Krooninen sairaus

tiivistelmä

NRP-2 on korkean affiniteetin kinaasi-puutosta reseptorin ligandeille kuuluvat luokkaan 3 semaforiini ja endoteelikasvutekijä perheitä. NRP-2 on havaittu pinnalla useita erilaisia ​​ihmisen syöpäsoluja, mutta sen ilmentymistä ja toimintaa ruuansulatuskanavan (Gl) syöpäsolut on vielä määrittämättä. Me pyrittiin määrittämään toimintaa NRP-2 välittämisessä alavirran signaalit säätelevät kasvua ja selviytymistä ihmisen ruoansulatuskanavan syöpäsoluja. Ihmisen mahasyöpä yksilöt, NRP-2: n ilmentymisen havaittiin kasvainkudoksissa, mutta ei viereisissä normaalin limakalvon. Vuonna CNDT 2.5 soluissa, shRNA välittämä knockdown NRP-2 ilmaisun vähensivät muuttoliikettä ja invaasiota in vitro (p 0,01). Kohdennettu geenin erilaisia ​​analyysi osoitti, että menetys NRP-2 vähensi ilmaus kriittisen etäpesäke sovittelija geeni, S100A4. Vakaan tilan tasot ja toiminta β-kateniinin, tunnettu säätelijä S100A4, myös laski shNRP-2 klooneja. Lisäksi knockdovvn NRP-2 herkistyneet CNDT 2,5 solua

in vitro

5FU myrkyllisyys. Tämä vaikutus liittyy kaspaasien aktivaatio 3 ja 7, lohkaisu PARP, ja downregulation Bcl-2.

In vivo

kasvu CNDT 2,5 solujen maksa nude-hiirten oli merkittävästi vähentynyt shNRP-2 (p 0,05). Intraperitoneaalisesti NRP-2 siRNA-DOPC pienensi tuumoritaakka hiirillä (p = 0,01). Yhdessä tuloksemme osoittavat, että kasvain soluista peräisin NRP-2 välittää kriittistä selviytymisen signalointi ruoansulatuskanavan syöpäsoluja.

Citation: Samuel S, Gaur P, Tuuletin F, Xia L, Gray MJ, Dallas NA, et al . (2011) Neuropiliini-2: n välittämien β-kateniinin Merkinanto ja Survival in Human ruoansulatuskanavan Cancer Cell Lines. PLoS ONE 6 (10): e23208. doi: 10,1371 /journal.pone.0023208

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Kiina

vastaanotettu: 31 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 12 heinäkuu 2011; Julkaistu: 20 lokakuu 2011

Copyright: © 2011 Samuel et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: RE ” Bob ”Smith Fund for Cancer Research (SS); National Institutes of Health avustuksen 5 T32 CA09599 (ND, PG, ja DB); Center for RNA-interferenssi ja koodaamattomat RNA (GL-B, AS), ja ohjelma hankekehitysyksikkö Grant muodostavat Munasarjojen Cancer Research Fund (GL-B, AS); William C. Liedtke, Jr., puheenjohtaja for Cancer Research (LE); National Institutes of Health avustuksen R01 CA112390 (LE). Nämä rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Genentech, Inc. maksettu palkkaa ja tutkimusinfrastruktuurin työntekijöilleen GP AB, mutta ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tietojen keruu ja analysointi, tai valmisteen käsikirjoituksen. Genentech, Inc. hyväksyi julkaisemisen käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: LE on konsulttina Genentech, Inc., joka on toimittanut NRP-2-vasta-aineita, ja Roche. GP ja AB maksettiin työntekijöille Genentech aikaan tutkimuksen. Patenttihakemus on jätetty, jotka liittyvät anti-NRP vasta Genentech, joita käytettiin tässä käsikirjoitus. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamiseen ja materiaaleja, yksityiskohtaisena online-oppaassa tekijöille.

Johdanto

Neuropiliini-2 (NRP-2) on transmembraaninen glykoproteiini, joka on alun perin kuvattu reseptori aksoniohjauksen välittäjiä, Semaforiinien [1]. Myöhemmin todettiin, ilmaistaan ​​laskimoiden ja imusuonten endoteelisoluissa, ja se identifioitiin koreseptoria jäsenten verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF) perheen [2], mikä viittaa siihen, rooli angiogeneesissä ja imusuonten [3]. NRP-2: n ilmentymisen on raportoitu kasvainsoluihin keuhkosyövän [4], [5], neuroblastooma [6], haimasyöpä [7], osteosarkooma [8], ja virtsarakon syöpä [9]. Kuitenkin toiminta NRP-2 kasvaimen solukalvon ihmisen syövissä, mukaan lukien maha-suolikanavan (GI) neuroendokrii- ja mahalaukun alkuperä, jää suurelta osin määrittelemätön. Aiemmin olemme osoittaneet, että NRP-2 ilmentyy paksusuolen ja haiman syöpäsoluissa, ja että sen ilmentyminen on mukana edistämään kasvaimen kasvua [10], [11]. Tarkoituksena Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli selvittää toiminnan NRP-2 välittämisessä alavirran signaalit säätelevät kasvua ja selviytymistä ihmisen ruoansulatuskanavan syöpäsoluja. Huomasimme, että NRP-2 yliekspressoitui ihmisen mahasyövän yksilöt sekä maha- ja karsinoidioireyhtymän soluissa in vitro. Me selvitetty rooli NRP-2 solulinjoissa korkein NRP-2: n ilmentymisen. Huomasimme, että menetys NRP-2 vähensi vakaan tason ja toiminta β-kateniinin näissä soluissa. NRP-2 Knockdown johti laskuun ilmaisun S100A4 ja väheni muuttoliike ja invaasion solujen in vitro. Lisäksi knockdovvn NRP-2 herkistyneet CNDT 2,5 soluja in vitro 5FU myrkyllisyys. Nämä tulokset osoittavat, että NRP-2 välittää kriittisten onkogeeninen toimintojen GI syöpäsoluissa ja että estäminen sen ilmentymisen ja aktiivisuuden voitaisiin käyttää hyväksi terapeuttista hyötyä potilaille, joilla on etäpesäkkeitä.

Tulokset

ilmentäminen NRP-2 ihmisen mahasyövän kudosten ja solulinjoissa

ensin arvioitiin ilmentymistä NRP-2-proteiinin parafinoidut kudoksia ihmisen mahasyövän ja viereisen normaali limakalvo immunoperoksidaasivärjäyksellä. Edustavaa mahasyöpä yksilöt, NRP-2-proteiini ilmentyy mahasyövän epiteelin, mutta ei normaalissa limakalvon epiteelissä (kuvio 1A). NRP-2-proteiinia (~130 kD) oli heterogeenisesti ilmaistaan ​​viidellä kuudesta maha syöpäsolulinjoissa analysoitiin western-blottauksella: AGS, CNDT 2,5, MKN74, NCI-N87 ja KKLS (kuvio 1 B). CNDT2.5 (ihmisen karsi- solulinjassa [12], [13]) ja NCI-N87 ilmaisi korkeimman NRP-2 ja sen vuoksi käyttää tämän jälkeen knockdown tutkimuksiin. Kontrollina esi-inkubointi NRP-2-vasta-aineen kanssa immunisoivalla peptidi vahvisti vasta- aineen.

(A) immunohistokemiallinen värjäys NRP-2 ilmentymisen edustavaa kudosleikkeiden (20X) normaalia ihmisen mahalaukun limakalvon ja mahasyöpä yksilöt (B) immunoblottianalyysi NRP-2: n ilmentymisen kuudessa ihmisen GI syöpäsolun linjat. Vinkuliini toimi sisäisenä latauskontrollina. (C) Generation vakaiden CNDT 2,5 solulinjoissa NRP-2 knockdown. Immunoblottianalyysi NRP-1 ja -2 ilmentymisen CNDT 2.5 transfektoiduissa soluissa shcntr tai shNRP-2 plasmidit (shNRP-2 klooneja, C6 ja C10). Vinkuliini toimi latauskontrollina. (D) MTT-määritys tuloksia. Kasvuluvut eivät eronneet välillä ohjaus solujen ja NRP-2 knockdown klooneja. Palkit osoittavat SEM. (E) Yläosa: solujen keskimääräinen lukumäärä, jotka kulkeutuivat on Boyden kammiossa määritystä. Pohja: Kuvat ovat (10x) siirtolaisuuden määritykset. (F) Top: solujen keskimääräinen lukumäärä, jotka hyökkäsivät BioCoat Matrigel hyökkäystä kammion määrityksessä. Pohja: Kuvat ovat (10x) invaasion määritykset.

vaikutus NRP-2 ilmaisun soluproliferaatioon in vitro

Ymmärtää toiminta NRP-2 mahasyövän, me ensin tutkinut vaikutuksia NRP-2 hiljentäminen kasvuun on CNDT 2,5 soluissa in vitro. Valitsimme nämä solut, koska ne ilmentävät korkeita endogeenisten tasojen NRP-2. CDNT 2,5-solut stabiilisti transfektoitu shRNA ohjaus (shcntr) tai shNRP-2 (shNRP-2) plasmidi, ja kaksi shNRP-2 transfektoidut kloonit, joissa on merkittävä väheneminen NRP-2-proteiinin ilmentymisen (C6 ja C10, kuvio 1C), olivat valittu. shNRP-2 transfektion ei vaikuttanut ilmaus NRP-1 näissä soluissa, tarkistaa spesifisyys NRP-2 shRNA. Sitten käytimme MTT-määritys määrittää vaikutuksen NRP-2 Knockdown kasvuun hinnat solujen in vitro. Kloonit transfektoitu stabiilisti shNRP-2 ei osoittanut muutosta leviämisen hinnat suhteessa kuin shcntr-transfektoiduissa soluissa (kuvio 1 D).

vaikutus NRP-2 ilmaisun maahanmuutosta ja invaasio

Vaikutus of NRP-2 RNAi on motiliteettia CNDT 2,5 soluista tutkittiin käyttäen Boyden kammion määrityksiä. Solujen määrän, jotka muuttivat alaosaan oli merkitsevästi pienempi shNRP-2 transfektoiduissa soluissa (37 ± 5 per kenttä) kuin shcntr transfektoiduissa soluissa (140 ± 12 per kenttä) (p 0,001; Kuva 1E, ylhäällä). Toisaalta, kun solut, joilla on alhainen endogeenisen ilmentymisen NRP-2 (KKLS) transfektoitiin ohimenevästi kanssa NRP-2-cDNA-ekspressiorakenne, jotta yli-ilmentää proteiinin, solumigraatio oli merkittävästi lisääntynyt (tuloksia ei ole esitetty).

soluinvaasiota arvioitiin käyttämällä modifioitua Boyden kammion määritystä kalvoilla päällystetty Matrigel. NRP-2 RNAi merkittävästi esti hyökkäyksen CNDT 2,5 solujen (64,4%; p 0,001; Kuva 1 F, ylhäällä). Kuitenkin, koska hyökkäystä solujen tässä määrityksessä on myös funktio vaeltavien mahdollisten solujen on vaikea harjata pois yksittäisiä kommentteja. Sellaisena sillä erot ryhmien välillä on samanlainen molemmissa määrityksissä, emme voi sulkea pois ajatusta, että pienempi määrä hyökkäävän solut voivat pelkästään heijastaa vähentynyt migraatio shNRP2 klooneja.

vaikutus NRP- 2 knockdown ekspressioon tunnetaan metastasoituneen geenien

Koska hyökkäyksen ja maahanmuutto liittyvät metastaattisen fenotyypin, teimme geenijärjestelyillä analyysi joka käyttää kohdistettua ihmisen kasvaimen etäpesäke mikrosirulla, joka edustaa 113 geenit, joiden tiedetään olevan mukana etäpesäke. Suppressio NRP-2 vähensi ekspressiotaso useiden metastaattisen geenien (kuvio 2A). Monet vaimentua geenit, jotka olivat herkkiä NRP-2 pudotus tiedetään liittyvän hajoamisen soluväliaineen ja ovat erittäin ilmaistaan ​​etäpesäkkeen muodostumisen aikana. Selkeimmin havaitsimme, että vähen- tämisessä NRP-2 aiheutti merkittävän vähentämisen ( 95%) ilmaisemisessa S100A4 (kuvio 2A). Koska S100A4 oli varsin kiinnostunut NRP-2 knockdovvn, olemme keskittyneet tässä geenissä lisätutkimuksiin. Western blot-analyysi vahvisti, että S100A4 proteiinin ilmentyminen väheni merkittävästi, kun NRP-2 pudotus (kuvio 2B).

(

) Autoradiografinen kuva array kalvon osoittaa ero ilmentymisen metastaattisen geenien shcntr (

jäljellä

) ja shNRP-2 (

oikeus

) soluja. Kiersi täplät osoittavat paikan S100A4 geenin. (B) validointi S100A4 ekspressiotaso soluissa immunoblot-analyysillä. Aktiini toimi latauskontrollina. (C) vähentäminen vakaan tilan tason β-kateniinin by NRP-2 knockdown. β-kateniinin ilmentymistä shcntr ja shNRP-2-soluissa määritettiin immunoblottauksella. Vinkuliini toimi latauskontrollina. (D) tarkastaminen vähensi β-kateniinin ilmentymistä shNRP-2-soluissa immunofluoresenssivärjäyksen. shcntr ja shNRP-2 CNDT 2,5 kasvavien solujen kammiossa Leikkeitä kiinnitettiin ja immunovärjättiin anti-β-kateniinin vasta-ainetta (punainen). Tumat vastavärjättiin DAPI (sininen). (E) validointi β-kateniinin vähennys toisessa NRP-2 Knockdown mahasyövässä solulinjassa. NCI-N87 mahasyövän solut infektoitiin lentiviruksen sisältävien shcntr tai shNRP-2 konstruktioita. Immunoblot-analyysi osoitti vähenemistä β-kateniinin ilmentymistä NCI-N87 NRP-2 knockdown soluissa. Aktiini toimi latauskontrollina. (F) β-kateniinin taso sytoplasman (Cyto) ja ydin- (Nuc) murto shcntr ja shNRP-2-soluissa. HSP90 (sytoplasmisen) ja LaminB (ydin) toimi fraktioinnin valvontaa.

vaikutus NRP-2 Knockdown ilmentymiseen ja lokalisoinnin β-kateniinin

Koska S100A4 on suora transkription kohde- of β-kateniinin, tutkimme ilmentymistä β-kateniinin että NRP-2 knockdown soluissa. Yhteensä β-kateniinin proteiinin ilmentyminen oli merkitsevästi pienempi CNDT 2,5 shNRP-2-soluissa kuin shcntr soluissa (kuvio 2C). Sillä lisävahvistusta, shcntr ja shNRP-2 kloonia kiinteitä ja immunovärjättiin anti-β-kateniinin vasta-ainetta (punainen fluoresenssi). Yhdenmukainen western blot data, yhteensä β-kateniinin tasoja vähensi merkittävästi KUO-2 taintumisen soluja (kuvio 2D). Sillä lisävalidointia toisessa mahasyövän solulinja, NRP-2 pudotettiin NCI-N87-solut, jotka ilmentävät korkeaa endogeenistä tasoa NRP-2, jonka lentivirus välittämä vakaa shNRP-2 sisällyttäminen. Tarkastamisen jälkeen NRP-2 taintumisen (kuvio 2E, Lähi paneeli) näissä soluissa β-kateniinin tason arvioitiin western blottauksella. Yhteenlaskettu β-kateniinin tason väheni merkittävästi näissä NRP-2 taintumisen soluissa (kuvio 2E, Ylälevy).

onko NRP-2-välitteisen β-kateniinin ilmentyminen oli ligandi riippuvainen luentaa itsenäinen, β-kateniinin tila arvioitiin western blot analyysissä CNDT 2,5 soluissa hoidon jälkeen estävät vasta NRP-2 (anti-NRP-2

B, joka estää VEGF-C sitova, ja pan-anti-NRP, joka estää Sema sitoutumista sekä NRP-1 ja NRP-2 ja myös estää VEGF sitova steerinen este); anti-NRP1 vasta-aine toimi kontrollina (kaikki Genentech, San Francisco, CA). Kontrolliin verrattuna, ei ollut eroa ilmentymisen β-kateniinin soluissa käsitelty estävien vasta-aineiden, mikä viittaa siihen, että NRP-2-välitteistä signalointia näissä soluissa on ligandi riippumaton (tuloksia ei ole esitetty).

β-kateniinin tiedetään panevan sen toiminto translokaatiota sytoplasmasta tumaan, jossa se sitoutuu transkription tekijöitä, kuten T-solujen tekijä (TCF) /lymfaattisen edistäjän sitova tekijä ja siten stimuloi kohdegeenien transkription. Siksi analysoitiin suhteellinen runsaus β-kateniinin proteiinin sytosolisen ja ydinvoiman osastojen CNDT2.5 shNRP-2 ja shcntr soluissa, sen jälkeen solun fraktioinnin. Kuten kuviossa 2F, NRP-2 Knockdown johti huomattavaan vähenemiseen vakaan tilan tason β-kateniinin proteiinin sekä sytosolin ja ydinvoima jakeet solujen.

vaikutus NRP-2 knockdown toiminnosta ja β-kateniinin

Sen määrittämiseksi, NRP-2 pudotus vaikuttaa myös signalointi aktiivisuutta β-kateniinin, transfektoimme CNDT 2,5 shcntr ja shNRP-2-solujen kanssa TCF reportteriplasmidilla TOPflash tai kontrolli plasmidin FOPflash. TOPflash sisältää lusiferaasireportteri- valvonnassa kolme kopiota villityypin TCF-sitova osa ylävirtaan tymidiinikinaasin minimaalinen promoottori ja erityisesti säätelee β-kateniinin signalointia. Vuonna FOPflash, TCF-sitova elementti on mutatoitunut. Lusiferaasimääritystä osoitti, että toimittaja aktiivisuus väheni 2-kertaisesti shNRP-2-soluissa verrattuna aktiivisuus shcntr soluissa (kuvio 3A).

(A) arviointi TCF reportteri aktiivisuus käyttämällä β-catenin- reagoiva TOPflash tai mutantti FOPflash toimittajille. Lusiferaasiaktiivisuudet mitattiin sen jälkeen, kun ohimenevän transfektion reportteri plasmidit shcntr ja shNRP-2 CNDT 2,5-soluja (B) lisääminen proteasomi-välitteinen hajoaminen β-kateniinin shNRP-2-soluissa. shcntr ja shNRP-2 CNDT 2,5-soluja käsiteltiin 30 uM MG132 tai yhtä suuri tilavuus DMSO: ta (liuotin MG132) 2 tunnin ajan. Solulysaatit analysoitiin immunoblottauksella käyttäen anti-β-kateniinin vasta-ainetta ( ”φ”, ei hoitoa; UB ”, ubikitinoituja β-kateniinin). (C) immunoblottianalyysi osoittaa palauttaminen β-kateniinin tasolla sytoplasman ja ydinvoiman jakeet hoidon jälkeen 30 uM MG132 2 tuntia. (D) Vähentynyt tasot fosforyloitua GSK3p NRP-2 knockdown soluissa. Immunoblottianalyysi fosforyloitua GSK3p (at Ser-9) ja GSK3p. (E) palauttaminen β-kateniinin tason jälkeen esto GSK3p aktiivisuutta NRP-2 knockdown soluissa. shcntr tai shNRP-2 CNDT 2,5 knockdown-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla LiCl: ssa 24 tuntia ja korjattu immunoblot-analyysi havaitsemiseksi β-kateniinin.

vaikutus NRP-2 pudotus on vakautta β- kateniinin

Solunsisäinen β-kateniinin proteiinin tasot ylläpitää multiproteiinikompleksissa ”tuhoa monimutkainen”, joka sisältää APC, ak- siini, ja GSK3p. Aktiivisessa monimutkainen, GSK3p fosforyloi β-kateniinin, koodaus sen tunnustamista β-trCP, polyubiquitinylation, ja myöhemmin hajoamiselle proteasomia monimutkainen. Suoritimme estäjä tutkimuksia arvioida vakautta β-kateniinin että NRP-2 knockdown soluissa. Hoito MG132, proteasomin estäjä, johti palauttaminen koko β-kateniinin proteiinin tason NRP-2 Knockdown solujen taso shcntr soluissa (kuvio 3B). Lisäksi hoito MG132 palautti myös koko β-kateniinin proteiinin tason sekä sytosolin ja ydinvoima osastojen NRP-2 taintumisen soluja (kuvio 3C).

jälkeinen muokkaus tiedetään pelata kriittinen rooli sääntely β-kateniinin liikevaihdon, ja β-kateniinin peräkkäin fosforyloituu GSK3p. Sen tutkimiseksi, GSK3p: n aktivaatio oli mukana downregulation of β-kateniinin, tutkimme fosforylaatiotilaa GSK3p: n käyttämällä vasta-ainetta vastaan, Ser-9 fosforyloitua muotoa GSK3p. Ser-9 fosforylaation on raportoitu tehdä GSK3p: n aktiivinen. Kuten on esitetty kuviossa 3D, Ser-9 fosforylaatio GSK3p oli merkittävästi vähentynyt shNRP-2-soluissa, mikä osoittaa, että näissä soluissa ei ollut kohonnut aktiivisen GSK3p proteiinia, joka edistää β-kateniinin hajoamiseen. Edelleen vahvistavat osallistumista GSK3p aktivoinnin säätelyssä β-kateniinin, vaikutus litiumkloridia (LiCl)

, tunnettu estäjä GSK3p aktiivisuuden, analysoitiin. LiCI: n on raportoitu indusoivan inhiboivan Ser-9 fosforylaatio GSK3p mutta sillä ei ole vaikutusta muihin proteiinikinaaseihin. Kuten kuviossa 3E, hoidon LiCl stabiloitu β-kateniinin proteiinin shNRP-2-soluissa annoksesta riippuvalla tavalla.

vaikutus NRP-2 pudotus on kemosensitiivisyys ruoansulatuskanavan syöpäsolujen in vitro

Koska tunnetun roolin β-kateniinin välittämisessä solujen eloonjäämistä, me arveltu, että alennettu β-kateniinin tasolla NRP-2 knockdown solut kääntää lisääntynyt kemosensitiivisyys näiden solujen. Tämän hypoteesin testaamiseksi, ensin suoritetaan in vitro kemosensitiivisyys määrityksessä 5-fluorourasiilin (5FU), jota käytetään tavanomaista hoitoa varten ruoansulatuskanavan syöpien. Yhdenmukainen hypoteesia, jonka avulla anneksiini V-värjäyksellä, CNDT 2,5 shNRP-2: lla käsiteltyjen solujen kliinisesti merkityksellistä 5FU-annoksen, oli merkitsevästi suurempi osuus apoptoottisten solujen kuin ei shcntr soluja (25,5% vs. 12,5%, vastaavasti; p 0,05; kuvio 4A).

(A) anneksiini V-määrityksellä shcntr ja shNRP-2 CNDT 2,5-solujen hoidon jälkeen ilman tai 5FU: n 48 tuntia. (B) Western blot-analyysi apoptoottisen merkkiaineiden solu otteita shcntr ja shNRP-2 CNDT 2,5 soluja käsitellään ilman tai 5FU. Vinkuliini ja aktiini toimi lastaus valvonta.

Vahvista mekanismi 5FU-solukuolema, vertasimme aktivointi apoptoottisten välittäjiä CNDT 2.5 shcntr ja shNRP-2-solut käsiteltiin 5FU. Aktivointi kaspaasin 3 ja -7, efektori kaspaasit apoptoottisessa Cascade, ja lohkaisu kaspaasisubstraatin PARP, joka kohdistaa proapoptoottiset aktiivisuuden arvioitiin immunoblottauksella käyttämällä vasta-aineita, jotka spesifisesti tunnistavat niiden lohkaistun tuotteita. Yhdenmukainen lisääntynyt apoptoosin 5FU-käsitellyn NRP-2 pudotus soluissa, havaitsimme selvästi tasojen nousu aktiivisen kaspaasin 3 ja -7 näissä soluissa, mutta ei shcntr soluissa (kuvio 4B). Lisäksi havaitsimme PARP lohkaisu 5FU-käsitelty shNRP-2-soluissa, mutta ei 5FU-käsiteltyjen shcntr soluissa (kuvio 4B). Lisäksi havaitsimme merkittävää ilmentymistä antiapoptoottisten proteiinin Bcl2 että CNDT 2,5 shcntr soluja; Bcl2 ilmaisu ei ole yleisen shNRP-2-soluissa.

vaikutus NRP-2 knockdovvn in vivo kasvun ruoansulatuskanavan syöpäsolujen

vaikutuksen tutkimiseksi NRP-2 Knockdown kasvuun maha syöpäsoluja in vivo, me pistetään CNDT 2.5 shcntr tai shNRP-2 kloonien maksojen (yhteinen sivusto maha syövän etäpesäkkeiden) hiirten (10 eläintä ryhmää kohti) ja arvioitiin kasvaimen esiintymistiheys ja kasvaimen tilavuus. Kaikki hiiret olivat suunnilleen sama paino, kun uhrattu. Kasvaimen esiintymistiheys oli merkittävästi pienempi hiirillä injektoitu shNRP-2 klooneja kuin hiiriä, joihin injektoitiin shcntr soluja (30% shNRP-2 C6 ja 10% shNRP-2 C10 vs. 80%, shcntr; p 0,05, Fishers tarkka Test, kuvio 5A). Lisäksi kasvaimet tuottama CNDT 2,5 shNRP-2 solut olivat huomattavasti pienempiä (Mean maksakasvain tilavuus 38 ± 24 mm

3 ja 14 ± 10 mm

3 kahden kloonin, vastaavasti) kuin olivat kasvaimet tuottama ohjaus solut (Mean maksakasvain tilavuus 1797 ± 880 mm

3; p 0,05; kuvio 5B). Piirretystä datasta sisältää kaikki 10 hiirtä kussakin ryhmässä, mukaan lukien ne, jotka eivät kehittäneet mitään kasvain (eli 7/10 ja 9/10 vastaavasti kaksi shNRP2 ryhmää Vs 2/10 kontrolliryhmässä). Edustavia kuva koko maksassa kasvain kustakin ryhmästä näkyy alemmassa paneelissa. Knockdovvn NRP2 kasvaimissa vahvistettiin immunoblot-analyysi NRP-2 maksan tuumorikudoksissa injektoitujen hiirien CNDT 2,5 shcntr tai shNRP-2 C6-soluissa (kuvio 5C).

(A) väheneminen kasvaimen esiintymistiheys ja kasvaimen keskimääräisen tilavuuden jälkeen NRP-2 knockdown. Kasvaimen esiintymistiheys (10 hiirtä) kuluttua maksan injektion CNDT 2,5 shcntr soluja tai yksi kahdesta shNRP-2 klooneja. (B) Top: Final maksan kasvainten hiirillä ruiskutetaan shcntr ja shNRP-2 klooneja. Pohja: Kuvat ovat kasvaimia. (C) immunoblot-analyysi NRP-2 kasvaimissa injektoitujen hiirien CNDT 2,5 shcntr tai shNRP-2 C6-soluissa [ ”T1”; Kasvaimen # 1; ”T2”; Kasvain # 2]. β-Actin toimi latauskontrollina.

vaikutus in vivo kohdentamisen NRP-2 kasvuun ruoansulatuskanavan syöpäsolujen

Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus in vivo annon NRP-2 kohdistettu siRNA käyttäen 1,2-dioleoyyli-sn-glysero-3-fosfatidyylikoliini (NRP-2 siRNA-DOPC) neutraali nanoliposomes [10], [14] kasvua ruoansulatuskanavan syöpään hiirissä. CNDT 2,5-soluja kasvatettiin s.c. ksenografteja, ja NRP-2 siRNA-DOPC hoito aloitettiin 7. päivänä hiirillä silmin havaittavat kasvaimet (15 ± 1,5 mm

3). Hoito koostui kahdesti viikossa vatsaonteloon 5 ug CNTR siRNA-DOPC tai NRP-2 siRNA-DOPC. Keskimääräinen tilavuus hiirissä hoidettu NRP-2 siRNA-DOPC oli pienempi kuin hiiriä hoidettiin CNTR siRNA-DOPC sekvenssit (264,4 ± 19,4 mm

3 vs. 751,3 ± 150,6 mm

3, tässä järjestyksessä; p = 0,01; kuvio 6A). Lisäksi hiiret, joita käsiteltiin NRP-2 siRNA-DOPC näytteillä merkittävä väheneminen kasvaimen massa verrattuna syöpäkasvain hoidettujen hiirien CNTR siRNA-DOPC sekvenssit (160 ± 18 mg vs. 459 ± 102 mg, vastaavasti; p 0,05; kuva 6B). Immunohistokemiallinen värjäys tuumorikudoksista vahvisti, että NRP-2 ilmentyminen väheni kasvaimissa hiirille on NRP-2 siRNA-DOPC sekvenssit verrattuna kasvaimia hiirille on CNTR siRNA-DOPC sekvenssit (kuvio 6C).

(A) Tuumoritilavuudet annon jälkeen sicntr ja siNRP-2 liposomit. Nude-hiiriä (7 ryhmää kohden) olivat s.c. injektoitiin 1 x 10

6 CNDT 2.5 soluissa. Hiiret, joissa on näkyviä kasvaimia ositettu ja käsiteltiin 5 ug liposomiin konjugoidun siRNA (i.p. injektiot) kahdesti viikossa. NRP-2-siRNA DOPC-hoito johti merkittävään laskuun kasvaimen kasvussa verrattuna CNTR siRNA DOPC-hoitoa (264,4 mm

3 vs. 751,3 mm

3, vastaavasti; *

p

= 0.01). (B) Top: lopussa kokeen, s.c. kasvaimet leikattiin irti ja punnittiin. Kasvaimen paino oli merkitsevästi pienempi NRP-2-siRNA-DOPC käsiteltyihin hiiriin (keskiarvo, 160 mg) verrattuna CNTR siRNA DOPC käsitellyissä hiirissä (keskiarvo, 459 mg; *

p

= 0,01). Pohja: edustaja kuviin kasvaimista (C) immunoblottianalyysi NRP-2 kasvaimissa hiirille on CNTR-siRNA DOPC tai NRP-2-siRNA DOPC.

Keskustelu

Neuropiliini -2 (NRP-2) on perinteisesti tunnettu toimimaan nonsignaling koreseptoria luokan 3 Semaforiinien ja jäsenten VEGF-perheen [1], [2]. Vaikka ekspressio NRP-2: n ajateltiin alunperin rajoittuvan neuronien, tutkimukset ovat osoittaneet, että NRP-2 ilmentyy VSMCs, endoteelisolujen, ja kasvainsoluissa. NRP-2 on ilmoitettu reagoivan VEGFR2 ja VEGFR3 ja lisätä selviytymisen ja kulkeutumista verisuonten ja imusuonten endoteelisoluissa [15]. Viimeaikaiset toiminnallinen tutkimuksista Caunt ja kollegat ovat osoittaneet, että esto NRP-2 on prekliinisissä keuhkometastaasitestissä malli esti kasvaimen etäpesäke estämällä muodostumista kasvaimeen liittyvien lymphatics [16].

ilmentyminen NRP-2 on havaittu kasvainsolujen potilaan näytteitä monien kasvainten tyypit, mukaan lukien glioblastooma, neuroblastooma, ja melanooma. Laboratoriossamme ja muut ovat osoittaneet, että kasvainsolun peräisin oleva NRP-2: lla on rooli kasvaimen kasvun [10], [11]. Olemme pyrkineet edelleen valaista toiminnallista roolia NRP-2 ja signalointi mekanismeja, jotka välittävät toiminta NRP-2 GI syöpäsoluissa, mukaan lukien mahalaukun ja karsinoidioireyhtymän soluja. Osoitamme tässä tutkimuksessa, että NRP-2 on erittäin ilmaistaan ​​kasvainsolujen mahalaukun karsinooma kudoksissa ja ruuansulatuskanavan syövän solulinjoissa, mutta se ei ole havaittavissa immunohistokemiallisesti normaalin mahan limakalvon. Mekanismeja, joilla NRP-2 tasot ovat yläreguloituja ruoansulatuskanavan syöpien jää epäselväksi. Mielenkiintoista, Tsukamoto ja työtovereiden [17] todettiin, että 40% mahasyöpäpotilaista analysoidaan oli voitto on 2q33 (alue, jolla NRP-2-geeni sijaitsee) mukaan joukko vertaileva genominen hybridisaatio (CGH) analyysi, mikä viittaa kopiomäärä aberraatiota ( CNA) tämän alueen.

hyödynnettiin shRNA välittämä RNA-interferenssi lähestymistapa tukahduttaa NRP-2: n ilmentymisen mahalaukun syöpäsolujen tutkimaan tuloksena fenotyyppisiä muutoksia, mukaan lukien proliferatiivinen, muuttavien ja invasiivisia toimintoja. Knockdovvn NRP-2 ei vaikuttanut leviämisen CNDT 2,5 in vitro; kuitenkin, menetys NRP-2 vähensi kasvua tuumoriksenograftien

in vivo

. Ristiriita

in vitro

ja

in vivo

kasvun estäminen voi johtua NRP-2-vasteita soluista kasvaimen mikroympäristössä tuumoripaikkaan

in vivo

jotka eivät kuitenkaan ole merkittäviä käytettäessä

in vitro

järjestelmässä.

In vitro

tutkimukset osoitti lisäksi, että oli huomattavan estymisen muuttoliikkeen ja invaasion solujen. Käyttämällä etäpesäke liittyvien geenien cDNA mikrosiruanalyysi tunnistimme S100A4, keskeinen etäpesäke sovittelija geeni, voidaan merkittävästi vaimentua jälkeen NRP-2 hiljentäminen. S100A4 on aikaisemmin yhdistetty etäpesäkkeiden useissa kokeellisissa järjestelmissä [18], [19]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että S100A4 voi myös edistää syövän etenemistä tehostamalla solujen selviytymistä toimintoja. Mahon ja kollegat [20] ovat osoittaneet, että S100A4 pudotus herkistää haimasyövän soluja gemsitabiinihoidon lisäksi aktivoimalla kaspaasien ja PARP, mikä lisää apoptoosia ja solusyklin pysähtymisen. Havaitsimme, että downregulation NRP-2 mahalaukun syöpäsoluissa chemosensitized solujen 5FU hoitoon. Lisätutkimuksia tarvitaan sen määrittämiseksi, NRP-2 välittää prosurvival toimintoja mahasyövän soluihin S100A4.

lisätutkimukset NRP-2-välitteisen S100A4 sääntely osoitti, että vakaan tilan tasoja ja toiminta β-kateniinin, suora transkription säätelijänä S100A4, olivat vaarantunut NRP-2 knockdown soluissa. Suuri aineistolla tukee panos aktivointi β-kateniinin signalointireitin kehittämiseen ja etenemiseen syöpien. Aktivointi Wnt /β-kateniinin signalointi löytyy noin 30%: mahasyövistä [21]. Tuoreessa tutkimuksessa, Wang ja työtovereiden [22] on ehdotettu β-kateniinin stabilointi kuin toimintatapa varten ATDC välittämää onkogeenisen toiminto haimasyöpä. Käyttäen siirtogeenisen hiiren mallia, Oshima ja työtovereiden [23] ovat osoittaneet, että yhteistyö Wnt signalointia ja prostaglandiini E

2 (PGE

2) polku aiheuttaa mahalaukun syövän kehittymisen. Säädellyllä β-kateniinin reitin aktivaatio havaittiin NCI-N87 solujen on oltava riippumattomia mutaatiot APC ja β-kateniinin geenejä, koska tästä solulinjasta ei satama luontaista mutaatioita kummassakin näistä geeneistä. Mekanismi, jonka NRP-2 hiljentäminen vaikuttaa tämän reitin kautta edelleen epäselvä.

Yksi mahdollinen rajoitus Tutkimuksemme on, että olemme analysoineet kasvua NRP-2 Knockdown mahalaukun syöpäsoluja ensisijaisena kasvaimia, mutta ei arvioi etäpesäke kasvaimia. Koska havaintomme, että nämä solut ovat vähentyneet muuttoliikettä ja invaasion jälkeen NRP-2 Knockdown,

in vivo

metastaattisen potentiaalin näiden solujen tarpeet tutkitaan tulevaisuudessa. Lisätutkimuksia myös selvästi tarpeen selvittämiseksi potentiaalinen mekanismi taustalla vaimennus β-kateniinin-reitin NRP-2 hiljentäminen. Tämä on edelleen merkittävä ratkaisematon ongelma ja on aiheena meneillään olevaan tutkimukseen laboratoriossamme.

NRP-2 on nousemassa uutena terapeuttisena kohteena. Koska rooli NRP-2 kasvainsolun muuttoliikettä ja invaasiota, kohdistaminen NRP-2 tarjoaa mahdollisen uudenlainen lähestymistapa estää kasvun ja eloonjäämisen syöpäsolujen potilailla etäpesäkkeitä. Lisäksi, koska NRP-2 näyttää olevan rooleja eroaa VEGF-perheen reseptorien, kohdistaminen NRP-2 ei todennäköisesti ole sama tulos kuin kohdistaminen VEGF. Olemme havainneet, että gastrointestinaalisten syöpäsolujen bevasitsumabiin ei ole vaikutusta β-kateniinin ilmentymistä (tuloksia ei ole esitetty). Targeting NRP-2 voi siis täydentää ja laajentaa antituumorivaikutukset hoitoja, jotka kohdistuvat VEGF, kuten bevasitsumabi.

Huomasimme, että NRP-2-välitteisen β-kateniinin ilmentymisen tässä tutkimuksessa havaitut on ligandi riippumaton. Tämä ligandista riippumatonta NRP2 signalointi on romaani kuitenkin; mekanismi (t) välittävät tätä ilmiötä vielä ymmärretty. Tällä hetkellä voimme vain spekuloida mekanismi (t) mukana, joka perustuu niitä dokumentoitu muiden kalvon reseptoreihin. (I) On mahdollista, että kasvainsoluissa lisääntyneen ekspression NRP2 solun pinnalla johtaa ligandista riippumattoman aktivaation NRP2 välitteisen signaloinnin kautta spontaanisti NRP2 sitoutumista VEGFR /plexin. (Ii) Vaihtoehtoisesti, ligandista riippumatonta NRP2 signalointia voitaisiin myös aktivoidaan homo-dimerisaatiota (tai heterodimerisaatio, jossa NRP1), kuten tapauksessa, monien muiden kalvon reseptoreihin. Uudistusohjelmien tiedetään muodostavan homo- tai hetero-multimeerejä jopa ilman ligandia kalvon läpi-proksimaalisen c domain. (Iii) Kolmas mahdollisuus vetoaa aktivointi koulutusjakso ylikuulumista muiden kalvo reseptoreihin, mutta tämä herättää kysymyksen, miten oletetun reseptorit aktivoituvat. Joka tapauksessa, proteiinit, jotka liittävät NRP2, kuten neuropi- vuorovaikutuksessa proteiini (NIP) /synectin, ovat todennäköisesti avainasemassa ligandista riippumatonta signalointia. Perustuu ligandista riippumaton luonne NRP2 signalointi havaittu tutkimuksessamme, terapeuttinen lähestymistapa inhiboida NRP2 biologista aktiivisuutta mahasyövän olisi käyttää RNA-interferenssi.

Tiedot tässä tutkimuksessa tukevat seuraavia mallin mekanismin