Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

MikroRNA (miRNA) ovat pieniä ei-koodaavaa RNA: ita, jotka säätelevät sukulais-mRNA: klo transkription jälkeisellä vaiheessa. Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA moduloida geenin ilmentymistä nisäkässoluissa mukaan emäspariutumisessa täydentäviin sivustoja 3′-alue (3′-UTR) kohde mRNA: iden.

Menetelmät /Principal Havainnot

esillä olevassa tutkimuksessa, miR-24: n havaittiin kohdistaa fas liittyvän tekijän 1 (FAF1) sitomalla sen aminohapposekvenssi koodittavan sekvenssin (CDS) alueella, jolloin apoptoosin säätelyyn DU-145-soluja. Tämä tulos tukee lisätyn mallia, että eläin miRNA voivat käyttää vaikutuksia sitoutumalla CDS alueelle kohde-mRNA. Transfektio miR-24 antisense (miR-24-ASO) indusoi myös apoptoosin HGC-27, MGC-803 ja HeLa-solut.

Johtopäätökset /merkitys

Huomasimme, että miR-24 säätelee apoptoosin kohdistamalla FAF1 syöpäsoluissa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-24 voisi olla tehokas lääke kohde hormonista-herkkä eturauhasen syöpää tai muita syöpiä. Tuleva työ voi kehittää miR-24 terapeuttisiin sovelluksiin syöpäbiologian.

Citation: Qin W, Shi Y, Zhao B, Yao C, Jin L, Ma J, et al. (2010) miR-24 Säätelee Apoptoosi kohdistaminen Open Reading Frame (ORF) alue FAF1 syöpäsoluissa. PLoS ONE 5 (2): e9429. doi: 10,1371 /journal.pone.0009429

Editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Kanada

vastaanotettu: 19 tammikuu 2010; Hyväksytty 4 helmikuuta 2010 Julkaistu: 25 helmikuu 2010

Copyright: © 2010 Qin et ai. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Key Basic tutkimus- ja kehittämisohjelma (2005CB724602) ja ohjelmat Kiinan Academy of Sciences (KSCX-2-SW-228 ja KSCX1-YW-R-64). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

MikroRNA (miRNA) ovat endogeenisiä, evoluutiossa konservoituneen pieni (noin 22 nt), ei-koodaavaa RNA: ita, jotka on osoitettu säätelevän geenien ilmentymistä transkription jälkeen [1], [2]. miRNA yleensä säätelemään niiden kohdegeenien hajottamalla kohde-mRNA-transkriptien tai estämään mRNA: n translaation [3], [4]. miRNA ovat sekaantuneet erilaisissa biologisissa prosesseissa kehitykseen liittyvä ajoitus, kuviointi ja alkionkehityksen erilaistumista ja organogeneesissä, immuunivaste, kasvun ohjaus ja apoptoosin. Kuitenkin kohdegeenien ja toiminnot useimmat miRNA ovat vielä epäselviä [5] – [9].

Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miRNA moduloivat geeni-ilmentymisen nisäkkään soluissa emäspariutumisesta täydentävien alueiden 3′ transloimaton alue (3′-UTR) niiden kohde-mRNA: iden [4], [10], [11]. Viime aikoina on osoitettu, että miRNA voi säädellä kohde-mRNA: iden sitoutumalla aminohapposek- koodittavan sekvenssin (CDS) [12] – [14].

Apoptoosi on muoto ohjelmoidun solukuoleman (PCD), että esiintyy monisoluisista organismeista. Tietyntyyppisiä vaurioita käynnistää sarjan biokemiallisia tapahtumia, jotka johtavat ominaisuus solujen morfologia ja syöttämällä [15], [16]. Se on hyvin järjestettyjä solujen mekanismi, joka tasapainottaa vaikutukset soluproliferaation ja solukuoleman [17]. Näyttää selvältä, että tiukka sääntely apoptoottisen funktion kautta miRNA on kriittinen kehittämiseen ja muissa solun prosesseissa. Useat miRNA, jotka säätelevät apoptoosia on tunnistettu, vaikka mikään niistä ei säädellä apoptoosia sitomalla CDS alueen tavoitteensa [17] – [22]. Viime aikoina on osoitettu, että miRNA voivat toimia onkogeenien ja tuumorisuppressoreita kohdentamalla keskeisiä säätelijöitä solun kasvua [23] – [25].

uuden luokan kemiallisesti muokattuja oligonukleotidejä, joita kutsutaan ”antagomirs”, voi tehokkaasti vaientaa endogeenisen miRNA ja on käytetty poistamaan poikkeava ilmentyminen onkopsykologista miRNA [26], [27]. Tämä osoittaa mahdollisia terapeuttisia hakemuksen tehokasta vaiennettu onkopsykologista miRNA hoidossa joidenkin syöpien [9].

Fas-liittyvä tekijä 1 (FAF1) on osa kuoleman aiheuttavia signalointikompleksiin ( DISC) ja vuorovaikutuksessa kaspaasin 8 ja FADD vaikka se ei ole ”kuoleman motiiveja” tyypillistä apoptoosin proteiinien [28]. Useat viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että yli-ilmentyminen FAF1 stimuloitiin apoptoosin Jurkat-soluissa, L-solut ja BOSC23 solujen huolimatta ei ole mitään ulkoisia syöttämällä signaali [28] – [30]. FAF1 on osoitettu olevan tärkeä rooli normaalin kehityksen ja hermosolujen eloonjäämistä, kun taas FAF1 downregulation voi edistää useita näkökohtia tumorigeneesin [31]. Käyttämällä Sirna (siRNA) kohdistaa FAF1, havaittiin, että alas-säätely FAF1 parannettu alttius apoptoosin laukaisi CP [32].

Toistaiseksi ei tiedetä, onko FAF1 säädellään miRNA. Tietääksemme ei tutkimus on selvittänyt miRNA että tavoite CDS alueen kohdegeenin edistää kasvaimen apoptoosin. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että miR-24 voi säädellä ihmisen FAF1 (hFAF1) lauseke sitoutumalla CDS alueelle hFAF1 mRNA. Lisäksi osoitamme, että miR-24 säätelee apoptoosin ja proliferaation DU-145, HGC-27, MGC-803 ja HeLa-soluissa kohdistamalla FAF1 geeni. Nämä havainnot viittaavat siihen, että miR-24 voisi olla mahdollinen lääke kohdegeenin hoitoon hormoni-herkkä eturauhasen syöpä ja muut syöpätyypit.

Tulokset

miR-24-ASO-välitteistä Down -Regulation Mir-24 indusoi apoptoosia ja Vaikuttaa proliferaation DU-145 solut

tutkia toiminnallinen vaikutus miR-24 solun selviytymisen, mittasimme apoptoosin DU-145-solut transfektoitu miR-24-ASO . Down-regulation miR-24 miR-24-ASO lisääntynyttä apoptoosia DU-145-soluja, mitattuna FACS-analyysi solujen propidiumjodidilla ja anneksiini V-värjäyksellä (kuvio. 1A). Staurosporiini käytettiin apoptoosin indusoimiseksi 48 tunnin kohdalla miR-24-ASO transfektion. Apoptoosi oli paljon suurempi DU-145-soluja, jotka on transfektoitu miR-24-ASO kuin soluissa, jotka on transfektoitu Negative Control NC-ASO (Fig. 1 B). Seuraavaksi vaikutus miR-24 proliferaatioon DU-145-soluissa tutkittiin kanssa CCK8 laskenta kit. Ennustetusti leviämisen DU-145-soluihin vähenee huomattavasti jälkeen miR-24 oli alas-säädellä miR-24-ASO, mahdollisesti koska indusoiman apoptoosin miR-24-ASO (Fig. 1 C). Ekspressio kaspaasi-8 oli myös kohonnut transfektoiduissa soluissa miR-24-ASO, kun taas kaspaasi-8 hieman suojattu aktivointi soluissa yli-ilmentävät miR-24 (Fig. 1 D). Nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-24 down-regulation in DU-145-soluja voidaan indusoida apoptoosia, mahdollisesti kaspaasi-8-reitin.

(A) DU-145-soluja käsiteltiin 20 nM miR-24-ASO tai NC-ASO 48 tuntia. Apoptoosi mitattiin FACS anneksiini V ja propidiumjodidivärjäys (n = 3 ± SE; *

p

0,01). Down-regulation miR-24 indusoi apoptoosin DU-145-soluja. (B) Apoptoosi indusoitiin 2 h, 1 uM staurosporiini, 48 h transfektion jälkeen, 20 nM miR-24-ASO tai NC-ASO (n = 3 ± SE; *

p

0,01). Apoptosis herkkyys lisääntyi merkittävästi transfektion jälkeen miR-24-ASO. (C) Solulisääntyminen mitattiin CCK-8 kit osoitetuissa aikapisteissä transfektion jälkeen 20 nM miR-24-ASO tai NC-ASO (n = 3 ± SE). Down-regulation miR-24 vaikutti leviämisen DU-145-soluja. (D) kaspaasi-8 aktivaatio havainnoitiin Western blot-analyysi pro-kaspaasi 8 ja kypsän muodon kaspaasin 8 24 tunnin kuluttua hoidon (kuten edellä). Kaspaasi-8 aktivoitiin transfektion jälkeen miR-24-ASO.

miR-24 Säätelee FAF1 Gene sitoutumalla ORF alueen FAF1

Käyttäen menetelmiä kuvataan Karginov ja kollegansa [33] muutamin muutoksin, huomasimme, että FAF1 on otaksuttu kohteena miR-24. Analyysi RNA22 ohjelmisto (IBM) osoitti, että ei ole olemassa miRNA sitoutumiskohta 3’UTR alueella FAF1 geenin, mutta kahden mahdollisen miR-24 sitoutumiskohtien havaittiin sisällä avoimen lukukehyksen (ORF) alue FAF1 (Fig. 2A). Lisäksi miR-24 kohdesekvenssien, erityisesti ”siemenen alueen”, on ORF-alueen FAF1 havaittiin olevan erittäin konservoituneita kahdeksan lajien (Fig. 2B).

(A) RNA22 ohjelmistoa käytettiin ennustaa, että CDS alue FAF1 mRNA satamat kahden mahdollisen miR-24 sitoutumiskohtia. Sekvenssi miR-24, sen sitoutumiskohtia, ja energiat esitetään. (B) ennustettu sitoutumiskohdat on FAF1 olivat konservoituneita kahdeksan eri lajia. Emäkset muutettu mutantti FAF1 konstruktit on myös esitetty. Red: pariksi emäkset; vihreä: G: U pari; sininen: mutantti emäkset. (C) 293T-solut transfektoitiin reportterivektorin, joka koostuu lusiferaasigeenin, joka sisältää villin tyypin tai mutantit miR-24 sitoutumiskohtia) sen 3′-UTR-alueen (FAF1 /pGL3 tai FAF1-M12 /pGL3, 20 ng /kuoppa kussakin 24-kuoppalevyllä). Solut transfektoitiin myös CMV-Renilla sivektorissa (20 ng /kuoppa kuhunkin 24-kuoppaisen levyn) sisäisenä standardina. Lusiferaasi sisältävät ennustetun miR-24 sitovia sekvenssejä väheni käsittelemällä 20 nM miR-24-matkivat verrattuna hoitoon NC-matkivat, kun taas lusiferaasi, joka sisälsi mutatoidut sekvenssit, ei voitu alassäädetty (n = 3 ± SE; *

p

0,01). (D) miR-24 säätelee FAF1 geenin. 293T-soluja käsiteltiin kuten ja transfektoidaan 100 ng pcDNA3.1-FAF1. Ilmentyminen FAF1 oli alassäädetty transfektion jälkeen 20 nM miR-24-matkivat ja pelastettiin jälkeen 100 nM miR-24-ASO on transfektoitu. (E) Annos-riippuvainen tukahduttaminen FAF1 by miR-24 293T-soluissa. 293T-solut ko-transfektoitiin 100 ng pcDNA3.1-FAF1 ja 1, 5, tai 20 nM miR-24-matkivat 24 tunnin jälkeen ja immunoblotattiin edellä kuvatulla tavalla. (F) Mutant FAF1 voisi olla alassäädetty upon transfektiota 1 nM tai 5 nM miR-24-matkivat 24 tuntia. FAF1 oli alassäädetty hieman transfektion jälkeen 20 nM miR-24-matkivat; tämä saattaa koska mutaation FAF1 oli hieman pieni.

Sen testaamiseksi, onko miR-24 voi säädellä FAF1 sitomalla nämä kaksi ennustettu sivustoja, fragmentit, jotka sisältävät näiden kahden sekvenssin tai mutatoituja sekvenssejä kloonattiin 3 ’UTR alue lusiferaasigeenin reportteri pGL3, nimeltään FAF1 /pGL3 tai FAF1-M12 /pGL3 (Fig. 2C). Nämä lusiferaasireportteri- vektoreita, jotka sisältävät miR-24 vaste-elementit tai mutatoituja sekvenssejä transfektoida 293T-soluihin, jossa on NC-matkivat ohjaus- tai miR-24-matkivat. Tämän jälkeen lusiferaasi ja Renilla aktiivisuus kussakin kuopassa mitattiin. Todettiin, että miR-24 pystyi alentamaan lusiferaasiaktiivisuus reportteri sisältävän vektorin miR-24 vaste-elementit, kun taas reportteri, joka sisälsi mutatoidut sekvenssit, ei alassäädetty (Fig. 2C). Nämä tiedot osoittavat, että miR-24 voi alas-säädellä tavoitteensa sitomalla nämä kaksi ennusti sitovaa kohtaa.

Sen testaamiseksi, onko miR-24 vähentää ilmentymistä FAF1, 293T-solut ko-transfektoitiin miR-24 jäljittelee ja pcDNA3.1-FAF1. Kontrollina, jotkut solut kotransfektoitiin NC-jäljittelee ja pcDNA3.1-FAF1. Todettiin, että miR-24 jäljittelee laski FAF1 proteiinin tasot pitoisuudesta riippuvalla tavalla (kuvio. 2D ja E). Lisäksi, miR-24-ASO, miR-24 jäljittelee ja pcDNA3.1-FAF1 kotransfektoitiin 293T-soluihin. Alas-säätely FAF1 purettiin miR-24-ASO, mutta ei NC-ASO (Fig. 2D).

Varmista, että miR-24 säännelty FAF1 geeni sitoutumalla kahteen ennustettu sidonta sivustoja ORF, synonyymi mutantteja näiden kahden sivustoja rakennettiin (Fig. 2B). 293T-solut ko-transfektoitiin miR-24-matkivat ja pcDNA3.1-FAF1. Mutantti FAF1 ei voida alassäädetty transfektoimalla miR-24 jäljittelee peräti FAF1 /pCDNA3.1 teki (Fig. 2F). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-24 voi sitoa ja säädellä näitä kahta vaste elementtiä CDS alueella FAF1 geenin.

miR-24 Säätelee Apoptosis in DU-145-soluihin kohdistaminen FAF1 Gene

sen hypoteesin testaamiseksi, että miR-24 säätelee apoptoosia DU-145-soluja kohdistamalla FAF1-geenin, käytettiin FACS-analyysi tutkia apoptoosin transfektoitujen solujen joukon reagensseja. Yli-ilmentyminen FAF1 indusoi apoptoosin, samoin alas-säätely miR-24. Kun FAF1 ja miR-24-ASO kotransfektoitiin tulee DU-145-solut, apoptoosia oli paljon suurempi, kun FAF1 transfektoitiin ja miR-24 on alas-säädellä samanaikaisesti, verrattuna tuloksiin transfektoidaan joko FAF1 tai miR-24 -ASO yksin. Todellakin, indusoiman apoptoosin FAF1 voitaisiin pelastaa yli-ilmentyminen miR-24 (Fig. 3). Nämä tiedot osoittavat, että aiheuttamaa apoptoosia alas-säätely miR-24 voi toimia kautta sääntelyn FAF1.

DU-145-soluja käsiteltiin osoitetuilla reagenssien ja apoptoosin mitattiin FACS 48 h transfektion jälkeen (n = 3 ± SE, *

p

0,01). Ei ainoastaan ​​alas-säätely miR-24 indusoi apoptoosin, mutta yli-ilmentyminen FAF1 myös indusoi apoptoosia DU-145-soluja. Prosenttiosuus apoptoottisten solujen tuli paljon suurempi, kun pcDNA3.1-FAF1 ja miR-24-ASO kotransfektoitiin. Indusoiman apoptoosin yli-ilmentymistä FAF1 voitaisiin pelastaa MIR-24-matkivat. Nämä tiedot osoittavat, että yli-ilmentyminen miR-24 voi suojata DU-145-soluja FAF1-indusoitua apoptoosia ja että säätely alaspäin miR-24 voi lisätä indusoiman apoptoosin FAF1 DU-145-soluja. Vektorit transfektoitiin konsentraatio 100 ng per kuoppa; jäljittelee ja ASO transfektoitiin konsentraatio 20 nM kuoppaa kohti 12-kuoppalevyllä.

mutaatio miR-24 sitoutumiskohdat FAF1 Gene herkistää solut apoptoosin

sitoutumiskohtien miR-24 sisällä FAF1 ORF mutatoitiin edelleen vahvistaa, että miR-24 säätelee apoptoosia DU-145-soluja kohdistamalla ORF alueen FAF1 geenin. Tulokset Tämän kokeen osoittavat, että DU-145-soluja, joilla on mutantti FAF1 olivat herkempiä apoptoosia kuin solut, jotka sisältävät villityypin FAF1 geenin. Sen määrittämiseksi, onko mutantti FAF1 voitaisiin säädellä miR-24, mutantti FAF1 geenin ja miR-24-matkivat kotransfektoitiin tulee DU-145-soluja. Yli-ilmentyminen miR-24 ei pelastaa solujen indusoiman apoptoosin mutantti FAF1 geenin (Fig. 4). Nämä tiedot tukevat hypoteesia, että miR-24 säätelee apoptoosia sitomalla ORF alueen FAF1 geenin.

DU-145-soluja käsiteltiin kuten on osoitettu, ja apoptoosi mitattiin FACS: llä 36 h transfektion jälkeen (n = 3 ± SE, *

p

0,01, **

p

0,05). Synonyymi mutaatiot ennustetun miR-24 sitoutumiskohtia sisällä FAF1 indusoi suurempaan apoptoosin. Yli-ilmentyminen miR-24 ei suojannut DU-145-soluja indusoiman apoptoosin mutantti FAF1. Vektorit transfektoitiin konsentraatiossa 100 ng per kuoppa; jäljittelee ja ASO transfektoitiin pitoisuudella 20 nM kuoppaa kohti 12-kuoppalevyllä.

miR-24-ASO-välitteisen Down-asetus miR-24 Myös indusoi apoptoosia ja Vaikuttaa proliferaation HGC-27, MGC-803 ja HeLa Cells

vieressä palveluksessa kohdunkaulan syövän solulinja HeLa ja kaksi ihmisen mahalaukun sinoomasolulinjoja (HGC-27 ja MGC-803) tutkimaan, onko miR-24 voisi säännellä apoptoosin muissa syöpäsoluissa. Apoptoosi indusoitiin 20 nM miR-24-ASO ilman muita induktion jälkeen 48 tuntia HGC-27 ja MGC-803-solut (Fig. 5A). HeLa-soluissa, apoptoosi indusoitiin with1 nM staurosporiinilla. Määrä apoptoosin oli paljon korkeampi soluissa, jotka on transfektoitu 20 nM miR-24-ASO kuin soluissa, jotka on transfektoitu NC-ASO (Fig. 5B). Edellä mainitut tiedot viittaavat siihen, että sääntely apoptoosin miR-24 voisi olla yhteinen mekanismi erilaisissa syöpäsoluissa.

(A) HGC-27 ja MGC-803-soluja käsiteltiin 20 nM miR-24- ASO tai NC-ASO ja apoptoosin mitattiin FACS anneksiini V ja propidiumväriä jodivärjäyksen kuluttua 48 h (n = 3 ± SE; *

p

0,01). Down-regulation miR-24 indusoi apoptoosin HGC-27 ja MGC-803 soluja. (B) Apoptoosi indusoitiin 1 uM staurosporiini 2 h kuluttua 48 h transfektion käyttäen 20 nM miR-24-ASO tai NC-ASO (n = 3 ± SE; *

p

0,01). Apoptoottinen vaste staurosporiini lisättiin transfektion jälkeen miR-24-ASO.

Keskustelu

miRNA tiedetään estävän geeniekspressiota sitoutumalla 3 ’UTR: t niiden kohde-transkriptien [34]. Viime aikoina on osoitettu, että miRNA voivat myös moduloida geenin ilmentymisen emäspariutumisen CDS alueelle kohde-mRNA: iden. Esimerkiksi anna-7 miRNA suoraan kohdistaa miRNA-käsittely entsyymin Dicer sen koodaava sekvenssi, jolloin syntyy järjestelmä, jossa miRNA /Dicer itsesäätelydomeenin negatiivinen kierre [12] – [14].

Aikaisemmat tutkimukset ovat havainneet, että alas-säätely FAF1 kautta RNA-häirintää voitaisiin parantaa alttius apoptoosin [32]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että miR-24 toimii sisäsyntyinen siRNA varten FAF1, ja indusoiman apoptoosin FAF1 voidaan pelastaa yli-ilmentyminen miR-24.

Suurin löydös on että miR-24 tavoitteiden FAF1 sitoutumalla sen CDS alueelle ja siten säännellä apoptoosin DU-145-soluja. Tutkimuksemme tukee täydennetty malli, jossa eläin miRNA voi säädellä mRNA: iden sitoutumalla sijaitseviin sekä sisällä 3’alue, ja laajentaa tietämystämme miR-24 ja FAF1 säätelevät apoptoosin syöpäsoluissa.

toiminta miRNA on erityisen monimutkainen, ja miR-24 voi olla tavoitteita muita kuin FAF1, jotka ovat mukana myös solujen eloonjäämistä. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että miR-24 tukahduttaa aloittamista ja venymä vaiheissa mRNA: n translaation, joka koodaa kasvaimeen vaimennin p16 (INK4a) [35]. Se on myös havaittu, että miR-24 tarvitaan tukahduttaa apoptoosin neurologisen verkkokalvon [36]. Näin ollen, FAF1 voi olla yksi useita eri tavoitteita miR-24, jotka vaikuttavat sen vaikutus apoptoosin.

DU-145 on ”klassinen” ihmisen eturauhassyövän solulinja, joka on peräisin aivojen etäpesäke. DU-145-soluissa on kohtalainen metastaattista potentiaalia, eivät ole hormoniherkän eivätkä ilmaise PSA (eturauhasen spesifisen antigeenin) [37] – [39]. Hormonien herkkä eturauhasen syöpiä hoidettiin hormonihoidon tyypillisesti osoittaa hyvää ennustetta. Kuitenkin vain harvat tehokkaita hoitoja olemassa hoitoon hormonin herkkä eturauhasen syöpiä edustaa DU-145 [40]. Tässä tutkimuksessa havaittiin, että yli-ilmentyminen FAF1 jälkeen miR-24 alassäätöä aiheuttaman apoptoosin noin 70% DU-145-soluissa 48 tunnin jälkeen (Fig. 3). Tämä osoittaa, että miR-24 voisi olla lupaava hoito tavoite hormonista erottelua eturauhassyöpä.

Lisäksi, miR-24 on yksi runsaimmin miRNA kohdunkaulan syövän soluihin [41], ja on tiettävästi säädelty kiinteässä mahasyöpä [42]. Muut tutkimukset ovat osoittaneet, että FAF1 ilmentyminen alenee mahakarsinoomat verrattuna ei-kasvainkudoksessa, ja oli merkittävä korrelaatio FAF1 vähentäminen ja sisällön sinettisormuksella solujen mahakarsinoomat [43]. Nämä raportit viittaavat siihen, että ilmaus FAF1 korreloi käänteisesti määrä miR-24 mahakarsinoomat. Tutkimuksemme osoittaa, että FAF1 on välittömänä kohteena miR-24, ja että miR-24 voi säädellä apoptoosin HGC-27, MGC-803 ja HeLa-soluissa. Nämä tulokset osoittavat, että apoptoosin säätelyyn kautta miR-24 tukahduttaminen FAF1 voi olla yhteinen mekanismi useita erilaisia ​​syöpiä.

Yhteenvetona tämän tutkimuksen ehdottaa, että pro-apoptoottinen tekijä FAF1 säätelee negatiivisesti miR-24 kautta kaksi erityistä tavoitetta motiivia sisällä FAF1 ORF alueella. Lisäksi alas-säätely miR-24 indusoi apoptoosia DU-145-soluja. Tuloksemme tukevat täydennetty malli, jossa miRNA voi suoraan kohdistaa selostukset niiden koodaavan alueen, ja ehdottaa, että täydellinen etsiä sääntelyn tavoitteiden miRNA pitäisi laajentaa koodausalueissa geenejä. Meidän havainnot paljastavat edelleen miR-24 on potentiaalinen kohde-geenin ja tarkoitettua lääkehoitoa hormoni herkkä eturauhassyöpä. Koska samanlaisia ​​tuloksia saatiin HGC-27, MGC-803 ja HeLa-solut, on myös vahva perusta tulevaisuuden tutkimusten miR-24 terapeuttisena kohdunkaulan ja mahasyövän.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely ja transfektio

Solulinjat (293T, HeLa, HGC-27, MGC-803 ja DU-145) saatiin Cell Bank on China Academy of Science. Soluja viljeltiin DMEM: ssä, RPMI-1640 tai DMEM /F12, kaikki oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS), 37 ° C: ssa 5% CO

2-ilmakehässä.

soluja noin 70%: n konfluenssiin transfektoitiin käyttäen INTERFERin (Polyplus, transfektioon oligonukleotideilla vain) tai Lipofectamine 2000 (Invitrogen, transfektiota varten plasmideilla) eri pitoisuuksilla synteettisiä miRNA jäljittelee, negatiiviset kontrollit (NC-matkii) (Ambion), synteettiset LNA-leimattua oligo-ribonukleotidit, miR-24-ASO ja LNA-leimatun NC-ASO (TaKaRa) sekä plasmideilla standardimenetelmien mukaisesti. Solut kerättiin eri aikapisteissä transfektion jälkeen biokemiallisia tai biologisia määrityksiä. Oligonukleotidisekvenssit käytettiin:

LNA NC-ASO, 5 ’caCTTATCagtcAGACCAtcGT 3’;

LNA 24-ASO, 5 ’ctGTTCCTgctgAACTGAgcCA 3’ (pienet kirjaimet tarkoittavat LNA-leimattu emäkset).

plasmidin muodostaminen

FAF1 proteiinin ekspressiovektori luotiin PCR-kloonaus FAF1 cDNA (NM_007051) välillä EcoRI- ja XhoI-kohtiin pcDNA3.1 (-) (Invitrogen). FAF1 cDNA monistettiin ihmisen cDNA-kirjastosta käyttäen seuraavia alukkeita:

5′-GAACTCGAGATTGGCGTCCAACATGGAC-3 ’ja 5′-GCGCGAATTCTTACTCTTTTGCTTCAAGG-3’. Plasmidit, jotka sisältävät mutaatioita sitoutumiskohtien miR-24 oli rakennettu PCR-pohjainen menetelmä, käyttäen seuraavia mutantti alukkeita:

FAF1-Mu-B1-FW: 5′-TTAGCTACCTCACGCAAAATTTTATAACCTGGGCTT-3 ’

FAF1-Mu-B1-RV: 5′-TGCGTGAGGTAGCTAACAATGGATTCAGCACAAAG -3 ’

FAF1-Mu-B2-FW: 5′-CTCCCTCCGGAACCTAAGGAAGAAAATGCTGAGCCTG-3′

FAF1-Mu-B2- RV: 5′-TTAGGTTCCGGAGGGAGGGCTTGCTCTAAGGACAG-3 ’

Luciferase Assay

miR-24 sitoutumiskohdat syntetisoitiin ja kloonattiin 3’UTR alueelle lusiferaasigeenin pGL3 sivektorissa (Promega ). Saatu konstrukti kotransfektoitiin PRL-SV40 ja miR-24 jäljittelee tai NC matkii (Ambion) 293T-soluihin, kuten aiemmin on kuvattu. 48 tunnin kuluttua, lusiferaasiaktiivisuus määritettiin keskimäärin kolme riippumatonta määritysten kanssa Dual-Luciferase Reporter (Promega).

Apoptosis Analyysi

Kukin solulinja transfektoitiin syntetisoituja oligonukleotidejä tai vektoreita . Vielä inkuboitu 36 tai 48 tuntia, solut kerättiin, värjättiin propidiumjodidilla ja FITC-leimattua anti-anneksiini-V-vasta-aine, ja analysoitiin FACS: lla.

proliferaatiomääritystä

Soluproliferaatiomäärityksiä suoritettiin Cell Counting Kit-8 (Dojindo). Solut maljattiin 24-kuoppalevyille kolmena kappaleena noin 5 x 10

4 solua per kuoppa ja viljeltiin kasvualustassa. Osoitetuissa aikapisteissä, numerot solua kuoppaa kohti mitattiin absorbanssi (450 nm) vähensi WST-8 (2- (2-metoksi-4-nitrofenyyli) -3- (4-nitrofenyyli) -5- ( 2, 4-disulfofenyyli) -2H-tetratsolium, mononatriumsuola).

Protein Extraction ja Western Blot

Solut kerättiin SDS-latauspuskuria (Sigma). Proteiinit erotettiin SDS-polyakryyliamidigeeleillä ja siirrettiin PVDF-kalvolle. Membraani blokattiin sitten PBST: llä, joka sisälsi 5% maitojauhetta 1 tunnin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen hybridisaatio yön yli 4 ° C: ssa TTBS: llä, joka sisälsi 1% maitojauhetta ja primaaristen vasta-aineiden. Ensisijainen vasta-aineita havaittiin peroksidaasi-kytketty sekundaarinen vasta-aine (Sigma) ja kemiluminesenssin (Pierce). Seuraavat ensisijainen vasta-aineita käytettiin: kanin anti-FAF (Cell Signaling Technologies) ja GAPDH (Abcam).