Krooninen sairaus

tiivistelmä

Tarkoitus

tutkimiseksi käyttöä liposomaalisen irinotekaanin (Irinophore C ™ ) plus tai miinus 5-fluorourasiilin (5-FU) ja kolorektaalisen syövän.

Kokeellinen malli

vaikutus irinotekaanin (IRI) ja /tai 5-FU valotusaika sytotoksisuuteen arvioitiin

in vitro

vastaan ​​HT-29 tai LS174T ihmisen koolonkarsinoomasoluja. Farmakokinetiikkaa ja biologista jakaantumista ja Irinophore C ™ (IRC ™) ja 5-FU, antaa yksin tai yhdistelmänä, verrattiin

in vivo

. Ihonalaisena malli HT-29 ihmisen paksusuolen ja peräsuolen syövän rag2-M hiiriä käytettiin tehokkuuden arvioimisessa Irc ™ yksin, ja yhdessä 5-FU.

Tulokset

sytotoksisuus IRI ja 5-FU olivat vahvasti riippuvaisia ​​valotusaikaa. Synergistiset vaikutukset havaittiin seuraavan pitkäaikainen altistuminen IRI /5-FU yhdistelmiä. Farmakokinetiikka /biojakaantumi- tutkimukset osoittivat, että 5-FU poistumanopeus laski huomattavasti, kun 5-FU annettiin samanaikaisesti suonensisäisesti IRC ™, verrattuna yksinään. Merkitsevää pienenemistä 5-FU poistaminen havaittiin myös plasmassa, siihen liittyvän kasvua 5-FU joissakin kudoksissa, kun 5-FU annettiin injektiona vatsaonteloon ja Irc ™ annettiin laskimoon. Poistaminen IRC ™ ei ollut merkitsevästi erilainen, kun sitä annetaan yksin tai yhdessä 5-FU. Terapeuttinen tutkimukset osoittivat, että yksittäinen aine IRC ™ oli merkitsevästi tehokkaampi kuin yhdistelmä IRI /5-FU; yllättävää, IRC ™ /5-FU-yhdistelmä ollut tehokkaampi kuin Irc ™ yksin. Yhdistelmien antamisesta 5-FU (16 mg /kg) ja IRC ™ (60 mg IRI /kg) oli kohonnut myrkyllisyys verrattuna Irc ™ yksin. Käsittely IRC ™ yksinään (60 mg IRI /kg) viivästytti aika tarvitaan 5-kertainen alkuperäiseen kasvaimen tilavuuden päivä 49, verrattuna päivään 23 valvonnasta. Kun IRC ™ (40 mg IRI /kg) käytettiin yhdistelmänä 5-FU: ta (16 mg /kg), aika lisätä kasvaimen 5-kertainen oli 43 päivää, mikä oli verrattavissa saavutetaan käytettäessä IRC ™ yksin ( 40 mg IRI /kg).

Johtopäätökset

Yhden aineen IRC ™ oli hyvin siedetty ja sillä on merkittävää terapeuttista potentiaalia. IRC ™ voi olla sopiva korvaaja IRI hoitoon, mutta sen käyttö on ilmainen 5-FU mutkistaa IRC ™ -engendered muutokset 5-FU farmakokinetiikkaa /biojakaantumi- joita liittyy lisääntynyt myrkyllisyys käytettäessä yhdistelmää.

Citation: Hare JI, Neijzen RW, Anantha M, Dos Santos N, Harasym N, Webb MS, et al. (2013) kolorektaalisyövän hoitoon yhdistämällä Liposomaalisen Irinotekaani (Irinophore C ™) ja 5-fluorourasiilia. PLoS ONE 8 (4): e62349. doi: 10,1371 /journal.pone.0062349

Editor: Dimitris Fatouros, Thessalonikin Aristoteles-yliopisto, Kreikka

vastaanotettu: 23 maaliskuu 2012; Hyväksytty: 22 maaliskuu 2013; Julkaistu 23. huhtikuuta 2013

Copyright: © 2013 Hare et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Kanadan Institutes of Health Research (rahoitus viitenumeron 82583) ja vastaavia varoja Terry Fox Research Institute (Project ID 2008-010). Tällaista tutkimusta rahoitetaan saatiin myös Pfizer /Centre for Drug tutkimuksen ja kehityksen innovaatiorahasto. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

peräsuolen syöpä (CRC) on johtava syy syövän kuoleman maailmanlaajuisesti [1], [2], [3]; Yhdysvalloissa, CRC on kolmanneksi yleisin syy syövän kuoleman ja kolmanneksi yleisin diagnosoitu syöpä, lähes 150000 uutta tapausta arvioidaan diagnosoitu vuonna 2013 [4], [5]. Kemoterapeuttinen lääke irinotekaanin (IRI) käytetään useissa ensilinjan CRC hoito-ohjelmia. Vaikka IRI itsessään on aktiivinen, ei-spesifinen plasman, maksan, maha-suolikanavan (GI), ja kasvaimen carboxylesterases [6], [7], [8], voivat metaboloida IRI SN-38, joka on 100- 1000 kertaa voimakkaampi kun testattiin

in vitro

määrityksissä [9], [10]. Gut carboxylesterases (CE) tuottaa paikallisesti korkeita SN-38 [11], [12]. Tämä muuntaminen voi liittyä terapeuttista aktiivisuutta, mutta se on myös yhdistetty suoliston vaurioita, jotka on vastuussa suuresta osasta IRI: n haitallisten GI myrkyllisyys [13], [14], [15]. Toissijainen epäkohta käyttöön IRI ja SN-38 on pH-riippuvainen hydrolyyttinen muuntaminen aktiivisen laktonin muodossa happamassa pH: ssa, joka ei ole aktiivinen karboksylaatin muodossa, fysiologisessa pH: ssa, mikä rajoittaa annos vaikuttavaa lääkettä, joka saavuttaa tavoitteen [16], [17], [18], [19]. Jotkut haitalliset toksisuuksia ja CE-välitteisen muuntaminen IRI voidaan parantaa käyttämällä lääkeainekuljetussysteemeihin [20], [21], [22], [23], [24], [25]. Irinophore C ™ (IRC ™) on formulaatio, joka on IRI kapseloitu unilamellaarisia, 1,2-distearoyyli-sn-glysero-3-fosfatidyylikoliinin (DSPC) /kolesteroli liposomeja (100 nm halkaisijaltaan), joka sisälsi hapanta vesipitoista sisäosan puskuroimattoman CuSO

4. IRI on suljettuna hapan vesipitoinen sisäosa liposomeja, kun pH-gradientti on tuotettu, kun läsnä on divalenttinen metalli A23187, jota tarvitaan vakautta ja ylläpito pH-gradienttia [21], [26]. Yhdistelmä ionofori syntyvän pH kaltevuus yhdessä läsnäolo kapseloitu Cu

2+, tulokset erinomainen lääkeretentioon ominaisuudet sellaisina

in vivo

[26], [27], [28 ].

Prekliinisissä tutkimuksissa IRC ™ osoitti, että aktiivisuutta IRI voidaan lisätä merkittävästi erilaisia ​​kasvainmuotoja [21], [26], [29], [30], jossa on parannettu turvallisuusprofiili verrattuna vapaan lääkeaineen [21]. Kasvu terapeuttinen indeksi IRC ™, versus IRI, arvellaan johtuu useista tekijöistä: i) ylläpito IRI aktiivisessa laktonimuodossaan pitkän aikaa [21], [27], [30]; ii) lisääntynyt toimituksen IRI sivustoille kasvaimen kasvua [21]; iii) pitkittynyt systeeminen altistus vaikuttavalle laktonimuoto SN-38 [21]; ja iv) olemassaolo vastaisen verisuonten toimintaa, joka ei havaittu bolusantaminen vapaa IRI [29], [31]. Oletimme, että terapeuttinen vaikutus IRC ™ on eniten merkitystä silloin, kun sitä käytetään osana lääkeyhdistelmää – esimerkiksi kemoterapian hoito FOLFIRI (leukovoriini, 5-fluorourasiili (5-FU), ja IRI), jossa IRC ™ korvattaisiin ilmaiseksi IRI. Tämä hypoteesi testattiin ennalta hoitopaikassa täällä, missä yhdistelmiä IRC ™ /5-FU ja IRI /5-FU arvioitiin hiirimallissa CRC. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus tutkii käyttöä liposomaalisen IRI muotoiluja, kuten Irc ™, yhdessä 5-FU hoitoon CRC. Terapeuttinen Tulokset yllättäen osoittaneet, että tehokkuus tämän yhdistelmän ei ollut parempi kuin joka saavutettiin IRC ™ monoterapiana. Lisäksi mallissa käytetään tässä, oli odottamaton kasvu toksisuus yhdistelmä, joka vaaditaan annoksen pienentämistä IRC ™ tasolle, joka oli huomattavasti vähemmän aktiivinen kuin suuremman annoksen Irc ™, mutta voidaan antaa turvallisesti kun käytetään ainoana lääkkeenä.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

DSPC ja kolesteroli saatiin Avanti Polar Lipids (Alabaster, Alabama, USA). [

3H] Kolesteryyliesteritransferaasiproteiini hexadecylether (CHE) hankittiin PerkinElmer (Waltham, Massachusetts, USA). [

14C] 5-FU hankittiin Moravek Biochemicals (Brea, Kalifornia, USA). A23187 ostettiin Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, CA). Suolaliuos, 5% dekstroosi vedessä (D5W), irinotekaani (Camptosar, Sandoz), ja 5-FU (Alfa Aesar) saatiin BC Cancer Agency (Vancouver, British Columbia, CA). AlamarBlue reagenssi, naudan sikiön seerumia (FBS), L-glutamiinia, ja natriumbikarbonaattia ostettiin Invitrogen (Burlington, Ontario, CA). Eaglen minimi olennainen väliaine (MEM) Earle tasapainotettu suolaliuos (BSS), McCoyn 5A väliaineessa, Hankin BSS (HBSS), ei-välttämättömiä aminohappoja, natriumpyruvaattia, ja penisilliini /streptomysiinillä hankittiin StemCell Technologies (Vancouver, British Columbia, CA). Kaikki muut kemikaalit olivat analyyttistä laatua.

Cell Culture

paksu- ja solulinjat LS174T ja HT-29 saatiin ATCC (Manassas, Virginia, USA). Stock solulinjoja ylläpidettiin ilman penisilliiniä ja streptomysiiniä, ja seulottiin

Mycoplasma

ennen valmistelee varasto soluja, jotka jäädytettiin käytettäväksi kokeisiin. Solut suspendoitiin uudelleen jäädyttämistä media (10% (tilavuus /tilavuus, v /v) dimetyylisulfoksidia FBS) ja hitaasti pakastettiin Nalgene 1 ° C pakastusrasiana (Rochester, New York, USA), joka sisälsi 100% isopropanolia -80 ° C: ° C: ssa 24 tuntia ennen varastointia nestemäisessä typessä. Pakastetut solut sulatettiin nopeasti 37 ° C: ssa, sentrifugoidaan jäädyttämistä median, pinnoitettu ja siirrostettiin kahdesti ennen käyttöä kokeissa. LS174T-soluja viljeltiin Eaglen MEM Earlen BSS, johon oli lisätty 2 mM L-glutamiinia, 1 mM natriumpyruvaattia, 0,1 mM ei-välttämättömiä aminohappoja, 1,5 g /l natriumbikarbonaattia, 1% (v /v) penisilliini /streptomysiiniä, ja 10% (v /v) FBS: ää, 37 ° C: ssa 5% CO

2 ympäristössä. HT-29-soluja viljeltiin modifioidussa McCoyn 5A-väliaine, jota oli täydennetty 1,5 mM L-glutamiini, 2,2 g /l natriumbikarbonaattia, 1% (v /v) penisilliini /streptomysiiniä ja 10% (v /v) FBS: ää, 37 ° C: ssa 5% CO

2 ympäristöön.

sytotoksisuusmääritykset

elinkelpoisuus ihmisen CRC solulinjojen altistuminen eri pitoisuuksia IRI ja /tai 5-FU määritettiin käyttämällä alamarBlue määritys [32], [33]. Solut (LS174T, 10000 solua /kuoppa; HT-29, 5000 solua /kuoppa) ympättiin tasapohjaisille 96-kuoppaisille levyille. Sen jälkeen solu sitoutuminen oli tapahtunut, kasvavien pitoisuuksien IRI tai 5-FU lisättiin soluihin 1-72 h, huumeiden huuhtoutumisen tarpeen osoitettuna ajankohtana. Kokeissa määrittää aika riippuvuutta altistumista solujen lääkeaineen yhdistelmiä, HT-29-solut altistettiin IRI /5-FU: ta 01:01 moolisuhteessa 1-48 h, huumeiden huuhtoutumisen tarvittaessa ilmoitettuina aika (et). Kaikissa kokeissa, solujen elinkykyisyys arvioitiin 72 tuntia aloittamisen jälkeen lääkkeen altistumista. AlamarBlue reagenssia lisättiin kuhunkin kuoppaan 1:10 laimennus, ja soluja inkuboitiin vielä 4-8 tunnin ajan ennen kuin fluoresenssi mitattiin. Elinkelpoisuutta data, osa vaikuttaa (FA) oli mitta alamarBlue fluoresenssin normalisoitu fluoresenssiin valvonta: no solut ohjaavat määritellään 100% vaikuttavat taso ja huumeettoman ohjaus määritellään 0% vaikuttaa tasolla. Vuorovaikutukset IRI /5-FU, kun käytetään yhdessä

in vitro

määritettiin perusteella yksittäisen määrityksen päätepisteen (alamarBlue elinkelpoisuuden määritys, yllä), ja tulokset analysoitiin kautta Mediaani-Effect periaate [34 ], kuten arvioitiin CompuSyn ohjelmisto (ComboSyn, Inc .; Paramus, New Jersey, USA) [35]. Kunkin valotusaika, annos-vaste käyrät muodostettiin asiamiehille, yksin ja yhdessä, ja myöhemmin yhdistelmä indeksi (CI) arvot arvioitiin eri vaikuttavat tasoilla (määritelty murto vaikuttaa). CI-arvo 0,8-1,2 edustaa lisäaineen vuorovaikutusta, alle 0,8 edustaa synergistinen vuorovaikutus, ja suurempi kuin 1,2 edustaa antagonistista vuorovaikutusta.

valmistaminen Irinophore C ™

IRC ™ valmistettiin kuten kuvataan Ramsay

et al

. [26]. DSPC: kolesteroli (55:45 mol-%), liposomit valmistettiin, kuten aikaisemmin on esitetty [36], [37], käyttäen pieniä määriä ei-metaboloituva, ei-vaihdettavissa lipidi merkkiaineen [

3H] CHE [38]. Ohut lipidikalvo hydratoitiin 300 mM CuSO

4-liuosta 65 ° C: ssa, tuloksena lipidivesikkelit alistettiin 5 sykliä jäädytys-ja-sulatus, ja liposomit ekstrudoidaan halkaisijaltaan -100 nm. Kapseloimatonta CuSO

4 poistettiin kromatografisesti käyttäen Sephadex G-50 kolonniin, joka oli tasapainotettu SHE-puskuria (300 mM sakkaroosi, 20 mM HEPES, 15 mM EDTA, pH = 7,5). Liposomit inkuboitiin 0,5 ug A23187 /mg yhteensä lipidiä 30 min 60 ° C: ssa. IRI lisättiin liposomeihin, mooli- lääke-to-lipidi-suhde 0.2:1, ja seosta inkuboitiin 50 ° C: ssa 1 h. Kapseloimatonta lääkeaine poistettiin kromatografialla Sephadex G-50 kolonniin, joka oli tasapainotettu PBS: llä (pH = 7,4), ja lääkeaineen kuorma tehokkuus määritettiin sen jälkeen, kun mittaus IRI absorbanssi 370 nm: ssä. Tarvittaessa IRC ™ keskitettiin 3000 ×

g

käyttämällä keskipakoisvoiman filtteri (molekyylimassarajan 100 kDa).

Eläimet ja etiikka lausunto

Kaikki

vuonna vivo

kokeita hyödyntäen 129S6 /SvEvTac-

rag2

tm1Fwa

(rag2-M) saatuja hiiriä BC Cancer viraston Animal Resource Centre Vancouver tutkimuskeskuksessa (Vancouver, Brittiläinen Columbia, CA). Tutkimukset suoritettiin noudattaen Kanadan neuvoston Animal Care suuntaviivoja valvontatoimintoja University of British Columbian Animal Care komitea (protokollia A10-0171 ja A10-0206). Hiiriä pidettiin standardiolosuhteissa rikastamiseen, jolla on pääsy ruoan ja veden

halun

.

Farmakokinetiikka ja bioleviäminen

Kokeita päätökseen onko samanaikainen käyttö IRC ™ /5-FU, laskimonsisäisellä (iv) tai vatsaonteloon (ip) injektion, muutti PK /BD ominaisuuksia kummallakaan aineella. Mies rag2-M hiiriä (8-10 viikkoa vanhoja; 4 hiirtä aikapistettä kohti) saivat i.v. injektiot, kautta sivusuunnassa häntälaskimoon, on [

3H] CHE-leimattua IRC ™ (40 mg IRI /kg), [

14C] 5-FU (40 mg /kg), tai samanaikaisesti [

3H] CHE-leimattua IRC ™ ja [

14C] 5-FU: ta (40 mg IRI /kg ja 40 mg /kg, vastaavasti), yhteensä injektion tilavuus 0,2 ml. Annos 5-FU valitaan näihin tutkimuksiin, perustuu aikaisempien kokeiden jotka osoittavat, että tämä annos oli hyvin siedetty, kun annetaan kerran viikossa (Q7D) annostusohjelma, joka on verrattavissa käytetään IRC ™ (tuloksia ei esitetty). Eri ajankohtina injektion jälkeen hiiret tapettiin CO

2 tukehtumisen. Veri kerättiin välittömästi talteen sydänpunktiolla, ja sentrifugoidaan plasman. Elimet kerättiin ja jaettu 2 kpl; puolet plasma tai elimen valmisteltiin nestetuikelaskennalla (LSC) määrittää tason liittyvän radioaktiivisuuden (lipidien ja 5-FU), kun taas toinen puoli käsiteltiin HPLC analyysi määrittää IRI ja SN-38 tasoja. Rajoittamiseksi muuntaminen välillä laktoni ja karboksylaatti muotoja, plasmanäytteet ja elimet pidettiin jäillä ja siirrettiin -70 ° C: seen 1 h kokoelma.

erillinen tutkimus tehtiin sen määrittämiseksi, PK /BD ominaisuuksia 5-FU, annettiin QD x 2 kautta ip injektio, vaikutti samanaikaisen IRC ™ annoksella 60 mg IRI /kg. Tämä annostus oli verrattavissa käytettiin tehotutkimuksissa kuvattu alla. Koe suoritetaan käyttäen uros rag2-M hiiriä (7-10 viikkoa vanhoja; 3 hiirtä aikapistettä kohti). -Hiiriin ruiskutettiin i.p. 16 mg /kg 5-FU päivinä 1 ja 2, tai ilman samanaikaisen annon IRC ™ (60 mg IRI /kg) kautta i.v. injektio päivänä 1 2 tuntia injektion jälkeen 5-FU. Kun toistuvia annoksia 5-FU annettiin lopullinen annos sisälsi [

14C] 5-FU, koska etiketti jäljittää 5-FU tasoa. Eri ajankohtina injektion jälkeen hiiret tapettiin CO

2 tukehtumisen. Veri kerättiin välittömästi talteen sydänpunktiolla, ja sentrifugoidaan plasman. Elimet kerättiin ja säilytettiin jäässä, ja siirrettiin -70 ° C: seen 1 tunnin kuluessa kokoelma. Näytteet valmisteltiin LSC varten mittaamiseen liittyvän radioaktiivisuuden.

valmisteltaessa LSC, kudoshomogenaateista (10% paino /tilavuus) valmistettiin keittosuolaliuokseen käyttäen Polytron-homogenisaattoria (Brinkmann Instruments, Rexdale, Ontario, CA) ja 0,5 ml kutakin homogenaattia pilkottiin sitten 0,5 ml: Ratkaistavat (DuPont Canada, Mississauga, Ontario, CA) 1 tunnin ajan 50 ° C: ssa. Sen jälkeen kun oli jäähdytetty huoneenlämpötilaan, näytteet poistettiin väri lisäämällä 0,2 ml 30% H

2O

2. Nämä näytteet sitten inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa liiallisen vaahtoamisen estämiseksi. Tuikeseosta lisättiin näytteitä, ja seuraavat tumma-tasapaino- radioaktiivisuuden ([

3H] CHE ja [

14C] 5-FU), joka liittyy plasman ja elinten kvantitoitiin kautta LSC.

valmisteltaessa HPLC-analyysi, jälkipuoliskolla kunkin elimen homogenoitiin jääkylmässä vedessä. Ja metaboliittien uutettiin homogenaatista käyttäen jääkylmää asetonitriili /metanolilla (01:01 v /v) liuosta, ja sentrifugoimalla 14000 x

g

15 min proteiinien saostamiseksi. Supernatantti kerättiin, ja pitoisuudet IRI (laktonin ja karboksylaatista muodot) ja SN-38 (laktoni ja karboksylaatti lomakkeet) elimessä supernatantti ja plasmanäytteet määritettiin HPLC. HPLC erottaminen IRI ja SN-38 laktoni ja karboksylaatti muodot suoritettiin käyttäen 250 x 4,6 mm: n C18 Symmetryshield pylväs ja C18 Symmetryshield suojapylväs (Waters, Mississauga, Ontario, CA). Gradienttieluointi käytettiin liikkuvalla faasilla A, joka koostuu 75 mM ammoniumasetaattia ja 7,5 mM tetrabutyyliammoniumbromidia, säädettiin pH-arvoon 6,4 jääetikalla (Fisher Scientific, Nepean, Ontario, CA), ja liikkuva faasi B, joka koostuu asetonitriilistä. Kaltevuus profiili oli seuraava: aika = 0 min: 78% A: ta: 22% B, aika = 10 min: 64% A: ta: 36% B, = 12 minuuttia: 78% A: ta: 22% B, aika = 20 min: 78% A: ta: 22% B. 0,01 ml: n näyte injektoitiin pylvääseen (kolonnin lämpötila 35 ° C) ja eluoitiin virtausnopeudella 1 ml /min. Laktoni ja karboksylaatti muodot sekä IRI ja SN-38 todettiin käyttäen Waters 2475 moniaallonpituus- fluoresenssidetektorilla (Waters, Mississauga, Ontario, CA), asettaa ajan ohjelman tapahtumien Aex = 370 nm, Aem = 425 nm välillä 0 ja 12.5 min IRI laktoni ja IRI karboksylaatista, ja Aex = 370 nm, Aem = 535 nm välillä 12,5 ja 20 min SN-38 laktoni ja SN-38 karboksylaatti. Ennen injektiota, kaikki näytteet pidettiin 4 ° C: ssa vähentää muunnoksen laktoni ja karboksylaatti muotoja IRI tai SN-38. Standard käyrät IRI laktonin ja SN-38 laktonia valmistettiin sarjalaimennoksia on 02:01: 1 natriumasetaattia (100 mM): metanoli: asetonitriili (pH 4,0) puskuria. Jotta IRI karboksylaatti ja SN-38 karboksylaatti sarjalaimennoksia valmistettiin 02:01: 1 natriumboraatti (100 mM): metanoli: asetonitriili (pH 9,0) -puskuria. Kvantitointirajan IRI ja SN-38 laktoni ja karboksylaattia lomakkeet oli 10 ng /ml. Plasma ja kudosten AUC arvot laskettiin konsentraatio vastaan ​​aika käyrät (keskiarvo +/- standardipoikkeama) käyttäen GraphPad Prism 5.00 ohjelmisto (GraphPad Software, La Jolla, Kalifornia, USA). Tilastollinen merkitys PK /BD tutkimus laskettiin kautta kaksisuuntaisen varianssianalyysin kanssa Bonferronin testin jälkeen käyttäen GraphPad Prism 5.00 ohjelmisto.

terapeuttisen tehon

HT-29 kasvain mallia käytettiin määrittää terapeuttinen tehokkuus. HT-29-soluja (5 x 10

6 solua 0,05 ml media) injektoitiin ihon alle (s.c.) keskellä olevaan alempaan selkään naisten rag2-M hiiriä (6-9 viikkoa vanhoja). Kasvaimia esiintyi 2 viikon jälkeen, soluinokulaation, ja tällä kertaa, hiiret jaettiin satunnaisesti hoitoryhmiin 6 hiirtä ryhmää kohti, ellei toisin ole mainittu. Hoidot aloitettiin, kun kasvaimet olivat saavuttaneet keskimäärin tilavuuden ~150 mm

3 (0,5-0,7 cm), joka tapahtui noin päivänä 14-soluinokulaation. Hoidot annettiin hiirille seuraavasti: suolaliuos + D5W, 5-FU: ta (16 mg /kg), IRI (60 mg /kg), IRC ™ (40 tai 60 mg IRI /kg), IRI + 5-FU: ta (60 mg /kg +16 mg /kg), tai IRC ™ + 5-FU: ta (40 mg tai 60 mg IRI /kg +16 mg /kg). D5W ja 5-FU annettiin päivittäin 5 päivän ajan (QD x 5) joka viikko 3 viikon kautta i.p. injektio; kaikki muut käsittelyt annettiin kerran viikossa 3 viikon ajan (Q7D x 3) kautta i.v. injektio sivusuunnassa häntälaskimoon. Kun hiiret saivat kaksi erilaista aineita joko IRI ja 5-FU tai irc ™ ja 5-FU, samana päivänä, 5-FU ruiskutettiin 2 tuntia ennen IRI tai Irc ™ antoa. Jotta voitaisiin lisätä koko 5-FU valotusaikaa, päivittäinen annostus 5-FU käytettiin [39], joka perustuu hoito kuvanneet Saltz

et al

. [40], [41], ja 16 mg /kg: n annos valittiin kuluttua annoksen suurentaminen tutkimus määritti, että se oli MTD in rag2-M hiirissä (julkaisemattomat tulokset). Korkeimmat IRC ™ annoksella (60 mg IRI /kg) Tässä tutkimuksessa käytettiin on hyvin siedetty ja noin 66% MTD määritetään ryhmämme rag2-M hiirissä. Risteäviä kasvaimen mitat mitattiin 3 kertaa viikossa; kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen (ab

2) /2 (a, suurempi ulottuvuus; b, pienempi ulottuvuus). Hiiret lopetettiin, jos paino on vähentynyt (BWL) ylitti 20%, jos kasvaimen tilavuuden ylitti 1000 mm

3, jos kasvain haavauma havaittiin, tai jos merkittävä huonontumista havaittiin hiiren terveys (kliiniset pisteet määrittelemien hyväksytyn standardin toiminta menettely). Arvioitaessa kertainen kasvaimen tilavuuden kasvu, kasvaimen koko päivänä 0 (päivä hoidon aloittamisesta) määriteltiin 1.

Tulokset

5-FU ja IRI Näytä Valotusaika Riippuvuus Single Agents ja in Combination

Drug yhdistelmäefektit riippuvat useista tekijöistä, mukaan lukien lääkeaineiden suhteet, tilaukset ja aikajärjestyksiä hallinnon ja valotuksen kertaa. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet lääkkeen suhde riippuvuus IRI /floksuridiini yhdistelmät [42]; samanlainen lääkeaineen suhde riippuvuutta on myös esitetty nykyinen tutkimuksissa yhdistelmiä IRI /5-FU: ta (tuloksia ei ole esitetty). Kuitenkin tutkimukset tässä kuvatut lisäksi pidetään rooli lääkealtistuksen kertoja lääkeyhdistelmä vaikutuksia. Tämä voidaan saavuttaa esimerkiksi, käytön lääkkeen infuusiota, joka on optimoitu lääkkeen antaminen aikataulun, tai käyttämällä nanohiukkasten syöpälääkettä formulaatiot on suunniteltu optimaalinen lääkkeen vapautumisnopeudet ja parannettu lääkealtistuksen kertaa. Vaikutus valotusaika sytotoksisuuteen /sytostaasi määritettiin yhdistelmiä IRI /5-FU, ja nämä tiedot on koottu kuvioon. 1. terapeuttisia vaikutuksia 5-FU: n ja IRI, kun niitä käytetään yksin, olivat erittäin riippuvaisia ​​valotusajan (Fig. 1A-D). Sillä LS174T solulinja, IC

50 IRI (0,3 uM; Fig. 1A) ja 5-FU (3,0 uM; Fig. 1 B) oli yli 100 kertaa pienempi, kun lääke altistusaika oli 72 tuntia, suhteellinen jotta valotusaika on 1 h (44 uM ja 330 uM). Jotta HT-29-solujen IC

50 5-FU oli 9 uM lääkkeen altistumisen aika 72 h, verrattuna 4000 uM altistumisen aika 1 h (Fig. 1 D). Lisäksi IC

50 IRI ei ollut mitattavissa HT-29-solujen, kun valotusaika oli 1, 4 tai 8 h (Fig. 1 C). On huomattava (katso menetelmät), että näissä tutkimuksissa myrkyllisyyden arvioinnit määritettiin 72 tuntia, ja siten vain huumeiden valotusaika oli vaihteleva täällä.

A-D) Single agentti valotusaikaa riippuvuutta. LS174T (A ja B) ja HT-29 (C ja D) solut altistettiin IRI (A ja C) tai 5-FU (B ja D) 1 (•, katkoviiva), 4 (□, yhtenäinen viiva) , 8 (▾, katkoviiva) 24 (⋄, yhtenäinen viiva), 48 (X, katkoviiva), tai 72 h (○, ​​yhtenäinen viiva). E) Yhdistelmä valotusaikaa riippuvuutta. HT-29-solut altistettiin IRI /5-FU: ta (01:01 molaarinen suhde) 1 h (•), 8 h (▾) tai 48 h (X). F) Laskettu CI arvot FA = 0,9 HT-29-solujen altistettiin IRI /5-FU (01:01 moolisuhde) varten 1-72 tuntia. A-D) Jokainen piste edustaa keskiarvoa +/- keskihajonta (n = 3-9) 2-3 kokeissa jokainen valmis kolmena kappaleena. E, F) Kukin piste tai palkki on yhdistelmä indeksin arvo lasketaan sytotoksisuustiedot koottu 2-4 eri kokeesta, joista kukin täytetään kolmena kappaleena. CI 0,8-1,2 ehdottaa lisäaineen vuorovaikutuksia; CI 0,8 ehdottaa synergistiset vaikutukset; ja CI 1,2 ehdottaa antagonistisia vuorovaikutuksia.

sytotoksisia vaikutuksia yhdistelmien IRI /5-FU määritettiin HT-29-solujen eri valotusajoilla. Lyhyt valotusaika (1 h) tuotetaan voimakas antagonismi, ja Cl-arvot, joka on suurempi kuin 5 FA arvoja yli 0,1 (Fig. 1 E). Sen sijaan, synergia (CI-arvot olivat alle 0,8) havaittiin laajalla FA-arvot, kun valotusaika nostettiin 48 h. Klo FA arvo 0,9 (eli alamarBlue määritys osoitti arvo, joka oli 90% pienempi kuin todeta kyseisestä huumeettomista valvonta), CI-arvot olivat 10, 0,8, 0,9, ja 0,4, kun valotusaika oli 1, 8, 48, ja 72 h, vastaavasti (Fig. 1 F). Nämä tulokset viittaavat siihen, että valotusaika on tärkeä muuttuja harkitsemaan, kun yritetään mitata lääkeaineinteraktioita solu-pohjainen seulonta-analyysejä.

PK /BD Tutkimukset annon jälkeen 5-FU: n ja IRC ™ yksinään ja yhdistelmänä

in vivo

tutkimuksissa arvioidaan yhdistelmäefektit IRC ™ 5-FU, on tärkeää ensin onko yksi huumeiden muuttaa farmakokinetiikkaa tai biologisen jakautumisen käyttäytymistä muiden huumeiden, kun niitä samanaikaisesti (Fig. 2-4). Plasmasta poistumisen käyrät 5-FU annettiin yksin tai yhdessä IRC ™ on koottu kuvioon. 2A. Kun annetaan yksinään, 5-FU oli poistuu nopeasti ja plasman 5-FU oli vähemmän kuin 3% injektoidusta annoksesta 15 min injektion jälkeen. Plasman AUC

0-24h 5-FU, annetaan yhdessä IRC ™, oli lähes 10-kertainen nähty 5-FU annetaan yksinään, että tulos on ilmeisintä ajankohtina yli 1 h ( kuva 3A). Korkeampi plasman 5-FU-tasot liittyy myös korkeampi 5-FU maksassa, pernassa ja keuhkoissa, mutta ei munuaisissa (Fig. 3A). Tulokset viittaavat siihen, että 5-FU korjaava väheni, kun lääke annettiin samanaikaisesti (i.v.) IRC ™.

Hiiret injektoitiin i.v. radio-leimattu 5-FU: ta (40 mg /kg) tai IRC ™ (40 mg IRI /kg), tai molemmat aineet samanaikaisesti. Eri ajankohtina injektion jälkeen plasmapitoisuuksia 5-FU: n ja IRI (laktoni) määritettiin. A) keskimääräinen plasmassa 5-FU +/- keskihajonta (n = 4) antamisen jälkeen yksinään (kiinteä harmaa viiva) tai samanaikaisen antamisen jälkeen kanssa IRC ™ (kiinteä musta viiva). B) plasman keskimääräistä IRI laktonin +/- keskihajonta (n = 4) antamisen jälkeen IRC ™ yksinään (katkoviiva harmaa viiva) tai samanaikaisen antamisen jälkeen IRC ™ 5-FU (kiinteä musta viiva).

Hiiret injisoitiin iv radio-leimattu 5-FU (40 mg /kg; viivoitetut pylväät) tai IRC ™ (40 mg IRI /kg; mustat palkit), tai molemmat aineet samanaikaisesti (valkoiset pylväät). Eri ajankohtina injektion jälkeen plasman ja elinten pitoisuudet lipidin ja lääkkeen lajin määritettiin, ja AUC

0-24h arvot laskettiin saadusta pitoisuus-aika-käyrät. Tiedot esitetään keskimääräinen plasmassa ja elimen käyrän alla oleva ala (0-24 h) (n = 4) ja 5-FU (A), koko lipidi (B), IRI laktoni (C), IRI karboksylaatti (D), ja SN-38 laktoni (E).

Hiiret injektoitiin ip 5-FU (16 mg /kg) päivinä 1 ja 2 (harmaa viiva /bar); 5-FU on terästettiin radioleimatun 5-FU päivänä 2. Puolet hiiriin injektoitiin myös i.v. IRC ™ (60 mg IRI /kg) päivänä 1 (musta viiva /baari), 2 tunnin kuluttua injektion 5-FU. Eri ajankohtina injektion jälkeen plasman ja kudosten pitoisuuksia 5-FU määritettiin, ja AUC

0-8h arvot laskettiin saadusta pitoisuus-aika-käyrät. Tulokset esitetään keskimääräinen pitoisuus 5-FU maksassa (A), perna (B), keuhkojen (C), munuaisen (D), plasman (E) +/- standardipoikkeama (n = 3), tai keskimääräiset plasman ja elimen AUC (0-8 h) (n = 3) 5-FU (F).

eliminaation käyrät IRI laktoni antamisen jälkeen Irc ™ yksinään tai yhdessä 5-FU: n, on esitetty kuviossa. 2B. Varhaisessa ajankohtina jopa 4 tuntia injektion jälkeen, oli pieni, mutta merkittävä, lasku plasman IRI laktonin eläimille ruiskutettiin Irc ™ yhdessä 5-FU, versus irc ™ yksin; klo 8 ja 24 tunnin ajankohtina, selvemmin vähentää plasman IRI laktoni tasot havaittiin hiirillä, jotka annettiin samanaikaisesti IRC ™ /5-FU, verrattuna ainoana lääkkeenä Irc ™. Kuitenkin, kun arvioidaan plasman AUC

0-24h tiedot lasketaan liposomaalinen lipidien (Fig. 3B), IRI laktonimuodossa (Fig. 3C) tai karboksylaatti muodossa (Fig. 3d), ja SN-38 laktoni lomake (Kuva. 3E) arvot olivat vastaavat pääosin plasman AUC

0-24h määrittää annon jälkeen Irc ™ yksin. Tämä heijastui myös kudoksen AUC

0-24h tiedot (Fig. 3B-E), lukuun ottamatta perna, jossa kohonneet IRI laktonin ja IRI karboksylaattia havaittiin annettaessa samanaikaisesti (iv) IRC ™ /5-FU, suhteessa Irc ™ yksin. HPLC-analyysi IRI ja SN-38 maksassa ei voitu suorittaa eläimille annettiin IRC ™ IRC ™ /5-FU, koska spektrin häiriöitä tuntemattomasta molekyylistä, joka oli mukana uutetaan IRI ja SN-38 maksan naattia. Vaikka määritystä käytetään näissä tutkimuksissa oli pystyvät havaitsemaan SN-38: n karboksylaatti muodossa, se ei havaittu mitään plasma- tai kudosnäytteitä yläpuolella HPLC detektioraja 10 ng /ml.

tehoa koskevat tutkimukset kuvattu alla arvioi aktiivisuutta 5-FU (yksin ja yhdistelmänä) käyttäen annosta intensiivinen (päivittäin) aikataulu, aikataulu minkä vuoksi oli tarpeen lääkkeen antamiseksi vatsaonteloon. Muutos PK /BD edellä mainittiin, kun lääkkeet sekä laskimoon, oli myös odotetaan olevan vähemmän ongelmia, kun IRC ™ annettiin i.v. ja 5-FU annettiin i.p. Tulokset esitetty kuvassa. 4 puuttua tähän tutkimuksen suunnittelu. Yhdenmukainen-tulokset kuviossa. 3, tulokset viittaavat siihen, ainakin alussa ajankohtina, että plasman ja elinten pitoisuuksia 5-FU on korkeampi, kun IRC ™ annetaan yhdistelmänä 5-FU. Tämä vaikutus oli vähemmän ilmeinen kuin annostellessaan molemmat lääkkeet i.v., kuten 5-FU pitoisuudet eivät olleet tilastollisesti erilaisia ​​korkeintaan ajankohtina yli 2 tuntia. Kuitenkin 0,5 h injektion jälkeen 5-FU pitoisuudet olivat korkeammat maksassa (P 0,001; Fig. 4A), keuhkojen (P 0,05; Fig. 4C), munuainen (P 0,001; Fig. 4D) ja plasmassa (P 0,05; Fig. 4E) hiirten annettiin IRC ™ /5-FU, suhteessa niihin eläimiin, jotka saivat 5-FU yksin. Verrattuna eläimiin injektoitiin 5-FU ainoana lääkkeenä, kun hiiret saivat yhdistelmä IRC ™ /5-FU, 2-kertaa suurempi pitoisuuksia 5-FU havaittiin maksassa 0,5 h (P 0,001) ja 1 h (P 0,01) injektion jälkeen, ja vastaava lisäys maksan AUC

0-8h 5-FU (Fig. 4F) havaittiin myös. AUC

0-8h 5-FU plasmassa (Fig. 4F) oli ~1.5 kertaa suurempi annon jälkeen IRC ™ /5-FU, verrattuna eläimiin annetaan 5-FU yksin.