Krooninen sairaus

tiivistelmä

hypoksian indusoima tekijä (HIF) signalointireitin on tärkeä kasvainsolujen rajoitetusti happea tarvikkeita, koska se on osoitettu olevan mukana prosessissa leviämisen ja angiogeneesiä. Koska sen keskeinen asema syövän biologian, vankka määrityksiä seuranta muutosten HIF ilmaus tarvitaan ymmärtämiseksi sen sääntelyä syövän sekä kehittää hoitoja, jotka kohdistuvat HIF signalointi. Kirjoittajat raportoivat uudenlainen HIF reportterikonstruktio sisältävä tandem vähintään HIF sitoutumiskohtien ylävirtaan EYFP koodaavan sekvenssin. Osoitamme, että reportterikonstruktio on erinomainen signaali taustan suhteen ja toimittaja toiminta on HIF riippuvainen ja suoraan korreloi HIF-proteiinin tasoja. Hyödyntämällä tätä uutta konstruktio, me analysoitiin HIF aktiviteettitasoa eri syöpäsolulinjoissa viljeltiin eriasteisia hypoksian. Tämä analyysi paljastaa yllättäviä tasyöpäsolulinja vaihtelua HIF toimintaa samalla tasolla hypoksian. Me osoittavat lisäksi, että kahdessa kohdunkaulan syövän solulinjoista, ME180 ja HeLa, eri HIF toiminnan tason havaittiin korreloivan tasot hsp90, kofaktorin joka suojaa HIF vastaan ​​VHL-riippumaton hajoamista. Tämä uusi HIF reportterikonstruktio toimii työkaluna nopeasti määritellä HIF aktiivisuuden tasoa ja siten terapeuttista kapasiteettia mahdollisten HIF repressorit yksittäisissä syövissä.

Citation: Zhou W, Dosey TL, Biechele T, Moon RT, Horwitz MS , Ruohola-Baker H (2011) arviointi hypoksian indusoima tekijä Levels in Cancer Cell Lines upon Hypoxic induktio käyttäminen Novel reportterikonstruktio. PLoS ONE 6 (11): e27460. doi: 10,1371 /journal.pone.0027460

Editor: Gangjian Qin, Northwestern University, Yhdysvallat

vastaanotettu: 4. toukokuuta 2011; Hyväksytty 17. lokakuuta 2011; Julkaistu: 23 marraskuu 2011

Copyright: © 2011 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat R01GM083867-01, R01GM097372-01 ja 1P01GM081619 National Institute of General Medical Sciences ja Breast Cancer Research Program Pilottihanke avustuksen HR-B. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Hypoksia on tunnettu pohjimmiltaan säädellä monin solubiologian. Suurin osa hapen niukkuuden vaikutuksilta liittyy hypoksian indusoima tekijä (HIF), joka on erittäin konservoitunut ja ratkaiseva hapen säädellään heterodimeerinen transkriptiotekijä, joka koostuu alfa (α) ja beta (β) alayksikkö. Molemmat alayksiköt kuuluvat PER-ARNT-SIM (PAS) ryhmä perus–helix-loop-helix (bHLH) perheen transkriptiotekijöiden [1]. Kaksi geeniä, jotka koodaavat nisäkkään HIFα alayksiköt (HIF1α, HIF2α) ovat hyvin tutkittu: HIF1α ilmentyy kaikkialla taas HIF2α näyttelytila ​​rajoitetumpaa kudosjakaumasta [2]. Normaaleissa happiolosuhteissa, HIFα läpi prolyyli hydroksylaatio ja sitoutuu ubikitiinipromoottori E3-ligaasia, von Hippel-Lindaun (VHL) proteiinia, joka johtaa polyubiquitination ja nopea proteosomal hajoaminen HIFα [3], [4]. Hypoksiaolosuhteissa, HIFα hydroksylaatio estyy, mikä johtaa kertyminen HIFα ja muodostumisen HIFα-HIFβ heterodimeerejä. Heterodimeerit edelleen monimutkainen kanssa koaktivaattoriproteiinin p300, ja sitoutuvat promoottorien HIF kohdegeenien aiheuttavan geenin ilmentymisen [5]. Lisäksi hypoksia, monia muita polkuja voi vaikuttaa HIF vakauttaminen [6], [7]. Kofaktoreita, kuten PACF P300 /CBP liittyvä tekijä [8] ja hsp90 [9], [10], myös helpottaa HIF vakauttamista ja tehostaa HIF toimintaa. Hsp90 on osoitettu suojaavan HIFα vastaan ​​VHL-riippumaton hajoaminen, jota voi esiintyä hypoksia [11].

hyvin tutkittu HIF kohdegeenien sisältyvät ne, jotka ovat mukana hapen toimitus ja solujen lisääntymistä, kuten vaskulaarinen endoteelikasvutekijä kerroin (

VEGF

) [12], [13] ja

p21

[14]. Lisäksi HIF helpottaa sopeutumista hapen puutteen säätelemällä geenien glukoosin oton ja aineenvaihduntaa, kuten hiilihappoanhydraasi (

CA9

) [15], joka ylläpitää solun pH

i homeostaasiin hypoksiaolosuhteissa. Se raportoi äskettäin, että HIF ja sen kohdegeenin,

Oct4

, vastaavat hypoksian aiheuttaman syövän kantasolujen fenotyyppiä, joka on ajatellut ajaa etenemistä ja aggressiivisuutta tietyt kasvaimet [16]. Koska sen keskeinen rooli angiogeneesissä ja kasvaimen etenemiseen, HIF on terapeuttisesti houkutteleva kohde ja estää HIF, varsinkin yhdistettynä perinteisiin hoitoihin, on osoittanut suotuisia vaikutuksia [17], [18].

tarkastella HIFs ”ajallinen ja tilan ilme kudoksissa, useita suoria ja epäsuoria toimittaja järjestelmiä kehitetään, jotta seurata HIF-proteiinin ilmentymistä

in vivo

. Joko täysipitkä HIF cDNA tai fragmentti alla hapen vaikutuksesta sääntely on liitetty fluoresoiva proteiini [19], tai tulikärpäsen lusiferaasi [20] rakentamiseen HIF-fuusioproteiineja. Vaihtoehtoisesti koska HIF fuusioproteiini tutkimukset eivät paljasta onko HIF kompleksi on kopiointia ajatellen aktiivisen, promoottori pohjainen toimittajat on myös kehitetty. Tyypillisesti 5-8 mallikertaa hypoksiavaste elementit (hRes) (5′-GCCCTACGTGCTGTCTCACACAGC-3 ’) 3′ tehostaja-alue ihmisen Epo-geenin, tai HRE peräisin VEGF (5’-CACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCT-3 ’) on liitetty rinnalla minimaalista promoottoria ajamaan ilmentymistä alavirran reportterigeenin [21], [22]. On syytä huomata, että nämä konstruktit, HRE sisältää ei vain HIF-1α tai HIF2α konsensus sitoutumiskohtia (5’-CGTG-3 ’ja 5′-TRCGTG-3’, vastaavasti), mutta myös

Epo

tai

VEGF

promoottori spesifisiä sekvenssejä. Äskettäin

Oct4

on osoitettu indusoituvan HIF hypoksiaolosuhteissa [16], mutta

Oct4

promoottori sisältää vain kolme toistoa CGTG, todellinen HIF sitoutumiskohtaan muttei HRE sekvenssit havaita joko in

Epo

tai

VEGF

promoottori.

jotta voidaan maksimoida spesifisyys ja herkkyys reportterikonstruktio, strategiaa käyttäen alkeellisin transkriptiotekijän sitoutumiskohta tandem in toimittaja on onnistuneesti käytetty aikaisemmin tapauksessa Wnt-reitin analyysi [23], [24]. Esillä olevassa tutkimuksessa käytimme samanlaista strategiaa rakentaa promoottorin, joka perustuu reportteri, vain joka sisältää vähän HIF1α ja HIF2α sitoutumiskohdat yhdessä (CGTGTACGTG) peräkkäin promoottorissa. Osoitamme, että tämä uusi HIF reportteri HIF sitovia toistoja (HBR) on hyvä signaali taustan suhteen ja signaali dynamiikkaa hapenpoistolla ja uudelleenhapetukselle. Osoitamme myös, että signaali on HIF riippuvainen kuten kävi ilmi HIF RNAi tutkimuksissa, ja se korreloi solun HIF-proteiinin tasolla eri solulinjoissa. Hyödyntämällä uutta konstruktio, osoitamme, että HIF toiminnan taso vaihtelee huomattavasti eri syöpäsolulinjoissa viljeltiin samassa määrin hypoksian. Olemme lisäksi paljastaa, että kahden kohdunkaulan syövän solulinjoista, erot HIF toiminnan tason korreloivat tason HIF kofaktorina, Hsp90, joka suojaa HIF vastaan ​​VHL-riippumaton hajoamista.

Tulokset

rakensimme lentiviruksen plasmidi, jossa ilmaisu tehostetun keltainen fluoresoiva proteiini (EYFP) oli alle asetuksen kahdentoista tandem-toistojen minimaalinen HIF-sitoutumiskohtia (CGTGTACGTG), jonka jälkeen vähän ihmisen tymidiinikinaasi (TK) promoottori (12U- HBR). Myös 770 bps on β-globiini intronisekvensseillä sisällytettiin välillä TK-promoottorin ja EYFP paremmin transkription EYFP (Kuva 1a, kuva S1). Koetta konstruktin toiminnon

in vitro

, me transdusoitiin viruksen HeLa-solut ja viljellä niitä joko normoxic (20% O

2) tai hypoksinen (2% O

2) kunnossa. 24 tunnin kuluttua, havaitsimme, että solut hypoksiaolosuhteissa tasaisesti ilmaistaan ​​EYFP (-70% of EYFP positiivinen), kun taas alle normoksia ainoastaan ​​saadut fluoresenssia suuresti vähentynyt intensiteetti (~6% of EYFP positiivinen kuva 1b ja kuvio S2).

3, 6 tai 12 tandem yksikköä HIF sitovien toistojen (3U, 6U tai 12U-HBR) ja TK minimaalinen promoottori yhdessä säädellä EYFP ilmaisua. b-c) optimointi määrää HIF sitoutumisen toistuu. b) 6U-HBR HeLa-solut puolestaan ​​EYFP päälle 2%, mutta ei 20% happea. Sama määrä soluja (5 x 10

4) maljattiin sekä kulttuurin ruokia ja mikroskopia ja FACS-analyysi tehtiin 2 päivän kuluttua; c) signaali-tausta-suhde edustaa FACS-analyysillä. HeLa-solut transdusoitiin HIF-HBR toimittaja lentivirus- partikkeleita 24 tuntia, ja sitten kasvatettiin normoksia (20% O2) tai hypoksian (2% O2) 48 tuntia ennen FACS-analyysiä. Suhteet ovat geometrisen keinoja EYFP intensiteetti 2%: sta 20% happea.

optimoida signaalin suhde taustaan, me vähensi HIF-sitoutumiskohtien, luoden siten HIF-toimittajat kanssa 3 tandem sitoutumiskohtia (3U-HBR) tai 6 sivustoja (6U-HBR) (kuva 1a). Kun analysoidaan HeLa-soluissa, havaitsimme, että 6U-HBR konstruktio saavuttaa parempi signaali-tausta suhde kuin 3U-HBR ja 12U-HBR konstruktioita (33,4, 5,8 ja 15,1, vastaavasti. Kuva 1c). Vertailla ja herkkyydestä muiden hypoksia toimittajille, me nimenomaan saatu yksi laajalti käytössä HIF toimittaja 5HRE_hCMV_Luc [25]. Sen jälkeen ohimenevä transfektoitu 5HRE_hCMV_luc reportteri HeLa-soluissa, havaitsimme 50-100 kertaa suurempi lusiferaasivaikutusta alle 2% O

2 verrattuna soluihin kasvaa 20% O

2, joka vastasi alkuperäisen havainnon. Vertailun vuoksi meidän HBR_eYFP toimittaja näyttää noin 30-40 kertainen nousu 2% O

2, kasvua, joka kuuluu samalla mittakaavassa nähty 5HRE_hCMV_luc toimittaja. Kun samankaltaisuus signaalin voimakkuus kuitenkin kaksi HIF reportterirakenteet eivät ole suoraan vertailukelpoisia, koska ne ovat eri selkäranka sekvenssit, eri minimaalinen promoottorit ja toimittaja geenit, jotka kaikki voi tehdä niistä erilliset käyttäytymistä ja dynamiikkaa hypoksiaolosuhteissa. Tässä tutkimuksessa, 6U-HBR käytettiin edelleen optimointia ja karakterisointia.

vieressä tunnettu dynamiikkaa konstruktin prosessissa hapen poistamiseksi ja uudelleenhapetukselle. Kun siirretään normoksia hypoksia (2%), 6U-HBR-HeLa-soluissa oli nopean toiminnan (kuva 2a); kuitenkin, kun siirretään hypoksia takaisin normoksia, fluoresoiva intensiteetti laski hitaasti (72 tunnin päästä pohjapinta tasolla kuva 2b). Saat konstrukti parempi kyky ajoissa heijastaa liikevaihdon HIF, muutimme EYFP ja tuotti horjuttaa version liittämällä hiiri ornitiinidekarboksylaasi 422-461 verkkotunnuksen, alue vastaa nopea hajoaminen proteiinin [26], että C-päähän of EYFP, siis luoda rakennelma 6U-epävakaiksi-HBR (6UD-HBR). Havaitsimme, että 6UD-HBR oli alentunut fluoresenssin mutta samanlaisia ​​dynamiikkaa nähdään 6U-HBR (kuvio 2a). Kun siirretään takaisin normoksia, fluoresoiva signaali 6UD-HBR solut osoittivat dramaattinen väheneminen saavuttaa alimmilleen 10 tuntia. Näiden havaintojen perusteella, 6U-HBR on herkempi havaitsemaan muutokset prosessissa hapen poistamiseksi samalla 6UD-HBR paremmin muutoksia prosessissa uudelleenhapetukselle.

5 x 10

4 solut maljattiin 35 mm levyt ja sitten viljeltiin joko normoksia (20% O

2) tai hypoksia (2% O

2). Eri ajankohtina, solut kerättiin ja vahvistettu FACS-analyysiä. Mean ja virhepalkkeja ovat kolmesta biologisesta toistuu.

Vahvista HIF-riippuvuutta reportteri, suoritimme RNAi kokeita kohdistaminen HIFs hypoksiaolosuhteissa. Kun kaatamalla kolme HIFs (HIF1α, HIF1β ja HIF2α), 6U-HBR-HeLa-soluissa hypoksiaolosuhteissa oli suuresti alentunut fluoresenssin, lähellä tasoa nähtävissä normoksia (kuva 3a-f, suunnilleen yhtä paljon soluja havaittiin a-d) . Lisäksi olemme osoittaneet, että yli-ilmentyminen ei-hajoavien HIF1α tai HIF2α yksinään oli riittävä aktivoimaan ilmaisu konstruktin (kuvio 4a ja 4b). Sen testaamiseksi aiheuttamaa signaalia HIFα yli-ilmentyminen (OE) oli suoraan aiheutunut kanoninen toimintaa HIFα toimme RNAi vastaan ​​olennainen kofaktori HIFα, HIF1β, vuonna HIFα OE soluissa. Olemme osoittaneet, että kun transfektoitu HIF1β RNAi, The EYFP intensiteetti aiheuttama HIFα OE väheni suuresti (kuvio 4b-d). On syytä huomata, että RNAi kokeet suoritetaan suurikapasiteettisten alustan, solut osoittivat samankaltaista kaikkialla kaivoja samassa hoitoryhmässä (kuvio 4b-d). Nämä kokeet osoittavat, sovellettavuutta ja herkkyyttä 6U-HBR konstruktin suurikapasiteettisten alustalla. Herkkyys konstruktin sekä HIF1α ja HIF2α vahvistettiin edelleen tulokset, kun kaatamalla yksittäisten HIFα tai HIFs erilaisten yhdistelmien HeLa-soluissa (kuvio S3). Kaiken kaikkiaan, osoitamme, että reportteri on suoraan tunnistava HIF signaloinnin soluihin.

6U-HBR transfektoiduissa HeLa-soluissa siRNA kolmea HIFs (HIF1α, HIF1β ja HIF2α) ovat EYFP negatiivisia alle hypoksia, osoitti sekä mikroskoopilla (ylempi paneeli a-d) ja FACS tulokset (alapaneeli e ja f). Sama määrä soluja (5 x 10

4) maljattiin kulttuurin ruokia ja mikroskopia ja FACS-analyysi tehtiin 2 päivän kuluttua siRNA transfektion.

a) 6U-HBR konstruktio A549 on aktivoitu joko ndHIF1α tai ndHIF2α, mutta ei tyhjällä vektorilla konstruktilla. b-d) HIF1β siRNA yksin pitkälti vähentää fluoresoivien signaalien aiheuttama ndHIF1α /ndHF2α yli-ilmentyminen (ndHIFα OE) HeLa-soluissa, mikä osoittaa, että EYFP signaalit ovat palautuvia manipuloimalla tasot HIF tekijöistä. Molemmat mikroskoopilla kuvia (b) ja fluoresoiva kvantifiointi (c ja d) on esitetty.

nisäkkäiden alkionkehityksen ja kehitys, kudosten kehittyä microenviroment erilaisilla happea. On osoitettu, että hypoksia, toisaalta, on välttämätöntä sydämen muodostumisen [27], [28], [29] ja endochondrial luun muodostumisen [30], [31], [32], [33]; kuitenkin, toisaalta, se heikentää rasvakudos kehittäminen [34], [35] ja iho myofibroblastin eriyttäminen [36]. Koska kriittinen rooli HIF signaloinnin hypoksia eräs keskeinen kysymys on, solut saavat kudosspesifisiä vastauksia niiden alhaisen happiympäristöön differentiaalisesti säätelemällä HIF-reitin. Sen määrittämiseksi, miten solut eri kudoksista peräisin reagoida hypoksia kannalta HIF tasoilla ja kaikissa toiminnoissa, tutkimme 5 6U-HBR karsinoomien solulinjoissa, eli 786 + VHL munuaisten adenokarsinooma, A549 keuhkokarsinoomakudoksesta, ME180 alkaen epidermoidikarsinooma vuonna kohdunkaula , U251 alkaen gliooma, ja HeLa kohdunkaulan adenokarsinooma. Soluja inkuboitiin eri happipitoisuus (20%, 5%, 3%, 2%, 1% tai 0,3%) ja 4 päivää, ja keskimääräinen 6U-HBR fluoresenssi määritettiin FACS-analyysillä. Nämä solut olisi voinut odottaa käyttäytyvän samalla tavalla hypoksisissa olosuhteissa johtuen siitä, että ne ovat sopeutuneet viljelyolosuhteisiin; kuitenkin, havaitsimme, että he vastasivat selvästi, samoin verran happea. Esimerkiksi ME180 ja HeLa molemmilla oli vähän vastakaikua 3% happea, mutta kun happipitoisuus oli alle 3%, ME180 näytteille dramaattinen kasvu signaalin, kun taas HeLa oli suhteellisen vähäistä lisäystä (kuvio 5). Toisaalta, signaalia U251 kasvoi hitaasti 5% ja 3% happea, lisää dramaattisesti 2% ja 1% happea, ja selvästi jatkoi kasvuaan jopa 0,3% happea (kuvio 5).

Viisi syöpäsolulinjoissa infektoitu 6U-HBR lentivirus viljeltiin erilaisissa määrin hypoksian, kuten 20%, 5%, 3%, 2%, 1% ja 0,3% O

2. Heidän EYFP voimakkuudet määritettiin kuluttua 4 päivän viljelyn FACS-analyysillä. Astetta hypoksian esitetään log suhteellisen O

2-tason normoksia (20% O

2).

Lisäksi todennettiin, että 6U-HBR signaalit näissä solulinjoissa korreloi solunsisäisten HIF-proteiinin tasoja. Koska 1% happea ympäristö näytteillä suurin ero 6U-HBR signaalien keskuudessa ME180, U251 ja HeLa-solut, käytimme tätä happipitoisuus määritystä HIF mRNA ja proteiini. Vaikka HIF1α mRNA-tasot olivat samanlaisia ​​joukossa näissä solulinjoissa, HIF2α mRNA-tasot vaihtelivat (kuvio S4), joka oli mukaisesti edellisessä tutkimuksessa [2]. Proteiinin tasolla meidän ensimmäinen osoitti, että neljä tuntia hypoksian aiheuttamaa korkeampi HIF1α proteiinin tasot ME180, U251 ja A549 kuin HeLa ja 786-O + VHL (kuva 6a-b). Koska on aiemmin raportoitu, että pitkäaikainen hypoksia, HIF1α proteiini hajoaa samalla HIF2α häviävän vähän muutosta [37], me arveltu, että ei ainoastaan ​​koko HIF-proteiinin tasot mutta myös vakauttamisen dynamiikka proteiinit ovat vastuussa eri 6U-HBR reportteri toimintaa näissä solulinjoissa. Siksi analysoi erot hajoamiskinetiikan of HIFα proteiinien kaikissa viidessä syöpäsolun linjat 1% happea. Tämä analyysi paljasti, että HIF1α HeLa-soluissa on vähemmän vakaana pitkäaikainen hypoksia kuin missään muissa solutyypeissä analysoitiin (kuvio 6c ja d). Verrattaessa HIF2α tasoa 1% hypoksia vs. normaxia, niiden erot näiden viiden solulinjoja on vähentynyt kannalta kokonaisproteiinin tasossa ja hajoaminen kuviot (kuva S5). Vaikka ei HIF1α proteiini havaittiin 786-O + VHL-solut, HIF2α proteiini indusoitiin hypoksia tässä solulinjoissa, explaning reagointikykyä tämän solulinjan 6U-HBR toimittaja (kuvio S5; kuvio 5). Kaikkiaan tiedot osoittavat, että korkeampi vakaampi HIFα proteiineja havaitaan ME180, A549- ja U251 verrattuna HeLa ja 786-O + VHL soluissa, mikä tukee havainnot paljasti 6U-HBR toimittajalle, että nämä viisi solulinjat näyttää selvästi HIF toimintaa samassa määrin hypoksian.

a) HIF1α in ME180, U251, A549, HeLa ja 786-O + VHL soluja 1% O

2 4 tuntia. b) kvantifiointi varten HIF1α proteiinin näytetään). Kvantifiointi suoritettiin skannattu elokuva kuvia saatu erillisistä western blotit. c) HIF1α tasot ja d) kvantifiointiin ME180, U251, A549, HeLa ja 786-O + VHL soluja 1% O

2 kolmena ajankohtana: 4 tuntia, 12 tuntia ja 48 tuntia, pitoisuuksiin verrattuna alle 20% O

2 verrokkeina.

Valitsimme HeLa- ja ME180 jatkotutkimuksiin, koska ne ovat molemmat kohdunkaulan syöpä solulinjoja, jotka ilmentävät hyvin erilaisia ​​vastauksia hypoksia. Jotta ymmärtäisimme sääntelyyn HIFα näissä kahdessa kohdunkaulan syövän solulinjoista, analysoimme mRNA microarray data aikaisemmin suoritettu näissä solulinjoissa 2% hypoksia [38]. Mielenkiintoista, tunnistimme hsp90 mRNA ilmentyy differentiaalisesti välillä HeLa- ja ME180. Ensin validoitu tämän toteamuksen reaaliaikaisella PCR-analyysi ja osoitti, että ME180 on korkeampi hsp90 sekä normoksia ja hypoksia (kuvio 7). Sen määrittämiseksi, onko korkeampi hsp90 vuonna ME180 voisi olla syy korkeampiin HIF aktiivisuus vähensimme hsp90 sitoutuminen HIF1α in ME180 inkuboimalla soluja 17-allyyliaminopyrimidin demethoxygeldamycin (17-AAG) 2% hypoksinen olosuhteet. 17-AAG estää ATP: n sitoutuminen hsp90, estäen vuorovaikutus hsp90 ja sen kohdeproteiinin [39]. Koska hsp90 vuorovaikutus HIF1α on osoitettu nostavan HIF1 vakautta hypoksia [11], 17-AAG pitäisi vähentää hsp90 riippuvainen HIF1 aktiivisuutta. Niinpä 6U-HBR ME180 inkuboitiin 17-AAG oli vähäisempää 6U-HBR reportteriaktiivisuutta kuin havaittiin kontrolleissa (kuva 8a). Lisäksi mRNA ilmentyminen HIF1α kohdegeenin CA9 väheni merkittävästi (kuva 8b), mikä viittaa siihen, että HIF aktiivisuus väheni ME180 kun hsp90 oli inaktivointia. Nämä tulokset tukevat hypoteesia, että ero hsp90 tasoilla on kausaalinen varten ero HIF aktiivisuuden havaittiin kahdessa kohdunkaulan syövän solulinjoista. Me sulkenut pois mahdollisuuden vähentämiseksi HIF toiminnan aiheuttama yleinen transkription säätelyyn soluissa osoittamalla stabiili ilmentyminen toisen endogeenisen taloudenhoito geenin molemmissa solutyypeissä (WYHAZ, kuva 8c).

Soluja inkuboitiin joko alle 1% hypoksia tai 20% normoksia 48 tuntia ennen kvantifiointiin hSP90 mRNA tasolla reaaliaikainen PCR. Virhepalkit esitetään näytteen keskiarvon keskivirhe (SEM) kolmesta itsenäisestä biologisesta kokeesta.

Tulokset kolmesta riippumattomasta kokeesta on esitetty yhteenvetona ja virhepalkit on esitetty näytteen keskiarvon keskivirhe (SEM ). a) fluoresenssivoimakkuuksien HeLa DMSO, ME180 DMSO ja ME180 100 nM 17-AAG 2% hypoksia on normalisoitu 20% normoksia. b) kertainen muutokset CA9 mRNA-tasojen normalisoitu 20% normoksia niissä soluissa, viittaavat siihen, että ero suhteen HIF aktiivisuus, on vähentynyt, kun läsnä on 17-AAG. c) stabiili ilmentyminen toisen taloudenhoito geeni, tyrosiini 3-mono-oksygenaasi /tryptofaania 5-mono-oksygenaasi aktivointia proteiini, zeta polypeptidi (YWHAZ), osoittaa yleensä normaalia transkription toimintaa niissä soluissa hoidettiin joko DMSO tai 17-AAG.

keskustelu

Täällä luomme ja luonnehtia uusi HIF reportterikonstruktio, jossa EYFP ilmentymistä säätelee tandem minimaalinen HIF1α ja HIF2α sitoutumiskohdista. Käyttämällä soluja, jotka on infektoitu lentiviruksen ja HIF-HBR konstrukti, osoitamme, että solut 6 tandem-toistojen kuin promoottori konstruktiin (6U-HBR) antavat paremman signaali-tausta-suhde kuin ne, joilla on 3 tai 12 toistoa. Myös kannalta reportteri kinetiikan, The 6U-HBR konstruktio saavuttaa voimakkaampi signaali prosessissa hapenpoiston, kun taas solut 6U-epävakaiksi-HBR konstruktio paremmin vastaamaan vähentäminen HIF tasojen prosessissa uudelleenhapetukselle. Lisäksi kautta siRNA tutkimuksia vastaan ​​HIF1α, HIF2α ja HIF1β sekä yli-ilmentymisen tutkimukset ndHIF1α ja ndHIF2α, me osoitamme, että konstrukti on HIF, ja sillä pystytään vastaamaan sekä HIF1α ja HIF2α. Hyödyntämällä 5 eri syöpäsolulinjoissa infektoitu 6U-HBR konstruktio, huomaamme että eri syövän solulinjaa on selvä EYFP signaaleja samoilla happipitoisuus, joka korreloi kokonaismäärä HIF1 α ja HIF2 α proteiineja näissä solulinjoissa.

Hyödynsimme reportteri tutkia eroa hypoksinen vasteen HeLa ja ME180 kohdunkaulan syövän solulinjoissa. Havaitsimme, että nämä kaksi syöpäsolulinjoissa on erilaiset 6U-HBR signaaleja, jotka korreloivat määrä HIFα proteiinien vasteena samalla tasolla hypoksian. Samoin eri käyttäytymistä välillä HeLa- ja ME180 hypoksiaolosuhteissa myös havaittu angiogeenisen kasvutekijän ilmentyminen [40], [41] sekä proteasomin, histonideasetylaasi- [42] ja Hsp90 toimintaa [43]. Joukossa, Hsp90 on erityisen kiinnostava. Mukaan edelliseen analyysi [43], osoitamme, että ME180 on korkeampi Hsp90 mRNA kuin HeLa sekä alle normoksia ja hypoksiaa. Korkeampi perustason HIF kofaktori Hsp90 in ME180 voisi edistää havaittiin korkeampi HIF toimintaa, koska hsp90 sitoutuminen HIF on raportoitu suojaamaan HIFα vastaan ​​VHL-riippumaton hajoaminen [9], [11]. Alhainen happipitoisuus inaktivoida PHD /VHL riippuvainen hajoamista HIF, jolloin vakiintui ja aktiivista HIF transkriptiotekijä. Kuitenkin HIFα lopulta hajoaa hypoksinen olosuhteissa. Tämä VHL-riippumaton hajoaminen HIF1α on osoittautunut RACK1 riippuvainen [11]. Hsp90 kilpailee RACK1 sitoutumisesta HIF1α, minkä vuoksi se suojaa HIF1α vastaan ​​hypoksinen hajoamista. Nykyisessä tutkimuksessa osoitamme, että ME180 soluja on korkeampi hsp90 ja vakaampi HIFα proteiineja verrattuna HeLa (kuvio 6). Olemme edelleen osoittavat, että vähentäminen hsp90 vuonna ME180 vähentää ero HIF tason ja aktiivisuuden verrattuna HeLa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että eri Hsp90 arvot voitiin kausaaliseksi eri HIF aktiivisuuden tasoja havaittiin kahdessa kohdunkaulan syövän solulinjoista samoissa tasolla hypoksian. On mielenkiintoista testata tulevaisuudessa siitä happi /PDH /VHL-riippumaton HIFα hajoaminen on yleensä keskeinen säätelijä HIF aktiivisuuden havaitut erot syövän solulinjoissa samoissa tasolla hypoksian.

On tiedetään, että kohdunkaulan syöpäsolut usein tartunnan onkogeenisen-tyyppinen ihmisen papilloomaviruksen (HPV) ja HeLa transformoidaan HPV18 kun ME180 mukaan HPV68. HPV erityyppisiä vaihtelevat ilmaisussa ja sääntelyn kaksi ensisijaista HPV onkogeenien, E6 ja E7 [44], jotka riittävät muuttamaan HIF-1α tasolla. HPV11 E6- ja HPV31 E6 voi stimuloida HIF-1α ilmentymisen seurauksena ubikitiinipromoottori riippuvainen hajoamista p53 [45], kun taas HPV16 E7 voi vuorovaikutuksessa Cullin-2 ubikitiinipromoottori ligaasilla kompleksi, joka välittää VHL-riippuvainen HIFα hajoaminen [46]. On mielenkiintoista paljastaa tulevaisuudessa, onko eri vastaukset hypoksia havaittiin HeLa ja ME180 liittyy tyypin onkogeenisten HPV he ovat sairastuneet.

Tässä tutkimuksessa me raportoimme uudenlainen HIF reportterikonstruktilla sisältävien tandem toistoja vähintään HIF sitoutumiskohtien ylävirtaan EYFP koodaavan sekvenssin. Osoitamme, että signaalin toimittaja on HIF riippuvainen ja korreloi solun HIF-proteiinin tasot eri solulinjoissa. Hyödyntämällä tätä uutta konstruktio, löydämme yllättävä vaihtelu HIF aktiivisuuden eri syöpäsolulinjoissa samoissa tasolla hypoksian. Tämä uusi HIF reportterikonstruktio voi toimia välineenä nopeasti määritellä HIF aktiivisuuden tasoa ja siksi terapeuttisia valmiuksia mahdollisten HIF repressorit yksittäisissä syövissä.

Materiaalit ja menetelmät

Solut, kudosviljelmässä ja hypoksia induktio

HeLa ja ME180 (kohdunkaulan karsinooma), A549 (keuhkokarsinooma), U251 (gliooma) soluja American Type Culture Collection (Rockville, MD). 786-O-solut transfektoitiin villityypin VHL saatiin tri William G. Kaelin Jr. (Dana-Farber Institute, Boston, MA). Syövän soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa (DMEM), johon oli lisätty penisilliiniä, streptomysiiniä ja 10% naudan sikiön seerumia (FBS, Invitrogen, Carlsbad, CA). Solut ohittaa trypsiini /EDTA (Invitrogen, Carlsbad, CA), kun ne saavuttivat 80% konfluenssin.

Hypoksia induktio

Soluja viljeltiin useiden kaasujen yrityshautomot (Sanyo, San Diego, CA ). Typpikaasua syötetään jaostoja aiheuttaa hallitusti alennettu happipitoisuus. Sillä normoksia, soluja viljeltiin hautomakoneisiin joka sisälsi 5% CO

2 ja ilmakehän O

2, noin 20%: sta 21% O

2. Koko tämän paperin ”normoksia” oli tarkoitettu niin 20% O2.

Lentivirusvektorikonstruktit plasmidikonstruktion

syntyy HIF toimittaja rakentaa kanssa HIF1α konsensus-sitoutumiskohta CGTG seurasi HIF2α sivuston TACGTG yhtenä yksikkönä sitoutumiskohdan for HIFα tekijät ja toistuva niitä samanaikaisesti 12 kertaa (12U-HBR), jossa on 5 emäsparia nukleotidien erilaisia ​​yhdistelmiä väli. Induktioelementin CACAG, DNA-elementti tarpeen hypoksinen induktio, oli tasaisesti insertoitiin koko sekvenssit kolme kertaa auttamaan induktio prosessissa. Lopullinen HIF-sitova sekvenssit suoraan syntetisoitiin Integrated DNA Technologies, Inc, Coralville, Iowa (kuva S1). TK minimaalisen promoottorin, jota seuraa 770 bps β-globiini intronisekvensseillä ja EYFP monistettiin pBARL plasmidista (kohteliaisuus tohtori Randall Moon laboratorio, University of Washington, Seattle, WA) ja liittyvät HIF-sitoutuvan sekvenssin sulattamalla PCR. HIF-TK-EYFP sekvenssit edelleen ligoidaan lentiviraalinen plasmidiin pRRL-cPPT–X-PRE-SIN [47] (: Dr. William Osborne laboratorio, University of Washington, Seattle, WA) välillä Clal ja XhoI sivustoja. 6U-HBR ja 3U-HBR rakennettiin samalla tavalla, paitsi HIF-sitova sekvenssit sisältävät vain kuusi sitovia toisintoa (6U-HBR) tai kolme toistoa (3U-HBR). Rakentaa 6U-HBR-horjutti versio, hiiren ornitiinidekarboksylaasi 422-461 verkkotunnuksen sekvenssit ensin monistettiin Plasmidi M38 TOP-dGFP (kohteliaisuus tohtori Randall Moon laboratorio) ja liitettiin sitten 6U-HBR konstruktista MluI jälkeen 3 ’EYFP sekvenssin.

Lentivirus tuotannon ja vakaa transduktio solulinjojen

Lentivirusvektorikonstruktit transfektoitiin FT293 solulinjoja (Invitrogen, Inc, Carlsbad, CA), jonka kalsiumfosfaattitransfektiolla tuottaa lentivirus hiukkasia. Erityisesti siirtämällä plasmidi (12U-HBR, 6U-HBR, 3U-HBR tai 6U-HBR-epätasapainoon konstrukti), pakkaus plasmidi, VSVG plasmidi ja REV plasmidi transfektoitiin yhdessä 23:15:8:11.5 suhteen, ja 25 ug sekalaisen transfektoitiin per 150 mm levy 1 ml 2X HBS ja 0,1 ml 2,5 M CaCl

2. Transfektion jälkeen alustat vaihdetaan 24 tunnin kuluttua ja virusten supernatantit kerättiin ja suodatettiin 72 tunnin jälkeen. Saada väkevää viruksen, viruksen supernatantit sentrifugoitiin edelleen 6100 rpm 17 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Sakka suspendoitiin uudelleen 1 x TBS: ää (50 mM Tris-HCI, pH 7,4, ja 150 mM NaCl) ja sitten varastoidaan -80 ° C: ssa ennen käyttöä. Transduktion solulinjat virus, sopiva määrä virusta suoraan lisätty osaksi median läsnäolon heksadimetriinibromidi 4 ng /ml (Polybrene, Invitrogen Inc, Carlsbad, CA) ja media vaihdettiin 24 tunnin kuluttua.

Fluoresenssi soluerotte- (FACS)

Solut analysoitavan trypsinoitiin levyiltä, ​​sentrifugoidaan alas ja sitten kiinnitettiin 4% paraformaldehydiä vähintään 30 minuuttia ennen analyysiä. Vakioasetukset sovellettiin solulaji kanssa kanavalle jännitteet ja vähintään 30000 solua analysoitiin kullekin kokeelle. FITC kanava käytettiin havaitsemaan EYFP fluoresenssi. FlowJo (Puu Star, Inc. Ashland, OR) käytettiin visualisoida tietojen ja FITC arvot määriteltiin geometrinen keskiarvo florescence voimakkuuden EYFP positiivisen populaation hypoksinen näytteitä. Näytteissä inkuboitiin 20% O

2, voimakkuudet määritettiin geometrinen keskiarvo florescence voimakkuuden EYFP koko väestöstä (EYFP negatiivinen).

Non-hajoava HIF (ndHIF) yli ilme

saamiseksi konstitutiivisesti stabiilin ekspression HIFα proteiinia, ndHIF yli-ilmentävien plasmidien (Addgene plasmidi 19005 ja 19006) käytettiin, jossa kaksi Proline sivustoja HIF cDNA muutettiin alaniiniksi, kuten aiemmin on kuvattu [48]. Retrovirus niistä tehdyt plasmidit infektoitiin HeLa ja A549-solulinjoissa, kun läsnä on heksadimetriinibromidi 4 ng /ml (polybreeniä, Invitrogen Inc. Carlsbad, CA) ja media vaihdettiin 24 tunnin kuluttua. Yli-ilmentyminen HIF1α ja HIF2α varmistettiin western blotit kuvan S6.

siRNA vastaan ​​HIF määritys

siRNA vastaan ​​HIF tekijä oli lahja Dr. Zhan Zhang [38]. siRNA: t olivat ohimenevä transfektoitiin soluihin 6-kuoppalevyn Lipofectamine 2000 (Invitrogen Inc. Carlsbad, CA) seuraten Lipofectamine 2000 ohje.