Krooninen sairaus

tiivistelmä

hajoaminen soluväliaineen (ECM), joka on kriittinen vaihe syövän etäpesäke, määritetään tasapaino MMP (metalloproteinaasien) ja niiden estäjät TIMP (kudoksen metalloproteinaasien estäjiä). Syöpäsoluissa, tämä tasapaino on siirtynyt MMP edistäen ECM hajoamista. Tässä osoitamme, että EZH2 on aktiivinen rooli tässä prosessissa tukahduttaa ilmaus TIMP2 ja TIMP-3 eturauhasen syöpäsoluja.

TIMP

geenit tukahduttavat knockdovvn EZH2 ilmentymisen ihmisen eturauhasen syöpäsolujen mutta tukahdutettu yliekspressiolla EZH2 hyvänlaatuisia ihmisen eturauhasen epiteelisolujen. EZH2 katalysoi H3K27 trimethylation ja sen jälkeen DNA: n metylaatio on

TIMP

geenin promoottorit. Yliekspressio EZH2 antaa invasiivisen fenotyypin hyvänlaatuinen eturauhasen epiteelisolujen; kuitenkin, tämä fenotyyppi on tukahdutti cooverexpression of TIMP-3. EZH2 Knockdown vähentää huomattavasti proteolyyttistä aktiivisuutta MMP-9, mikä vähentää invasiivisen aktiivisuuden eturauhasen syöpäsoluja. Nämä tulokset viittaavat siihen, että transkription tukahduttamisen

TIMP

geenien EZH2 voi olla merkittävä mekanismi siirtää MMP /TIMP tasapainoa hyväksi MMP toimintaa ja siten edistää ECM hajoaminen ja myöhemmin invaasion eturauhasen syöpäsoluja.

Citation: Shin YJ, Kim JH (2012) The Role of EZH2 asetuksessa n Activity matriisimetalloproteinaasientsyymien eturauhassyöpäsoluissa. PLoS ONE 7 (1): e30393. doi: 10,1371 /journal.pone.0030393

Editor: Dean G. Tang, The University of Texas M. D Anderson Cancer Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 02 marraskuu 2011; Hyväksytty: 20 joulukuu 2011; Julkaistu: 17 tammikuu 2012

Copyright: © 2012 Shin, Kim. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tuettiin osittain Grant GM087470 (J-HK) National Institute of General Medical Sciences, National Institute of Health. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Metastasis-leviämisen syöpäsolujen ensisijainen sivuston muihin kehon osiin-on yhteinen piirre pahanlaatuisia kasvaimia. Prosessi syövän etäpesäkkeiden koostuu useista, peräkkäisiä vaiheita; syöpäsolut paeta primaarikasvaimen, siirtyvät verenkiertoon, matkustaa kaukaisiin sivustoja, ja ekstravasoitumaan muodostamaan toissijainen tuumorikohdat [1]. Etäpesäkkeen muodostumisen aikana, syöpäsolut tunkeutuvat ja kulkeutuvat normaalin molekyylipainon rajoitteet, kuten soluväliaineen (ECM) [2]. ECM, usein kutsutaan sidekudoksen, on organisoitu solunulkoisen materiaalien ympärillä ja tukevat soluja. ECM muodostuu erilaisia ​​polysakkaridien ja proteiinien, kuten laminiinit, kollageenit, fibronektiini, ja proteoglykaanin, ja sillä on keskeinen rooli määritettäessä muodon, kehityksen, ja biokemialliset solujen toimintaa [2]. Kangas ECM-proteiinien muodostaa tyvikalvon (BM), joka taustalla pohjapinnan epiteelikudosten ja muodostaa fyysisen esteen tuumori-invaasio. Syöpäsolut pystyvät hajottamaan ECM este käyttämällä entsyymejä, jolloin liukeneminen BM. Niistä tärkeimpiä entsyymit ovat matriisin (MMP) [3].

MMP suuri perhe sinkki-riippuvaisen endopeptidaasit ja vastaavat hajoamisen ECM [4]. MMP: t on jo kauan tiedetty liittyvän fysiologisissa ja patologisissa prosesseissa, kuten kudoksen uudelleen, haavan paraneminen, angiogeneesistä, ja syövän etenemistä [5] – [8]. MMP näkyvät piilevä proteiinien sytosoliin (pro-MMP) ja niitä prosessoidaan proteolyyttisesti, jolloin saadaan kypsä entsyymejä, jotka ovat puolestaan ​​erittyvän ja liittyy solun pinnan ja ECM [9], [10]. Kun esillä solun pinnalla, mutta, MMP: t estää endogeenisen kudoksen metalloproteinaasien estäjiä (TIMP: t), jotka suoraan sitoutuvat katalyyttisiä domeeneja MMP on 01:01 stoikiometria [11]. Siksi tasapaino MMP ja TIMP on kriittinen mahdolliseen ECM remontin ja hajoamista. Ihmisen genomi koodittaa neljä TIMP (TIMP1-TIMP4), jotka ovat toiminnallisesti tarpeettomia ja estävät 23 ihmisen MMP [12]. Monissa pahanlaatuisia kasvaimia, ilmaus TIMP säätyy alas, sopusoinnussa niiden rooli MMP-estäjät [13], [14]. Vastustamisesta TIMP ilmentymisen antisense-RNA annetaan onkogeenisuustutkimuksessa Sveitsin 3T3 [15], [16]. Toisaalta, yliekspressio TIMP johtaa inhibitioon ja metastaasit syöpäsolujen [17] – [23]. Nämä havainnot viittaavat siihen, että tukahduttamisen

TIMP

geenit voivat olla tärkeä sääntelymekanismiin syövän etenemisen, mutta taustalla olevaa mekanismia ei ole vielä täysin ymmärretty.

EZH2 (Polycomb ryhmä proteiinia tehostajana zeste homologin 2 ) on katalyyttinen alayksikkö on Polycomb tukahduttavia kompleksin 2 (PRC2) [24], [25], ja yli-ilmennetään erilaisissa ihmisen syövissä [26]. Varhaiset tutkimukset osoittivat, että korkeita EZH2 ilmaisun liittyy invaasiota ja etäpesäkkeiden pahanlaatuisia kasvaimia, kuten rinta- ja eturauhasen syöpiä [27] – [31] ja että EZH2 yli-ilmentyminen muuttaa hyvänlaatuinen eturauhasen solujen RWPE-1 [32] ja BPH1 [33 ] ja kuolemattomaksi rintojen epiteelisolujen [28]. Viime aikoina EZH2 on myös todettu säätelemään signalointireittejä liittyy solujen aineenvaihduntaa, kuten Ras GTPaasia aktivoivan proteiinin DAB2IP [34], [35] ja adrenergisen reseptorin-beeta-2 ADRB2 [36], joka edistää syövän etenemisessä. EZH2 näyttää välittävän transkription hiljentäminen joko metyloimalla lysiiniä 27 histoni H3 (3meH3K27) [23], [24] tai rekrytoimalla DNA metyylitransferaaseja (DNMTs) sen kohdegeenien jotka katalysoivat de novo DNA: n metylaatio [37]. Kuitenkin viime aikoina raportit ovat myös osoittaneet, että H3K27 trimethylation by EZH2 ei ole aina liittynyt promoottori DNA: n metylaatio varten hiljentäminen tiettyjen EZH2-kohdegeenien [38] – [41]. Toiminnallista roolia EZH2 eturauhasen syövän etenemisessä on todettu geeniekspressioprofilointi RNA ei tuumorigeeninen ihmisen eturauhasen epiteelisolujen yli-ilmentävät EZH2 [27]. Kuitenkin tulokset eivät olleet muuttamaan merkittävästi ekspressiotasoja monia etäpesäkkeiden liittyvien geenien, jotka tunnistettiin geneettistä kartoitusta ihmisen eturauhasen syöpäsolujen [42]. Luonne Tämän ristiriita on epäselvä, mutta saattaa johtua eroista ilmentymisen tasojen EZH2 eturauhasen syöpäsoluja testattiin.

Tässä tutkimuksessa selvitimme roolia EZH2 aktivoitumiseen MMP edistää invaasio ja etäpesäkkeiden eturauhasen syöpäsoluja. Tunnistamaan etäpesäkkeitä liittyvien geenien säätelee EZH2 eturauhassyövässä, mRNA: n ekspression erittäin invasiivisen eturauhassyövän solut, joissa EZH2 ilmentyminen pudotettiin profiloitiin käyttäen ihmisen etäpesäke PCR taulukot. Huomasimme, että korkea EZH2 ilmaisun aikana syövän etenemisen aiheuttaa tukahduttaminen

TIMP

geenejä (

TIMP2

ja

TIMP-3

), mikä johtaa lisääntyneeseen aktiivisuuteen MMP-9 ja täten lisääntynyt invasiivisen aktiivisuuden eturauhasen syöpäsoluja. Nämä tulokset tarjoavat ensimmäistä kertaa todisteita siitä, että EZH2 on aktiivinen rooli siirtämällä MMP /TIMP balanssia MMP ja näin edistää etäpesäkkeiden eturauhassyöpäsolujen.

Tulokset

EZH2 Knockdown vähentää merkittävästi invasiivisia ja muuttavat toimintaa eturauhassyöpäsolujen

Sen tutkimiseksi, korkeita EZH2 ilmentyminen korreloi invasiivisen fenotyypin eturauhassyöpäsolujen, ensin määritellään proteiinin tasot EZH2 ihmisen eturauhasen solulinjoissa (LNCaP, PC3, ja DU145). Meidän Western blot-analyysi osoitti, että EZH2 arvot ovat selvästi kohonneet syövän solulinjoissa kuin hyvänlaatuinen ihmisen eturauhasen epiteelisolujen linja RWPE-1 (kuvio 1A). Sitten tutkittiin invasiivisen aktiivisuuden eturauhassyövän soluissa, jotka ilmentävät eri EZH2 proteiinin avulla TranswellTM Boyden kammion määrityksessä. Tätä varten EZH2 ilmentyminen pudotettiin käyttäen kahta erilaista EZH2 erityisiä shRNAs, SH1 tai SH2 (kuvio 1 C, ylhäällä). PC3 ja DU145-soluja erittäin invasiivinen, verrattuna hyvänlaatuinen RWPE-1-soluissa (kuvio 1 B). Kuitenkin EZH2 pudotus merkittävästi vähentynyt invasiivisuuden eturauhasen syövän solut (kuvio 1C, keskellä); vain 18~20% eturauhasen syöpäsolujen infektoitu lentiviruksen ilmentävien EZH2 kohdistaminen shRNA tunkeutui BME kalvon kammion (SH1 ja SH2), verrattuna soluihin, jotka oli infektoitu kontrolli (NT, nontargeting shRNA) lentiviruksesta (kuvio 1 C, alhaalta ). Päinvastoin, yliekspressio EZH2 sille invasiivisen fenotyypin RWPE-1-soluissa (kuvio 1D, WT); kuitenkin, RWPE-1-solut yli-ilmentävät mutantti EZH2 proteiini (EZH2-H689A) pienentyneellä HMT toimintaa [44] ei näy invasiivisia aktiivisuutta (kuvio 1D, H689A). Koska EZH2 osallistuu aktiivisesti eturauhassyövässä invaasiota (kuviot 1C ja 1D), me tutki vielä muuttavien aktiivisuutta DU145 soluihin käyttämällä arpeutumisprosessit migraatiokokeessa (kuvio 1 E, ylhäällä). Huomasimme, että DU145 solut täyttävät -80% ja -50% haavoittuneista kohdat ennen (NT) ja jälkeen (SH1) knockdovvn EZH2 ilmaisun vastaavasti 24 tunnin jälkeen raapiminen (kuvio 1 E, alhaalla). Nämä tulokset viittaavat vahvasti siihen, että korkea EZH2 ilmaisun invaasiota ja migraation eturauhasen syöpäsoluja.

(A) Western blot -analyysi EZH2 ilmentymisen hyvänlaatuinen eturauhasen solulinja RWPE-1 ja pahanlaatuisen eturauhassyövän solulinjoissa LNCaP, DU145, ja PC3 (ylhäällä). Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. Proteiini kvantitoitiin käyttäen Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad) (alhaalla). (B) Invasion määritystä RWPE-1, PC3 ja DU145 soluja. Solujen invasiivisuus arvioitiin hyökkäys solujen kautta BME-päällystetty teriä TranswellTM Boyden kammion (ylhäällä). Invaasio nopeus määritettiin laskemalla solut, jotka vaelsivat läpi insertit ja ilmaistava suhteessa kontrolliin (RWPE-1, asetetaan 100%) (alhaalla). Kukin pylväs esittää keskimääräistä ± S.E on viisi kenttää laskettiin. (C) Western blot-analyysi EZH2 ilmaisun PC3 ja DU145 solujen jälkeen infektion EZH2 erityisiä shRNA lentivirukselle (SH1 tai SH2; kaksi erilaista EZH2 erityisiä shRNAs) tai ei-käsiteltyjen shRNA (NT, kontrolli) lentivirukselle (ylhäällä) . Invaasiomääritys PC3 tai DU145 solujen jälkeen infektion EZH2 erityisiä shRNA (SH1 tai SH2) tai kontrolli (NT) lentivirukselle (keskellä). Edustavia aloilla hyökkäsi ja värjättyjen solujen näkyvät (keskellä). Kukin pylväs esittää keskimääräistä ± S.E viiden kentät lasketaan (alhaalla). (D) Western blot analyysi yli-ilmentymisen villityypin (WT) ja mutantti (H689A, entsymaattisesti inaktiivinen) EZH2 proteiinien RWPE-1-solut infektoitiin EZH2 (WT) GFP, EZH2 (H689A) GFP, tai ohjaus (GFP vektori) lentiviruksen. EZH2 proteiinit ilmennettiin CMV-promoottori (vasemmalla). Invaasiomääritys of RWPE-1-soluja infektoitiin EZH2 (WT) GFP, EZH2 (H689A) GFP, tai ohjaus (GFP-vektorilla) lentiviruksesta (oikealla). (E) Haavan paranemista määritystä DU145 infektoitujen solujen EZH2 erityisiä shRNA (SH1) tai kontrolli shRNA (NT) lentiviruksen. Kuvat otettiin ennen (0 h) ja sen jälkeen haava (24 h) (ylhäällä). Tulokset ilmaistiin prosentteina jäljellä alueen määritetään normalisoimalla alueen haavan 24 tunnin kuluttua alkuperäisestä haava-alueella 0 h (asetettu 100%). Kukin pylväs edustaa keskiarvoa ± SE viiden kenttien mitattuna (alhaalla).

* P 0,05

,

** p 0,005 *** p 0,001

(verrattuna kontrolliarvoihin) .

tunnistetiedot loppupään kohdegeenien EZH2 liittyy etäpesäkkeitä eturauhassyövän

tunnistamiseksi etäpesäke liittyvien geenien joiden ilmaisuja säädellään EZH2, tutkimme geenien ilmentymisen muutoksia invasiivisia eturauhassyövän soluissa, sen jälkeen EZH2 pudotus. Expression eri mRNA eturauhassyövän soluissa arvioitiin käyttäen ihmisen kasvaimen etäpesäke RT

2

Profiler

™ PCR Array (PAH-028D) suunniteltu edustamaan 84 geenejä tiedetään olevan osallisena etäpesäkkeitä (kuviot 2A ja 2B). Tulokset osoittivat, että ilmentyminen 12 ja 32 geenien muuttunut 2-kertaisesti DU145 (taulukko S1) PC3 (kuviot S1A ja S1B ja taulukko S2) soluja, tässä järjestyksessä, knockdovvn EZH2 ilmaisun. Niistä geenit, TIMP-3 havaittiin olevan geeni, joka on korkeimmin yliaktiivista sekä DU145 ja PC3-solut (kuviot 2B ja S1B), mikä johtaa olettamukseen, että TIMP-3 voi olla ensisijainen tavoite tukahduttamisen EZH2. Tämän hypoteesin testaamiseksi, tutkimme proteiinien tasoja TIMP-3 ja EZH2 immunohistokemialla käyttäen anti-EZH2 ja anti-TIMP-3-vasta-aineita (kuvio 2C). Kuten kuviossa on immunovärjäys kuvia, TIMP-3-proteiinin tasot olivat korkeita normaalissa eturauhasessa kudoksissa (kuviot 2C-e ja 2C-f), mutta tuskin havaittavissa eturauhassyöpäkudoksille (kuviot 2C-g ja 2C-h). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin RT-PCR-analyysi, joka osoittaa, että TIMP-3 mRNA-tasot ovat huomattavasti vähentyneet PC3 ja DU145-soluissa, verrattuna RWPE-1-soluissa (kuvio S1C). Sen sijaan, EZH2 proteiinin tasot olivat erittäin korkeat eturauhassyöpäkudoksille (kuviot 2C-c ja 2C-d) verrattuna normaalissa eturauhasessa kudoksissa (kuviot 2C-a ja 2C-b). Nämä havainnot viittaavat siihen, että ilmaus TIMP-3 ja EZH2 korreloi käänteisesti, johtunee downregulation TIMP-3 ilmentymisen EZH2.

(A) RT

2 Profiler PCR array for Human tuumorietäpesäke geenejä DU145 soluissa jälkeen infektio EZH2 erityisiä shRNA tai ohjaus (NT) lentiviruksen. Sirontakuvaaja Testin

vs

vertailunäytteet osoittaa pätevyyden kokeen. (B) 12 geenit, joiden ilmaisuja ovat erittäin vaikuttavat EZH2 taintumisen esitetään (katso myös taulukot S1 ja S2). Kokonais-RNA eristettiin DU145-soluja sen jälkeen, kun tartunnan EZH2-erityisiä shRNA tai valvontaa (NT) lentivirus ja käsitelty PCR array (C) Immunofluoresenssi kuvia normaalin eturauhasen (Normaali 1 ja Normal 2) ja eturauhassyövän kudosleikkeiden (PCa1 ja pCA2 ), käyttäen anti-EZH2-vasta-aine (vihreä) ja anti-TIMP-3-vasta-ainetta (punainen). Tumat värjättiin DAPI (sininen).

alassäätely TIMP-3 ilmentymisen EZH2 eturauhassyövässä solulinjoissa

tutkittava tarkemmin transkription tukahduttaminen TIMP-3 ilmentymisen EZH2, me määritetään kvantitatiivisesti TIMP-3 mRNA ja proteiini tasoilla kolmella eturauhassyövän solulinjoissa (LNCaP, PC3 ja DU145) kanssa ja ilman knockdovvn EZH2 ilmaisua. TIMP-3-mRNA-tasot todettiin ~10-13-kertainen syöpäsoluja käsitellään EZH2-erityisiä shRNA (SH1) kuin kontrolli-solut käsittelemättömiä kanssa shRNA (kuvio 3A), ja sen seurauksena, TIMP-3-proteiinin tasot lisääntyivät merkitsevästi by knockdovvn EZH2 ilmentymisen (kuvio 3B). Sen sijaan yli-ilmentyminen funktionaalisen EZH2 (WT), mutta ei mutantti-EZH2-proteiinia (H689A), oli osoitettu vähentävän TIMP-3-mRNA: n ja proteiinin tasot RWPE-1-soluja (kuvio 3C). Down-regulation TIMP-3 ilmentymisen EZH2 on vahvistanut myös immunovärjäyksen TIMP-3 in DU145 soluissa tartunnan EZH2 erityisiä shRNA lentivirukselle (SH1) tai kontrolli (nontargeting shRNA) lentivirukselle (NT) (kuvio 3D). TIMP-3-proteiinin tasot olivat alhaiset DU145-soluissa (kuvio 3D-c), mutta merkittävästi kohonnut, jonka knockdovvn EZH2 ilmentymisen (kuvio 3D-h). Siten TIMP-3 voi olla kohde EZH2 sortotoimiin eturauhassyövän soluissa.

(A) qRT-PCR-analyysi ilmentymisen TIMP-3 eturauhasen syöpäsolujen (LNCaP, DU145, ja PC3) jälkeen infektion EZH2-spesifinen shRNA (SH1) tai kontrolli shRNA lentiviruksen (NT).

* P 0,05

,

** p 0,005

(verrattuna kontrolli (NT)). (B) Western blot analyysi endogeenisten tasojen EZH2 ja TIMP-3-proteiinin eturauhassyöpäsoluissa (LNCaP, DU145, ja PC3) infektoitiin EZH2-erityisiä shRNA (SH1) tai kontrolli shRNA virus (NT). Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. (C) Western blot (ylhäällä) ja qRT-PCR (alhaalla) analyysit ilmaisun EZH2 ja TIMP-3 on hyvänlaatuista eturauhasen RWPE-1-soluissa, kun infektio EZH2 (WT) GFP, EZH2 (H689A) GFP tai valvonta (GFP vektori) lentiviruksen. Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina.

* P 0,05

,

** p 0,005

(verrattuna kontrolli (vektori)). Kiinteä nuoli osoittaa EZH2-GFP ilmentyy CMV-promoottori, pilkullinen nuoli osoittaa endogeenisen EZH2. (D) immunovärjäys EZH2 ja TIMP-3 ilmaistu DU145 infektoiduissa soluissa EZH2-erityisiä shRNA (SH1) tai kontrolli (NT) lentivirusta käyttäen anti-EZH2-vasta-aine (vihreä) ja anti-TIMP-3-vasta-ainetta (punainen). Tumat värjättiin DAPI (sininen). Sulautuneen kuvat olivat osoittaneet (EZH2 /TIMP-3 ja DAPI /TIMP-3).

Epigeneettiset vaiennettu TIMP-3 ilmentymisen EZH2

EZH2 on osa PRC2 joka katalysoi trimethylation of H3K27 ( 3meH3K27) [24], [25]. Tutkia taustalla mekanismi epigeneettiset tukahduttaminen TIPM3 mukaan EZH2, tutkimme vaikutukset histoni metylaation estäjä 3-deatsa-naplanocin A (DZNep) on ilmaus TIMP-3. DZNep hoito johti alentuneet TIMP-3-proteiinin (kuvio 4A), luultavasti aiheuttaa derepressiota TIMP-3 ilmentymistä (kuvio 4B). Lisäksi invasiivisia potentiaalia PC3-soluja oli -5-kertaisesti vähentynyt DZNep käsittely (kuvio 4C).

(A) Western blot -analyysi endogeenisten tasojen EZH2, TIMP-3 ja 3meH3K37 eturauhasen syöpäsolujen (PC3 solu) käsittelyn jälkeen DZNep (5 uM) tai DMSO (kontrolli) ja 2 päivää. Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. (B) qRT-PCR-analyysi ilmentymisen TIMP-3 PC3-soluissa, joita käsiteltiin DZNep (5 uM) tai DMSO (kontrolli). (C) invaasiomääritys PC3 käsiteltyjen solujen DZNep (5 uM) tai DMSO (kontrolli).

Tutkia edelleen molekyylitason mekanismi transkription tukahduttaminen TIMP-3 ilmentymisen EZH2 teimme ChIP määritykset in DU145 ja PC3-soluissa käyttäen anti-EZH2 ja anti-3meH3K27 vasta-aineita. Koska PcG-proteiinien rekrytoidaan DNA: lla DNA: ta sitovan proteiinin YY1 [45], immunosaostetun DNA analysoitiin PCR: llä alukkeella, jotka on suunniteltu monistamaan alueet sisältävät YY1-sitoutumiskohdat

TIMP-3

promoottori ( kuvio 5A). Tulokset osoittavat, että: 1) EZH2 sitoutuu

TIMP-3

promoottorin ja katalysoi trimethylation of H3K27 (3meH3K27) (kuviot 5B ja 5C), mutta ei sitoudu

GAPDH

promoottorin, tarjoillaan negatiivisena kontrollina (kuvio 5C); 2) RNA-polymeraasi II (RNAP II) sitoutuu voimakkaasti

GAPDH

promoottori mutta ei ole merkittävää sitoutumista

TIMP-3

promoottori (kuvio 5C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että EZH2-välitteinen trimethylation on H3K27 estää RNAP II sitoutumisen

TIMP-3

promoottorin ja siten johtaa transkription hiljentämisen geenin.

(A) Kaavamainen esitys promoottorialueen on

TIMP-3

geeni. Taivutettu nuoli edustaa transkription aloituspaikkoja (+1). Linjat alla

TIMP-3

lokus ilmaisevat alueet monistettiin PCR: llä. (B-C) immunosaostettiin DNA analysoitiin PCR erityisiä alukesarjoista (katso myös taulukko S3). Kromatiinin saatu PC3 (B) ja DU145 (C) solut immunosaostettiin käyttäen vasta-aineita EZH2, trimetyyli-histoni H3K27 (3meH3K27), RNA-polymeraasi II (Pol II), ja IgG. Immunosaostetut DNA analysoitiin PCR: llä alukesarjoja alueen monistamiseksi 4 kuviossa 5A.

GAPDH

promoottoria käytettiin negatiivisena kontrollina. Kukin ChIP koe toistettiin vähintään kolme kertaa, ja edustavasta kokeesta on esitetty. (D) Epigeneettiset sääntely TIMP-3 ilmentymisen PC3-soluissa. ChIP määritys suoritettiin käyttäen vasta-aineita EZH2, 3meH3K27, MeCP2, RNAP II (Pol II), ja IgG-ohjaus käsittelyn jälkeen DZNep (1 uM), 5-atsa (10 uM), DMSO (kontrolli), tai EZH2- erityiset shRNA (shRNA1). Immunosaostetut DNA analysoitiin PCR: llä alukesarjoja alueen monistamiseksi 4 kuviossa 5A. (E) qRT-PCR-analyysi ilmentymisen TIMP-3 PC3-soluissa hoidon jälkeen DZNep (1 uM), 5-atsa (10 uM), tai DMSO (kontrolli) ja 2 päivää. Kokeet toistettiin vähintään kaksi kertaa ja tulokset ilmaistiin suhteena TIMP2 tai TIMP-3 mRNA GAPDH mRNA valvontaa.

* P 0,05

,

** p 0,005

(verrattuna kontrolli (DMSO)).

Seuraava ratkaistava, onko H3K27 trimethylation kytketään promoottori DNA: n metylaatio varten tukahduttamisesta TIMP-3, käsittelimme PC3-solujen kanssa DZNep tai DNA metylaatio estäjä 5-atsa seurasi ChIP analyysi. EZH2 Knockdown tai DZNep hoito selvästi esti sekä H3K27 trimethylation ja DNA: n metylaatio (MeCP2, metyyli CpG sitova proteiini 2) on

TIMP-3

promoottori; Sitä vastoin 5-atsa hoito esti vain DNA: n metylaatio, mutta ei ollut merkittävää vaikutusta H3K27 trimethylation promoottorin (kuvio 5D). Lisäksi hoito PC3 solujen DZNep tai 5-atsa johti derepressiota TIMP-3 lausekkeen lähes samassa määrin (kuvio 5E). Näin ollen, nämä tulokset viittaavat siihen, että transkription tukahduttamisen

TIMP-3

geenin tapahtuu läpi EZH2-välitteisen H3K27 trimethylation ja sen jälkeen DNA: n metylaation.

Epigeneettiset hiljentäminen TIMP2 ilmentymisen EZH2

me tutkimme seuraavaksi, kuten TIMP-3, muut kolme TIMP (TIMP1, TIMP2 ja TIMP4) on transkriptionaalisesti tukahdutettu EZH2. Meidän RT-PCR-analyysi osoitti, että TIMP1 ei säännelty EZH2, kun taas TIMP4 tukahdutettiin kun EZH2 ilmaisua pudotettiin (kuva 6). Sen sijaan, TIMP2 ekspressio lisääntyi merkitsevästi EZH2 pudotus, mutta ei kasvanut, kun mutantti EZH2-proteiinia (EZH2-H689A) on ilmaistu. Meidän ChIP tutkimukset osoittavat, että TIMP2, kuten TIMP-3, sovelletaan myös EZH2 välittämää histoni metylaatio ja myöhemmät promoottori DNA: n metylaatio (kuva 7). Down-regulation

TIMP2

geenin eturauhassyövän soluissa osoitettiin liittyvän promoottori metyloinnin [13], mikä viittaa siihen, että epigeneettiset sääntelyn tekijät, kuten HDAC ja DNMT, voi olla mukana säätelyyn TIMP2. Tuloksemme osoittavat, että epigeneettisten modifiointiaine EZH2 voi olla tekijä, joka välittää epigeneettisellä inaktivointi TIMP2.

(A-C) qRT-PCR-analyysi ilmentymisen

TIMP

geenejä (A, TIMP1; B, TIMP2, C, TIMP4) eturauhasen syöpäsolujen (LNCaP, DU145, ja PC3) sen jälkeen, kun tartunnan EZH2-erityisiä shRNA (SH1) tai kontrolli shRNA lentiviruksen (NT).

* P 0,05

,

** p 0,005

(verrattuna kontrolli (NT)). (D-F) qRT-PCR-analyysi ilmentymisen

TIMP

geenien (D, TIMP1, E, TIMP2, F, TIMP4) on hyvänlaatuinen eturauhasen solulinja RWPE-1 sen jälkeen, kun tartunnan EZH2 yliekspressioon lentiviruksen ( WT tai H689A) tai kontrolli-virusta 4 päivää. Tulokset ilmaistiin suhteena

TIMP

mRNA: t

GAPDH

mRNA ohjaus.

* P 0,05

,

** p 0,005

(verrattuna kontrolli (GFP)).

(A) Kaavamainen esitys promoottorialueiden

TIMP2

geeni. Taivutettu nuoli edustaa transkription aloituspaikkoja (+1). Linjat alla

TIMP2

lokus ilmaisevat alueet monistetaan PCR: llä käyttäen alukesarjoja (set 1, asettaa 2, ja asettaa 3 (B); asetettu 2 (C) ja (D)) suunniteltiin monistamaan alueet sisältävä YY1 sitovat kohdat (katso taulukko S3). (B-C) Kromatiini immunosaostuksella (ChIP) kokeet suoritettiin kromatiinin eristetty PC3 (B) ja DC145 (C) solut käyttäen vasta-aineita EZH2, 3meH3K27, ja IgG. Tulokset meidän siru sekä PC3 ja DU145 solut ovat hyvin lähellä toisiaan. On esitetty ChIP tuloksia DU145 soluissa. (D) Epigeneettiset sääntely TIMP2 ilmentymisen PC3-soluissa. ChIP määritys suoritettiin käyttäen vasta-aineita EZH2, 3meH3K27, MeCP2, RNAP II (Pol II), ja IgG-ohjaus käsittelyn jälkeen DZNep (1 uM), 5-atsa (10 uM), DMSO (kontrolli), tai EZH2- erityiset shRNA (shRNA1). (E) qRT-PCR-analyysi ilmentymisen TIMP2 PC3-soluissa hoidon jälkeen DZNep (1 uM), 5-atsa (10 uM), tai DMSO (kontrolli) ja 2 päivää. Kokeet toistettiin vähintään kaksi kertaa ja tulokset ilmaistiin suhteena

TIMP2

mRNA

GAPDH

mRNA ohjaus.

* P 0,05

,

** p 0,005

(verrattuna kontrolli (DMSO)).

Transcriptional tukahduttaminen TIMP-3 by EZH2 edistää hyökkäys eturauhasen syöpäsolujen

arvioimiseksi välinen toiminnallinen yhteys downregulation TIMP-3 by EZH2 (kuvio 3) ja laski invasiivisen fenotyypin eturauhasen syöpäsolujen EZH2 pudotus (kuviot 1C ja 1D), me yli-ilmennetään EZH2 ja TIMP-3 erikseen tai yhdessä RWPE-1-soluissa (kuvio 8A) ja tutkittiin invasiivisen aktiivisuuden soluihin käyttämällä Transwell Boyden kammion määrityksessä (kuvio 8B). Invasiivista fenotyyppi RWPE-1-soluissa indusoitiin EZH2 yli-ilmentymisen kuten edellä on esitetty (kuvio 1 D), mutta se oli merkitsevästi tukahdutettiin cooverexpression of TIMP-3 (kuvio 8B), joka antaa suoraa näyttöä siitä, että tukahduttaminen TIMP-3 by EZH2 johtaa lisääntyneeseen invasiivisia toimintaa eturauhasen syöpäsoluja.

(A) Western blot -analyysi EZH2 ja TIMP-3 ilmentymistä RWPE-1-soluissa sen jälkeen, kun tartunnan kanssa osoitti yhdistelmiä lentivirus ilmentävien EZH2, TIMP-3 ja valvonta-virus. (B) Invasion määritystä RWPE-1-soluissa, kun infektio ilmoitetuilla yhdistelmillä lentivirusta ilmentävien EZH2, TIMP-3 ja valvonta virus. Top: a, EZH2 (-) /TIMP-3 (-); b, EZH2 (-) /TIMP-3 (+); c EZH2 (+) /TIMP-3 (-); d, EZH2 (+) /TIMP-3 (+). (C) liivate tsymografisen määritys MMP-2 ja MMP-9: n aktiivisuutta PC3 ja DU145-soluja infektoitiin EZH2-erityisiä shRNA (SH1) tai kontrolli shRNA virus (NT). Ylempi ja alempi vanteet osoittavat aktiivisen MMP-9 (92 kDa) ja aktiivisen MMP-2 (62 kDa), vastaavasti. Tsymografisen kaistaintensiteettejä kvantitoitiin densitometrillä käyttämällä Määrä Yksi ohjelmisto (Bio-Rad). Kukin pylväs esittää keskimääräistä ± S.E kolmesta kentästä laskettiin.

* P 0,05

,

** p 0,005

,

*** p 0,001

(verrattuna kontrolli (NT)).

MMP-2 ja MMP-9 tiedetään olevan merkittävä MMP vastaavan ECM hajoamista, ja siten testasimme, onko entsymaattinen aktiivisuus näiden kahden MMP säätelee EZH2 käyttämällä gelatiinitsymografialla määritystä. MMP-2 aktiivisuus havaittiin ei muuteta merkittävästi EZH2 knockdown. Kuitenkin MMP-9-aktiivisuus väheni noin 28% PC3-soluissa ja -50% vuonna DU145 soluissa, vastaavasti, käsiteltiin EZH2 erityisiä shRNA verrattuna säätökennoja (NT) (kuvio 8C). Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että EZH2 välittämää transkription tukahduttamisesta TIMP-3 suoraan johtaa aktivoitumiseen MMP-9.

Keskustelu

Tasapaino MMP ja TIMP on kriittinen parametri hajoamista ECM ja täten ratkaiseva askel syövän eteneminen ja metastaasit. Tässä tutkimuksessa osoitamme, että poikkeava voimistumista EZH2 ilmentymisen eturauhassyöpäsoluissa siirtää tämän tasapainon kohti MMP ja siten edistää hajoamista ECM. EZH2 tekee tämän vähen- tämisessä ilmaus

TIMP

geenejä (

TIMP2

ja

TIMP-3

). TIMP2 ja TIMP-3, verrattuna TIMP1 ja TIMP4, estävät laajan kirjon MMP ja useiden disintegriini- metalloproteinaasien, Adamsin ja ADAMTSs [12]. Lisäksi TIMP-3 on ainoa jäsen, TIMP perheen tiukasti sitoutuu ECM ja on siten osallisena patogeneesissä [9], [10]. TIMP-3 on myös estävä vaikutus angiogeneesiä tukos VEGF sitoutumisen VEGF-reseptori-2 [46], ja kyky edistää apoptoosia [47] – [49]. Siksi transkription tukahduttaminen TIMP2 ja TIMP-3 by EZH2 todennäköisesti lisää ECM hajoamista ja angiogeneesiä, mutta vähentää apoptoottista aktiivisuutta, joka suosii syöpäsoluinvaasiota ja etäpesäkkeiden.

Läsnäolo tai kohonnut kuvaamaan joitakin MMP positiivisesti liittyy syövän etenemiseen [3], [50]. Meidän etäpesäke PCR erilaisia ​​analyysi osoittaa, että jotkut

MMP

geenejä, kuten

MMP7

ja

MMP-13

, PC3-solut merkittävästi vaimentua mukaan knockdovvn EZH2 ilmaisun (kuva S1) . Näin ollen, EZH2 näyttää toimivan aktivaattorina, sen sijaan, että repressorin, ilmentymisen näiden geenien. Näitä tuloksia ei ole selvästi havaittavissa DU145-soluissa, johtuen ehkä eri geneettisissä taustoissa kahden solulinjojen [51]. Vaikka transkription MMP geenien EZH2, joka oli pois kuulu tämän tutkimuksen, on parhaillaan tutkittavana, tuloksemme tukevat mahdollisuutta, että yliekspressio EZH2 metastaattisessa eturauhassyövän solut voivat nostaa yleistä MMP toimintaa sekä vähentämällä tasot TIMP (TIMP2 ja TIMP-3), ja lisäämällä veren tiettyjen MMP: iden, kuten MMP-9.

Promoottori DNA: n metylaatio on yleisin epigeneettisiä muutoksia, jotka liittyvät geenien syövän. EZH2 näyttää rekrytoida DNMTs sen kohdegeenien, jolloin metylaatio vierekkäisten CpG-saarekkeiden ja myöhemmät geenien [37]. Tässä mallissa, EZH2-välitteinen H3K27 metylaatio saattaa olla edellytys promoottori-DNA: n metylaation. Tuloksemme tukevat tätä ajatusta, koska olemme havainneet, että

TIMP2

ja

TIMP-3

, kuten muutkin EZH2 kohdegeenien, kuten

MSMB

[31],

RUNX3

[52], ja

SLIT2

[39], on vaimennettu kautta histoni (H3K27) metylaatio, jota seuraa DNA: n metylaatio (kuviot 5 ja 7). Kuitenkin promoottori DNA metylaatio ei aina tarvita tukahduttamisen EZH2 kohdegeenien. Esimerkiksi, EZH2-välitteisen hiljentäminen E-kadheriinin geenin tapahtuu läpi H3K27 metylaatio, mutta ei edellytä, promoottori-DNA: n metylaatio [38]. Lisäksi H3K27 trimethylation ei liity promoottori DNA: n metylaatio hiljentää huomattavan määrän EZH2 kohdegeenien eturauhassyövässä [41]. Siksi tarvitaan lisätutkimuksia erottamaan nämä mekanismit.

Jotta syöpäsolujen etäispesäkkeitä, niiden on irrottautua normaalista fyysiset esteet, maahanmuuttoon ja invaasio, kuten ECM ja solu-soluadheesion. Lisäksi hajoaminen ECM päästöjen molekyylejä, jotka liittyvät ECM, kuten kasvutekijöitä ja sytokiinejä, jotka vaikuttavat huomattavasti etäpesäke [53]. Siten ECM hajoamista MMP on ratkaisevan tärkeää paitsi poistamalla esteitä, vaan myös tehdä molekyylejä saatavilla syöpäsoluja. Kuten osoitettu tässä tutkimuksessa, EZH2, joka toimii mahdollisena onkogeenin oli erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, on aktiivinen rooli ylösajon MMP toimintaa ja edistää ECM hajoamista ja myöhempi hyökkäys eturauhassyöpäsolujen, saada aikaan uusi käsitys roolin EZH2 vuonna eturauhassyövän etäpesäkkeiden.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Kaikkia solulinjoja käytettiin tässä tutkimuksessa saatiin American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). PC3, DU145 ja LNCaP-soluja viljeltiin RPMI 1640: ssä, jossa oli 10% FBS: ää ja penisilliini /streptomysiinillä, 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, jossa 5% CO

2. RWPE-1-soluja viljeltiin keratinosyyttien seerumittomassa elatusaineessa (K-SFM), joka sisälsi 50 ug /ml naudan aivolisäkeuutetta ja 5 ng /ml epidermaalista kasvutekijää, kuten aiemmin on kuvattu [43].