Krooninen sairaus

tiivistelmä

Colon syöpä on toiseksi yleisin syy syövän kuolleisuus länsimaissa metastasiaa yleisesti läsnä diagnoosin ajankohtana. Seulonta lisäykseen ja metastaattisen käyttäytymistä uusia kimeerisiä-hiiri paksusuolensyöpä malli vetämänä mutantti p53 ja β-kateniinin, johti tunnistamiseen ainutlaatuinen, invasiivisia adenokarsinooma. Vertailu genomin tämän kasvaimen, CB42, jossa genomit ei-lisäys kasvainten array CGH ja sekvensointi paljasti amplikoni kromosomissa viisi sisältävät CDK6 ja CDK14, ja KRAS mutaatio, vastaavasti. Yhden agentti pienimolekyylisiä esto joko CDK6 tai MEK, kinaasi alavirtaan KRAS, johti kasvaimen kasvun estäminen in vivo taas yhdistelmähoito paitsi johti taantumisen ihonalaisen kasvaimia, mutta myös lähellä täydelliseen estymiseen keuhkometastaasitestissä; Näin ollen, genominen analyysi tämän kasvaimen johti tehokkaita, yksilöllisiä hoito.

Citation: Zhou Y, Rideout WM III, Bressel A, Yalavarthi S, Zi T, Potz D, et al. (2014) spontaani Perimän Muutokset Kimeerisen Model paksusuolisyövän Enable etäpesäke ja Guide Tehokas Kombinatoriset Therapy. PLoS ONE 9 (8): e105886. doi: 10,1371 /journal.pone.0105886

Editor: Sandra Orsulic, Cedars-Sinai Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 09 huhtikuu 2014; Hyväksytty: 24 heinäkuu 2014; Julkaistu: 27 elokuu 2014

Copyright: © 2014 Zhou et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tämä työ oli kokonaan rahoittamia AVEO Pharmaceuticals. AVEO Pharmaceuticals on /oli työnantajan kaikkien kirjoittajat paitsi Marcus Bosenberg. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Tämä työ oli kokonaan rahoittamia AVEO Pharmaceuticals Inc. Marcus Bosenberg oli maksettu konsultti AVEO. Kaikki muut kirjoittajat ovat joko nykyisiä tai entisten työntekijöiden AVEO Pharmaceuticals. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen PLoS One politiikkaa jakaa tietoja ja materiaaleja.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on yksi neljästä yleisin ja tappava kasvain tyypit aiheuttavat noin 53000 kuolemaa vuosittain pelkästään Yhdysvalloissa. Onneksi on edistytty vastaan ​​CRC koska sekä esiintyvyys ja kuolleisuus tästä kasvaintyyppi ovat laskeneet viimeisen vuosikymmenen aikana noin 2-3% vuodessa. Tästä huolimatta yleinen edistyminen, keskimäärin viisi vuotta eloonjäämisaste vaiheessa 4 metastasoituneen kolorektaalisyövissä on edelleen synkkä 12,5% [1]. Monet geneettiset muutokset, jotka vaikuttavat CRC on tunnistettu, mukaan lukien mutaatiot, jotka inaktivoivat tuumorisuppressorigeeneille (esim p53 ja APC mutatoitunut 52% ja 76% kasvaimia, vastaavasti) tai aktivoi onkogeenien (esim KRAS ja BRAF mutatoitunut 42% ja 10% kasvaimet, vastaavasti) [2], [3]. Potilaat, joilla on vaiheen 3 tai 4 CRC tarvitsevat tehokkaampaa ja vähemmän myrkyllisiä hoidot parantaa selviytymistä ja elämänlaatua. Kuten paremmin kohdennettuja terapeuttiset tulevat saataville, kliiniset kokeet ovat osoittaneet, että monet niistä ovat vain vähän tehokkaita, kun niitä käytetään monoterapiana. Sen sijaan jotkut ovat merkittävästi parempia tuloksia, kun se yhdistetään olemassa olevien kemoterapeuttisten tai muita kohdennettuja lääkkeitä [4], [5]. Jotta paremmin seuloa huumeiden yhdistelmiä niille, jotka saadaan suurin hyöty, tarkka ja ennustavia malleja. Geneettisesti hiiri malleja CRC on kehitetty viimeisten kahden vuosikymmenen aikana pääasiassa inaktivoimiseksi tuumorisuppressorigeeneille (esim APC1638N, [6] katsausta varten katso [7]). Olemassa prekliinisissä, CRC syksyllä pääasiassa neljään ryhmään: vakiintuneesta solulinjasta ksenografteja, potilas johdettu ksenograftit (PDX), ituradan geneettisesti hiiren malleissa (GEMMs) ja Cre-Lox ehdollinen GEMMs. Jokainen malli järjestelmien on omat etunsa ja haittansa kanssa solulinja ksenografteissa on helpoin suorittaa, mutta useimmat kaukaista sukua primaarikasvaimen isännässä, kun taas toisessa ääripäässä Cre-Lox aktivoitu GEMMs syntyä haluttu kudoksessa immunokompetenteilla isäntä.

viime kerääminen ja etenemistä kasvaimia suoraan potilailta on tuottanut uusia PDX resursseja pitävien suurempi kasvain heterogeenisyys, sekä histologisesti ja geneettisesti [8]. Kuitenkin perustaminen ihmisen kasvaimista immuunipuutteisilla hiirillä kykenee selektiivinen paine sekä sopeutumista hiiren isäntä ja yleensä kohdun päällä (eli ihonalainen). Tämän luonnostaan ​​rajoittaa joukko vuorovaikutusta, joka tavallisesti välillä tapahtuu kasvain, strooman ja hematopoieettisen järjestelmän. Useissa tutkimuksissa etenemistehokkuus potilaan johdetun materiaalin immuunipuutteisilla hiirillä on sekoitettu, raportteja jopa 77% hyvin kehittyneen ihmisen koolontuumoreissa etenevän nude-hiirissä [9].

GEMMS voitettava monia rajoitukset ksenograftien. Nykyinen GEMMs paksusuolisyövän kehittää kasvaimia lyhyessä ajassa vetämänä ominaisuus mutaatiot ratkaiseva onkogeenien ja kasvainten synnyssä (katso katsaus [7]). Jotkin nykyiset hiiri malleja paksusuolisyövän, jotka työllistävät asiaan RAS mutaatioita, ovat tarjonneet tietoa mahdollisista lääkkeiden vastauksista [10]. Meidän tapa luoda GEMMs liittyy ei-ituradan, hiiri-kimeeran pohjainen järjestelmä, jonka olemme onnistuneet tuottamaan monimutkaisia ​​malleja syövän, kuten rinta- ja keuhkosyöpä mallit [11], [12]. Meidän kantasolujen lähestymistapa mahdollistaa nopean sukupolven uusien doksisykliini indusoitavissa malleja, joissa on useita geneettisiä muutoksia ilman ylittämään kasvattaa modifioidun alleelit yhdessä. Kasvaimet Näiden mallijärjestelmiin on lisättyjä allotransplantaatteja ja käytetään tuottamaan arkistoon kasvaimen materiaalia sallien siten mahdollisen tarkastelun lääkevaste ja korrelaatio, joka vaste kasvainten ominaisuuksiin [12], [13]. Molecular karakterisointi microarray ja array vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH) analysoi näiden lisätyistä kirjastojen kasvaimia ovat osoittaneet, että kasvaimen ylimääräinen edistäminen mutaatioita oli tapahtunut tuumorilinjoja vaikuttaa niiden kasvuvauhti, etäpesäke, ja vastaus terapeuttisia [12], [13] , [14]. Vaikka erilaisia ​​biomarkkereiden geeniekspression näytöt ovat yhä käyttökelpoisia ohjaamaan terapiassa Meneillään olevissa kliinisissä tutkimuksissa (esim 21, 50, 70 ehdokasta vastaavasti Oncotype Dx, PAM50, ja Mammaprint [15]) ja seuraavan sukupolven sekvensointi tunnettujen syövän geenien (n = 236) alkaa ohjata hyödyllisiä valinnan terapiaa laajan valikoiman kasvaintyypeille [16], kasvava edullisuus genomin laaja seulonta ilmaisun, kopioiden määrä, ja sekvenssi voi tarjota puolueettoman lähestymistavan määrittämiseksi tehokas syövän hoidossa.

tässä artikkelissa kuvataan prosessia tekemällä ES-solujen mallia paksusuolisyövän ohjaavat p53-mutaation, ja indusoituva aktivoitu β-kateniinin (

CTNNB1

).

CTNNB1

mutaatioita esiintyy 5% ihmisen CRC ja ilman vastaavaa mutaatiot

APC

[2] erityisesti perinnöllinen polypoottinen peräsuolen syöpä (HNPCC) potilailla, joilla taajuus

CTNNB1

mutaatio nousu [17]. Kasvaimet, jotka syntyvät näistä ES-solujen perustuvia malleja sisältävät samanlaisia ​​geneettistä taustaa ja alkuperäisen kuljettajan mutaatioita; kuitenkin, ne ovat yleensä hankkia de novo mutaatioita ja kopioluvun vaihtelut aikana tuumorigeneesin jotka luovat rajoitettu monimuotoisuus, jotka voivat vaikuttaa hoitovasteen. Β-kateniinin (ΔN131) -indusoituun malli esittelemme tässä syntyy uusia oivalluksia geneettisiin muutoksiin tarvittavista hiiren kasvaimen eteneminen, etäpesäke, ja huumeiden vastaus.

Tulokset

ES Solupohjaisten chimera paksusuolen malli

aiemmin raportoitu uusi lähestymistapa mallintamiseen syövän kehityksen hiirillä käyttäen ES-solujen kimeeroita. Verrattuna tavanomaiseen ituradan siirtogeenisiä malleja, yksi tärkeimmistä eduista kimeeristen lähestymistapa on, että se mahdollistaa solujen kätkeminen kasvaimia synnyttävän mutaatioita rinnalla viereisiin soluihin, jotka ovat geneettisesti villityypin, parempi matkien onkogeenisel- prosessi ihmisen syövissä. Poistaminen APC, tunnettu kasvain vaimennin, on keskeinen tapahtuma paksusuolen syövän etenemisessä. Inaktivointi APC johtaa kohonnut ydin- β-kateniinin tasoja, mikä estää pääte erilaistumista ja edistää leviämistä. Tuottaa paksusuolen malli ES solulinjojen aloitimme kanssa INK4a +/- rivi (H12C23) ja peräkkäin muutettu kaksi p53-alleelit: ensimmäinen p53 alleeli ehdoksi lisäämällä loxP reunustavat eksonit 2-7, joka muuttuu toiminnalliselta alleeli on nolla-alleelin kun Cre välittämä rekombinaationa Toisen p53-alleelin on lox-stop-lox kasetti työnnetään introni 1 yhdistettynä R172H eksonissa 5 mikä johtaa ilmentymä onkogeenisessä version p53 jälkeen Cre-välitteistä poistaminen lopettaa kasetin. Seuraavaksi GAPDH-lox-stop-lox-rtTA-IRES-lusiferaasi kasetti (aktivaattori /markkerikasetin) rakennettiin, joka aktivoituna Cre, ilmaisee rtTA (reverse tetrasykliiniä trans-aktivaattori) ja Luciferase samanaikaisesti. Lopuksi, ES-solut kotransfektoitiin konstrukteja GAPDH-lox-stop-lox-rtTA-IRES-lusiferaasia, villiini-Cre ja TetO-β-kateniinin (ΔN131), joka on katkaistu versio β-kateniinin, josta puuttuu alue joka sitoo APC /ak- siini monimutkainen ja konstitutiivisesti kerääntyy tumaan. Muissa kuin maha-suolikanavan epiteelisolut tuloksena kimeerojen villiiniä promoottori on hiljainen, ja näin ollen Cre ei ilmaista. Tässä tapauksessa yksi p53 alleeli säilyy villin tyypin ja rtTA aktivaattori kasetti on aktiivinen (Kuva. 1 ES solu). Kohdesoluissa suolen epiteelissä, jossa villiini promoottori ohjaa Cre ilmentymistä, ainoastaan ​​mutantti p53 voidaan ekspressoida ja aktivaattori kasetti näihin rtTA ja lusiferaasi ja sen vuoksi, β-kateniinin (ΔN131) ilmentyminen voidaan spesifisesti indusoida näissä soluissa doksisykliiniä (kuvio . 1 GI solu ja GI solu + DOX).

A). ES-soluissa: 3 siirtogeenisiä kasetit istutettiin: villiini-Cre, GAPDH-lox-stop-lox-rtTA-IRES-lusiferaasia, ja TetO- β-CateninΔN131; kaikki kolme vaieta ES-soluissa. Lisäksi yksi p53-alleeli Floxed ja ilmaisee villityypin p53 ES-soluissa ja toinen alleeli kohdennettiin lox-stop-lox ja R172H pistemutaatio, joka on toiminnallisesti null ES-soluissa. B). Maha-suolikanavan epiteelin, ilmaus Cre johtaa poistetaan kahden lox-stop-lox-kasetit sekä floxed p53-alleeli. p53 lauseke vaihtaa villityypin mutanttimuotoon, ja ilmaus rtTA ja Luciferase kytkeytyy päälle. C). kun läsnä on doksisykliini, rtTA tulee sitoutuvat TetO-promoottorin ja transkription aktivoimiseksi ja β-CateninΔN131.

Kaksikymmentä ES-klooneja positiivisia kaikkien viiden geneettisten elementtien injisoitiin blastokysteihin tuottaa kimeerojen, joka annettiin 2500 ppm Doksisykliini ruoka vieroituksen jälkeen. Induktion jälkeen 2-4 viikon ajan, kutakin ES linja, 2-3 kimeerit 80% kimerismiä mukaan turkin värin tapettiin ja kudokset kerättiin 3 eri alueilla suolistossa. Analysoimme ilmentyminen Cre, rtTA, ja β-kateniinin by qRT-PCR: llä ja rekombinaatio p53-alleelien ja aktivaattori kasetti PCR: llä. Nämä analyysit tunnistettu 5 geneettisesti ja toiminnallisesti validoituja ES linjat (91A2, 91C5, 91D3, 91F5, ja 91F7) lisätutkimuksia varten (tietoja ei esitetty).

β-kateniinin induktio paksusuolen epiteelin johtaa invasiivisia adenokarsinoomat

sata ja kaksikymmentä yhdeksän kimeerisiä hiiriä luotu käyttäen 5 validoitu paksusuolen malli ES solulinjojen ja ruokitaan doksisykliini ruoan vieroituksen jälkeen. 3 kuukauden kuluttua induktio, me seulotaan piilevän veren kuukausittain ja hiiret positiivinen 2 peräkkäistä kuukautta tarkkailtiin päivittäin ja tapettiin, kun laihtuminen havaittiin. Suolistossa leikattiin pituussuunnassa, huuhdeltiin PBS: ssä poistaa ulostetta, niin litistetty paperipyyhkeellä ja skannattu alle stereoscope polyypit ja kasvaimia.

Neljäkymmentä-neljä prosenttia kimeerisiä hiiriä induktiossa doksisykliini kehittyi suoliston neoplastisia vaurioita kuluessa 3-17 kuukautta mediaani kasvain latenssi 11 kk (Fig. 2B, ja taulukko 1). Bioluminescent kuvantaminen osoitti lisääntynyt Lusiferaasiaktiivisuutta alavatsan alueella kasvaimen kantavien hiirten (Fig. 2A). Näissä hiirissä, tunnistimme keskimäärin 2-3 uudisvaurioiden hiirtä kohden; histologinen analyysi vahvisti 60% leesioiden polyypit, 25% kuten adenoomien ja 15%, kuten adenokarsinoomat (Fig. 2C). Mielenkiintoista on, että alussa leesioita (polyyppien ja adenoomia) havaittiin yhtä sekä ylemmän ja alemman suolikanavan ottaa huomioon, että suurin osa (85%) kehittyneitä vaurioita havaittiin paksusuolessa. Adenokarsinomia vaihteli 2-8 mm halkaisijaltaan ja muistuttivat ihmisen koolontuumoreissa histologisesti. Invaasion osa-limakalvo havaittiin 70% adenokarsinoomien (Fig. 2C). Nämä tulokset osoittivat, että ydin- β-kateniinin, yhdessä p53-mutaatio, oli riittävä ajamaan pahanlaatuinen kasvain kehitystä ruoansulatuskanavasta.

A). Bioluminescent kuvantaminen kolmen kimeeristen hiirten kolmen kuukauden kuluttua doksisykliinin induktio. Luminescent signaaleja havaittiin alavatsan alueella kaksi hiirtä. B). Kaplan-Meyer käyrä latenssi paksusuolen kasvainten kehittymistä kimeerisiä hiiriä. C). Histologinen vertailu normaalia ruoansulatuskanavassa, hyvänlaatuinen polyypit, ja adenokarsinooma mistä kimeerisiä hiiriä. D). Kemialliset kolorimetrinen värjäys Mucin ja immunohistokemiallinen värjäytyminen β-kateniinin, Ki-67, ja sykliini D1 normaalissa GI epiteelin, polyypit ja adenokarsinooma.

Molecular luonnehdinta β-kateniinin ajettu koolontuumoreissa

analyysi immunohistokemiallisesti ehdokas proteiinien β-kateniinin perustuva primaarikasvaimia osoitti aktivoitumista useiden reittien tiedetään olevan rooli paksusuolen kasvainten synnyssä. Normaalit paksusuolen epiteelin muodoissa hyvin organisoitu krypta-villus yksikköä (Fig. 2C), jossa jaetaan esisolut sijaitsevat kryptassa alueella ja eriytetty ei-jakamalla solujen villus osoituksena rajoittaminen Ki-67 ja sykliini D1 positiivisia soluja kryptassa. Vaikka membranous β-kateniinin havaitaan kaikissa epiteelisolujen, ydin- β-kateniinin löytyy vain 20-30% soluista sisällä crypt (Fig. 2D). Sen sijaan normaalin krypta-nukkalisäkkeen rakenne oli kadonnut sekä polyyppien ja invasiivisia adenokarsinoomat. p-kateniinin värjäys enää rajoitu kalvoon; sijaan 80-90% soluista osoitti sytoplasmista ja ydin- β-kateniinin positiivisuutta. 60-80%: n kasvainten solut osoittivat voimakasta Ki-67 värjäys ja sykliini D1 positiivisuutta, jotka osoittavat, että kasvaimen solut aktiivisesti lisääntyvissä. Lisäksi, vaikka vahva positiivinen värjäytyminen ja epiteelimusiini havaittiin 20-40% soluista kaikilla hyvänlaatuisia polyyppeja tutkittu, sopusoinnussa niiden paksusuolen epiteelin alkuperä, Mucin ei havaittu adenokarsinoomat tutkittiin (Fig. 2D). Fraktio adenokarsinoomien osoitti myös yli ilmentyminen EGFR (tietoja ei esitetty).

Serial etenemisen paksusuolen kasvaimista

pitkä latenssi tämän mallin yhdessä asynkronisen kasvainten kehittymiseen, esitti este tehokkaasti suorittamaan prekliinisissä Kliinisissä tutkimuksissa tilastollisesti mielekkäällä tavalla. Voittamiseksi että ongelman, selvitimme tapoja laajentaa kasvaimen kerätyn aineksen tämän mallin kautta serial in vivo leviämistä. Toistaiseksi raportit hiiren paksusuolen kasvaimen eteneminen on ollut poissa kirjallisuudessa. Testasimme in vivo etenemisen 3 eri kantojen immuunipuutteisilla hiirillä, (SCID, NOD-SCID ja Nude) 3 eri paikoissa (ihonalainen tila, munuaisten kapseli, ja umpisuolen Saharan limakalvon tila) (katso taulukko S1 lisätietoja) joko kasvain fragmentteja tai yksisolususpensioi- upotettu Matrigel. Eteneminen kasvain materiaalia 82 kasvaimista testattiin yhteensä 107 sivustoja. Kasvainten testataan vain yksi muodostanut lisätyistä kasvainlinjaan, CB42, joka syntyi umpisuoli kimeerisen hiiri ES linjan 91C5 (taulukko 2 ja taulukko S1).

CB42 kasvoi reippaasti sekä munuaisten kapseli ja ihonalaisen avaruus; Esimerkiksi kun 10

5 solua injektoitiin per sivusto, kasvaimia alkoi näkyä 5-7 päivää ja saavutti inhimillinen rajat, vielä 2 viikoksi. Histologinen analyysi osoitti, että arkkitehtuuri kasvaimia kasvatettiin joko munuaiskapselin tai ihonalaisen tilaa muistutti primaarikasvaimen (Fig. 3A, B ja tietoja ei ole esitetty). Lisättyjen kasvaimia säilytti yli 80% soluista, joilla sytoplasmista ja ydin- β-kateniinin ilmentymistä (Fig. 3C) ja pidettiin niiden epiteelin ominaisuudet ovat osoituksena homogeeninen IHC värjäyksellä pan sytokeratiini (Fig. 3d) ja E-kadheriinin (tietoja ei esitetä ). Immunohistokemiallinen värjäys HGF oli positiivinen 70-80% näistä kasvainsoluja, ja värjäyksen fosfo-MET paljasti korkeat MET ilmaisun ja aktivointia, mutta kumma ei EGFR positiivisuutta (Fig. 3C-F ja tuloksia ei esitetty) kuten yleisesti nähtävä ihmisen CRC [18] ja muiden ensisijaisten kasvainten ES-chimera B-kateniinin paksusuolen malli.

A) Histologia (H maksassa määrityksessä, 7 10 hiirille kehittyi näkyvä kasvain kyhmyt maksassa 5-8 viikkoa injektion jälkeen. Toinen sarja etäpesäkkeiden kokeissa tarkemmin kertasi prosessi etäpesäkkeiden ihmisen syöpäpotilailla. Kasvainsoluja ensin ruiskutetaan ihon alle tilaan. Kun ympätty kasvaimet saavutti 500-800 mm

3 kooltaan, me leikattiin niitä kirurgisesti ja seurataan hiiret tarkasti yleisen terveen näköisiä ja laihtuminen, osoitus etäpesäkkeiden sisäelimiin. Kahdeksan 10 hiirillä ei havaittu merkkejä regrowth ihonalaisen kasvaimen ja 2 oli vain hyvin pieni kyhmy ( 200 mm

3) leikkauskohtaan. Kuitenkin kaikki 10 hiirtä sairastui sisällä 3-5 viikkoa leikkauksen jälkeen. Ruumiinavaus paljasti etäpesäkkeitä keuhkoihin kaikkien 10 hiirtä ja kaukana imusolmuke etäpesäke 6 10 hiirtä. Huolellinen histologinen tutkimus muiden sisäelinten kuten aivojen, maksan, pernan ja munuaisten ei havaittu kasvaimen kyhmyjä (tuloksia ei ole esitetty). Keuhkojen ja imusolmukemetastaaseja muistuttivat primaarikasvaimen histologisesti, ja olivat positiivisia pannulla sytokeratiini värjäystä (kuvio. 4). Se ei ollut kuitenkin selvää, tämän kokeen perusteella, onko leikkaus oli olekaan yhteydessä kasvainsolun levittämiseen kaukaisiin elimiin tai pelkästään salli levittää kasvaimet enemmän aikaa kasvaa kaukaisessa urut pidentämällä elinikää näiden hiirten. Erottamaan nämä kaksi mahdollisuutta, me toisti kokeen ilman kirurginen poisto ihonalainen kasvain. Hiiret lopetettiin, kun ihonalainen kasvaimet saavuttivat inhimillinen rajat ja tutki huolellisesti merkkejä etäpesäke. Pienet valkeahko kyhmyt havaittiin keuhkoissa 5/10 hiirillä, ja 2 näistä hiirillä oli turvonneet avustavia imusolmukkeisiin lähellä kaulan. Tämä koe osoitti, että CB42 oli toimivaltainen etäispesäkkeitä spontaanisti

Lung etäpesäke H imusolmuke etäpesäke H pan-sytokeratiini immunohistokemia keuhkojen (E) ja imusolmukkeesta (F) etäpesäkkeitä.

Spontaani geenikopiomäärä muutoksia CB42

Koska CB42 oli ainutlaatuinen keskuudessa β-kateniinin ajettu paksusuolen kasvaimia sen kyky levitä ja etäispesäkkeitä, suoritimme joukon puolueeton genomista määritysten mukaan lukien puettu vertaileva genominen hybridisaatio (aCGH) ja sekvensointi tunnistaa spontaani genomista muutoksia, jotka korreloivat leviämistä ja etäpesäkkeiden. Eristetyn genomisen DNA: CB42 ensisijainen ja ihonalainen, sarjatuotannossa lisätyistä (passage 3, merkitty CB42P3) kasvainnäytteet yhdessä DNA: n kanssa 7 muiden primaaristen kasvainten, jotka eivät etene valittiin vertailussa aCGH. Analyysi aCGH paljastivat useita amplikoneja, jotka olivat läsnä vain ihon alle lisätyistä CB42 kasvaimet (CB42P3), mutta ei ole ensisijainen CB42 kasvain, eikä mitään muita ensisijaisen paksusuolen kasvaimet (Fig. 5A).

). aCGH profiilia CB42 primaarikasvaimen ja passage 3 lisättyjen kasvain. 3,5 Mb amplikoni 5-kromosomissa havaittiin vasta lisätyistä kasvain. Koettimet Cdk6 oli väriltään keltaisen ja koettimien Cdk14 värjättiin sinisellä. B). RT-PCR-analyysi ilmentämiseen 7 geenien kromosomin 5 amplikonin. Suhteellinen ilmentyminen arvot CB42P4 kasvain (n = 4), normalisoitiin kuin normaalin umpisuolen epiteelin (n = 4). C). Western Blot-analyysi tasoilla Cdk4 ja Cdk6 on CB42 ja 4 ihmisen paksusuolen syövän solulinjat. D). Taajuus CDK6 ja CDK14 vahvistusta ihmisen syövässä näytteistä 13 kudostyypeistä. Tiedot haettiin CBio verkkosivuilla.

Näkyvin amplikoni oli 3,5 Mbp kromosomi 5 välillä Cdk6 ja Steap1 sisältävät yli 25 tunnettuja geenejä. Me tutkittiin qRT-PCR ilmentymistä 7 kandidaattigeenejä sisällä amplikonin ja havaitsi, että 3 7 geenit yliekspressoituvat merkittävästi verrattuna normaaliin ruoansulatuskanavasta epiteelin: Cdk6, Cdk14 (Pftk1) ja Fzd1 (kuvio. 5B). Western blot-analyysi CB42 ja useita ihmisen paksusuolen -tuumoriksenografti linjat vahvistettu korkea ilmentyminen CDK6 in CB42 ja SW620 ja havaittavissa CDK6 in HCT116 ja HCC2998 osoittaa, että aktivointi CDK6 voi olla edullista ihmisen kasvaimen ksenografteja (Fig. 5C). Analyysi Cancer Genome Atlas (TCGA) tietokanta löydetty todisteita monistamisen syntenic alueen ihmisen genomista ja paljasti, että vaikka alueen monistamisen oli harvinaista ihmisen CRC, se vaihteli jopa 11% mahalaukun kasvaimet (Fig. 5D) .

mutaatiot tunnistettiin Genomikartoituksen

lisäksi kopioida useita muutoksia, tutkimme DNA lisätyistä CB42P3 kasvaimista mutaatioanalyysiä muuttuu koko genomin, exome, ja RNA sekvensointi jotka toistuvasti tunnistettu 9 mutaatioita eksonin alueilla (taulukko 3). Yksi mutaatiot aiheutti muutoksen Glysiini on kysteiini kodonissa 12 asemaa KRAS-geenin. Myöhemmät pyro-sekvensointi DNA sekä ensimmäisen ja lisätään CB42 sekä 10 muuta ensisijaista paksusuolen kasvainten vahvisti KRAS mutaatio vain lisätyt CB42, mutta ei löytänyt KRAS mutaatiot minkä tahansa muiden näytteiden, mikä viittaa siihen, että aktivaatio KRAS ei tarvita primääri paksusuolen kasvaimen aloittamista CRC malli, mutta tarvittiin pahanlaatuisen kasvaimen kasvua edetessä ja etäpesäkkeiden.

kasvu ja metastaasin CB42 täyttyy /HGF-reitin riippumaton

koska MET ilmaisun ja aktivoinnin kohosivat lisätyt CB42 (Fig. 3F) ja roolin markkinatalouskohtelu ja metastaasit on hyvin tuettu kirjallisuudessa [19], [20], [21], testasimme ovatko MET polku voisi olla tärkeä rooli CB42 leviämisen ja etäpesäke. Tämän hypoteesin testaamiseksi suoritimme sarjan 3 kokeita. Ensimmäisessä kokeessa, me käsitellyistä hiiristä istutettiin ihonalaiseen CB42 kasvaimista crizotinib (50 mg /kg po qd), pieni molekyyli estäjä MET ja ALK. Yllättäen huolimatta korkea MET ilmaisun ja aktivointi, hoito CB42 kanssa crizotinib ollut mitään vaikutusta kasvaimen kasvuun (TGI = 0%, Fig. 6A). Toisessa kokeessa, olemme tutkineet, onko crizotinib voisi estää CB42 etäpesäkkeitä. CB42-kasvainsoluja injektoidaan ihon alle, ja ensisijainen kasvaimet poistettiin kirurgisesti 14 päivän kuluttua, kun keskimääräinen kasvaimen koko oli 500 mm

3. Nämä hiiret kohortoida yhteen ajoneuvoon ryhmässä (n = 10) ja yksi hoitoryhmässä (n = 10), ja käsittely aloitettiin toisena päivänä leikkauksen jälkeen. Hiiret molemmissa ryhmissä alkoi sairastuvat 2-3 viikkoa leikkauksen jälkeen. Kun ne tapettiin, keuhkometastaaseja havaittiin 9/9 hiirissä vehikkeliryhmässä ja 10/10 hiiret crizotinib käsitellyssä ryhmässä, kun taas imusolmuke etäpesäke havaittiin 2 hiirtä kustakin ryhmästä. Ei ole merkittävää eroa numeroita tai koko etäpesäkkeiden havaittiin hoitoryhmien välillä, mikä viittaa siihen, että esto MET ei vaikuttanut metastaattista kasvua jälkeen perustamisen kaukaisia ​​etäpesäkkeitä.

A). MET estäjä crizotinib ei estänyt CB42 kasvaimen kasvua. B). CDK4 /6-estäjän PD0332991 esti merkittävästi CB42 kasvaimen kasvua (*** P 0,001). C). MEK1 /2-estäjä PD0325901 täysin tukossa CB42 kasvaimen kasvua (*** P 0,001). D). Yhdistelmä CDK4 /6 ja MEK1 /2-estäjän aiheuttama CB 42 kasvainregressio (**** P 0,0001). E). Ihonalainen kasvain määriä kolmen hoitohaaran lopussa tutkimuksen. Yhdistelmä on huomattavasti tehokkaampi kuin CDK4 /6-inhibiittorin (**** P 0,0001) tai MEK-inhibiittorin (*** P 0,001). F). Gross tarkastelu keuhkolohkojen metastasoineeseen kyhmyjä paljasti, että molemmat CDK4 /6-estäjän ja MEK estäjä esti merkittävästi CB42 keuhkometastaasitestissä (* P 0,05), mutta yhdistelmä oli merkitsevästi tehokkaampi kuin kummallakaan aineella yksinään (**** P 0,0001) ja lähes täysin eliminoitu keuhkometastaasitestissä.

kolmannessa kokeessa testasimme MET esto voisi estää kasvainsolun levittämistä poissa pienten primaarikasvaimen sivustoja. Tässä kokeessa annostelun ajoneuvo tai crizotinib alkoi kaksi päivää ihonalaisen CB42 soluja saajahiiret. Ihonalainen kasvaimet poistettiin kirurgisesti kaksi viikkoa myöhemmin ja annostusta jatketaan kunnes hiiret sairastui. Keuhkometastaaseja havaittiin kaikissa hiirissä, riippumatta siitä, onko ne vastaanotettu crizotinib tai ajoneuvon. Näiden kokeiden perusteella, päättelimme, että markkinatalouskohtelua ei ollut tarpeen CB42 kasvaimen kasvua ja etäpesäkkeiden.

merkittävä estyminen ihonalainen ja etäpesäkekasvainten kasvua CDK4 /6 tai MEK esto

Koska lisätyistä CB42 oli genominen amplifikaatio CDK6 ja vahva ekspressoitumisen solussa (katso edellä), testasimme yhdiste, PD0332991, joka estää sekä CDK4 ja CDK6 [22]. Huolimatta vahvistus Western blot, joka osoitti vahvaa CDK6 ja heikompia CDK4 ilmaisun CB42 (Fig. 5C), 3 päivää in vitro proliferaatiomäärityksessä osoittivat, että PD0332991 ei estänyt proliferaation CB42-solulinjaa edes suurimmalla annoksella (10 uM) (tuloksia ei ole esitetty). Sen sijaan, hiiriä istutettiin ihon alle CB42 kasvainten PD0332991 (125 mg /kg, po qd) inhiboi voimakkaasti ihonalaisen kasvaimen kasvua (TGI-75%, p 0,00005, Fig. 6B), ja keuhkojen etäpesäkkeiden. Lopussa kokeilu, vain viisi 15: sta käsiteltyjen hiirien PD0332991 oli näkyvissä kyhmyjä keuhkoissa taas kaikki 15 hiiret ajoneuvon ryhmissä oli näkyvissä keuhkometastaaseista. Siellä olivat keskimäärin 5 keuhkojen kyhmyt per hiiri PD0332991 ryhmässä vs. 18,3 vehikkeliryhmässä (p = 0.00002). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset viittaavat siihen, CDK6 yliekspressio mahdollistaa hiiren GI kasvaimia kasvaa ulkopuolella paksusuolen Saharan limakalvon ympäristö ja että aktivointi CDK6 voisi vaikuttaa GI kasvaimia elossa ja kukoistava on Metastasoituneessa.

Koska CB42 oli myös hankkinut aktivoimalla Kras mutaatio ja kirjallisuudessa ehdotetaan, että KRAS mutantti kasvaimet olivat herkkiä MEK-inhibiittoreita [23] MEK: n estäjä PD0325901 testattiin sen kyky inhiboida kasvua CB42 in vitro ja in vivo. MEK esto estää alavirran signalointia KRAS. In vitro, PD0325901 voimakkaasti estetty Erk1 /2 signalointi CB42-soluja (tietoja ei esitetty). In vivo yksittäinen annos PD0325901, joko 5 mg /kg, tai 15 mg /kg, johti täydelliseen inhibitioon Erk1 /2-fosforylaation 4 tuntia annostuksen jälkeen (tuloksia ei ole esitetty). Hoidon PD0325901 ihonalaisen CB42 hiirissä, joko 5 mg /kg tai 15 mg /kg, johtaa lähes täydellinen kasvaimen kasvun estäminen (93% ja 96% deltaTGI, vastaavasti Fig. 6C). Skannaus keuhkojen lopussa Tutkimuksessa osoitettiin merkittävä väheneminen sekä määrän ja koon etäpesäkenystyröiden käsitellyssä hiirillä vs. vehikkeliryhmässä. Nämä tiedot osoittivat, että kasvua ja etäpesäkkeiden CB42 ihonalaisena siirteen oli myös voimakkaasti riippuvainen KRAS-mutaatio.

regressio CB42 yhdistetyllä estämällä KRAS /MEK signalointi ja CDK4 /6

moninkertainen geneettinen vauriot tunnistettu CB42 ehdotti, että suurin terapeuttinen vaikutus voidaan saavuttaa yhdistelmällä kohdennettujen estävien useat säädeltyyn polkuja. Tämän hypoteesin testaamiseksi käsittelimme CB42 kanssa MEK inhibiittorin PD0325901 (5 mg /kg) yhdessä CDK4 /6-estäjän PD0332991 (125 mg /kg). Näiden kahden lääkkeen siedettiin hyvin, ei aiheuttanut merkittävää laihtuminen ( 10%) (tuloksia ei esitetty). Yhdistetty hoito PD0332991 ja PD325901 ei dramaattisesti taantua kasvaimet keskimäärin 35% (Kuva. 6D), kun taas yksittäinen aine hoitoryhmien osoittivat jälleen merkittävää kasvaimen kasvun estämistä verrattuna kontrolleihin. Vertailu erikseen piirretty kasvain koot välillä kolmen Hoitoryhmien lopussa tutkimuksen osoitti, miten merkittävä ja yhtenäinen kasvaimen taantumiseen oli yhdistelmähoitoa saaneilla (Fig. 6E). Myös lopussa tutkimuksen, keuhkot leikeltiin ja tutkittiin havaittavissa etäpesäkenystyröiden. Vähemmän etäpesäkkeitä havaittiin molemmissa ainoana lääkkeenä hoitoryhmissä (alas 5 kyhmyjä /hiiri verrattuna 15 kyhmyjä /hiiri ajoneuvonhallintajärjestelmän arm), kun taas etenkin yhdistelmä varsi keskimäärin alle yhden kyhmyn hiirtä kohti (Fig. 6F). Siten CB42, molemmat hankittu geneettisiä vaurioita osaltaan ihonalaisen kasvaimen kasvua sekä metastaattisen potentiaalin ja /tai metastasized kasvaimen kasvua.

pakotettu ilmentymä CDK6 ja CDK14 johti lisääntymiskykyisen koolontuumoreissa

Vaikka on jonkin verran kirjallisuutta näyttöä siitä, että molemmat CDK6 [24], [25] ja CDK14 [26], [27] ovat mukana eri näkökohtia tumorigeneesin, niiden potentiaalinen rooli paksusuolen kasvainten synnyssä eivät tällä hetkellä ole täysin ymmärretty. Otimme etuna joustavuutta ES-kimeeran mallin lähestymistapa ja lisätään doksisykliini-indusoituvaa ekspressiokasetteihin CDK14 yksinään tai yhdessä CDK6 ja Fzd1 alkuperäiseen paksusuolen malli ES linja 91C5 perustaa uuden mallin linjoja.