuvitella, että tyrosiini kinome, tyrosiini phosphatome, muita geenejä syövän polkuja, sekä lukuisia uusia ehdokas syövän geenien johdetut exome ja Genomikartoituksen muodostavat ensisijassa laajamittaista
in situ
hybridisaatioon perustuva luonnehdinta. Ehdotamme, että kattavasti ja järjestelmällisesti kartoitus ilmaisun
in situ
normaaleissa ja pahanlaatuisen ihmisen kudosten solutyyppi resoluutio antaa arvokasta tietoa, erityisesti syövän lääkekehityksessä koska tulokset voivat tukea ennustaa vaikutuksia, ohjaavat repositioning kohdennettua huumeita, ja auttaa ennustamaan vastaus estävien lääkkeiden useita eri molekyyli tavoitteita. Se tarjoaa myös teknisen pohjan transkriptioekspressiokuvio kartoituksen ihmisen koodaavan geenien, ja mahdollisesti myös muita RNA-lajien ja systemaattinen koko genomin lähestymistapoja.
Materiaalit ja menetelmät
Ethics lausunto
käyttö HPA kudosmatriisien tässä tutkimuksessa kuuluu HPA eettinen lupa (EPN Uppsala 2002/577, 2005/338) ja eettinen lupa tutkijoille (EPN Uppsala 2007/116). Identiteetit puettu kudosnäytteitä ei tiedetä Tutkijoiden eivätkä ne ole päästää julkisuuteen.
Probe sukupolven
koetin sukupolvi menettely on hahmoteltu kuvassa S2. Kehitimme talon ohjelmisto, joka valitsee transkriptin alueet soveltuvat Hybridisaatiokoetin muotoilun kiinnostavat geenit minimoimalla homologian selostukset muiden geenien ihmisen RefSeq transcriptome, varmistaa, että koetin sekvenssit sisältyvät RefSeq selostukset kiinnostavan geenin , ja myös alueet span eksonin rajoja. Kaksi itsenäistä PCR-alukesarjat monistamiseksi 500-600 nt tuotteet tuotettiin kullekin geenille käyttämällä Primer3 [12]. T7-promoottorin sekvenssi (5′-GCGTAATACGACTCACTATAGGG-3 ’) on sisällytetty 5’-pään eteen tai taakse aluke, vastaavasti, tuottamaan sense- tai antisense-ribokoettimella mallin. Kaikki alukepareja käytetään koetin sukupolven on esitetty taulukossa S1.
Stratagene-yhtiön MegaMan ihmisen transcriptome kirjasto, kokoelma cDNA luotiin käyttäen mRNA: 32 ihmisen kudoksista ja 34 ihmisen syöpäsolulinjoissa, käytettiin PCR (www. genomics.agilent.com). Kukin reaktio sisälsi 2 ui 10 x PCR-puskuria (166 mM (NH
4)
2SO
4, 670 mM Tris pH 8,8, 100 mM 2-merkaptoetanolia, 67 mM MgCI
2), 2 ui dNTP: itä (10 mM, GE Healthcare, Uppsala, Ruotsi), 1,2 ui DMSO: ta (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), 0,4 ui aluketta (50 uM, Sigma-Aldrich), 0,4 ui reverse-aluke (50 uM, Sigma-Aldrich), 0,2 ui Taq-polymeraasia (5 U /ul, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 1 ui MegaMan ihmisen transcriptome kirjasto (160 ng /ul, (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA)) ja MilliQ vettä tilavuuteen 20 ui. Kosketuskohta PCR-olosuhteet sisältyvät hehkutus lämpötila vaihtelee 64 ° C: sta 57 ° C; 96 ° C 2 min; 3 sykliä, joissa 96 ° C 10 s, 64 ° C: ssa 10 s ja 70 ° C: ssa 30 s; 3 sykliä, joissa 96 ° C 10 s, 61 ° C: ssa 10 s ja 70 ° C: ssa 30 s; 3 sykliä, joissa 96 ° C 10 s, 58 ° C: ssa 10 s ja 70 ° C: ssa 30 s; 41 sykliä 96 ° C: ssa 10 s, 57 ° C: ssa 10 s ja 70 ° C: ssa 30 s, ja lopullinen laajennus 5 minuutin ajan 70 ° C: ssa. PCR-tuotteet ajettiin 1,25% agaroosigeelissä tuotteen koko vahvistusta. Sense ja antisense ribokoettimilla leimattiin digoksigeniinillä kertyi
in vitro
transkriptio PCR-tuotteiden DIG RNA merkintöjä sekoitus (Roche, Rotkreuz, Sveitsi) kanssa reaktion kokonaistilavuus on 5 ui. Yksi ug kutakin RNA-koetin ajettiin 6% TBE-Urea geeli (Invitrogen) koon vahvistusta. Varastot tehtiin laimentamalla RNA-koettimien kanssa MilliQ vettä 200 ng /ul ja varastoidaan -80 ° C. Koetin toimivia ratkaisuja on 20 ng /ul tehtiin kantaliuoksesta ja varastoidaan -20 ° C: ssa.
RNA-koettimet olivat hajautuneet käyttämällä kahta eri lähestymistapaa. Alkalisen katalysoima pirstoutuminen, jolloin fragmentit vaihtelevat 50-150 bp, RNA-koettimet pilkottiin 0,2 M natriumkarbonaattia (pH 10,2) 60 ° C: ssa. Inkubointiaika lasketaan t = L
0-L
f /
k
L
0L
f, missä t on inkubointiaika minuutteina, L
0 ja L
f ovat alun ja lopun pituudet anturi kb, ja
k
on nopeusvakio hydrolyysin (noin 0,11 kb
-1min
-1). Reaktiot pysäytettiin lisäämällä natriumasetaattia (pH 4,7) ja näytteet saostettiin etanolilla [13]. Yksi ug kutakin RNA-koetin ajettiin 6% TBE-Urea geeli koko vahvistusta. Metalli-ionin katalysoima pirstoutuminen, jolloin fragmentit välillä 60-200 bp, RNA-koettimet inkuboitiin 100 mM sinkkikloridia 100 mM Tris-HCI (pH 7) 70 ° C: ssa 15 minuutin ajan. Reaktiot pysäytettiin 0,5 M EDTA (pH 8) [14]. Yksi ug kutakin RNA Koetin ajettiin 6% TBE-Urea geeli koko vahvistusta.
Kudospreparointi
kudosmatriisien käytettiin standardin paneelit käytetään immunohistokemia Human Protein Atlas projekti (www.proteinatlas.org). Nämä paneelit kattavat kolmena 1 mm ytimet 48 eri tyyppisiä ei-pahanlaatuisten ihmiskudoksen [15] ja kahtena 1 mm ytimet ensisijainen peräsuolen syöpä [10]. Kudossiruina kanssa FFPE kasvain ja normaali leikeltiin 6 pm ja kiinnitetty Superfrost Plus mikroskoopin.
In situ -hybridisaatio
Kudosleikkeitä poistettiin vaha ksyleenillä, jonka jälkeen nesteytys on porrastettu etanoliin sarja (100%, 95% ja 80%, 3 min kukin). Hybridisaatio on automatisoitu käyttäen Tecan GenePaint (Tecan Ag, Männedorf, Sveitsi) oleellisesti, kuten on kuvattu [2], [4], [16]. Kaikki toimenpiteet suoritettiin huoneenlämpötilassa, ellei toisin mainita. Lyhyesti, endogeeninen peroksidaasiaktiivisuus estetty 0,7% H
2O
2 metanolissa, mitä seurasi proteiinien poisto 0,2 M HCI ja ruoansulatusta 60 ug /ml proteinaasi K: n (Roche). Kudosleikkeissä esi-hybridisoitiin hybridisaatiopuskuriin (Ambion, Foster City, CA, USA) ilman anturi 30 minuuttia ja sitten inkuboitiin 200 ng /ml digoksigeniinillä-leimattua ribokoettimella 4 tunnin ajan 64 ° C: ssa. Hybridisaation jälkeen kudosleikkeet pestiin 5 x suolaliuosta (SSC), 50% formamidi ja 0,1 x SSC. Havaita sitoutuneen koetin, anti-digoksigeniinivasta-ainetta (150 U /ml, Roche) konjugoituna piparjuuriperoksidaasiin lisättiin. Viiden pesun estopuskurilla, joka on tyramide biotiini-monistus vaihe suoritettiin lisätä in situ tunnistuksen herkkyys (Perkin Elmer, Waltham, MA, USA). Talletettu biotiini havaittiin alkalisella fosfataasilla konjugoidulla neutravidiini (2 mg /ml, ThermoScientific, Waltham, MA, USA), joka katkaisee kromogeenisen substraatin nitrosinitetratsoliumia (NBT) 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti (BCIP ) tuottaa sininen /violetti sakkaa paikalla hybridisaatio. 30 minuutin kuluttua kehityksen aikaa, kromogeeninen reaktio pysäytettiin inkuboimalla kudosleikkeitä puskurissa, joka sisälsi EDTA: ta, mitä seurasi kiinnitys 4% PFA. Tumat vastavärjättiin 2% metyyli vihreä ja dioja dehydratoitiin arvostellaan alkoholien ja asennettu hartsipohjaiset väliaineessa.
immunohistokemia
Lyhyesti, diat poistettiin parafiini ksyleenillä, sammutettua arvostellaan alkoholit ja blokattiin endogeenisen peroksidaasin 0,3% vetyperoksidia laimennetaan 95%: ista etanolia. Sillä antigeeni haku, joka on decloaking kammio (Biocare Medical, Walnut Creek, CA, USA) käytettiin. Objektilasit upotettiin ja keitettiin sitraattipuskurissa, pH 6 (Lab Vision, Värmdö, Ruotsi) 4 minuutin ajan 125 ° C: ssa ja sitten sen annettiin jäähtyä 90 ° C: ssa. Automatisoitu IHC suoritettiin oleellisesti, kuten on kuvattu [17], käyttämällä Autostaineriin 480 väline (Lab Vision). Kudosleikkeet inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla (taulukko S2) ja dekstraanipolymeerin visualisointi järjestelmä (UltraVision LP HRP polymeeriä, Lab Vision) 30 minuuttia kulloinkin huoneen lämpötilassa, ja lasit kehitettiin 10 min käyttäen diaminobentsidiiniä (Lab Vision) kromogeenina. Kaikki inkuboinnit seurasi huuhtelu pesupuskurissa (Lab Vision). Objektilasit vastavärjättiin vuonna Mayerin hematoksyliinillä (Histolab, Göteborg, Ruotsi) ja kansi putosi käyttämällä Pertex (Histolab) kuin kiinnitysväliaine.