Krooninen sairaus

tiivistelmä

Keuhkosyöpä on yleisin syöpä. Eloonjäämisaste metastasoituneen keuhkosyöpä on -5%, joten vaihtoehtoisia hoitostrategioita tämän sairauden hoidossa kriittisesti tarvitaan. Viimeaikaiset tutkimukset viittaavat siihen, että rasva-biosynteesireittejä, erityisesti rasvahappojen synteesi ja desaturation, ovat lupaavia molekyylikohteista syöpähoitoa varten. Olemme aiemmin raportoitu, että esto stearoylCoA desaturaasi-1 (Scd1), entsyymiä, joka tuottaa kertatyydyttymättömiä rasvahappoja (MUFA), heikentää keuhkosyöpä soluproliferaatiota, selviytymisen ja invasiivisuus, ja dramaattisesti vähentää kasvainten muodostumista hiirillä. Tässä raportissa, osoitamme, että esto SCD vaikutus ihmisen keuhkosyöpä solut pienimolekyylinen SCD estäjä CVT-11127 vähensi lipidisynteesiin ja heikentynyt lisääntymistä estämällä etenemistä solusyklin läpi G

1 /S rajan ja liipaisu ohjelmoidun solukuoleman. Nämä muutokset johtuvat SCD salpaus oli täysin päinvastainen joko öljyhappoa (18: 1n-9), palmitoleiinihappo (16: 1n-7) tai cis-vakseenihappoa (18: 1n-7), mikä osoittaa, että cis-MUFA ovat keskeisiä molekyylejä syöpäsolun lisääntymistä. Lisäksi co-solujen käsittely CVT-11127 ja CP-640186, tietty CoA karboksylaasin (ACC) estäjä, ei voimistanut kasvua estävä vaikutus näiden yhdisteiden, mikä viittaa siihen, että esto ACC tai Scd1 vaikuttaa samanlainen tavoite kriittinen solu leviämisen, todennäköisesti MUFA, yhteinen rasvahappo tuotteen kautta. Tätä olettamusta tukee myös havainto, että eksogeeninen öljyhappo kääntää anti-kasvua vaikutusta SCD ja ACC estäjiä. Lopuksi, eksogeeninen öljyhappoa palautti maailmanlaajuisesti alentuneet solun lipidien soluissa meneillään tukkiminen SCD aktiivisuuden, mikä osoittaa, että aktiivinen lipidi synteesiä tarvitaan rasvahappo-välitteisen palauttaminen proliferaation Scd1-inhiboitu soluja. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot viittaavat siihen, että Scd1 ohjaa solusyklin etenemisen ja apoptoosin ja siten yleinen nopeus leviämisen syöpäsoluissa kautta MUFA aktivaatio lipidisynteesiin.

Citation: Hess D, Chisholm JW, Igal RA (2010) esto StearoylCoA desaturaasivaikutusta Blocks solusyklin etenemisen ja indusoi ohjelmoitua solukuolemaa Lung Cancer Cells. PLoS ONE 5 (6): e11394. doi: 10,1371 /journal.pone.0011394

Editor: Alfons Navarro, University of Barcelona, ​​Espanja

vastaanotettu: 11 huhtikuu 2010; Hyväksytty: 2 kesäkuu 2010; Julkaistu: 30 kesäkuu 2010

Copyright: © 2010 Hess et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain varoja School of Environmental ja biologiset tieteet ja Johanna ja Charles Busch Foundation, Rutgers University, ja Hatch avustusta Yhdysvaltain maatalousministeriön. Gilead Sciences Inc. toimitti CVT-11127 tueksi tutkimuksia ja JWC osaltaan tieteellisesti tulkintaan tietojen ja kirjallisesti käsikirjoituksen. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: JWC on työntekijä ja osakas Gilead Sciences Inc. (Palo Alto) ja keksijä koskevasta SCD liittyvä patentti ja useita SCD patenttihakemuksia.

Johdanto

ei-pienisoluinen keuhkosyöpä on johtava kuolinsyy syöpä teollisuusmaissa. 5 vuoden eloonjäämisaste on -15% potilailla, joilla keuhkosyöpä, ja laskee -5% potilailla, joiden metastaattisen syövän [1], siis uusia terapeuttisia lähestymistapoja perustuu uuteen molekyylikohteista tarvitaan. Viime vuosina tutkimukset ovat osoittaneet, että konstitutiivinen aktivointi lipidien biosynteesin, erityisesti synteesi tyydyttyneiden (SFA) ja monotyydyttymättömien rasvahappojen (MUFA), on kriittinen tapahtuma karsinogeneesissä [2], [3], mikä viittaa siihen, että lipogeeniset reittejä voi olla arvokas kohteita syöpään intervention. SCD on perheen Δ9-rasvahapon desaturaasi isomuotoja, joka muuntaa SFA osaksi MUFA [4]. Kaksi isoformia ovat läsnä ihmisissä; Scd1, joka on ilmaistu useimmissa aikuisen kudoksissa, ja SCD5, joka on erittäin ilmaistaan ​​alkion kudoksissa ja aikuisen aivoissa [5], [6]. On osoitettu, että pahanlaatuisiin keuhkosyövän soluissa korreloi positiivisesti Scd1 aktiivisuuden ja ilmentymisen [7]. Lisäksi kun useat syövän solulinjat seulotaan siRNA kirjasto vastaan ​​3700 geenejä tunnistaa sopivia kohteita aiheuttaen sytotoksisuutta ja solukuolemaa, Scd1 oli yksi tärkeimmistä tavoitteista tunnistettu [8]. Keuhkojen syöpäsoluja, kumota Scd1 geeniekspression johtaa heikentyneeseen de novo lipidisynteesiin, alennettua soluproliferaatiota menetys kiinnittymisestä riippumattoman kasvun ja korkeampia seramiditasot riippumattoman apoptoosin [9]. Nämä havainnot vahvasti sotkea Scd1 säätelyssä leviämisen, invasiivisuus ja selviytyminen syöpäsoluja.

Scd1 on tärkeässä osassa kasvaimen muodostumista ja kasvua. Hiirillä, taustalla taso Scd1 ilmaisun korreloi alttius maksan syövän synnyn; jyrsijöitä korkeampi Scd1 ovat alttiimpia syöpäsairauden [10]. Lisäksi käyttämällä kateenkorvattomiin ”nude” hiirillä, me osoitettu ensimmäistä kertaa, että keuhkosyövän soluja, joilla on alentunut taso Scd1 omaavat vakavasti heikentynyt kyky kasvaimen muodostumisen ja etenemisen kasvaimen kasvua, mikä viittaa siihen, että Scd1 on kriittinen tekijä kasvaimien syntyyn [11] .

aiemmin raportoitu [9], [11], [12], että Scd1, muuntamalla SFA osaksi MUFA, säätelee syöpäsolun lipogeneesiin by: i) säilyttämään ACC sen aktivoida tilassa vaikka muuntaminen kyllästetty acylCoAs jotka ovat allosteerinen estäjiä ACC osaksi MUFA; ii) edistää defosforyloitumista ja inaktivaation AMPK tärkein syöpäsolun polttoainetunnistimeen joka kohdistuu ACC Fosforylaatioon /inaktivaation ja iii) indusoimalla aktivoinnin Akt-reitin, joka aktivoi ekspressiota avaimen lipogeeniset entsyymien [3]. Vaikka nämä tulokset tukevat selvästi Scd1 keskeisenä säätelijänä lipogeneesiä syöpäsoluja, ne eivät täysin selittää, miten Scd1 ja lipogeneesiä vuorovaikutuksessa säätelyssä syöpäsolun mitogeneesissä ja transformaatio.

Tavoitteena tässä tutkimuksessa oli selvittää roolia Scd1 moduloinnissa solusyklin etenemisen. Käyttämällä uutta pienmolekyylisalpaaja- SCD aktiivisuuden totesimme, että akuutti farmakologinen esto Scd1 keuhkoissa soluissa estää kulun pyöräily solujen G

1 S-vaiheeseen ja indusoi sisäänkäynnin solujen ohjelmoidun solukuoleman. Lisäksi soluja inkuboidaan pienmolekyylisalpaaja- ACC, nopeutta rajoittava lipogeeniset entsyymi, joka on moduloitu Scd1 aktiivisuudesta, samanlaisia ​​muutoksia soluproliferaatiota ei havaittu. Yhdenmukainen rasvahapposynteesissä ja yhteinen tavoite polku, ei ollut synergistinen sytostaattinen vaikutus, kun soluja inkuboitiin sekä ACC ja SCD estäjä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

AG01518 normaali ihmisen ihon fibroblasteja saatiin Coriell (Camden, NJ). H460 ihmisen keuhkojen adenokarsinooma solut olivat ATCC (Manassas, VA). Soluviljelyalustoja ja muiden kulttuurin reagenssit olivat Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA). [6-

3 H] tymidiinin oli American Radiolabeled Chemicals, Inc. (St. Louis, MO). Ultrasuodatettu naudan sikiön seerumia (FBS), rasvahappo-vapaata naudan seerumin albumiinia (BSA), hiiren anti-β-aktiini monoklonaalinen vasta-aine, anti-hiiri-IgG-peroksidaasikonjugaatin, fosfataasi ja proteaasiestäjäseostabletit hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO ). Sykliini D1 ja CDK6-aineet olivat peräisin Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Soluviljely tarvikkeita, silikageeli 60 kromatografialevyt, ja analyyttinen-asteen liuottimet olivat Fisher Scientific, (Morris Plains, NJ). CP-640186 on ystävällisesti lahjoittanut Donnie Owens, Pfizer.

Soluviljely

Soluja kasvatettiin DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% FBS: ää, penisilliiniä (100 U /ml), streptomysiiniä (10 ug /ml), 1% ei olennaisia ​​aminohappoja ja 1% MEM-vitamiinin liuosta (kasvualusta), 37 ° C: ssa, 5% CO

2, ja 100%: n kosteudessa.

Soluproliferaatiomääritys

Solulisääntyminen korko määritettiin normaaleissa ihmisen fibroblasteissa ja H460 syöpäsolujen Kristalliviolettiliuos määritys [12]. Lyhyesti, solut kiinnitettiin metanolilla, värjättiin 0,1% kristallivioletilla tislattuun veteen ja huuhdottiin kolme kertaa vedellä. Väriaineen värjäytyneiden solujen liuotettiin 10% metanolia, 5% etikkahappoliuos ja kvantitoitiin spektrofotometrillä 580 nm: ssä. Arvo tyhjän hyvin vähennettiin kussakin tapauksessa. Tulokset ilmaistiin prosentuaalisena muutoksena solujen proliferaatiota suhteessa OD-arvot apuaineella hoidettuun kontrolliryhmään (100%). Näissä soluissa, Scd1 aktiivisuus kumottiin inkuboimalla pieni molekyyli SCD-estäjä CVT-11127 [13]. Pitoisuuksina kokeissa käytettävien CVT-11127 esti Scd1 aktiivisuutta yli 95% [12]. Soluja käsiteltiin myös 20 uM CP-640186, voimakas estäjä ACC toimintaa [14]. Soluja inkuboitiin estäjien kanssa 48 tuntia tai enemmän, jotta vähintään yhden populaation kaksinkertaistumista. Joitakin kokeita, eksogeeninen rasvahappoja kompleksoitu BSA: ta (suhde 02:01), lisättiin inkubointiväliaine.

määritys solusyklin jakautuminen

Sen määrittämiseksi jakelun solupopulaatioiden eri vaiheissa solusyklin, H460-soluja käsiteltiin joko 1 uM CVT-11127, 20 uM CP-640186, tai DMSO ajoneuvon 48 tuntia. Ryhmiä soluja inkuboitiin rinnakkain 100 uM rasvahappojen kanssa kompleksin BSA. Lopussa inkubointien, solut kerättiin ja käsiteltiin 50 ul RNaasi I (1 mg /ml) ja värjättiin 5 ul propidiumjodidilla (1 mg /ml). Prosenttiosuus solujen solusyklin vaiheisiin analysoitiin fluorocytometry.

Apoptoosin määritys DNA: n fragmentoituminen määrityksen

määritys DNA: n fragmentoituminen nopeudella suoritettiin, kuten ovat kuvanneet Scaglia Igal [11]. Lyhyesti, DNA preconfluent soluissa leimattiin 0,4 uCi [

3 H] tymidiinin säännöllisesti kasvualustaa 24 tuntia. Sitten väliaine poistettiin, yksisolukerrokset pestiin kahdesti PBS: llä 37 ° C: ssa ja solujen annettiin kasvaa 24 tuntia, kun läsnä on 1 uM CVT-11127 tai ajoneuvon. Ryhmiä soluja täydennetty öljyhappoa. Käsittelyn jälkeen chase alustaa, joka sisälsi erillinen apoptoottisia soluja kerättiin ja [

3H] radioaktiivisuus määritettiin tuikelaskurilla. Yksisoluiset kerrokset lyysattiin PBS 1% Triton-X100 ja 0,2 uM EDTA ja sentrifugoidaan. Radioaktiivisuus kvantifioitiin supernatantista, joka sisältää hajanaisia ​​[

3H] DNA, ja pelletti, joka sisälsi ehjän solun DNA: han. Pelletti pestiin ja suspensoitiin uudelleen 1% Triton-X100 ja 0,2 uM EDTA. Prosenttiosuus hajanainen [

3H] DNA arvioitiin seuraavien laskelma: (Chase keskikokoinen DPM + supernatantti DPM) /yhteensä DPM.

Solun lipidiuuttoon ja analyysi

Cell lipidien uutettiin noudattamalla Bligh Dyer [15]. Yhteensä fosfolipideistä ja yksittäisten neutraaleja lipidejä erotettiin ohutkerroskromatografialla (TLC), kuten on kuvattu Scaglia ja Igal [7]. Lipid läiskät TLC-levyn värjättiin jodihöyryillä, valokuvataan ja niiden suhteellinen pitoisuus kvantitoitiin optisella densitometrialla Bio-Rad Chemidoc digitaalisen kuvan järjestelmän avulla QuantityOne ohjelmistoa.

Tulokset

Scd1 ohjaa kulkua H460-solujen kautta G

1 /S rajan solusyklin

Aiemmat tutkimukset laboratoriossamme osoittanut, että akuutin ja kroonisen köyhtyminen Scd1 syöpäsoluissa johti heikentyneeseen soluproliferaatioon [9], [ ,,,0],11], [12]. Jotta voitaisiin paremmin ymmärtää mekanismi, jonka Scd1 esto heikentää solujen kasvua, H460 keuhkoadenokarsinooma soluja inkuboitiin 1 uM CVT-11127, uusi pienmolekyylisalpaaja- Scd1, seerumia sisältävässä väliaineessa 48 h ja solusyklin etenemisen analysoitiin virtaussytometrialla taussytometria (Fig. 1A). Havaittiin, että solujen populaatio S-faasi väheni ~75%, jossa CVT-11127 hoitoon verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kontrolleihin, osoittaen, että Scd1 esto kohdistuu erityisesti etenemistä solusyklin tasolla synteettisen vaiheen . Rinnakkaisena kasvu väestön Scd1-vajaiden solujen in G

1 vaihe havaittiin myös, kun ei tapahtunut muutoksia prosenttiosuutena solujen G

2 /M vaiheessa. Kuitenkin, soluissa, inkuboitiin SCD inhibiittorin seerumin puutteesta media, joka on -50%: n lasku solujen G

2 /M-vaiheessa havaittiin myös (tietoja ei esitetä), mikä viittaa siihen, että tunnistetut komponentit seerumin, mahdollisesti MUFA sisältävä rasva-, pystyivät ylläpitämään kulkua Scd1-vajaiden solujen kautta mitoosin. Kaiken kaikkiaan nämä tulokset osoittavat, että pyöräily solut saarrosta Scd1 toimintaan eivät pystyneet edetäkseen alkuvaiheessa solusyklin. Eksogeeninen öljyhappoa merkittävästi käänteinen solusyklin muutokset tuottama Scd1 esto osoittaa kriittinen merkitys MUFA on solusyklin etenemisen.

H460 keuhkosyöpä solut käsiteltiin 1 uM CVT-11127 (CVT) tai DMSO: ssa 48 h, vuonna läsnäolo tai puuttuminen 100 uM öljyhappoa (Ole), jakelu solujen solusyklin vaiheissa määritettiin fluorocytometry (A), on sykliini D1, CDK6 ja β-aktiini arvioitiin Western blot (B), ja apoptoosin määritettiin tasot hajanainen [

3H] tymidiinin-leimatun DNA: n (C). *, P 0,05 tai vähemmän vs. ajoneuvon käsiteltyjä soluja; **, P 0,05 tai vähemmän vs CVT-käsitellyissä soluissa, Studentin t-testillä.

tasot nisäkkäiden Sykliinien ja sykliiniriippuvaisten kinaasien (CDK) erityisesti vaihtelevan solusyklin etenemisen. Sykliinit D ja CDK ovat avaintekijöitä kanavassa solusyklin läpi G

1 vaiheessa ohi rajoitus pisteen ja S-vaiheen. Koska havaittiin, että farmakologinen ablaatio Scd1 edistetään muutoksen etenemisen G

1 → S, määritimme tasot sykliini D1 ja CDK6 verrattuna apuaineella hoidettuihin kontrolleihin. Havaitsimme, että käsittelyn jälkeen solut 48 h: n Scd1 inhibiittorin, syöpäsolut osoittivat heikkenee huomattavasti sisällön sekä sykliini D1 ja CDK6 (Fig. 1 B). Inkubointi Scd1 vaje solujen öljyhappoa normalisoitui tasot molempien proteiinien vahvistetaan, että MUFA ovat ratkaisevia molekyylejä säätelyssä solusyklin.

Koska kapasiteetin syöpäsolujen kiertää ohjelmoidun solukuoleman edistää myös määrä syöpäsolujen proliferaation, vaikutukset öljyhappoa palauttamisesta soluproliferaation läsnä ollessa Scd1 estäjä voisi johtua osittain apoptoosin suppressiossa. Niinpä määritettiin määrä DNA-fragmentaation, tyypillinen merkki apoptoosin, soluissa käsiteltiin CVT-11127: ssa tai DMSO: ssa 48 tuntia, kun läsnä tai poissa ollessa 100 uM öljyhappoa. Kuten on esitetty kuviossa. 1C, pirstoutuminen DNA kasvoi 2,2-kertaiseksi Scd1-ablatoitu solujen kontrolleihin verrattuna, mikä osoittaa, että Scd1 on keskeinen eloonjäämistekijä syöpäsoluissa. Havaitsimme myös, että eksogeeninen öljyhappo alennettu taso hajanainen DNA Scd1-vajaiden solujen kontrolliarvoihin, mikä viittaa siihen, että tämä rasvahappoa tai rasvahapon tuote Scd1 on välttämätöntä ehkäistä apoptoosin syöpäsoluissa.

Cis -MUFA pelastus soluproliferaatiota heikentynyt Scd1 inhibitio

Olemme aiemmin osoittaneet, että anti-proliferatiiviset vaikutukset CVT-11127 (1 uM) voidaan kumota öljyhappoa [12]. Kuitenkin vaikutus muiden SCD tuotteen rasvahappoja ei ole tutkittu. H460 keuhkosyövän soluja, olemme huomanneet, että palmitoleiinihappo (16: 1 n-7), ja cis-vaccenic hapot (18: 1n-7), kuten öljyhappoa täysin päinvastainen anti-proliferatiivista vaikutusta CVT-11127 (Fig. 2A) . Kuitenkin, kun H460-soluja inkuboitiin kanssa tai ilman 1 uM CVT tai DMSO: ssa 48 tuntia, kun läsnä on joko 100 uM myristiinihappo (14: 0), palmitiinihappo (16: 0), heptadekaani- (17: 0), tai steariinihappoa (18 : 0) (Fig. 2B), havaitsimme, että kaikki SFA, lukuun ottamatta margariinihappo, ei-luonnollinen rasvahappo, lisätyn anti-proliferatiivista vaikutusta SCD-inhibiittori, kun taas SFA ei ollut anti-proliferatiivinen vaikutus soluissa vehikkeliä. Lisäksi, anti-proliferatiivista vaikutusta sekä Scd1 eston ja steariinihappo voitaisiin ratkaista koinkubaation öljyhapon kanssa. Yhdessä nämä havainnot osoittavat selvästi, että sekä endogeeniset ja eksogeeniset SFA ovat sytotoksisia puuttuessa joko SCD tuottaa MUFA tai eksogeenisesti lisätty MUFA.

, H460 keuhkosyöpä solut käsiteltiin 1 uM CVT-11127 (CVT ) tai DMSO: ta 48 tuntia läsnä ollessa tai puuttuessa 100 uM cis-MUFA palmitoleiinihappo (Pol), oleiinihappo (Ole) tai cis-vakseenihappoa; ja soluproliferaatiota määritettiin Kristalliviolettiliuos värjäystä. Proliferaatio samalla arvioitiin H460-soluissa, joita oli käsitelty 1 uM CVT-11127 (CVT) tai DMSO: ta 48 tuntia läsnä ollessa tai puuttuessa 100 uM SFA myristiinihappo (Myr), palmitiini- (Pal), heptadekaani- (Hep) tai steariinihappo ( ste) hapot (B) tai 250 uM Pal, plus tai miinus 250 uM Ole tai elaidiinihappo (Ela) (C). Ryhmät DMSO ja CVT-käsitellyt solut inkuboitiin 2 ug /ml tunikamysiiniä läsnä tai poissa ollessa 100 uM öljyhappoa 48 tuntia, ja solujen kasvu määritettiin (D). *, P 0,05 tai vähemmän, vs DMSO; **, P 0,05 tai vähemmän vs rasvahappokäsitelty ohjaus, Studentin t-testillä.

Kuten kuviossa. 2C, kun CVT käsiteltyjä soluja tai niiden valvonta inkuboitiin 250 uM palmitiinihapon soluproliferaatiota väheni edelleen kuin solujen saarrosta Scd1 ja inkuboitiin 100 uM palmitiinihappoa. Kuitenkin solumyrkkyvaikutuksessa erittäin korkea palmitiinihappoa oli täysin estetty öljyhapon kanssa, mutta vain osittain 250 uM laajuisen MUFA elaidiinihappoa, mikä viittaa siihen, että vain cis-MUFA ovat toiminnallisesti sopiva keino torjua sytotoksista vaikutusta korkeita SFA.

Voit selvittää MUFA tarjoaa laajan suojan sytotoksisuus, määritimme kyky öljyhappoa voittaa anti-kasvua vaikutusta tunikamysiini, yhdiste, joka edistää solujen stressiä ja apoptoosia estämällä proteiinin glykosylaatio. Tunikamysiiniä laski soluproliferaation 80% sekä CVT ja vehikkelillä käsiteltyjen syöpäsolujen, kun taas lisäys öljyhappoa voinut palauttaa leviämisen Scd1 inhiboimatonta soluja (Fig. 2D). Tämä havainto korostaa, että suojaava vaikutus Scd1 vastaan ​​SFA sytotoksisuus syöpäsoluissa perustuu sen tiettyyn aktiivisuus rasvahappojen biosynteesireitin eikä yleistä soluja suojaava vaikutus.

piirityksen Scd1 toimintaa CVT-11127 huonontaa leviämisen H460 syöpäsolujen mutta ei ihmisen normaalien fibroblastien

aiemmissa tutkimuksissa olemme raportoi, että leviämisen normaalin ihmisen ihon fibroblasteja ei heikennä SCD esto [12]. On kuitenkin mahdollista, nämä solut ovat resistenttejä vaikutukset SCD inhibition ja on inkuboidaan pidemmän aikaa inhibiittorin kanssa tai suurempaa estäjä. Tarkastella vaikutusta inkubaatioajan ja estäjän konsentraatio, ihmisen normaalit fibroblastit inkuboitiin 96 tuntia, aika riittää varmistamaan ainakin yksi väestö kaksinkertaistumista, jossa 1 ja 2 uM CVT-11127 elatusaineessa, joka sisälsi 10% FBS. Kuten näkyy kuvassa. 3A, inkubointi SCD estäjä ei vaikuta näiden solujen. Kuitenkin samoissa olosuhteissa esti täysin (98%) kasvu H460-soluissa (kuvio. 3B). Sekä normaali ja syövän soluja käsiteltiin SCD inhibiittorin seerumin puutteesta median ja vaikutus SCD inhibiittorin solun kasvuun oli riippumaton seerumin läsnä ollessa (tietoja ei esitetty). Se, että fibroblastit olivat täysin reagoimatta sytostaattinen vaikutus SCD estäjän viittaa siihen, että ei-syöpäsolujen on pienempi vaatimus endogeenisesti tuotetun MUFA kuin syöpäsoluja.

Solun kasvu määritettiin AG01518 normaalin ihmisen fibroblasteissa (A ) läsnäollessa 1 ja 2 uM CVT-11127 10% FBS DMEM tai ajoneuvon 96 tuntia. H460-soluja (B) käsiteltiin 1 uM CVT-11127 tai ajoneuvon 96 tuntia. Solujen lisääntyminen korko määritettiin Kristalliviolettiliuos värjäystä. *, P 0,05 tai vähemmän, vs DMSO; Studentin t-testiä.

Aktiivinen de novo lipidisynteesiin tarvitaan rasvahappo-välitteisen käänteinen anti-proliferatiivista vaikutusta Scd1 inhibition

Olemme raportoineet, että inhibitio Scd1 vähentää lipogeneesiin ainakin osittain inaktivoimalla nopeutta rajoittavaa lipogeeniset entsyymi ACC-α ja joka pienentää lipogeneesiin saattavat edistää alhaisen lisääntymisen Scd1-ablatoitu soluihin [12]. Tutkia suhdetta Scd1, ACC ja lipogeneesiä syövän solujen proliferaatiota, me käsiteltiin H460-solujen kanssa CP-640186, joka on spesifinen inhibiittori ACC, jonka pitoisuus on 20 uM, joka estää enemmän kuin 95% entsyymiaktiivisuuden [14]. Kuten on esitetty kuviossa. 4A, inkubointi solujen kanssa ACC estäjän 48 tuntia johti -30%: n lasku solujen määrä verrattuna vehikkelillä käsiteltyihin kontrolleihin. Tämä on yhtäpitävä aikaisempien raportoidussa tutkimuksessa [16], [17]. Sytostaattinen vaikutus ACC saarto oli peruutettavissa molemmissa 100gM palmitiinihappoa ja 100 uM öljyhappoa (Fig. 4A) viittaa siihen, että ACC toimintaa säätelee solujen lisääntymistä toimittamalla rasvahappoja lipidien biosynteesin. Kasvua estävä vaikutus ACC esto johtui lohkon solusyklin etenemisen sillä oli merkittävä väheneminen väestöstä solujen S- ja G

2 /M vaihetta ja samanaikainen kasvu soluissa G

0 /G

1 suhteessa kontrolleihin (Kuva. 4B). Eksogeeninen öljyhappoa ollut selvä vaikutus palauttamiseen solusyklin profiilia ACC-köyhdytettyä soluja, samanlainen vaikutus Scd1 estyy solujen vahvistavat käsitystä, että lopullinen metabolinen tarkoitus yhdenmukaistetun aktivoinnin ACC, FAS ja Scd1 havaittu syöpäsoluissa on tuotannon MUFA.

H460 keuhkosyövän soluja käsiteltiin 1 uM CVT-11127 (CVT), 10 uM CP-640186 tai molemmat läsnä tai poissa ollessa 100 uM palmitiinihappoa (Pal) tai öljyhappoa ( Ole) (A), ja proliferaatiota arvioitiin 48 tunnin jälkeen. Jakelu solujen solusyklin vaiheissa määritettiin fluorocytometry soluissa inkuboitiin CP-640186 plus tai miinus 100 uM öljyhappoa ja (B). Syöpäsolujen proliferaatiota määritettiin myös käsittelemällä 1 uM CVT-11127 (CVT), 20 uM CP-640186, tai molemmat läsnä tai poissa ollessa 100 uM palmitiinihappoa (Pal) tai öljyhappo (Ole) (C), ja solut, joita käsiteltiin 48 tunnin ajan 1 uM CVT-11127, 25-hydroksikolesteroli- tai molemmat, plus tai miinus 100 uM öljyhappoa (D). Kaikissa kokeissa, kontrollisolut sai yhtä tilavuutta DMSO ajoneuvon. *, P 0,05 tai vähemmän verrattuna DMSO; **, P 0,05 tai vähemmän verrattuna CVT hoidettuun kontrolliryhmään, Studentin t-testillä.

Mielenkiintoista, co-hoito CVT-11127 ja CP-640186 ei voimistanut kasvua estävää vaikutusta jokainen näistä yhdisteistä, viittaa siihen, että inhibitio joko ACC tai Scd1 vaikuttaa yhteinen tuote kautta. Koska Scd1 on myöhemmin rasvahappojen biosynteesireitin, MUFA ovat rasvahappojen kriittisiä soluproliferaation. Itse asiassa solut inkuboitiin sekä ACC ja Scd1 estäjät, öljyhappoa pystyi täysin palautettua alhainen solujen lisääntymisen määrä H460-solujen kontrolliarvoihin. Nämä tiedot tukevat vahvasti päätellä, että MUFA ovat toiminnallisia lopputuote (t) rasvahappojen biosynteesin, joita tarvitaan syöpäsolujen kasvua.

Lipid biosynteesiä nisäkässoluissa ohjataan transkriptiotekijöitä SREBP-1a ja SREBP -1, jotka ovat keskeisiä säätelijöitä rasvahappojen ja fosfolipidisynteesiin nisäkässoluissa [18], [19]. Induktio lipogeneesiä ihmisen ei-transformoituja ja syöpäsolujen vaatii SREBP-1 aktivointi [20] – [22], siksi määritti alas-säätely lipogeneesiä by SREBP-1 inaktivaation solun lisäkasvun. H460-soluja inkuboitiin Scd1 estäjän 48 h läsnä tai poissa ollessa 25-hydroksikolesteroli-, voimakas inhibiittori SREBP-1 aktivaatio ja lohkaisu SCAP [19]. Inkubointi 25-hydroksikolesteroli- yksinään ei vaikuttanut syöpäsolujen lisääntymistä, mutta co-hoito solujen kanssa hydroxysterol ja CVT-11127 edistänyt syvällisempää kasvua estävä vaikutus kuin kanssa Scd1 inhibiittorin, vaikutus johtui todennäköisesti voimistaa anti -lipogenic aktiivisuus sekä estäjien (Fig. 4D). Yhdenmukainen aiempien havaintojen, 100pM öljyhappoa oli riittävä voittamaan solunsalpaajavaikutus sekä Scd1 eston ja yhdistetyt Scd1 esto ja alas säätely lipidisynteesiin, joka edelleen varmistaa, että sekä lipidisynteesiin ja rasvahappo desaturation mukaan Scd1 tarjoamaan alustoille syövän solujen kasvua.

Lopuksi lisätodisteita, että aktiivinen lipidi muodostuminen on tärkeä askel säätelyssä soluproliferaation Scd1 saatiin tutkimalla suhteellinen pitoisuus suuria lipidien soluissa meneillään eston Scd1 ja käsiteltiin eksogeenisia rasvahappoja. Kuten näkyy kuvassa. 5A, saarto Scd1 kanssa CVT-11127 johtaneet huomattavaan vähentämiseen tärkeimmistä neutraalien lipidien, CE ja TAG samalla koko fosfolipidit olivat hieman vähennetty. Inkubointi Scd1 vaje solujen 100gM öljyhappoa kasvanut dramaattisesti tasot TAG 4,4-kertaisesti Kontrolliarvoille (Fig. 5B). Lisäksi öljyhappoa täysin palautettu vähentynyt pitoisuus CE Scd1-vajaiden solujen (Fig. 5c), kun taas se palasi fosfolipidin tasoja (kuvio. 5D) kontrolliarvoihin. Kaiken kaikkiaan nämä havainnot vahvistavat käsitystä, että Scd1 määrittää nopeus solusyklin etenemisen ja ohjelmoidun solukuoleman, ja lopulta, leviämisen syöpäsolujen ylläpitämällä aktiivista lipidisynteesiin ja cis-MUFA tuotantoa.

H460 keuhkosyöpäsoluissa käsiteltiin 1 uM CVT-11127 (CVT) 48 h: n läsnä tai poissa ollessa 100 uM öljyhappoa (Ole). Yhteensä solujen lipidit uutettiin, erotettiin TLC: llä ja värjättiin jodihöyryillä (A). Suhteelliset tasot, triasyyliglyserolien (B), cholesterolesters (C), ja fosfolipidit (D), määritettiin densitometrinen skannaus. *, P 0,05 tai vähemmän, vs DMSO; **, P 0,05 tai vähemmän vs CVT hoidettuun kontrolliryhmään, Studentin t-testillä.

Keskustelu

Aiemmissa tutkimuksissa olemme raportoi, että geneettinen ja farmakologinen ablaatio Scd1 vakavasti huonontaa kyky syöpäsolujen proliferaatiota [12]. Tässä työssä, tarjoamme uusia todisteita siitä, että Scd1 säätelee syöpäsolun mitogeneesissä moduloimalla solusyklin etenemisen. Havaintomme, että syöpäsolujen käsitelty farmakologinen estäjä Scd1 pidätetään G

1 vaihe ja että tämä vaikutus on palautettu öljyhappoa viittaa siihen, että MUFA synteesiä tarvitaan alkuvaiheessa solusyklin. Lisäksi esto ACC ja FAS, kaksi keskeistä entsyymien synteesin rasvahappojen, herättivät samanlaisen saarto etenemistä solusyklin läpi G

1 /S rajan [16], [23], [24] . Nämä havainnot viittaavat siihen, että yhteisiä aktivointi SFA synteesin ja myöhempi muuntaminen SFA osaksi MUFA on annettava fosfolipidin biosynteesireitin koneiden MUFA alustojen uuden kalvon synteesin aikana tai ennen synteettisen vaiheen solusyklin. Itse asiassa, tyylikäs tutkimukset Jackowski [25], [26] paljasti, että kertyminen uusien fosfolipidien jakamiseksi solujen on tuote koholla synteesin ja liikevaihdon, joka tapahtuu G

1 ja varhainen S vaiheissa.

Tuloksemme osoittavat myös, että Scd1 voi ohjata solusyklin etenemisen muuttamalla tasot sykliini D1 ja CDK6, kaksi proteiinia, jonka ilmentyminen ja vuorovaikutus ovat kriittisiä kulkua pyöräily solujen kautta G

1 /S siirtyminen [27]. Scd1 aktiivisuus voi epäsuorasti säädellä sisällöstä solusyklin proteiineja moduloimalla GSK3p, alavirran kohde Akt-reitin, joka lisää hajoaminen sykliini D1 [28]. Olemme aiemmin raportoitu, että esto Scd1 ilmaisun inaktivoi Akt ja lisää defosforyloitumista ja aktivointi GSK3p. Muutokset biokemiallinen koostumus ja siten biofysikaalisten ominaisuuksien solukalvon verkkotunnuksia voi aktivoida signaalitransduktion ja transkriptio polkuja, jotka moduloivat mitogeneesiin [3]. Valvonta SFA ja MUFA tasapainoa Scd1 näyttää olevan kriittinen modulaattori kasvun signaaleja ihmisen soluissa [11], [12], mutta mekanismeista, joiden avulla tämä entsyymi koordinoi muutoksia membraanilipidiin koostumuksessa, kalvo-johdetut signaalit ja niiden myöhemmät vaikutukset vielä ole täysin ymmärretty.

Vaikka syöpäsolujen moninkertaistaa pitkäjänteisellä solunjakautumisen määrää lisääntyvien solujen vaikuttaa myös määrä solukuoleman. Lisäksi suositaan suurempi määrä solun mitogeneesissä tarjoamme todisteita siitä, että Scd1 on tärkeä selviytymisen tekijä syöpäsolujen auttamalla solu välttää ohjelmoidun solukuoleman kautta tuotantoa cis-MUFA. Scd1 toiminta voi estää syöpäsolun apoptoosia ainakin kaksi mekanismia: suojaa SFA välittämä toksisuus tai lipoapoptosis [11], [29], ja stimulaatio cis-MUFA biosynteesiin solun lisääntymistä. Korkea konstitutiivinen rasvahappojen synteesi on tyypillisesti syöpäsoluissa [3], näin ollen toonisesti aktiivinen Scd1 voi estää mahdollisesti vahingollisia vaikutuksia endogeenisen SFA kertymistä. Koska elaidiinihappoa, trans-MUFA, vain heikosti esti sytotoksisen vaikutuksen sekä Scd1-puutos ja SFA taas cis-MUFA palautunut leviämisen, siellä näyttää olevan joitakin rasvahappo lajikohtaisuus varten suojaava vaikutus. Tämä mahdollisesti tapahtuu MUFA syrjäyttämällä SFA keskeisten sytotoksisten aineenvaihdunnan reaktioita.

Aktiivinen lipogeneesiin, erityisesti kalvo lipidisynteesiin, on kriittinen vaatimus jatkuvan leviämisen syöpäsolujen ja mekanismi välttää tuloa ohjelmaan apoptoosin [ ,,,0],30]. Olemme aiemmin todettu, että Scd1 kontrolloi kaikkia nopeutta lipidisynteesiin keuhkosyövän soluihin [9], [11], [12]. Tulokset nykyisestä työstä vahvistavat käsitystä, että Scd1 voi ohjata solujen lisääntymistä vaikuttamalla rasvahappojen biosynteettiset rate [12]. Havaitsimme merkittävä lasku leviämisen H460-solujen läsnä ollessa ACC estäjän ja antiproliferatiivinen vaikutus, joka voi johtua virheellisistä rasvahapposynteesissä voitaisiin pelastaa molemmat öljyhappoa (MUFA) ja palmitiinihappo (SFA). Nämä havainnot ovat samaa mieltä aikaisempien raporttien kanssa, jotka osoittavat, että solujen kasvun pysähtymistä ACC köyhdytetyn soluissa voitaisiin kääntää eksogeeniset palmitiinihappoa [16], [17].