Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Autophagy on evoluutiossa konservoituneen proteiinien hajoaminen kautta. Vika autophagy voi myötävaikuttaa kasvaimien syntyyn. Autophagy indusoijat voisi olla potentiaalinen funktio kasvaimen ehkäisy ja hoito.

Menetelmät /Principal Havainnot

Tuloksemme osoittivat, että Rhabdastrellic happo-A, joka on isomalabaricane triterpenoid eristettiin sienestä Rhabdastrella globostellata, estivät leviämisen ihmisen syövän solulinjoissa Hep3B ja A549 ja indusoi kaspaasi riippumattomia solukuoleman molemmissa solulinjoissa. Lisätutkimukset osoittivat, että Rhabdastrellic happo-A aiheuttama autophagy syöpäsolujen määritetty YFP-LC3 punctation ja lisääntynyt LC3-II. Esikäsittely autophagy inhibiittorin 3-MA inhiboi Rhabdastrellic happo-A-indusoidun solukuoleman. Knockdovvn autophagy liittyvän geenin Atg5 esti Rhabdastrellic happo-A-indusoidun solukuoleman A549-soluja. Myös fosfo-Akt ja sen loppupään tavoitteet merkittävästi vähentynyt hoidon jälkeen Rhabdastrellic happo-A: n syöpäsolun linjat. Transfektio konstitutiivisen aktiivisen Akt plasmidi kumotaan autophagy ja indusoima solukuolema Rhabdastrellic happo-A.

Johtopäätökset /merkitys

Nämä tulokset viittaavat siihen, että Rhabdastrellic happo-A voi aiheuttaa autophagy liittyvää solukuolemaa kautta esto Akt-reitin syöpäsoluissa. Se tarjoaa myös todisteita siitä, että Rhabdastrellic happo-A ansaitsee lisätutkimuksia mahdollisena syövänvastainen tai syöpää ehkäisevä aine.

Citation: Li DD, Guo JF, Huang JJ, Wang LL, Deng R, Liu JN, et al . (2010) Rhabdastrellic Acid-A aiheuttama Autophagy-Associated Cell Death kautta Esto Akt Pathway in ihmisen syöpäsoluja. PLoS ONE 5 (8): e12176. doi: 10,1371 /journal.pone.0012176

Editor: Gian Maria Fimia, INMI, Italia

vastaanotettu: 19 helmikuu 2010; Hyväksytty: 21 heinäkuu 2010; Julkaistu: 17 elokuu 2010

Copyright: © 2010 Li et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukee avustuksia National Nature Science Foundation of China (30873085, 30972882) (https://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default124.htm). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Marine sienet ovat osoittautuneet erityisen hedelmällinen lähde epätavallinen terpenoids [1], [2]. Rhabdastrellic happo-A (Fig. 1), joka on isomalabaricane triterpenoid, eristettiin keltainen sieni Rhabdastrella globostellata (Carter) kerätään Etelä-Kiinan merellä lähellä Hainan, kansantasavalta Kiinassa. Sen rakenne on perustettu pohjalta UV-, IR-, MS,

1H-NMR,

13C-NMR, ja 2D NMR-spektrometria [3], [4]. Suhteellinen ja absoluuttinen stereokemioita ratkaistiin NOESY ja CD tutkimuksia, vastaavasti. On raportoitu, että Rhabdastrellic happo-A voi estää syöpäsolujen kasvun solulinjassa HCT-116. Tasdemir et ai. havaittiin, että stellettin B ja E, kaksi terpenoids mistä Rhabdastrella globostellata kanssa samanlainen rakenne Rhabdastrellic happo-A, edullisesti inhiboida p21 – /- HCT-116 solujen kasvua [5]. Muut isomalabaricane triterpenoids havaittiin aiheuttavan reaktiivisen hapen (ROS), alentaa mitokondrion kalvon potentiaalia, korottaa Bax ja sytokromi c: n, tason alentamiseksi Bcl-2 ja välittäjänä kaspaasit-3 apoptoottisen reitin, mutta molekyylitason mekanismeja vastuussa triterpenoids solukuolema ei ole vielä selvitetty [5]. Myös meidän Tutkimus osoitti, että Rhabdastrellic happo-A aiheutti apoptoosia HL-60-solujen [4], mutta kehitystä apoptoottisten ominaisuuksia Hep3B ja A549-soluja altistuminen Rhabdastrellic happo-A ei havaittu.

Autophagy on lysosomaalisen hajoamisreitit että on välttämätöntä selviytymisen, kehityksen ja homeostaasin [6]. Autophagy pääasiassa palvelee mukautuva rooli suojella organismien vastaan ​​monipuolinen patologiat, kuten infektiot, syöpä [7], hermoston rappeutumisen [8], ikääntyminen, ja sydänsairauksia. Autophagic solukuoleman on morfologisia ja biokemiallisia ominaisuuksia erottaa sitä sekä apoptoosin ja nekroosin. Alkuvaiheessa kasvaimen kehitystä, autophagy toimii tuumorisuppressorina

39. Viat autophagy johtaa genomin epästabiilisuuden ja kasvaimen kehittymisen. Kuitenkin kasvainsolut, jotka sijaitsevat keskiosassa kasvaimen massan läpi autophagy hengissä matalan happea ja vähän ravinteiden olosuhteissa. Kerrottiin, että autophagy suojattu jotkut syöpäsoluja vastaan ​​syöpähoitoihin estämällä apoptoottisia kautta. Sen sijaan muut syöpäsolut voivat läpikäydä autophagic seuraavan solu- kuoleman syövän hoitomuotoja [9].

rooli autophagy välittämisessä soluvasteen stressi on tutkittu interferencing ilmentymistä nisäkkään ortologeja ATG-geenin [ ,,,0],10]. Esimerkiksi Beclin 1 (BECN1; tunnetaan myös nimellä Atg6) on yksi moniosaisen mukaan lukien III luokan fosfotidyyli-inositolin-3-kinaasi, joka on stimuloiva varten autophagy. Beclin 1 (ATG6) tunnetaan myös olevan vuorovaikutuksessa Bcl-2-perheen jäsentä, Bcl-2 ja Bcl-x L [11], [12]. Induktio Beclin 1 ilmentyminen voidaan havaitaan autophagy eri solutyypeissä [13]; ja ATG5 tarvitaan autophagy mutta voi myös aiheuttaa solukuoleman kautta vuorovaikutuksessa Fas liittyvän proteiinin kautta kuolemadomeenille [14]; Siksi tulokset tärkeitä kokeita ei saa tällä hetkellä pidettävä lopullinen todiste rooli autophagy joko tekijä tai vahinkojen lievittämiseksi agentti stressin aikana, mutta enemmän kuin osoitus tärkeä rooli sen sääntelyviranomaiset ovat pelissä solujen homeostaasin ja kasvaimen kehittymisen [15].

Useat signalointipolkujen osallistuvat säätelyyn autophagy. Yksi keskeinen säätelijöitä autophagy on rapamysiinin kohde, TOR kinaasi, joka on tärkein inhibitorinen signaalin, joka estää autophagy läsnäollessa kasvutekijöiden ja runsaasti ravinteita. Luokan I PI3K /Akt molekyylejä viittaavat reseptorityrosiinikinaaseilla Tor aktivointia ja siten tukahduttaa autophagy vastauksena insuliinin kaltainen ja muut kasvutekijä signaalit [16]. Jotkut muut säätelymolekyyleja jotka ohjaavat autophagy sisältävät 5′-AMP-aktivoitu proteiinikinaasi (AMPK), joka vastaa alhaisen energian; eukaryoottien initiaatiofaktoria 2α (eIF2α), joka reagoi ravintoaineprofiilin nälkään, kaksijuosteinen RNA, ja solulimakalvostoon (ER) stressi [17], [18]. Tukahduttaminen autophagic solukuoleman kaspaasin 8 nisäkässoluissa osoitti, että caspases voidaan säädellä apoptoottisia ja ei-apoptoottista solukuolemaa [19].

Viimeisten vuosikymmenien ajan tutkijat ovat keskittyneet keskeisen roolin Akt monissa ihmisen syövissä [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Akt signalointireitin on muodostunut keskeinen reitti säätelemiseksi useiden solun prosessien, mukaan lukien selviytyminen ja leviämisen monissa solutyypeissä. Tähän mennessä monet ihmisen syövät osoittavat hyperactivation Akt kinaasien, mikä inhibitio Akt-reitillä pidetään lupaavana strategia syövän hoitoon [26], [27], [28], [29], [30], [31], [32].

Tässä tutkimuksessa selvitimme, että mahdollisuus, että Rhabdastrellic happo-A kuoli ihmisen syöpäsoluja kautta induktion autophagy. Olemme havainneet, että Hep3B ja A549-soluja käsiteltiin Rhabdastrellic happo-A koki morfologisia ja biokemiallisia muutoksia, sopusoinnussa induktion autophagy ja solukuoleman. Mekanismi autophagy induktion Rhabdastrellic happo-A estoon liittyvän Akt-reitillä.

Tulokset

1. Rhabdastrellic happo-A indusoiman kaspaasi-riippumattoman solukuoleman Hep3B ja A549-soluja

hoito Hep3B ja A549-solut 3 d eri pitoisuuksilla Rhabdastrellic happo-A johti solujen kasvun esto on annoksesta riippuvainen tavalla. IC

50-arvo oli 0,42 ng /ml ja 2,50 ng /ml (kuvio. 2A). Solujen kasvun esto voi olla tuloksia apoptoosin induktioon, autophagy ja /tai solusyklin pysähtymisen. Hep3B ja A549-soluja käsiteltiin eri pitoisuuksilla Rhabdastrellic happo-A: ssa 48 tuntia ja analysoitiin solusyklin virtaussytometrialla. Kuva. 2B osoitti, että Rhabdastrellic happo-A ei indusoinut solusyklin pysähtymisen Hep3B ja A549-soluja näissä pitoisuusalueisiin 48 tuntia. Siten, tutkimme Rhabdastrellic happo-A voi aiheuttaa apoptoosin tai autophagy liittyvää solukuolemaa Hep3B ja A549-solut.

. Syövän solut maljattiin tiheydellä 8000 solua /kuoppa 96-kuoppaiselle levylle. Kanta Rhabdastrellic happo-A lisättiin kuoppiin. Soluja viljeltiin 3 päivää. MTT-analyysi suoritettiin. B. Hep3B ja A549-soluja käsiteltiin osoitetulla pitoisuuksia Rhabdastrellic happo-A: ssa 48 tuntia ja analysoitiin DNA-sisällön virtaussytometrialla. Tulokset olivat edustavia 3 kokeen.

monenlaisia ​​syöpälääkkeiden toimivat apoptoosin indusoimiseksi ja syöpäsolujen, jolle on tunnusomaista kaspaasi-3 ja PARP pilkkominen. Sen määrittämiseksi, onko solukuolema oli kaspaasiriippuvaisen, ensin havaitaan pilkkominen kaspaasi-3. Käyttämällä immunoblottaus analyysi, pilkkominen kaspaasi-3 sekä syöpäsoluissa ei havaittu hoidon jälkeen Rhabdastrellic happo-A. Pilkkominen PARP oli myös havaittavissa (Fig. 2A). Pilkkominen kaspaasi-3, ja PARP havaittiin myös molemmissa solulinjoissa käsiteltiin adriamysiinillä. Tulokset osoittivat, että pro-kaspaasi-3 pilkottiin, jolloin saatiin 17 kDa: n pirstoutumista ja PARP pilkottiin osaksi 89 kDa: n pirstoutuminen seuraavat adriamysiinikäsittelyä (Fig. 3A). Lisäksi pan-kaspaasi-inhibiittori z-VAD-fmk ei estänyt Rhabdastrellic happo-A solukuolema (Fig. 3B). Edelleen vahvistaa, että Rhabdastrellic happo-A pääasiassa indusoidun ei-apoptoottisen solukuoleman, Hep3B ja A549-solut altistettiin eri pitoisuuksia Rhabdastrellic happo-A analysoitiin 48 tunnin välein anneksiini V-FITC /PI-värjäyksen määrityksessä. Kuten on esitetty kuviossa. 3C, korkein apoptoottinen hinnat olivat 4,4% Hep3B soluissa ja 0,2% A549-solut hoidon jälkeen. Nämä tulokset vahvasti osoittivat, että Rhabdastrellic happo-A indusoi kaspaasi-riippumaton solukuolemaa Hep3B ja A549-solut.

. in Hep3B ja A549-soluja, Solulysaatit valmistettiin 0,1% DMSO: ta, 1 ug /ml Rhabdastrellic happo-A: n tai 4 uM adriamysiinin 24 h ja 48 h. Western blot analyysi tehtiin kaspaasi-3 ja PARP-vasta-aineita. B. Soluja inkuboitiin eri pitoisuuksien Rhabdastrellic happo-A: n läsnä tai poissa ollessa 20 uM z-VAD-fmk 3 d. MTT-analyysi suoritettiin. Tulokset (keskiarvo ± S.E.) Edustavat keskiarvoa kolmesta kokeesta. C. Hep3B ja A549-soluja käsiteltiin 0-4 ug /ml Rhabdastrellic happo-A: ssa 48 tuntia. Käsittelyn jälkeen solut kerättiin peräkkäin ja värjättiin anneksiini V: n ja PI: n ja analysoitiin virtaussytometrialla määrityksessä.

2. Autophagy liittyvä indusoimaa solukuolemaa Rhabdastrellic happo-A syöpäsoluissa

Rhabdastrellic happo-A indusoi muodostumista autophagosomes.

kalvoon liittyvä kevytketjun 3-proteiinin, MAP LC3 (Atg8) , paikantuu venymään kalvon ja pysyy kalvon kunnes autophagosome kypsymistä. Se on keskeinen merkkiaine autophagy. Kun induktio autophagy, LC3-I muuntuu LC3-II, joka on todennäköisesti konjugoitu fosfatidyylietanoliamiini (PE) ja tiukasti sitoutuneen autophagosomal kalvot, jotka muodostavat renkaan muotoinen rakenteita sytoplasmassa. Mitata autophagy, Hep3B ja A549-soluja transfektoitiin ekspressiorakenteeseen LC3 fuusioitu keltainen fluoresoiva proteiini (YFP-LC3). DMSO-käsiteltyjen kontrollisolujen YFP-LC3 on jakautunut tasaisesti koko sytoplasmassa. Sen jälkeen Rhabdastrellic happo-Hoidon, renkaan muotoinen rakenteet olivat havaittavissa sytosoliin, mikä osoittaa yhdistys YFP-LC3 kanssa autophagosomal kalvot jälkeen induktion autophagy (kuvio 4A). Mikroskooppitutkimus analyysi Rhabdastrellic happo-A-käsiteltyjen A549-solut elektronimikroskoopilla osoitti suurta autophagic vacuoles toisin ohjaamaan solujen jos tällaista vacuoles voitu havaita (Fig. 4B).

. Hep3B ja A549-soluja transfektoitiin ekspressiorakenteeseen LC3 fuusioitu keltainen fluoresoiva proteiini (YFP-LC3) 24 tuntia. Sen jälkeen soluja käsiteltiin kanssa tai ilman 1 ug /ml tai 4 ug /ml Rhabdastrellic happo-A: ssa 36 tuntia, ja visualisoida -konfokaalimikroskoopilla. B. Electron micrograph osoittaa autophagic vacuole A549-solujen seuraavien 4 ug /ml Rhabdastrellic happo-A hoito. C. Rhabdastrellic happo-A aikariippuvainen aiheuttama muodostumista LC3-II, merkkiaine autophagy. Hep3B ja A549-soluja käsiteltiin 1 ug /ml Rhabdastrellic happo-A osoitetut ajat. Lysaatit analysoitiin immunoblottaus LC3 vasta-aineella.

LC3-II ilmentyminen indusoi Rhabdastrellic happo-A syöpäsoluissa.

määrä PE-konjugoitua muotoa LC3 (LC3- II) korreloi hyvin määrää autophagosomes. Sen jälkeen Rhabdastrellic happo-A hoitoa varten ilmoitettu ajat, LC3 havaittiin immunoblottauksella analyysi. Tulokset osoittivat, että ilmentyminen LC3-II vähitellen voimistuvan (kuvio 4C). Tämä vahvisti tulokset YFP-LC3 transfektion ja osoitti, että Rhabdastrellic happo-A voi aiheuttaa autophagy in Hep3B ja A549-solut.

Autophagy liittyvä indusoimaa solukuolemaa Rhabdastrellic happo-A syöpäsoluissa.

Sen varmistamiseksi, että Rhabdastrellic happo-A indusoiman autophagy liittyvä solukuoleman, Hep3B-soluja käsiteltiin Rhabdastrellic happo-A: n ja /tai 3-metyyliadeniini (estäjä PI3K-C3 yleisesti käytetty spesifinen esto autophagy). Toisin kontrollisoluihin, kun Rhabdastrellic happo-A hoitoon, suurin osa Hep3B solut näyttivät pyöreä, jotkut irti pinnasta kaivoja ja solujen lukumäärä väheni (kuvio 5A). Kuitenkin vaikutukset mukaan Rhabdastrellic happo-Hoito palautettiin 3-MA (kuvio 5A). Ehdotettiin, että induktio solukuoleman Rhabdastrellic happo-A hoito on estetty, kun solut olivat rinnakkain käsiteltiin autophagy inhibiittorin 3-MA.

. Hep3B-soluja käsiteltiin 1 ug /ml Rhabdastrellic happo-A: n ja /tai 10 mM 3-MA 36 tuntia, ja sitten tutkittiin käänteismikroskoopilla. *, P 0,05 vs. Rhabdastrellic happo-A- /3-MA-. **, P 0,05 vs. Rhabdastrellic happo-A + /3-MA-. B. Lysaatit A549-vektori ja A549-shAtg5 solut analysoitiin immunoblottauksella Atg5 ja LC3 vasta-aineita. C. A549 vektori solut ja A549-shAtg5 soluja viljeltiin 6000 solua per kuoppa 96-kuoppaiselle levylle, altistettiin eri pitoisuuksia Rhabdastrellic happo-A 0,05-3,2 ug /ml 72 tuntia. Kasvun inhibitio havaittiin käyttämällä MTT-määritystä. Raportoidut arvot ovat keskiarvoja ± SD kolmesta näytteestä edustavasta kokeesta. * P-vlaue 0,05 verrattuna soluihin kohdellaan samalla tavalla, mutta transfektoitu ilman shRNA. D. A549 Soluja inkuboitiin 4 ug /ml Rhabdastrellic happo-A: n ja /tai 10 mM 3-MA 24 tuntia. Solukuolemaa kvantitoitiin käyttäen virtaussytometria PI värjäystä määritys. Koe toistettiin 3 kertaa.

shRNA-pohjainen ehtyminen olennaisen autophagy proteiinin Atg5, esti tehokkaasti Rhabdastrellic happo-A-indusoidun LC3-II kertymistä (kuvio 5B). Ja inhibition autophagy ehtyminen Atg5 esti Rhabdastrellic happo-A-indusoidun solukuoleman A549 solujen pitoisuus vaihtelee 0,05-3,2 ug /ml (kuvio 5C).

A549-solut altistettiin 4 uM Rhabdastrellic happo-A ja /tai 3-MA analysoitiin solukuolemaa 24 tunnin virtaussytometrialla. Propidiumjodidia (PI) positiiviset laskettiin kuten ”kuollut” soluja. Solukuolemaa indusoi Rhabdastrellic happo-A tukahdutettiin, kun solut käsiteltiin yhdessä 3-MA (Fig. 5D).

3. Rhabdastrellic happo-A esti Akt väylän Hep3B ja A549-soluja

Rhabdastrellic happo-A voi estää Akt-reitin HL-60-solujen [4]. Siksi oli kiinnostavaa testata, onko se sama muissa syöpäsoluissa. Kuten on esitetty kuviossa 6A, jälkeen Rhabdastrellic happo-A hoitoa varten ilmoitettu aikoina tai eri pitoisuuksina, Rhabdastrellic happo-A inhiboi fosforylaatiota Akt on Hep3B ja A549-solut.

Hep3B ja A549-soluja käsiteltiin Rhabdastrellic hapolla -A ilmoitettuina pitoisuuksina 36 tuntia tai käsiteltiin 1 ug /ml tai 4 ug /ml Rhabdastrellic happo-A osoitetut ajat. A. Solut peräkkäin kerätään ja rikotaan. solulysaatit analysoitiin immunoblottauksella fosfo-Akt tai Akt vasta-aineita. B. mTOR, fosfo-mTOR, FKHR, fosfo-FKHR, STAT3 ja fosfori-STAT3 analysoitiin immunoblottauksella. Koe suoritettiin 3 kertaa.

mTOR, FKHR ja STAT3 kolme tärkeää alavirtaan tavoitteita Akt-reitin ja avainrooleja autophagy ja apoptoosin [33]. Kuten esitetään tulokset (kuvio 6B), fosforylaatiota mTOR, FKHR ja STAT3 oli dramaattinen väheneminen kun Rhabdastrellic happo-Hoidon ajasta riippuva tavalla molemmissa solulinjoissa. Nämä tulokset osoittivat, että AKT-reitin aktivaation inhiboitui Rhabdastrellic AICD-A Hep3B ja A549-solut.

4. Induktion autophagy by Rhabdastrellic happo-A kumottiin konstitutiiviset aktiivinen Akt kohdunulkoinen ilmaisu

Rhabdastrellic happo-A voi estää Akt-reitin ja aiheuttaa autophagy in Hep3B soluissa. Jotta voitaisiin edelleen vahvistaa, luontainen rooli Akt in autophagy aiheuttama Rhabdastrellic happo-A, olemme transfektoitiin Hep3B-solujen kanssa myr-Akt1 plasmidit (aktivoitu) ja valitaan positiivisen kloonin käyttäen G418: aa. Kontrolliin verrattuna solut (Hep3B-solut, jotka on transfektoitu vektorilla plasmidi), eksogeeninen Akt ilmentymistä merkittävästi lisääntynyt Hep3B /myr-Akt1 solut (Fig. 7A). Lisäksi markkeri autophagy määritettiin samalla konstitutiivista aktiivista Akt ilmentymistä Hep3B-soluissa. Kontrolliin verrattuna soluihin, massiivinen induktio autophagy havaittiin Hep3B-soluissa, osoittaa lisääntyminen LC3-II. Kuitenkin ilmentävät konstitutiivisen aktiivinen Akt estetty kasvua LC3-II (kuvio 7B). Johdonmukaista sen havainnon kanssa, että jotkut väestö LC3-II hajotetaan lysosomeihin [34], käsittely lysosomaalisen entsyymin estäjiä pepstatiinia johti kertymistä LC3-II syöpäsoluissa (kuvio 7C), tämä ilmiö oli myös heikentynyt samalla konstitutiivisia aktiivinen Akt kohdunulkoinen ilme. Lisäksi konstitutiivinen aktiivinen Akt ilmaus voisi pelastaa Hep3B soluja Rhabdasterllic happo-A-välitteisen kasvun estäminen alle hoitoon Rhabdastrellic happo-A (kuvio. 7D). Nämä tulokset esitetään kuviossa 7 osoitti, että konstitutiivinen aktiivinen Akt ilmaus voisi estää Rhabdastrellic happo-A-välitteisen autophagy.

. A. positiivinen klooni pysyvästi ilmensivät myr-Akt1 analysoitiin immunoblottaus Akt vasta-aineella. B. Hep3B-soluja käsiteltiin 1 ug /ml Rhabdastrellic happo-A: ssa 36 tuntia poissa tai läsnä ollessa konstitutiivista aktiivista Akt ektooppinen ekspressoituminen. Sitten LC3 proteiinin ilmentyminen analysoitiin. C. Cancer soluja käsiteltiin 1 ug /ml Rhabdastrellic happo-A: n ja /tai 10 ug /ml pepstatiini A: ta (pepA) 36 tuntia, sitten LC3 proteiinin ilmentyminen analysoitiin. D. Käsittelyn jälkeen elävien solujen kahden solulinjan mitattiin. *, P 0,05 vs. Rhabdastrellic happo-A (vektori).

Sen tutkimiseksi, muita reittejä ovat mukana autophagy aiheuttama Rhabdastrellic happo-A, olemme analysoineet tasoja Bip, CHOP, fosfori -EIF2α ja fosfo-AMPK in Hep3B soluissa Rhabdastrellic happo-A hoito. Tulokset osoittivat, että fosforylaatiota AMPK, EIF2a ja CHOP lisääntyi jälkeen Rhabdastrellic happo-Hoidon annoksesta riippuvalla tavalla Hep3B soluissa. Kuitenkin kasvua Bip ei havaittu (esitetty kuvassa. S1). Nämä tulokset osoittivat, että useita eri reittejä pitkin voi olla mukana Rhabdastrellic happo-A-indusoidun autophagy.

Keskustelu

kuvatut tulokset tässä osoittavat, että Rhabdastrellic happo-A voi aiheuttaa autophagy ihmisen syöpäsolulinjoissa . Rhabdastrellic happo-A voi estää Akt väylän Hep3B ja A549-soluja, ja konstitutiivinen aktiivinen Akt ilmaus voisi estää Rhabdastrellic happo-A-välitteisen autophagy. Nämä tulokset osoittivat, että esto Akt /mTOR reitin osallistuu Rhabdastrellic happo-A aiheuttama autophagy ja solukuolemaa.

Autophagy on raportoitu olevan prosessi, jossa kaksinkertainen kalvo vacuoles kutsutaan autophagosomes muodossa ympäri, nielaista, sytosoliin ja organelles. Vaikka autophagy raportoitiin aikaansaamiseksi kuin prosurvival vasteen, joissakin esimerkiksi sytotoksisuus arseenitrioksidin, imatinibi, ionisoivan säteilyn jne. Jonkin solutyyppeihin välittää induktio autophagy. Näissä olosuhteissa autophagy muodostaa nonapoptotic koulutusjakson ohjelmoidun solukuoleman. Monet raportit osoittavat, että triterpenoids on potentiaalia sytotoksisuus syöpäsolulinjoissa [35], [36]. Rhabdastrellic happo-A on yksi triterpenoids, joka indusoi ei-apoptoottisen solukuoleman Hep3B ja A549-soluja. Tämän vuoksi tutkimme, onko induktio autophagy tarvittiin Rhabdastrellic happo-A-välitteisen solukuoleman näissä kahdessa syöpäsolulinjoissa. Autophagic solut suuremmaksi ilman läpäiseväksi solukalvon, muuntaa LC3-I LC-II, osoittavat pistemäinen soluliman LC3 translokaatio ja kehittää autophagosome. Tässä tutkimuksessa Hep3B ja A549-solut osoittivat morfologisia ja biokemiallisia ominaisuuksia, jotka ovat ominaisia ​​solujen käynnissä autophagy, ei apoptoosin seuraavia Rhadastrellic happo-A hoito. Myös kasvu esto Rhabdasterllic happo-A A549-solut oli heikompi kuin vuonna Hep3B soluissa. Mutta Rhabdasterllic happo-A kasvoi enemmän LC3-II ilme. Muuntaminen LC3-I LC3-II voidaan havaita autophagy aloittamista. Mutta osittainen LC3-II voi hajota, kun autophagy kypsymistä. Vain LC3-II ilmaisu voinut osoittaa herkkyyttä autophagy.

Aikaisemmat tutkimukset mekanismia taustalla sääntelyä autophagy syöpäsoluissa osoitti, että autophagy säädeltiin useita signalointireittien yhtä monipuolinen kuin luokan III PI 3-kinaasi ja proteiinikinaasien mTOR, ERK, ja p38. Poikkeava aktivaatio Akt /mTOR-signalointireitin on osallisena erilaisissa ihmisen malignances [20], [21], [22], [23], [24], [25], [37]. Fosforyloidun Akt pelaa keskeinen rooli joissakin perusprosesseihin, kuten solujen lisääntymisen, solukuoleman, solun liikkuvuus /tarttuvuus, solutransformaatiota, ja uudissuonittuminen. Kun aktivoitu, Akt toimii eloonjäämistekijänä estämällä vapautuminen sytokromi c: mitokondrioista ja inaktivoimalla FKHR jonka tiedetään indusoi pro-apoptoottisten tekijöiden, kuten Fas-ligandin [38]. MTOR indusoi apoptoosia joidenkin kasvainsolujen, kun taas ne käynnistävät autophagy muissa yhteyksissä. Rapamysiini, estäjä mTOR oli raportoitu aiheuttavan klassinen autophagic solukuolemaa syöpäsoluissa. Aikaisemmat tutkimus osoitti myös, että Rhabdastrellic happo-A esti PI3K /Akt-reitin ja indusoi apoptoosia ihmisen leukemian HL-60-solujen [4]. Joten esto Akt voi aktivoida joitakin autophagy liittyviä proteiineja ja aiheuttaa autophagy. Sopusoinnussa tämän toteamuksen, havaitsimme, että Rhabdastrellic happo-A voi estää fosforylaatiota Akt vuonna Hep3B ja A549-soluja. Fosforylaatio mTOR, FKHR ja STAT3 myös dramaattisesti vähentynyt jälkeen Rhabdastrellic happo-A hoito. Lisäksi kohdunulkoinen konstitutiivinen aktiivinen Akt ilmaisu voi tukkia autophagy aiheuttama Rhadastrellic happo-A. Yhdessä Rhadastrellic happo-A indusoiman autophagy estämällä Akt /mTOR-reitin.

Yhteenvetona, nykyinen tutkimukset osoittavat, että Rhabdastrellic happo-A tappaa Hep3B ja A549-soluja kautta induktion autophagy. Estyminen Akt /mTOR-reitin avainasemassa in Rhabdastrellic happo-A-välitteisen autophagy. Koska kasvainsolut saavat usein vikoja autophagy verrattuna normaaleihin soluihin, farmakologinen aktivaatio autophagy estämällä Akt /mTOR reitti voi tappaa syöpäsoluja ja raja tuumorigeneesiprosessin erityisesti syöpiä vikoja apoptoosin. Tutkimuksemme tarjoaa myös todisteita siitä, että Rhabdastrellic happo-A ansaitsee lisätutkimuksia mahdollisena syöpälääkettä tai syöpää ehkäisevä aine.

Materiaalit ja menetelmät

Lääkkeet ja reagenssit

Rhabdastrellic happo -A eristettiin sienen Rhabdastrella globostellata ja liuotetaan ensin 100% dimetyylisulfoksidi (DMSO) ja säilytettiin -20 ° C: ssa. Methylthiazolyldiphenyl-tetratsolium (MTT) ja 3-metyyliadeniini (3-MA) ​​ostettiin Sigma Co. (Sigma Aldrich, M2128). RPMI 1640 ostettiin Invitrogen (Invitrogen, 11875).

Solulinjat ja soluviljelmä

Ihmisen maksasyövän solulinjaa Hep3B [39] ja ihmisen keuhkon adenokarsinooman epiteelisolujen A549 [40] viljeltiin RPMI-1640, johon oli lisätty 10% lämpöinaktivoitua naudan sikiön seerumia, penisilliiniä (50 U /ml), ja streptomysiinillä (50 ug /ml). Soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa kostutetussa 5% CO2.

MTT-määritystä

Solut maljattiin 96-kuoppaiselle levylle. Kanta Rhabdastrellic happo-A laimennettiin, lisättiin kuoppiin lopulliseen analyysiin halutaan pitoisuus. Jälkeen 3 päivää altistuksen Rhabdastrellic happo-A, 10 ui MTT: tä (5 mg /l) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin neljä tuntia, sitten neste kuoppiin haihdutettiin. 100 ui DMSO: ta lisättiin kuhunkin kuoppaan. Absorbanssi havaittiin lukulaitteeseen 550 malli 565 nm aallonpituudella (Bio-rad Co., 17024). Kasvun estäminen laskettiin ja IC

50-arvo määritettiin käyttämällä Bliss ohjelmiston.

anneksiini V-FITC /PI-värjäys määritys

Solut eri hoitoja kerättiin, suspendoitiin uudelleen 10% 1640 medium, säätää solujen pitoisuus suspensiossa on noin 1 x 10

6 solua /ml, ja siirrettiin 0,5 ml: n solususpensiota mikrofugiputkeen. Sen jälkeen lisättiin 10 ui median sitova reagenssi ja 1,25 ui anneksiini V-FITC, soluja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 15 minuutin ajan pimeässä, sitten sentrifugoitiin ja poistetaan mediaa. Kun suspendoitiin uudelleen 0,5 ml: aan kylmää 1 x sitomispuskurissa (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, 1 mM MgCl2: a, 20% BSA, pH 7,4), soluja lisättiin 10 ui propidiumjodidia (30 ug /ml), asettamalla näytteet jäällä ja valolta. Apoptoosi analysoitiin virtaussytometrialla ((Beckman Coulter, Fullerton, CA) aallonpituudella 488 nm välittömästi.

Cell cycle havaitseminen

Solut kerättiin, suspensoitiin uudelleen 1 ml: esijäähdytetty 70% etanolia ja kiinnitettiin 4 ° C: ssa yön yli. Sen jälkeen poistettiin etanolia ja lisätään 0,5 ml värjäysliuosta (50 ug /ml PI, 100 ug /ml RNaasiA, 0,2% Triton-100), soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 min tumma. Cell cycle jakautuminen analysoitiin virtaussytometrialla ((Beckman Coulter, Fullerton, CA) aallonpituudella 488 nm välittömästi.

PI-värjäys määritys

Solut trypsinoitiin 0,5 ml 0,25% trypsiiniä 3 minuuttia, otettiin talteen ja suspendoitiin uudelleen 1 ml: lla esijäähdytettyä PBS: ää. Sen jälkeen lisättiin 0,5 ml värjäysliuosta (50 ug /ml PI, 100 ug /ml RNaasiA, 0,2% Triton-100), soluja inkuboitiin 37 ° C: ssa 30 minuutin ajan pimeässä. Solukuolema havaittiin virtaussytometrialla ((Beckman Coulter, Fullerton, CA).

Konfokaalimikroskopia ja epäsuoralla immunofluoresenssilla

Soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille ja transfektoitiin pYFP-LC3 for Hep3B ja A549-soluja. 36 h transfektion jälkeen solut käsiteltiin Rhabdastrellic happo-A ja analysoitiin sen jälkeen vielä 36 tunnin ajan. Solut kiinnitettiin 4% paraformaldehydillä PBS: ssä 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, levyt asetettiin anti-häipyminen liuokseen ja säilytettiin 4 ° C: ssa. Peitinlasit koettiin kanssa laser-skannaus -konfokaalimikroskoopilla (Olympus, FV-1000).

elektronimikroskopialla

Solut kiinnitettiin upottamalla seoksella 2,5% glutaraldehydiä, 2,5% paraformaldehydiä ja 0,05% pikriinihappoa on 0,067 M kakodylaattipuskurissa (pH 7,4). Jälkifiksaatio suoritettiin 1% osmiumtetroksidilla, jonka jälkeen yön yli upottamalla 0,3% uranylacetate liuotettiin 50 mM maleaattipuskuria (pH 5,0). Vakiomenettelyillä nestehukka ja upottamista Epon käytettiin. Palanäyte värjättiin edelleen lyijyä sitraatti, ja tutkittiin elektronimikroskoopilla (Philip, CN10).

Western blot-analyysi

lysaatit valmistettiin 4 x 10

5-soluissa liuottamalla solupelletit 100 ui lyysipuskuria (20 mM Na

2PO

4 (pH 7,4), 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 1% aprotiniini, 1 mM phenymethysulfonyl fluoria, 10 mg /ml leupeptiiniä 100 mM NaF, ja 2 mM Na

3Vo

4). Lysaatit sentrifugoitiin 12000 rpm 10 minuutin ajan. Supernatantti kerättiin. Proteiinipitoisuus määritettiin käyttämällä Bio-Rad proteiinimäärityksellä. SDS-PAGE-näytepuskuria (10 mM Tris-HCl, pH 6,8, 2% SDS, 10% glyseroli, 0,2 M DTT: tä) lisättiin lysaatit. Lysaatit kuumennettiin 100 ° C: ssa 5 min, ja 40 ug proteiinia ladattiin jokaiseen kuoppaan 4-20% SDS-PAGE-geelissä. Erotetut proteiinit siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosalle ja inkuboitiin peräkkäin primaarisen vasta-aineen ja piparjuuriperoksidaasiin konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG: tä (Santa Cruz, sc-2005) tai vuohen anti-kani-IgG: tä (Santa Cruz, sc-2004). Pesun jälkeen sitoutunut vasta kompleksi havaittiin käyttäen LumiGLO reagenssia (Cell Signaling Technology, # 7003) ja XAR kalvo (Kodak, XBT-1) kuvaamalla tavalla valmistaa. Seuraavat ensisijaiset vasta-aineita käytettiin: kaspaasi-3-vasta-ainetta (Santa Cruz, sc-7272), PARP-vasta-ainetta (Santa Cruz, sc-7150), glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi-vasta-ainetta (Santa Cruz, sc-47724), LC3 vasta-aine (Novus Biologicals, NB100-2220), Atg5 vasta-ainetta (Cell Signaling Technology, # 2630), Phospho-Akt1 /2/3 (Ser473) vasta-aineella (Santa Cruz, sc-7985-R), Akt1 vasta-ainetta (Santa Cruz, sc-1618) , Phospho-mTOR (ser2448) vasta-aineella (Cell Signaling Technology, # 2971), mTOR-aineella (Cell Signaling Technology, # 2972), Phospho-FKHR (ser256) vasta-aineella (Cell Signaling Technology, # 9461), FKHR vasta-aine (Cell Signaling Technology , # 9462), Phospho-STAT3 (ser727) vasta-aine (Santa Cruz, sc-8001-R), STAT3 vasta-aine (Cell Signaling Technology, # 9132).

Plasmidit ja transfektio

MYR -Akt1 (aktivoitu # 21-151) tai tyhjällä plasmidilla (pUSEamp (+) # 21-147) ostettiin upstate Co. Hep3B-solut ympättiin 6-kuoppaiselle levylle päivänä ennen transfektiota. Transfektiosta myr-Akt1 (aktivoitu) tai tyhjällä plasmidilla (vektori) suoritettiin Lipofectamine 2000 (Invitrogen, 11668019) protokollan mukaisesti ehdottamia valmistukseen. 48 tunnin kuluttua transfektion positiiviset kloonit valittiin alle G418 (1000 ug /ml).

konstruktit, retrovirusinfektiolla, ja RNA-interferenssi

stabiili ATG5 siRNA ilmaisu, retrovirusvektorin ( pSUPER. puro, lahja professori Musheng Zeng, Cancer Center, Sun Yat-sen University, Guangzhou, Kiina), joka koodaa hiusneula-RNA-sekvenssit rakennettiin. Erillinen lyhyt hiusneula RN (shRNA) sekvenssit vastaan ​​ATG5 (shATG5) tuotettiin ja kloonattiin ekspressiovektoriin.