Krooninen sairaus

tiivistelmä

Johdanto

Fysiologisesti asiaan prekliinisen

ex vivo

mallit pääpiirteittäin CNS kasvain mikro-ympäristön monimutkaisuutta auttavat kehittämiseen biologisesti kohdistetun aineita. Esitämme kattava luonnehdinta kasvaimen aggregaattien luotu käyttäen 3D Rotary Cell Culture System (RCC).

Methods

CNS syöpäsolulinjoja kasvatettiin perinteisen 2D kulttuureissa ja RCC ja vertailu kohortin 53 lapsipotilailla korkealuokkaisesta gliooma suoritti genomin laaja geenien ilmentyminen ja microRNA paneelit yhdistettynä immunohistokemian

ex vivo

magneettiresonanssispektroskopia ja huumeiden herkkyys käyttäen arviointia histonideasetylaasi estäjä, Vorinostat.

tulokset

MAKROSKOOPPINEN RCC aggregaatteja kertasi heterogeeninen morfologia aivokasvainten kanssa selvä lisääntyvän vanteen, nekroottinen ydin ja hapen paine kaltevuus. Geenien ilmentyminen ja microRNA analyysit paljastivat merkittäviä eroja 3D ilme väli 2D kulttuureja ja ensisijainen aivokasvaimia. Metabolinen profilointi paljasti ero profiileja, joiden kasvaimen tiettyjä aineenvaihduntatuotteita 3D. Arvioidaan potentiaalia RCC kuin huume Testausväline, määritimme tehoa Vorinostat vastaan ​​aggregaattien U87 ja KNS42 glioblastoomasoluista. Molemmat linjat osoittivat merkittävästi alentunut herkkyys kun määrittämällä 3D viljelyolosuhteissa verrattuna klassiseen 2D huumeiden näyttö lähestymistapoja.

Johtopäätökset

Kattava luonnehdinta osoittaa, että 3D RCC kulttuuri korkealuokkaisesta aivojen kasvainsoluihin on syvällisiä vaikutuksia geneettistä, epigeneettiset ja aineenvaihduntaan viljeltyjen solujen näihin soluihin asuvat välituotteena fenotyyppi välisten 2D kulttuurien ja ensisijainen kasvaimia. On ristiriita 2D kulttuurin ja kasvaimen molekyyliprofiilien, ja RCC osittain uudelleen taipuu kudos erityispiirteet, jonka avulla huumetestien merkityksellisempään

ex vivo

järjestelmä.

Citation: Smith SJ, Wilson M, Ward JH, Rahman CV, Peet AC, MacArthur DC, et al. (2012) Yhteenveto Kasvaimen heterogeenisuus ja Molecular allekirjoitukset 3D-aivosyöpä varustettu malli Vähentynyt herkkyys histonideasetylaasi- esto. PLoS ONE 7 (12): e52335. doi: 10,1371 /journal.pone.0052335

Editor: Daniel Monleon, Instituto de Investigación Sanitaria INCLIVA, Espanja

vastaanotettu: 16 heinäkuu 2012; Hyväksytty: 16 marraskuu 2012; Julkaistu: 18 joulukuu 2012

Copyright: © 2012 Smith et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Samantha Dickson aivosyövän Trust, herrasmiehen Night Out Charity ja Joseph Foote aivokasvain Trust. RR on Nottingham Advanced Research Fellow ja SJS on National Institute for Health Research /UoN kliininen Fellow. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Aivokasvaimet ovat suurin syy syöpään liittyvän kuoleman lapsilla ja aikuisilla jopa 40-vuotiaana, mikä vastaa 10000 menettänyt vuosia odotettu käyttöikä vuosittain Britanniassa. Laadukas invasiivisia aivojen syöpäsairauksia uusiutua huolimatta multimodaalinen hoito; joten on kiireellinen tarve kehittää uusia hoitostrategioita parantaa lopputulosta. Epätasapaino yhdiste efficacies välillä

in vitro

ja

in vivo

kokeissa on huomattavasti vaikeuttanut löytämisestä ja kehittämisestä tehokkaamman ja monipuolinen aseistus kemoterapeuttisten aineiden [1]. Tämän seurauksena vain -5% syövän lääkeaihiota että tulevat kliiniset kokeet koskaan saada hyväksyntää US Food and Drug Administration, mikä valtava taloudellinen ja kliininen taakka [2], [3]. Puute lapsipotilailla aivokasvain malleja erityisesti, on merkinnyt sitä, että kemoterapian lääkeaineiden, jotka ovat tällä hetkellä määrätty oli alun perin kehitetty aikuisten keskushermoston (CNS) ja muita kiinteitä kasvaimia. Tämä ohittaa kertynyt näyttöä siitä, että aikuisilla ja lapsilla, aivokasvaimia, vaikka histologisesti samankaltaisia ​​ovat molekyylirakennetta erillisiä [4] ja siten satama erilliset onkogeeninen mutaatioita, joita voi tarjota uusia terapeuttisia kohteita. Koska seuraavan sukupolven hoito siirtyy kohti erityinen biologinen ja reittiin liittyvien tavoitteiden arviointi lääkkeen tehoa ja parantaa hoidon saavutetaan paitsi kautta romaani lääkekehityksen, mutta myös parantamalla prekliinisen

ex vivo

malleja, jotka paremmin Yhteenvetona mikro-ympäristön monimutkaisuutta [5]. On kasvava arvostusta kasvaimensisäisenä heterogeenisyys korkealuokkaisesta aivokasvainten olemassaolon kanssa erilaisten solupopulaatioiden samassa kasvain, että jokainen näyttää eri molekyylitason muutoksia [6]. Nykyinen prekliininen huumetestejä mallit eivät monista näitä keskeisiä piirteitä.

Kaksiulotteinen (2D) yksikerroksinen soluviljelmissä edustavat erittäin reductionist malli syöpien tappioiden fysiologisten soluväliaineen (ECM) muovikalvolla pinnat. Niinpä solut näissä olosuhteissa sopeuttaa muuttamalla geeniekspressiomalleja ja signalointi verkot, menettää asiaankuuluvat ominaisuudet, kuten erilaistumista, polarisaatio ja solu-solu viestintä, ja keinotekoisesti edistää hyper-leviämisen [1], [7]. Helppous lääkkeen oton homogeeniseksi solupopulaatio on kiinnittynyt 2D pinnoilla, myös todennäköisesti johtaa yliarviointiin tehosta määritetään

in vitro

sytotoksiset näytöt, mikä johtaa tehottomuuteen ehdokasaineille

in vivo

[8]. Lisäksi 2D viljelmistä puuttuvat monimutkaisia ​​3D kudosten rakenteesta ja siksi vaikeuttaa työtä testata tehokkuutta tiettyjen ehdokas yhdisteet, kuten anti-angiogeeninen /vaskulogeeniseen aineita ennen

in vivo

strategioissa [8]. Itse 2D sytotoksinen näytöissä lähes yksinomaan tunnistaa antiproliferatiivisia ehdokas aineet [9], [10].

On kasvava tunnustus käsitteellisesti että kolmiulotteisia (3D) kulttuuri teknologiat voivat paremmin vastaamaan kasvain patofysiologia ja kerrata

in vivo

kasvaimen mikroympäris-

in vitro

. Kuten farmakologinen vasteet vierassiirrekokeissa tutkimukset eivät aina korreloi kliinisen vasteen, on välttämätöntä, että parempi ihmisspesifiset ennustavia malleja kehitetään prekliinisen vaiheen. Sen vuoksi kyseiset mallit olisi paremmin tiedotettava ksenografti-tutkimukset ja varhaisen kliinisten kokeiden suhteen ennustettaessa farmakologisen vasteen kemoterapeuttisia yhdisteiden [11], [12], [13] mikä lisäksi vähentää vaatimus määriä eläimiä varten syöpälääkettä testaus .

Monisoluista palloset ovat pieniä

in vitro

aggregaattien vaihtelee 100-1000 um ja yleisesti viljeltiin suspensiossa käyttäen pyörityspulloissa, kollageenigeelien ja neste-peittokuvien [14]. Koko viljelty pallomainen on rajoitettu alle 1 mm leikkausvoimien kasvatusastiassa ja puute sisäistä koheesiota /ECM sisällä pallomainen. Geometria sferoidi edistää muodostumista heterogeeninen solupopulaatioiden: uloin kerros proliferates verrattain on yksikerrosviljelmiä; sisäkerroksen solut voivat olla lepotilassa; ja ydin pallosia voi kehittyä kuolion [15]. Leviämisen kasvainsolujen kasvatettu 3D palloset on tyypillisesti hitaammin kuin yksikerroksisiin, näyttelyitä eri aineenvaihduntaan ja tyypillisesti näyttää alentunut herkkyys kemoterapiaa ja sädehoitoa [7], [16], [17], [18], [19] , [20]. Esimerkiksi sytosiiniarabinosidi (Ara-C) ja Taxol jotka estävät lisääntymistä glioblastoomasolulinjoissa 2D kulttuureissa, mutta ovat epäonnistuneet kliinisissä kokeissa, osoittavat merkittävästi pienentää herkkyyttä 3D kulttuureissa; ARA-C-annos 10 kertaa korkeampi kuin tehokas annos 2D viljelmissä oli tarpeen vähentää kasvainsolujen proliferaatiota [21], [22], [23]. Uudempi 3D sferoidiviljelmiä kulttuurin järjestelmä päässä Eccles ja työtovereiden on tarjonnut automatisoitu, kvantitatiivisen kuvantamisen ominaisuus, joka on mahdollisesti yhteensopiva suurikapasiteettisten prekliinisissä kohdistaminen tutkimukset ja saattaa vähentää vaatimus eläinkokeissa. Lisäksi toiminnalliset analyysit kasvaimen maahanmuutto- ja invaasion ovat sallittuja tässä järjestelmässä, mikä helpottaa huumeiden seulonta, joka kattaa laajan yhdisteiden [24]. Johdonmukaisesti, geeni-ilmentymisen allekirjoitukset ensisijaisen solun viljelmiä pidetään sferoidiviljelmiä kuten glioblastooma [25], [26].

Biologiset geelit kuten Matrigel on myös käytetty substraattina sferoidin kasvua. Matrigel on tyvikalvon saadun uutteen Engelbreth-Holm-parvi hiiren sarkooman, joka sisältää monien erilaisten komponenttien, mukaan lukien tyypin IV kollageenilla, laminiinin ja muiden ECM-molekyylit, lisäksi liukoisen signaaleja, kuten sytokiinien ja kasvutekijöiden [27]. LaBarbera ja kollegat osoittivat, että kasvaimeen liittyvät ilmiöt, kuten epiteelin-mesenkymaalitransitioon in metastasoituneen rintasyövän kasvaimia voidaan toisteta 3D matrigeeliä-pohjainen pallomainen kulttuuri, järjestelmän lisäksi käytetään korkean seulontaan työkalu pienmolekyylisalpaajien varten rintasyöpä [28 ]. Kuitenkin, kuten Matrigel on suurelta osin määrittelemätön ja vaihteleva seos proteiineja, sitä ei ole käytetty laajalti lääkeaineiden seulontaan varten. Huokoinen kollageeni /hyaluronihappoa tukirunkoja tarjota entistä fysiologisesti relevantti

in vitro

malli, joka mahdollistaa vuorovaikutusta eri solutyyppejä ja ECM kuvatulla vastikään rintaepiteelisolulinja ja adiposyyttien yhteisviljelyt [29]. Muut rintojen syöpä 3D-malleja on kuvattu hiljattain, jossa pahanlaatuinen rintasyövän solut upotetaan saatettua tyvikalvon suoralla yhdessä viljelemisen endoteelisolujen, joka mahdollistaa tutkimus stimuloivan vaikutukset jälkimmäisen solutyypin [30]. Jousitus kulttuureissa kuten pyörityspulloihin on tutkittu, mutta usein esteenä leikkausjännitys ja turbulenssin [31] vaikutuksia kokemaa solut.

Yksi tapa tuottaa 3D aggregaattien ei-turbulentti ympäristö ja jossa solut erittävät endogeeninen ECM ja kasvutekijät on Rotary Cell Culture System (RCC ™), perin kehitetty National Aeronautics and Space Administration (NASA) tutkia vaikutuksia mikrogravitaatiota soluihin ja kudoksiin [32]. Järjestelmää on käytetty menestyksekkäästi kudosteknologian [33], kehitysbiologia [34] ja mikrobiologian [35]. RCC menetelmä on laajennettu kasvainsolujen lisääminen (esim. Eturauhassyövässä [36] ja peräsuolen syöpä [37]), jossa minimaalinen leikkausvoiman ja jatkuvasti keskeytetty ”vapaa pudotus” kulttuuri rohkaisee soluaggregaation. Tämä sallii biologisten /biokemiallisten prosessien kehittämiseen alle seurattava tarkasti ympäristö- ja toimintaolosuhteet ja kannustaa solujen muodostamaan 3D kudokseen kaltaisia ​​aggregaatteja, joka näyttää fysiologisesti relevantti fenotyypit kuten alempi leviämisen nopeus, hypoksinen alueet ja verisuonistossa [1]. Ei aiemmat julkaisut ovat nimenomaan tutkinut aivokasvain kasvua RCC tai tehdään vertailu 2D kulttuurin, 3D kulttuuri ja todelliset aivokasvain yksilöitä. Analyysi geenin ilmentymisen, microRNA ja metaboliset profiilit osoittavat, että RCC aggregaatteja (verrattuna 2D yksikerrosviljelmiä) näyttää genotyypin huomattavasti lähempänä todellista aivokasvainten, ja se voi siten jäljitellä kasvaimen käyttäytymisen (esim. Vastauksena terapeuttisten aineiden) Lisää uskollisesti. Lisäksi 3D-aggregaatit voidaan viljellä ainakin jopa 4 viikkoa, verrattuna noin viikko 2D yksikerrosviljelmässä (johtuen solun konfluenssiin), joka tarjoaa keinot arvioida lääkkeen tehoa ja toistuvan annostelun pidemmän ajan kuluessa. Ei keinotekoisia matriisin tai ECM komponentteja käyttöön, jonka avulla solut tuottaa omia rakenteita ja ilman keinotekoisia esteitä lääkkeen diffuusio. Kasvanut koko ja heterogeenisuus RCC aggregaatit verrattuna muihin viljelymenetelmät esim neuropallojen tai monisoluisten sferoideina, lisää niiden fysiologista merkitystä, jonka avulla huumetestien vastaan ​​simulaation koko kasvain pikemminkin yhden valitun solulinjan sub-kloonin kuten 2D- tai neuropalloja. Kriittisesti, The RCC aggregaatteja näyttö merkitty sisäinen heterogeenisyys erilliset populaatiot proliferatiivisen, senescent ja nekroottista soluja, vaikutti osittain muuttamalla happipitoisuus välillä vanteen ytimeen aggregaatin. Tämä ainutlaatuisen yhteenveto siitä erilaisia ​​

in vivo

ympäristön kapeampiin jossa syöpäsoluja oleskelevat ja joka nyt ajatellaan kriittisiä kasvainten kehittymiseen ja etenemiseen.

Tässä tutkimuksessa olemme pyrkineet vertailla neoplastisten histologia , morfologia, leviämisen hinnat, geeni ja microRNA ilmaisua, aineenvaihduntaan ja histonideasetylaasi estäjä herkkyys 2D- yksikerrosviljelyissä ja 3D kasvainsolun aggregaatteja luotu käyttäen RCC ™, jotta voitaisiin arvioida niiden merkitystä perus aivosyövän tautien mallintaminen ja prekliinisen huumeiden löytö. Tietääksemme tämä on ensimmäinen kattava molekulaarinen aivokasvain aggregaattien viljeltiin käyttäen RCC, mikä osoittaa huomattavaa samankaltaisuutta ekspressiotasot keskeisten neoplastisten geenien varsinainen kasvaimia ja ensimmäinen raportti RCC lääkeaineen herkkyys verrattuna 2D kulttuureissa.

Materiaalit ja menetelmät

Cell Lines – kaksi ja kolmiulotteinen kulttuuri

seuraavat vakiintuneet solulinjat hyödynnettiin tutkimuksessa – KNS42 (lapsipotilailla GBM, ystävällinen lahja C. Jones , Institute of Cancer Research, Lontoo [38], [39]), U87MG (aikuinen GBM) [40], [41], PFSK-1 (lapsipotilaita keskushermosto primitiivinen neuro-eksodermaalisessa kasvain, ostettu ATCC [42]) , Daoy (lapsipotilaita medulloblastooma, ostettu ATCC [42], [43]), GB1 (in-house peräisin lapsipotilailla korkealaatuista gliooman [42]), SF188 (lapsipotilaita glioblastooma, [44], [45]) ja HBMEC (ihmisen brain mikrovaskulaarinen endoteelisolujen, ystävällinen lahja Naveed Khan, University of Nottingham, [46], [47]). KNS42 ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen väliaineessa (DMEM) /F12, U87MG, Daoy, C6 ja GB1 DMEM, PFSK-1 ja HBMEC Roswell Park Memorial Institute (RPMI) väliaine 1640. Kaikki alustat täydennettiin 10% (

v /v

) naudan sikiön seerumia (paitsi HBMEC, jotka olivat 20% (

v /v

) naudan sikiön seerumia), 100 IU /ml penisilliiniä ja 100 ug /ml streptomysiiniä. Samoja media käytettiin kutakin solulinjaa 2D- ja 3D-kulttuuri ja kaikki kulttuurin tapahtui kostutetussa inkubaattorissa 37 ° C: ssa ja 5% CO

2 ilmakehässä, paitsi hypoksinen säätimet Hypoxyprobe tutkimuksessa, joka tehtiin joka hypoksinen kammio 1% O

2 ympäristössä. 3D kulttuuri hyödynnetään Rotary Cell Culture System (RCC) (Synthecon, Luxemburg) sijaitsevat soluviljelmässä hautomo. Culture aloitettiin tuomalla 1 x 10

6 soluja yksisolususpensioon 10 ml viljelyastias- ja aluksi pyöritettiin 15 kierrosta minuutissa (rpm). Kun näkyvä yhteenlaskettu muodostunut, vallankumous nopeus säädettiin tasapainottaa Coriolis voima painovoimaa vastaan ​​säilyttää yhteenlaskettu paikallaan freefall. Aggregaatit kerättiin kolme viikkoa median muutetaan kahdesti viikossa (50:50). Kun korjattu, aggregaatit joko kiinnitettiin 4% (

p /t

) PFA tai säilytetään pakastettuna -80 ° C: ssa, kunnes sitä tarvitaan tarkempaa analysointia.

valmistaminen RNA ja Real Time PCR

Kokonais-RNA eristettiin solupelleteistä tai aggregaatteja, käyttäen

mir

Vana RNA: n eristys-kittiä (Ambion, Austin, Texas). Käänteinen transkriptio cDNA (mukaan lukien genominen DNA poistaminen) suoritettiin käyttäen RT

2 First Strand Kit (SA Biosciences, Frederick, MD). Array reaaliaikainen PCR suoritettiin käyttäen SA biotieteiden soluväliaineen ja adheesiomolekyylien PCR array (PAH-013A), analysoidaan 84 ECM liittyviä geenejä, 5 ohjaus geenit ja positiivinen ja negatiivinen kontrolli kuoppiin (taulukko S1), käyttäen CFX96 reaaliaikainen PCR- koneen (BioRad, Hercules, CA). Validation reaaliaikainen PCR genomin laajuista tietojen tehtiin vastaan ​​geenit taulukossa S2. Primer tehokkuus laskettiin ja jokaisen näistä geenin lasketaan suhteessa normaalin aikuisen aivojen RNA (FirstChoice, Ambion) käyttäen muunneltua Pfaffl yhtälö R = E

tavoite ACt (CT kohdegeenin ohjaus-CT kohdegeenin näyte) /E

ohjaus ACt (CT ohjaus geenin ohjaus- CT ohjaus geeni näyte) ja GAPDH kontrollina geeni.

Potilaille ja Tissue näytteitä

kohortti potilaan näytteitä (n = 53) analysoitiin geenien ilmentyminen array oli joukko aiemmin julkaistu [4] tietoja saatavilla verkossa (GEO hakunumero GSE19578). Kaikki näytteet olivat

de novo

lapsipotilailla korkealaatuista gliooma saadaan

ante mortem

UK Neurosurgical keskukset kaikkine diagnoosit varmistettiin patologisia tarkastelu. Kohortti näytteiden analysoitiin microRNA lauseke (n = 77, 72 henkilöä) koostui 21 näytettä analysoitiin myös geenin ilmentymisen kohortin muiden näytteiden myös tarkistetaan keskitetysti ja kaikki ensisijainen lapsipotilaiden korkealaatuista gliooma. Täysi suostumus ja eettisen hyväksyntä on saatu niiden käyttöä tässä tutkimuksessa, UK Lasten Cancer ja Leukemia Group ja paikallisten eettisten ja Trent Koy hyväksynnän (06 /MRE04 /86).

Gene Expression Array ja MicroRNA Array

Geenien ilmentyminen analyysi suoritettiin Affymetrix U133 Plus2 alustan, kolminkertaisia ​​kokeellisen toistojen 3D kulttuureissa. MicroRNA analyysi suoritettiin käyttäen Nanostring alustan (Nanostring Technologies, Seattle, WA) vastaan ​​747 ihmisen ja virusten microRNA lajien (täydellinen luettelo antureista ja tavoitteiden taulukossa S3).

resonanssispektroskopia (MRS) B

kolme viikkoa kasvaimen aggregaatit kerättiin, pestiin PBS: llä ja flash-jäädytettiin nestetypessä varmistaa jälkeäkään PBS tai median säilyi. Ennen NMR-analyysin, soluaggregaatteja sulatettiin huoneenlämmössä ennen joka otetaan 4 mm zirkoniumoksidi roottorit 12 tai 50 ui insertit riippuen näytteen tilavuutta. Mahdollisesti jäljelle tilavuus roottorin täytettiin D

2O sisälsi hieman trimethylsilylproprionate-d4 tukea kemiallisen siirtymän kalibrointia. NMR-analyysi suoritettiin Bruker HCD hr-MAS koetin pulssi kaltevuudet saatavilla z-suunnassa. Koetin toimi magneettikentän voimakkuus 500 MHz tuottaman aktiivisesti suojattu Oxford Instruments magneetin 3-kanavainen Bruker Avance II konsoli. Näyte kehruu asetettiin nopeudella 4800 Hz ja koetin lämpötila asetettiin 278 Kelvin minimoimiseksi aineenvaihdunta. NOESY-presat sekvenssiä käytettiin tukahduttaa veden signaalin ja 16K datapisteitä hankittiin spektrinleveyttä 16ppm seuraavien 90 asteen pulssi. Signaali keskiarvot (256 tai 512) on hankittu, riippuen signaali-kohina-suhde näytteen, kun 14 tai 28 minuuttia vastaavasti. Raaka-NMR-tulokset prosessoitiin käyttämällä Tarquin algoritmia [48] purkaa määrinä seuraavat aineenvaihduntatuotteet: asetaatti (Ace); alaniini (Ala); koliini (Cho); kreatiini (Cr); glutationi (Glth); glutamiini (Gin); glutamaatti (Glu); glysiini (Gly); guanidinoacetate (Gua); glycerophosphocholine (GPC); hypotauriini (h-Tau); myoinositoli (m-Ins); laktaatti (Lac); lipidien (Lip); n-acetylaspartate (NAA); fosfokoliini (PCH); scyllo-inositoli (t-Ins); sukkinaatti (Suc) ja tauriinia (Tau). Lac poistettiin myöhempää analyysia, koska sen suuri riippuvuus soluviljelyalustoissa peruuttamista. Aineenvaihduntatuotteiden profiilien normalisoitiin niiden summa ja määrät skaalata antaa yhtäläiset varianssi. Lämpökarttana juoni on tuotettu dendrogrammissa kummallakin akselilla lasketaan täydellisen sidoksen menetelmällä.

Huumausainetestaus ja Alamar Blue elinkyvyn

2D yksikerroksista proliferaatiomäärityksillä, U87 ja KNS42-solut ympättiin kuoppiin 24-kuoppalevylle tiheydellä 5 x 10

4 solua kuoppaa kohti. Alamar Blue lisääntymisen määritys kulki ensiksi 24 tunnin kuluttua kylvö (nimetty päivä 1) ja suoritetaan kolme peräkkäistä päivää myöhemmin. Lyhyesti, elatusaine poistettiin kuopista ja solut pestiin kahdesti PBS: llä sen varmistamiseksi, jälkeäkään fenolipunaista säilyi. Tuoretta PBS: ää (1 ml) lisättiin kuhunkin kuoppaan, joka sisältää kasvainsoluja ja sen jälkeen lisättiin 100 ui Alamar Blue indikaattoriväriä (Invitrogen, UK). Inkuboinnin jälkeen 2 tuntia 37 ° C: ssa, 100 ui alikvootteja siirrettiin yhden kuoppiin 96-kuoppaisella musta pohjalevyn kolmena kappaleena, ja fluoresenssiemissio mitattiin 585 nm: ssä käyttäen levylukijaa (Tecan, Sveitsi). Wells sisältäviä 2D solut korvattiin tuoreella väliaineella ja tämä menettely toistettiin päivää 2, 3 ja 4, jotta voidaan seurata leviämisen jokaisen solun väestöstä yli kolme päivää. 3D-kulttuuri lisääntymismäärityksissä, U87 ja KNS42 soluja viljeltiin kuten RCC aggregaatit 10-15 rpm 1 viikko. Seuraavana päivänä oli nimetty päivä 1 leviämisen analysointi ja kaikki myöhemmät leviämisen lukemat (mielivaltaisia ​​fluoresenssiyksiköinä) laskettiin suhteessa Päivä 1 lähtötilanteessa käsittelyssä, mikä osuus vaihtelut raekoko 1 viikon kuluttua kulttuuriin. 3D-aggregaatit poistettiin RCC alusten ja sijoitetaan yhdessä kuoppiin 24-kuoppaisella kudosviljelylevyllä, ja pestiin kahdesti PBS: llä. Kuten edellä, 1 ml: lla tuoretta PBS: ää lisättiin kuhunkin kuoppaan, joka sisältää aggregaatin, minkä jälkeen lisättiin 100 ui Alamar Blue indikaattoriväriä (Invitrogen, UK). Inkuboinnin jälkeen 2 tuntia 37 ° C: ssa, 100 ui alikvootteja siirrettiin yhden kuoppiin 96-kuoppaisella musta pohjalevyn kolmena kappaleena, ja fluoresenssiemissio mitattiin 585 nm: ssä käyttäen levylukijaa (Tecan, Sveitsi). Kasvaimen aggregaatit myöhemmin palautettiin UV-säteilytetään RCC alusten ja 3D kulttuurin uudelleen. Tämä menettely toistettiin päivien 2, 3 ja 4 valvomiseksi reaaliajassa leviämisen aggregaattien yli kolme päivää. Tiedot kaikista leviämisen analyysit esitetään keskimääräinen prosentuaalinen solujen elinkelpoisuuden kolmen erillisen kokeen kanssa virhejanat osoittaa keskivirhettä keskiarvon (SEM). Sytotoksisuuden analyysit 2D yksikerroksia, solut ympättiin 24 tuntia ennen lääkkeen hoitoa konsentraatioalueella 0-10 uM ja Alamar Blue määritys suoritettiin 72 tunnin kuluttua lääkkeen altistumista. Sytotoksisuuden analyysit 3D viljelmiä, soluja kasvatettiin RCC ja 1 viikko, jotta aggregaattien muodostamiseksi, jonka jälkeen poistetaan aggregaatit peräisin RCC alusten ja asettamalla yhden kuoppiin 24-kuoppaisella levyllä. Alamar Blue määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu ja leviämisen asema tässä vaiheessa nimetty lähtötilanteessa. Aggregaatit palautettiin UV-steriloitu RCC aluksia ja viljeltiin väliaineessa, joka sisälsi Vorinostat (Selleck Chemicals, 5 mM varastoliuos) pitoisuutena 0-30 uM. Leviämisen analyysit toistettiin 72 tunnin kuluttua lääkkeen altistumisen ja tiedot normalisoidaan perustason lukemat otetaan huomioon monipuolinen yhteenlasketut koot johtuu stokastisen vaihtelun RCC 3D kulttuuriin.

immunohistokemia

Immunohistokemia suoritettiin aiemmin julkaistu protokollat ​​[49]. Aggregaatit formaliinilla ja vaha sulautettujen ennen leikkaamista. Antigeeni haku suoritettiin höyryssä sitraattipuskurissa 40 minuuttia. Anti-Ki67 (Dako, monoklonaalinen hiiren anti-ihmis-Ki67-antigeeni, klooni MiB-1) levitettiin 30 minuuttia huoneenlämpötilassa 1:50 pitoisuus. Anti-beta-galaktosidaasi (Abcam, hiiren monoklonaalinen DC1 4C7) ja anti-CDKN2A /p16INK4a (Abcam, hiiren monoklonaalinen 2D9A12) on hyödynnetty 1:1000 ja 1:800 pitoisuudet vastaavasti yhden tunnin ajan huoneen lämpötilassa. Sekundaarinen vasta-aine (100 ui Dako piparjuuriperoksidaasiin konjugoitu kanin anti-hiiri) levitettiin kolmekymmentä minuuttia huoneen lämpötilassa ennen käyttöä 3,3′-diaminobentsidiini kromogeeni. Positiivinen kontrolli kudokset olivat nielurisojen (Ki67) ja paksusuolen karsinooma (beeta-galaktosidaasi ja P16). Immunohistokemiaallisesti Ki67, p16 ja beeta-galaktosidaasi pisteytettiin laskemalla positiivinen ytimien prosentteina koko ytimien sisällä useita suuritehoinen kenttiä (vähintään kolme henkilöä kustakin näytteestä). Kasvaimen näytteet on kudossiruina, positiivisin alue ( ”hot-spot”) kunkin ytimen pisteytettiin. Soluviljelmien käynnissä hypoxyprobe (Hypoxyprobe Inc., Burlington, MA) analyysi, hypoxyprobe reagenssi (pimonidatsoli) levitettiin kaksi tuntia ennen sadonkorjuuta 200 uM. Näytteet kiinnitettiin sitten vakiona ja immunohistokemia suoritettiin käyttäen primääristä vasta-ainetta mukana toimitettu hypoxyprobe kit 1:200 pitoisuus. Positiiviset kontrollit tehtiin 2D soluviljelmissä viljelty niukkahappiseen kammiossa 1% ilmakehän happea. Negatiiviset kontrollit tehtiin jättämällä ensisijaisen vasta-aineen ja myös yksikerrossoluissa viljelty 21% happea, 5% CO

2 sääolosuhteissa.

Immunofluoresenssikoe

yksikerrossoluissa tai 3D RCC aggregaatteja oli vahvistetaan 0,4% paraformaldehydillä ja blokattiin 5% normaalia vuohen seerumia /0,1% Triton-X 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa. Sillä immunoleimaus, soluja inkuboitiin anti-beeta-galaktosidaasi (Abcam, hiiren monoklonaalinen DC1 4C7) käyttäen 1:1000 laimennus yön yli 4 ° C: ssa kostutetussa kammiossa. Solut pestiin ja niitä inkuboitiin anti-hiiri-Alexa-fluori 555 (Dako) käyttäen 1:300 laimennus pimeässä huoneenlämpötilassa. Tumat visualisoitiin käyttämällä DAPI ja fluoresenssisignaalit rekisteröitiin käyttämällä Leica DMRB pystyssä fluoresenssimikroskoopilla.

Pyyhkäisyelektronimikroskopia

kolmiulotteinen kasvain aggregaatit pestiin kolme kertaa tuoreessa PBS ja kiinnitettiin 3% glutaraldehydiä 12 tunnin ajan. Kiinteät näytteet pestiin sitten kolme kertaa PBS: ssä ja kuivattu edelleen 12 tunnin altistuminen ilmassa huoneenlämpötilassa. Kiinteät ja kuivattu aggregaatit asennettiin alumiini tyngät ja olivat ruiskupinnoitettu kullalla on argon nykyisellä 30 mA 3 minuuttia. Solujen morfologia ja organisaatio aggregaattien tehtiin näkyväksi käyttämällä skannaus elektronimikroskoopilla (SEM) (JEOL JSM-6060LV) 10 kV.

biotilastollisen Analysis

analyysi geenien ilmentymistä ja microRNA array tiedot olivat suoritettiin käyttäen GeneSpring paketti (Agilent, UK), jossa vertailu ryhmien välillä suoritettiin käyttäen paritonta kaksisuuntainen t-testi Benjamini-Hochberg useita testi korjauksen. Analyysi array PCR data tehtiin käyttämällä mukana Excel tilastollinen paketti (SABiosciences). Pathway analyysi suoritettiin käyttäen kekseliäisyyttä IPA paketti (kekseliäisyyttä järjestelmät). SPSS ohjelmistoa käytetään johtamaan opiskelijoiden t-testiä ja P-arvoja pidettiin merkitsevä alle 0,05 kaikkialla.

Tulokset

MAKROSKOOPPINEN 3D RCC Kiviaines kerrata heterogeeninen morfologia Primary aivokasvainten

Näkyvä makroskooppisia soluaggregaatteja havaittiin 24-48 tunnin aloittamista kulttuurin ja saavutetaan maksimaalinen koko viikon kuluttua viljelyn. Halkaisija aggregaatit oli pääpiirteittäin kunkin solulinjan hyödynnetään mutta vaihtelivat eri solulinjoissa. Suurin aggregaatit tuloksena käytettäessä PFSK-1 solulinja jopa 9 mm ja KNS42 (enintään 5 mm). U87 muodostunut useita (5-10) pienempiä aggregaatteja kukin 1-3 mm halkaisijaltaan. Viljellyt aggregaatit pidettiin kannattava viljelmässä korkeintaan kuuden viikon ajan, mutta tyypillisesti talteen kolme viikkoa molekyyli- ja solutason luonnehdinta.

aggregaatit kaikista solulinjoista ollut samanlaisia ​​yleistä toistettavissa morfologia kanssa erittäin solun reuna (tyypillisesti 100 -200 um) elinkelpoisten solujen välissä muutosvyöhykkeellä sekoitettua terveitä ja kuolevia soluja ja keskeinen ydin alhainen cellularity jossa suurin osa soluista nekroottista tai apoptoottinen (kuvio 1 A-H). Sillä johdettu GB-1-solulinjassa, vertailu oli mahdollista alkuperäiseen primaarikasvaimen ja tämä osoitti hyvin samankaltainen morfologia ja solujen kasvua tiheys on keskimäärin 424 solua per suuritehoinen kenttä (HPF) ja primaarikasvaimen ja 398 solua HPF varten 3D yhteenlaskettu (ei tilastollisesti merkitsevää eroa, p = 0,452) (kuvio 1 I-J). 3D aggregaatit myös muistuttivat kasvaimia niiden uudelleen antautuminen heterogeenisyys korkean ja matalan sellulaarisuus alueilla. Korkea cellularity vanteen ja matalan solukkoisuus ydin myös näkyväksi pyyhkäisyelektronimikroskoopilla erittyneen soluväliaineen elementtejä havaittiin 3D aggregaattien alkoi vahvistaa endogeenisen ECM (kuvio 1 K-L). Sen sijaan, GB-1 2D yksikerrossoluissa näyttää enemmän homogeeninen morfologia koko kulttuuri alus, jolla ei ole erillistä aluetta tilallisesti (kuvio 1 M).

A-D -Low teho näkymät osien formaliinilla parafiiniin upotettuja GB1, U87, Daoy ja PFSK-1 aggregaatit vastaavasti, mikä osoittaa alhainen cellularity nekroottinen ydin ja tiheästi solujen lisääntymishäiriöiden vanteen. E-H – Tehokas näkymät GB1, U87, KNS42 ja PFSK-1 vastaavasti, mikä osoittaa solujen heterogeenisuus vanteen /ydin käyttöliittymä ja nekroottisen kudoksen kanssa apoptoottisten lukuja ydin. I L – pyyhkäisyelektronimikrosko- GB-1 RCC aggregaatit tiheä vanteen ja altistuvat ydin K ja suuritehoinen pinta näkymä L. M – morfologia GB-1 2D yksikerrossoluissa. Mittaviivat 100 mikrometriä A-D ja 25 mikrometriä E-J ja M. Suurennus × 500 K ja × 2000 L.

RCC aggregaatit Näyttö Cellular heterogeenisuus ja alennetulla Proliferaationopeudet

immunohistokemiaallisesti Ki67 paljasti suuren enemmistön lisääntyvät solut 3D aggregaattien olemaan sisällä vanteen tai muutosvyöhykkeellä, ilman tai hyvin vähän positiivisia soluja keskeinen ydin (kuvio 2 A-C). Tarkka värjäysmallia vaihteli hieman vuosina solulinjojen mutta kaikki linjat näytteillä nämä yleiset ominaisuudet. Värjäys p16 ja beeta-galaktosidaasi, markkereita solun vanhenemista, esillä samanlaisia ​​tuloksia, jolloin molemmat vasta-aineet värjättiin paljon suurempi osuus solujen ytimen verrattuna vanteen. Sillä KNS42 linja, P16 värjätään 90% solujen ydin ja 40% soluista vanteen, kun taas beeta-galaktosidaasi värjätään 47% ytimessä ja 1% vanteen. Tämä malli toistettiin kaikkien muiden solulinjojen (tietoja ei esitetty). Sekä P16 ja beeta-galaktosidaasi osoitti samanlaista osuutta positiivista värjäytymistä ytimessä primaarikasvaimia verrattuna ytimeen 3D aggregaatit (kuva 2 D-I). Immunohistokemiaallisesti nämä tavoitteet suoritettiin myös vastoin kohortti (n = 150) pediatristen korkealuokkaisesta gliooman archival näytteenvalmistukseen kudossiruina. Löysimme tilastollisesti merkitsevä assosiaatio Ki67 värjäytymistä verisuonia alueilla ja potilaiden eloonjäämisen aiemmin raportoidun [49].