Krooninen sairaus

tiivistelmä

Plasma, neljäs olomuoto, määritellään osittain tai kokonaan ionisoitunut kaasu, joka sisältää seosta, elektroneja ja ioneja. Ennakot plasmafysiikassa ovat tehneet mahdolliseksi käyttää ei-terminen ilmakehän paineessa plasmaa (NTP) syöpätutkimukseen. Aikaisemmat tutkimukset ovat keskittyneet pääasiassa apoptoottisen syöpäsolun kuoleman välittyy NTP mahdollisena syövän hoidossa. Tässä tutkimuksessa selvitimme NTP on invaasio tai etäpesäke, sekä mekanismi, jolla plasma indusoi anti-muuttoliike ja anti-hyökkäys ominaisuuksia ihmisen kilpirauhasen papillaarisen syöpäsolulinjoista (BHP10-3 ja TPC1). Haavan paranemista, pull-down, ja TranswellTM analyysit osoittivat, että NTP vähensi solujen vaeltamiseen ja invaasiota. Lisäksi NTP indusoi morfologiset muutokset ja solun tukirangan uudelleenjärjestelyihin, kuten havaitaan pyyhkäisyelektronimikroskoopilla ja immunosytokemia. Tutkimme myös matriksin metalloproteinaasi (MMP) -2 /-9 ja urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) aktiivisuus käyttäen gelatiinitsymografialla, uPA määritykset ja RT-PCR: llä. FAK, Src, ja paksilliini ilmentymistä havaittiin käyttäen Western blot analyysit ja immunosolukemiallinen. NTP vähentynyt FAK, Src, ja paksilliini ilme sekä MMP /uPA aktiivisuutta. Lopuksi NTP esti hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden BHP10-3 ja TPC1 solujen vähentämällä MMP-2 /-9 sekä uPA toimintaa ja järjestämässä tukirankansa, joka säätelee FAK /Src monimutkainen. Nämä havainnot viittaavat siihen uusia toimia NTP ja voi auttaa uusien terapeuttisten strategioiden paikallisesti invasiivisia ja metastaattinen syövät.

Citation: Chang JW, Kang SU, Shin YS, Kim KI, Seo SJ, Yang SS, et ai. (2014) Ei-Thermal Ilmanpaine Plasma Estää Kilpirauhasen papillaarinen syöpäsoluinvaasiota kautta cytoskeletal Modulation, Altered MMP-2 /-9 /uPA Activity. PLoS ONE 9 (3): e92198. doi: 10,1371 /journal.pone.0092198

Editor: Jian Cao, Stony Brook University, Yhdysvallat

vastaanotettu 13 marraskuuta 2013 Hyväksytty: 19 helmikuu 2014; Julkaistu 25 maaliskuuta 2014

Copyright: © 2014 Chang et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tukivat Bio Medical Technology Development Program NRF rahoittamia Korean hallitus (2012M3A9B2052870). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Keunho Lee on toimitusjohtaja PSM America Inc., omistettu teknisenä kuulemisen laitteella, ja tämä ei muuta meidän noudattamista PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

Kilpirauhasen papillaarinen karsinooma on yksi yleisimmistä pahanlaatuisia kasvaimia maailmanlaajuisesti ja yleisesti osoittaa veltto luonne [ ,,,0],1]. Se voi kuitenkin joskus olla aggressiivinen, jossa ekstrakapsulaarinen levitä, hihna lihas, toistuvat kurkunpään hermo, ja henkitorven invaasio, sekä etäpesäkkeiden imusolmukkeisiin. Harvoissa tapauksissa kilpirauhasen papillaarinen syöpä voi metastasoituneet keuhko- tai luun [2], [3]. Läsnäolo paikallisten tai etäispesäkkeitä vaikuttaa kasvaimen uusiutumisen, potilas eloonjäämisluvut, ja elämänlaatu, mikä johtaa huonoon ennusteita [4]. Siksi on tarpeen löytää uusia keinoja estää aggressiivinen ominaisuuksia hyökkäyksen ja etäpesäkkeiden kilpirauhasen papillaarinen syöpä.

Plasma lääketiede on nopeasti kasvava ala, johon liittyy uusi hoitomuotoa [5], [6]. Eri plasma lähteistä ja plasma laitteita käytetään useita merkkejä, mukaan luettuna desinfiointi [7], haavoja [8], veren hyytymisen [9], ja syöpäsolun kuoleman [10]. Lisäksi teknologiset edistysaskeleet ovat sallittuja sukupolven plasmat huoneen lämpötilassa ja ilmakehän paineessa (ei-terminen ilmakehän paineessa plasmaa, NTP) [10] – [12]. NTP on raportoitu olevan anti-syöpä toiminnan eri kudoksissa, mukaan lukien keuhkosyöpä, [5], paksusuolen ja peräsuolen syövän [10] – [12], ja melanooma [13], mikä viittaa uuden anti-kasvain hoitomuoto. Lisäksi ryhmämme aiemmin osoitti, että NTP indusoi kasvun pysähtymisen ja myöhäisempi kasvaimen invaasio kolorektaalisyövässä soluissa [10], [11]. Kuitenkin syövän mekanismi NTP on keskittynyt pääasiassa apoptoosiin liittyviä mekanismeja lisääntynyt reaktiivisen hapen tai hapetus epätasapaino [14].

Kasvaimen invaasio ympäröiviin kudoksiin tai etäpesäkkeiden kaukaisiin elimiin on vallitseva syy kuolleisuus syöpäpotilailla [15]. Siksi painopiste on saatettu estämällä syövän eteneminen ja metastaasit. Monet linjat todisteet osoittavat, että monimutkainen prosessi toisiinsa toimenpiteet, mukaan lukien solujen vaeltamiseen, invaasio, pintatarttuvuuden, ja hajoaminen soluväliaineen (ECM), liittyy läheisesti kasvaimen invaasio ja /tai etäpesäke ja säätelee erittäin monimutkaisten mekanismien [ ,,,0],16]. Aikaisemmin ehdotimme, että NTP hoito laski solujen vaeltamiseen ja invaasiota kolorektaalisyövässä soluissa [10]. Kuitenkin mekanismit plasmassa inhiboivan vaikutuksen solumigraation ja invaasiota ei täysin tunneta.

Tämän tutkimuksen tarkoituksena oli tutkia estäviä vaikutuksia NTP maahanmuutto- ja hyökkäys ihmisen kilpirauhasen syöpäsolu linjat. Parhaan tietomme mukaan tämä on ensimmäinen tutkimus, jossa arvioidaan syövän vaikutusta NTP solun muuttoliikettä ja invaasiota liittyy tukirangan modulaatio ja muutokset matriksimetalloproteinaasi (MMP) -2 /-9 /urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA ) toimintaa.

Materiaalit ja menetelmät

solulinjat ja reagenssit

ihmisen kilpirauhasen papillaarisen sinoomasolulinjoja BHP10-3 ja TPC1 ostettiin American Type Culture Collection (Manassas , VA, USA). Normaali kilpirauhasen solulinja Nthy-ori 3-1 ystävällisesti esitteli prof. Minho Song (Chungnam National University, Korea). BHP10-3 ja Nthy-ori 3-1-soluja ylläpidettiin RPMI 1640-alustassa (Gibco, Carlsbad, CA, USA), kun taas TPC1 solut ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eaglen elatusaineessa /Hamin ravinneseosta F-12 (DMEM /F12; Gibco ), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (FBS) ja 100 U /ml penisilliiniä-streptomysiiniä (Gibco). Soluja pidettiin 37 ° C: ssa, 5% CO

2 mukaisesti kostutetussa olosuhteissa.

Kokeellinen järjestelmän vaatimukset

Kuten aiemmin on kuvattu [11], me suunniteltu ja valmistettu spray-tyyppinen NTP järjestelmä äskettäin suunniteltu kaari-vapaa ja antistaattinen levy, joka tarjoaa yhtenäisen plasma jet biolääketieteellisen tutkimuksen sovelluksiin. Tämä järjestelmä näyttää korkea hyötysuhde pintamodifikaation bio-näytteiden alhaisissa lämpötiloissa, joka on kriittinen biologinen kokeiluja.

tekniset yksityiskohdat plasman järjestelmän ( ”soihtu spray-tyyppi”) esitetään kuvioissa . 1A ja B tekniset virtalähteen tämän järjestelmän ovat 2 kV vähintään 13 kV maksimi, ja keskimääräinen taajuus 20-30 kHz; nämä tiedot voivat vaihdella tyypin ja Käytetyn kaasun määrä. Tässä tutkimuksessa heliumin (He) ja happi (O

2) käytettiin kantaja kaasuja koska olemme aikaisemmin havainneet, että lisäämällä O

2 on hän plasma tehostanut syöpäsolun esto [10]. Emissiospektrit plasman sen voiman tässä tutkimuksessa käytetyt (2 tai 4 kV) on esitetty kuviossa. 1B.

(B) optinen emissio spektrit Hän ja O

2 kaasuseos plasma mukainen sähköinen intensiteetti (2 tai 4 kV), joka on alueella 280-920 nm. (C) Kuva on ”soihtu spray-tyyppi” plasma jet kanssa hän ja O

2. Näkyvä plasman pituus oli noin 2,5 cm, joka vaihteli kaasun virtauksen ja jännitteen.

Pyyhkäisyelektronimikroskopia (SEM) B

SEM, soluja kasvatettiin lasipeitinlevyille ja kiinteät 1 tunnin ajan huoneen lämpötilassa 4% paraformaldehydillä fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) (pH 7,2). Peitinlasit käsiteltiin kuten aiemmin on kuvattu [17]. Solut tutkittiin käyttäen pyyhkäisyelektronimikroskooppia (S-4800; Hitachi, Tokio, Japani), joka toimii 10 tai 15 kV.

Cytoskeleton värjäys

Solut kerättiin ja uudelleen maljattiin fibronektiinin -päällystettyihin peitinlasit. 24 tunnin kuluttua solut kiinnitettiin 20 minuutin ajan 3,7% formaldehydiä ja uudelleen hydratoitu PBS: ssä, jossa oli 0,1% Triton X-100. Blokkauksen jälkeen 45 minuuttia PBS: lla, joka sisälsi 5% BSA: ta, levyt inkuboitiin Texas-Red-konjugoidulla phalloidin (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Hoechst 33258 lisättiin vastavärjäämiseksi ytimet. Objektilasit analysoitiin käyttämällä fluoresenssimikroskooppia (Carl Zeiss, Oberkochen, Saksa).

Pull-down määrityksissä (RhoA, Rac1, ja Cdc42 GTPaasi aktivaatiotesteissä) B

edelleen määrittää NTP morfologisiin muutoksista solujen vaeltamiseen, joka on RhoA /Rac1 /Cdc42 aktivointi Assay Combo Biochem Kit (Cytoskeleton Inc., York, UK) käytettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden 600 ug kokonaisproteiinia. Lyhyesti, rhotekin-RBD Efektoridomeeni affiniteettihelmillä käytettiin sitomaan aktiivinen RhoA, ja PAK-PBD Efektoridomeeni affiniteettihelmillä käytettiin sitomaan aktiivinen Cdc42 ja Rac1. Kun oli inkuboitu 2 tuntia, proteiinit eluoitiin Laemmlin puskuria ja erotettiin 12% akryyliamidi /bis-akryyliamidi geelit. Negatiiviset ja positiiviset kontrollit suoritettiin valmistajan ohjeiden mukaisesti. Vahvista läsnäolo GTPaaseja soluun proteiinin uutteita, 5% syöttöpainikkeet myös ajaa geelejä. Geelit siirrettiin nitroselluloosamembraaneille, joita inkuboitiin yön yli vasta-aineita Cdc42, Rac1, ja RhoA (sisältyvät sarjaan) varovasti sekoittaen. Proteiinit havaittiin käyttäen vahvistettua kemiluminesenssiä Western blotting kit.

Haavan paranemista määrityksissä

solujen vaeltamiseen määritykset, solut maljattiin 12-kuoppaisille viljelylevyille tiheydellä noin 1 x 10

5 /kaivo ja kasvatettiin yhtenäiseksi. Haavojen parantumisen määritykset suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [10]. Lyhyesti, yksisolukerros oli naarmuuntunut steriilillä pipetillä kärjestä, jonka jälkeen pesun solujätteen poistamiseksi. Sitten solut altistettiin kaasun (He tai O

2 vain), 2 tai 4 kV NTP, vastaavasti, 1 s. Haavan paranemista suhteet dokumentoitiin valokuvaamalla kuluttua 24 h jälkeen kaksinkertaistaa kertaa BHP10-3 ja TPC1 olivat 30,0 ± 1,2 h ja 29,7 ± 0,8 h. Kahdentumisajoista laskettiin solujen kasvukäyrän kolmen päivän seuraavasti: (t

2: viimeisen kerran, t

1: alkuajankohdasta, q

2: lopullinen solujen määrä, q

1 : alustavan solun numero) B

Western blot -analyysit

Solut lyysattiin lyysipuskurissa, joka sisälsi 150 mM NaCl, 1,0% NP-40, 0,5% natriumdeoksikolaatti, 0,1% SDS, 50 mM Tris ( pH 8,0), ja proteaasiestäjäseostabletit (pH 7,4; Roche Applied Science, Wien, Itävalta) kuten aiemmin on kuvattu [18]. Seuraavia vasta-aineita käytettiin Western-blottauksella: anti-polttoväli adheesiokinaasi (FAK), -Src, -Paxillin, -extracellular signaali säädelty kinaasi (ERK), -Akt, ja -α-tubuliinia (1:1000; Cell Signaling Technology , Danvers, MA, USA).

Immunosytokemia

Soluja viljeltiin mikroskooppi peitelaseille (Thermo Fisher Scientific, Rochester, NY, USA) ja käsiteltiin kaasulla (Hän + O

2 ) vain, 2, tai 4 kV NTP, vastaavasti. 24 tunnin kuluttua levyt pestiin PBS: llä, kiinteä 20 minuutin ajan 3,7% formaldehydiä, ja uudelleen hydratoitu PBS: ssä. Blokkauksen jälkeen 45 min BSA: ta (5% PBS: ssä), levyt inkuboitiin 1 tunnin ajan kanin polyklonaalista anti-p-FAK ja-paksilliini vasta-aineita (1:50; Cell Signaling Technology), pestiin PBS: llä ja inkuboitiin 45 min Alexa 488-leimattua vuohen anti-kani-vasta-aineita (1:250; Molecular Probes). Huuhtelun jälkeen PBS: ssä, Hoechst 33258 lisättiin 15 min vastavärjäämiseksi ytimet. Objektilasit pestiin PBS: llä ja asentaa Vectashield (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) analysoitiin käyttämällä fluoresenssimikroskopiaa (Carl Zeiss).

Invasion (TranswellTM) määritykset

transwell (24-kuoppa) kammiot (Costar, Cambridge, MA, USA) käytettiin arvioitaessa soluinvaasion mukainen NTP hoitoa kuten aikaisemmin on kuvattu [10]. Aluksi, fibronektiini (2 ug /suodatin) liuotettiin 100 ul: aan MEM ja kaadettiin yläosaan polyeteeni suodatin (huokoskoko 8 pm) kantavassa kuopat päällystettiin yön yli laminaarivirtauskaapissa.

Sitten, 10

5-soluja (100 ul: ssa elatusainetta) lisättiin suodattimen päälle ylemmän hyvin. Kammio inkuboitiin 24 tuntia 5% CO

2 37 ° C: ssa. Lopuksi, kiinnittyneitä soluja alaosassa värjättiin H MMP-2-R, 5′-TGT GGC AGC ACC AGG GCA GC-3 ’; MMP-9-F, 5’-GGG GAA GAT GCT GCT GTT CA-3 ’; ja MMP-9-R, 5′-GGT CCC AGT GGG GAT TTA CA-3’.After denaturaatio 3 min 94 ° C: ssa, näytteet monistettiin 35 sykliä 30 s 94 ° C: ssa, 60 ° C, ja 72 ° C, jossa on 5-min pidentäminen 72 ° C: ssa. Tuotteet erotettiin elektroforeesilla 1,5% agaroosigeeleillä ja havaittiin käyttäen UV-valossa (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Zymografia

MMP-2 /-9 aktiivisuus määritettiin käyttäen gelatiinitsymografialla kuten aiemmin on kuvattu [19]. BHP10-3 ja TPC1 soluja käsiteltiin kaasun (He + O2) vain, 2, tai 4 kV NTP 1 s, ja inkuboitiin vielä 24 tuntia. Supernatantti (100 pl) kustakin näytteestä sekoitettiin 1 ui 100 mM 4-aminophenylmercuric asetaatti, ja näytteet aktivoitiin 1 tunnin ajan 37 ° C: ssa. Seuraavaksi jokainen näyte laitettiin näytepuskuriin 10 min ja elektroforeesi polyakryyliamidi- geeleissä 125 V: ssa 120 minuutin ajan 4 ° C: ssa käyttäen Novex Xcell II -järjestelmä (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Geelit inkuboitiin rena- 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa, minkä jälkeen inkuboidaan 18 tuntia 100 ml: ssa kehittää puskuria 37 ° C: ssa valoa ravistellen. Geelit värjättiin sitten 3 h Coomassie brilliant blue. Jälkeen värinpoisto 400 ml: ssa metanolia, 100 ml etikkahappoa ja 500 ml tislattua vettä, kuvat otettiin käyttämällä kuva-analysaattoria.

urokinaasi plasminogeeniaktivaattori (uPA) määritykset

BHP10-3 ja TPC1cells (3000 solua /kuoppa) lisättiin 96-kuoppaisille levyille täydelliseen elatusaineeseen, joka sisälsi 10% FBS: ää. Yön yli inkuboinnin jälkeen solut käsiteltiin kaasun (He + O

2) vain, 2, tai 4 kV NTP, vastaavasti. Levyjä inkuboitiin sitten vielä 24 tuntia. Solut käsitellään sitten kuten aiemmin on kuvattu [19]. Lyhyesti, solut pestiin DMEM ole fenolipunaista ja laitettiin 200 ul: ssa reaktiopuskuria, joka sisälsi 50% (v /v) 0,05 U /ml plasminogeenin DMEM (ilman fenolipunaista), 40% (v /v) 50 mM Tris-puskuria (pH 8,2), ja 10% (v /v) 2,25 mM chromozyme PL 100 mM glysiiniä. Seoksia inkuboitiin 3 tuntia 37 ° C: ssa 5% CO

2. Absorbanssi 405 nm: ssä mitattiin käyttämällä automaattista spektrofotometrisellä levynlukijalla.

Tilastolliset analyysit

Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) post hoc Tukeyn testi suoritettiin käyttäen SPSS 20.0 tilasto-ohjelmalla ( SPSS, Chicago, IL, USA). Tietojen parametrit kolmesta itsenäisestä kokeesta on ilmaistu keskiarvona ± S.D.

P

0,05 pidettiin tilastollisesti merkitsevä (*

P

0,05; **

P

0,01; ***

P

0,001).

tulokset

NTP indusoi muutoksia solun morfologiassa ihmisen kilpirauhasen papillaarisen syöpäsoluja

eloonjääneiden solujen että kiinni pintaan jälkeen NTP hoidon näytteillä eri morfologia (Fig. 2A ja B). Kilpirauhasen papillaarinen solut normaalisti kasvavat litistynyt kuvio, leimaavat monet sytoplasman ulokkeet (lamellipodioihin ja filopodia) [20]. Kun NTP hoito, solut näkyvät hyvin erilainen morfologia oli ominaista pienempi ja supistui ulkonäkö, ja laski sytoplasman Microspikes tuloksena rajoitetulla solunlevitys- (Fig. 2A).

(A) käsittelyn jälkeen kaasu ( hän + O

2) vain, 2 tai 4 kV NTP 1 s, vastaavasti, soluja inkuboitiin 24 h. Morfologia molemmissa solulinjoissa tutkittiin sitten valomikroskoopilla. Valvonnassa ja kaasulla-hoidetuilla ryhmillä, solut oli tasainen ja pitkänomainen, ja lamellipodioihin (tähti) ja filopodia (nuoli), joka perustettiin solu-solu-kontaktien sivusuunnassa. Sen sijaan NTP-käsitellyt solut osoittivat morfologisia muutoksia ominaista supistui sytoplasmassa, inhiboi solu-solu-kontakti, ja kumotaan sytoplasman ulokkeiden (lamellipodioihin ja filopodia). (B) SEM kuvia vahvisti NTP solumorfologiaan. Solulima NTP-käsitellyt solut osoittivat kutistuminen ja menetyksen vaakapolarisaatiota ja sytoplasman ulokkeita. Lisäksi solujen pinnalla käsitelty plasma oli karheampi kuin ohjaus- ja kaasun ainoastaan ​​käsiteltyjä soluja. (C) Immunofluoresenssimääritykset käyttäen Texas-Red-konjugoidulla phalloidin tehtiin havainnollistamaan tukirangan (F-aktiini); Hoechst 33258 käytettiin leimaamiseen solutumien. Vuonna ohjaus ja kaasu käsitellään-soluja, contractile aktiini niput (stressi kuidut) ja lävistäjä aktiinifilamentin meshwork muodostettiin. Kuitenkin NTP-käsiteltyjen ryhmien aktiinisäikeiden jaettiin supistui sytoplasmassa tuhoaa arkkitehtuuri solun tukirangan, eikä merkittävästi stressin kuidun muodostumista todettiin. Mittakaava = 50 pm. Jokainen luku edusti kolme kokeiluja triplikaatit.

Pyyhkäisyelektronimikroskooppivalokuvat Molempien solulinjojen vahvistettiin edellä mainitut päätelmät, jotka ohjaavat ja kaasua vain käsiteltyjä soluja osoitti mesenkymaaliset kaltaisia ​​piirteitä monia soluliman ennusteita. Sen sijaan NTP-käsitellyt solut oli enemmän kompakti solurungoissa ja karkea solujen pinnat, joissa ulkonevat soluliman prosessit ilmeisesti väheni (Fig. 2B).

NTP indusoi säädeltyyn solun tukirangan arkkitehtuuri ihmisen kilpirauhasen papillaarinen syöpäsoluja

Käytimme immunosolukemialliset vastaan ​​solunsisäisiä aktiinisäikeiden väriainepohjaisten konjugoitu falloidiinia ja totesi, että aktiinisytoskeletonver- rakenne plasma käsiteltyjä soluja muokattiin. Vuonna ohjaus ja kaasu-käsiteltyjä soluja, contractile aktiini niput (stressi kuidut) ja lävistäjä aktiinifilamentin meshwork havaittu. Kuitenkin aktiinisäikeiden jaettiin supistui sytoplasmaan, missä se tuhoaa arkkitehtuuri solun tukirangan, eikä merkittävästi stressin kuidun muodostuminen havaittiin NTP-käsitellyissä soluissa (Fig. 2C).

NTP inhiboi Rho GTPaasit (RhoA, Rac1, ja Cdc42) B

Rho perhe GTPaasit on tunnettu osallistumisesta solujen toimintoja kuten solujen polaarisuus, lamellipodioihin tai filopodia muodostumista, ja solujen vaeltamiseen. Siksi tutkimme vaikutus NTP Rho perhe (RhoA, Rac1, ja Cdc42) toimintaa. Kuten on esitetty kuviossa. 3, NTP hoito vähensi aktiivisten muotojen RhoA ja Rac1.

Rho perhe (Rho, Rac1, ja Cdc42) aktiivisuus arvioitiin käyttämällä avattavan detektiovälinepakkaukset altistumisen jälkeen kaasu (Hän + O

2) vain, 2 tai 4 kV NTP 1 s. NTP hoito BHP10-3 ja TPC1 solujen merkittävästi vähentää ilmentymistä GTP-RhoA ja GTP-Rac1 (aktiivisten muotojen näiden proteiinien). Jokainen luku edusti kolme kokeiluja triplikaatit.

NTP estää solujen vaeltamiseen kautta FAK /Src-kompleksin ihmisen kilpirauhasen papillaarisen syöpäsoluja

Sen tutkimiseksi, NTP vähentää kasvaimen solujen vaeltamiseen, naarmu haavansulkemiseen määritykset suoritettiin. Kuten on esitetty kuviossa. 4A ja B, tuloksemme osoittavat, että plasmakäsittely merkittävästi tukahdutti muuttoa BHP10-3 (

P

0,01) ja TPC1 (

P

0,001) solujen poikki hiertyneelle alue. Inhibitioprosentti solumigraatiota oli 48,2 ja 55,4% vuonna BHP10-3 soluissa ja 63,6 ja 84,1% vuonna TPC1 soluista 24 tunnin kuluttua inkubaation 2 ja 4 kV NTP vastaavasti verrattuna hallita soluihin. Kaasu vain hoito ei vaikuta merkittävästi soluvaelluksen joko linja.

(A) BHP10-3 ja TPC1 solua maljattiin 12-kuoppalevyille, kasvatettiin yhteen ja yksikerroksista haavoittui pipetillä kärjestä. Haavojen paraneminen dokumentoitiin valokuvaamalla kuluttua 24 tunnin inkuboinnin. Asteikko bar = 200 pm. (B) kvantifiointi solumigraation. NTP estivät merkittävästi migraation BHP10-3 (

P

0,001) ja TPC1 (

P

0,001) solujen poikki hiertyneelle alue. Tiedot edustavat keskiarvoa ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. NS, ei merkittävää; **

P

0,01, ***

P

0,001.

edelleen vaikutuksen arvioimiseksi NTP cellular maahanmuuttoa, arvioimme proteiini lysaatit että fosforylaatiota FAK, Src, ja paksilliini, jotka ovat tunnettuja niiden läheinen yhteys solumigraation, invaasio, ja solun tukirangan uudelleenjärjestelyn kautta FAK /Src kompleksin [21]. Jälkeen NTP hoito, havaitsimme inhibition FAK fosforylaation ja johdonmukainen väheneminen fosforylaatiota Src ja paksilliinin, jotka ovat alavirtaan FAK (Fig. 5A).

(A) Western-blottauksella p-FAK, p-Src, ja p-paksilliini. Immunosytokemiallinen määritys (B) p-FAK ja (C) p-paksilliini. Vuonna ohjaus ja kaasu käsitellään-soluja, FAK sijaitsi pienissä tarttuvuus rakenteita solun reuna. Sen jälkeen NTP hoito, FAK polttoväli kertyminen oli merkittävästi vähentynyt molemmissa solulinjoissa. Lisäksi p-paksilliini värjäys yhteistyötä paikallistaa p-FAK värjäystä. NTP hoito vähensi myös p-paksilliini ilme. Mittakaava = 50 pm. Jokainen luku edusti kolme kokeiluja triplikaatit.

analysoitiin myös solunsisäistä jakelua fosforyloidun (p-) FAK ja fosforyloitua (p) paksilliini. Vuonna ohjaus ja kaasu ainoastaan ​​käsiteltyjä soluja, p-FAK kertynyt hyvin määriteltyjä alueita, mukaan luettuna solun reuna, kun taas jälkeen NTP hoidon, p-FAK värjäys väheni huomattavasti (kuvio. 5B). Kolokalisaation signaalit p-paksilliini ja p-FAK todettiin (kuviot. 5B ja C).

NTP estää soluinvaasiota vähentämällä MMP-2 /-9 ja uPA aktiivisuutta ja Akt ja ERK signalointi ihmisen kilpirauhasen papillaarisen syöpäsoluja

Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että FAK säätelee solujen invaasiota sekä muuttoliike, selviytyminen, ja etäpesäkkeiden eri solutyyppejä, mukaan lukien kilpirauhasen syöpä [22], [23]. Sen tutkimiseksi, NTP vähentää kasvaimen invaasio, invaasio määritykset suoritettiin käyttäen TranswellTM kammioita ja Matrigel. Kasvaimen invaasio edellyttää hajoamista tyvikalvon ja ECM, soluliman laajentamista, ja solujen vaeltamiseen. TranswellTM määrityksiä jäljitellä tätä ympäristössä kasvainten invaasio. Liitteenä solut alemmassa osassa suodattimen läpi kammion, joka osoittaa invasiivisia soluja. Kuten on esitetty kuviossa. 6A, H 0,001) (Fig. 6B).

(A) BHP10-3 ja TPC1 solut ympättiin suodattimet (huokoskoko, 8 pm) päällystetään matrigeelin ylemmässä osastossa ja altistuvat Hän + O

2 kaasu vain, 2 tai 4 kV NTP 1 s. 24 tunnin jälkeen solut huokosia tai soluja kiinnitetty Kalvon alapintaa laskettiin, ja näiden solujen on kiinnitetty alaosaan värjättiin H 0,001) ja TPC1 (

P

0,001) soluja, jotka tunkeutui kalvon. Tiedot edustavat keskiarvoa ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. *

P

0,05, **

P

0,01, ***

P

0,001.

Ymmärtää mekanismi, jolla NTP vaikutukset kasvaimen invaasio

in vitro

, gelatiinitsymografialla MMP-2 /-9 aktiivisuus tehtiin. Tuloksemme osoittivat huomattavaa vähenemistä MMP-2 /-9 aktiivisuutta, kun BHP10-3 ja TPC1 soluja käsiteltiin NTP 1 s (Fig. 7A). Edelleen tunnistaa vaikutuksen NTP on MMP, RT-PCR: ää käytettiin arvioimaan mRNA MMP-2 /-9. Kuten on esitetty kuviossa. 7B, NTP hoito inhiboivat merkittävästi MMP-2 /-9 mRNA ilmaisun. Nämä havainnot viittaavat siihen, että NTP inhiboi soluinvaasion vähentämällä transkriptiota MMP-2 /-9 ja inhiboimalla olemassa olevan entsyymin. NTP esti myös uPA aktiivisuutta osoituksena uPA määritykset (Fig. 7C).

(A) gelatiinitsymografialla MMP-2 /-9. NTP heikennettyjä MMP-2 /-9 entsyymiaktiivisuus molemmissa solulinjoissa. (B) RT-PCR MMP-2 /-9. MRNA MMP-2 /-9 pieneni, kun NTP-hoidon molemmissa soluissa. Jokainen luku edusti kolme kokeiluja kolmen rinnakkaisen. (C) uPA määritykset. NTP hoito laski merkitsevästi uPA aktiivisuutta. Tiedot edustavat keskiarvoa ± S.D. Kolmen riippumattoman kokeen. NS, ei merkittävää, **

P

0,01, ***

P

0,001. (D) Western blotting. ERK ja Akt ilmentyminen väheni merkittävästi sen jälkeen, kun NTP hoidon intensiteetti riippuvaisella tavalla. Jokainen luku edusti kolme kokeiluja triplikaatit.

Lopuksi proteiinin ilmentymistä Akt ja ERK tutkittiin käyttäen Western blotting. NTP hoito esti Akt ja ERK ilmaisun molemmissa solulinjoissa verrattuna kontrolliin tai kaasun ainoa ryhmä (Fig. 7D).

Keskustelu

Tämänhetkiset tiedot osoittavat, että NTP aiheutti antituumorivaikutuksen estämällä syöpäsolujen muuttoliikettä ja invaasiota. NTP on lupaava ja kehittyvien liikennemuotojen syöpätutkimuksessa, ja me aiemmin raportoitu, että anti-syöpä vaikutuksia NTP välittyvät kasvun pysähtymisen ja solukuolemaa [10], [11]. Kuitenkin ensimmäinen kosketuspiste NTP ja solujen solukalvon, joka sisältää erilaisia ​​proteiineja suorittamista dynaaminen toimintoja. Siksi tässä tutkimuksessa keskityttiin muutoksia solujen ulkonäkö, joka tapahtui solun pinnalla jälkeen NTP hoidon. Tuloksemme osoittavat, että plasma-käsiteltyjen kilpirauhasen syöpäsoluja menettäneet tasainen, kara-muotoinen vaakapolarisaatiota ja oli vähentynyt sytosolin ennusteet, jotka ovat tärkeitä solujen liikkuvuuden ja ympäristön anturi, kun taas solut eivät osoittaneet merkittäviä apoptoosin NTP hoito (täydennyskuvio . S1). Nämä aktiini-pohjainen solu ulokkeita, nimeltään lamellipodioihin (aktiinifilamentin meshwork) ja filopodia (säteittäisesti suuntautunut aktiinisäikeiden), ohjataan Rho perheen pienten GTP sitovia proteiineja (Rho-GTPaasit, RhoA, Rac1, ja Cdc42) [24]. Nämä tarkoin säänneltyä proteiinit ohjata myös mesenkymaaliset kaltainen polarisaatio solujen ja solun tukirangan uudelleenjärjestelyt, jotka ovat ensimmäinen askel muuttoliike [24]. Olemme vahvistaneet induktio morfologisia muutoksia NTP läpi värjäys solun tukirangan, mikä paljasti aktiini kuitua uudelleenjärjestelyn. Yhdessä siirtotyökaluilla ja avattavan määrityksen tulokset osoittavat, että plasman esti BHP10-3 ja TPC1 solujen vaeltaminen, mikä oli solujen morfologisia muutoksia solun tukirangan uudelleenjärjestelyn.

FAK on ei-reseptori tyrosiinikinaasin sijoittuvan pesäkekohdissa kiinnikkeistä. FAK mRNA ja proteiinin ilmentyminen on lisääntynyt valtaosa invasiivinen ja etäpesäkkeitä, mukaan lukien ihmisen kilpirauhasen syöpä [25]. Kuitenkin FAK on tuskin havaittavissa normaaleissa kudoksissa tai ei-invasiivisia kasvaimia [25] – [28]. Lisäksi se on yksi kaikkein näkyvästi fosforyloidun proteiinin kilpirauhasen papillaarinen syöpäsoluissa [29]. Tutkimukset ovat osoittaneet, että FAK edistää solujen vaeltamiseen kompleksin muodostumisen kautta Src, ja myöhemmin fosforylaatiota tukirankaproteiinin Jatkemolekyylin paksilliini jonka FAK /Src kompleksin [30]. Lisäksi paksilliini liittyy Cdc42 /Rac kohde efektori, joka voi yhdistää Cdc42 ja Rac muihin kinaasien ja loppupään tavoitteet [31], [32]. FAK tunnetaan myös säätelemään solujen vaeltamiseen moduloimalla kokoamista ja purkamista aktiinisytoskeletonin kautta sen vaikutuksia Rho alaryhmään pieniä GTPaaseja [33], [34]. Tulokset Tämän tutkimuksen ovat sopimuksen näiden aiempien tutkimusten koska olemme havainneet, että NTP esti merkitsevästi solujen vaeltamiseen tukahduttamalla ilmaus FAK /Src monimutkainen ja paksilliini signalointi, jotka liittyvät solun tukirangan sääntelyä.

Lisäksi sen hyvin tunnettu rooli solujen vaeltamiseen, FAK signalointi liittyy kasvaimen invaasio useat mekanismien [35], [36]. Esimerkiksi MMP /uPA-järjestelmä on keskeinen rooli ECM hajoamista ja on ratkaisevan tärkeää helpottaa kasvaimen maahanmuuton ja invaasion aikana etäpesäkkeiden [37]. Siksi tutkimme NTP kasvainsolun invaasiota ja FAK: n ja MMP /uPA-järjestelmä. Suhde FAK ja MMP-2 /-9-reitin on aiemmin tutkittu [22], [38]. FAK inhibition on osoitettu vähentävän MMP-9 erittymistä karsinoomasolut [39]. Lisäksi, uPA sitoutumisen urokinaasi plasminogeeniaktivaattorin reseptorin aktivoi muuntaminen plasminogeenin plasmiiniksi. Aktivoitu plasmiini välittää muuntaminen pro-MMP on MMP. Siksi MMP /uPA esto liittyy läheisesti vähentynyt invasiivisuus syöpäsoluja. Tässä tutkimuksessa tulokset zymografia ja RT-PCR osoittavat, että NTP indusoi MMP-2 /-9 ilmaisuja ja niiden toimintaa, myös. Nämä tiedot olivat yhtäpitäviä aiempien julkaistujen tutkimusten, joissa ilmauksia pro-MMP-2 /-9 ja entsyymiaktiivisuus läheisesti korreloivat pahanlaatuinen ja /tai metastasoituneen fenotyyppiä syövän [40] – [42]. Yhdessä nykyisen Tulokset osoittavat, että NTP tehokkaasti vähentää syöpäsolujen invasiivisuuden kautta MMP-2 /-9 /uPA-järjestelmä, joka liittyy Akt ja ERK signaloinneista. Aiemmat tiedot paljastivat, että MMP /uPA järjestelmä säädellään PI3K-Akt ja /tai ERK /p38 signaloinneista [22], [43], [44].

tarkasteltiin myös vaikutusta NTP normaali kilpirauhasen solulinja (Nthy-ori 3-1). NTP hoito ei aiheuttanut merkittävää apoptoottisen solukuoleman normaaleilla kilpirauhassoluja (Täydentävä kuviot. S2 ja S3). Lisäksi, toisin kuin tuumorisolut, normaali kilpirauhanen solut eivät osoittaneet merkittäviä morfologisia muutoksia (Supplementary kuva S4) ja väheneminen solumigraatio jälkeen NTP hoidon (Supplementary kuva S5), mikä viittaa ero herkkyys NTP kohtelun syöpäsolujen ja normaalien kilpirauhasen solut. Nämä tulokset ovat yhtäpitäviä aiempien tutkimusten joka ilmoitti selektiivinen syövän vastaisen vaikutuksen plasmakäsittely [5], [45]. Kolmen riippumattoman kokeen. Mittakaava = 50 pm.