Krooninen sairaus

tiivistelmä

Aberrant aktivoitumisen Wnt /β-kateniinin reitti on kriittinen taudin alkamisen ja etenemisen useimmissa paksusuolen syövät. Tämä aktivointi provosoi kertymistä ydin- β-kateniinin ja induktio sen kohdegeenien.

APC

min /+

hiiret ovat yleisimmin käytetty malli paksusuolen syöpä. He satama mutatoitunut

APC

alleeli ja kehittää suoliston adenoomien ja karsinoomien ensimmäisten elinkuukausien. Tämä fenotyyppi johtuu mutaatio toisen

APC

alleeli ja seurauksena kertyminen ydin- β-kateniinin kyseisillä soluissa. Ohessa kuvataan, että D-vitamiinin reseptorin (VDR) on keskeinen modulaattori ydin- β-kateniinin tasoilla paksusuolensyöpä

in vivo

. Sopivalla kasvatus

APC

min /+

hiirillä ja

VDR

+/-

hiirillä meillä syntyy eläimet ilmentävät mutatoitunut

APC

alleeli ja kaksi , yksi tai ei yhtään

VDR

villityypin alleelit. Puute

VDR

lisäsi paksusuolen Aberrant Crypt Foci (ACF), mutta ei, kun adenoomien tai karsinoomien joko ohutsuolen tai paksusuolen. Tärkeää on, paksusuoli ACF ja kasvainten

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä oli lisääntynyt ydinvoiman β-kateniinin ja kasvaimet saavutti suuremman koon kuin

APC

min /+ VDR

+ /+

. Sekä ACF ja karsinoomien

APC

min /+ VDR

– /-

hiiret osoittivat korkeampia ilmentymistä β-kateniinin /TCF kohdegeenien. Tämän mukaisesti,

VDR

knock-down viljellyissä ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa parannettu β-kateniinin ydin- sisältöä ja kohdegeenin ilmentymisen. Johdonmukaisesti,

VDR

ehtyminen kumosi kapasiteetti 1,25 (OH)

2D

3 edistää siirtäminen β-kateniinin tumasta solukalvon ja estää β-kateniinin /TCF kohdegeenien. Lopuksi VDR ohjaa tasoa ydin- β-kateniinin koolonkarsinoomasoluissa ja voi näin ollen vaimentaa vaikutusta onkogeenisten mutaatioita, jotka aktivoivat Wnt /β-kateniinin reitin.

Citation: Larriba MJ, Ordóñez-Morán P , Chicote I, Martín-Fernández G, Puig I Muñoz A, et al. (2011) D-vitamiini- reseptoriin puutos Parantaa Wnt /β-kateniinin Merkinanto ja tuumoritaakka Colon Cancer. PLoS ONE 6 (8): e23524. doi: 10,1371 /journal.pone.0023524

Editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Yhdysvallat

vastaanotettu: 23 maaliskuu 2011; Hyväksytty: 19 heinäkuu 2011; Julkaistu: 15 elokuu 2011

Copyright: © 2011 Larriba et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Fondo de Investigación Sanitaria-Instituto de Salud Carlos III (ISCIII, PI081356), Vall d’Hebron syöpäinstituutti, Olga Torres Foundation, Fundación de la Asociación Española de Lucha Contra el Cancer (AECC), Ministerio de Ciencia e Innovación (SAF2010-18302) ja Red Temática de Investigación Cooperativa en syöpä (ISCIII, RD06 /0020/0009). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Colon syöpä on toiseksi yleisin kuolinsyy syöpään kehittyneissä maissa [1]. Todennäköisesti, tiedämme lisää geneettisiä muutoksia aiheuttavat paksusuolensyöpä kuin mikä tahansa kiinteä kasvain. Mutaatiot

APC Twitter /adenomatoottisen polypoosin coli,

CTNNB1 Twitter /β-kateniinin tai

ak- siini

geenejä, jotka aktivoivat Wnt /β-kateniinin koulutusjakson vastaavat aloittamisen eniten paksusuolen syövät [2]. Ensimmäisessä vaiheessa paksusuolen kasvaimen kehittymisen liittyy muodostumista Aberrant crypt Foci (ACF), joka myöhemmin edetä adenooma [3]. Posterior malignization of adenooma sinoomaan edellyttää hankkia uusia muutoksia geenejä, jotka liittyvät Wnt /β-kateniinin signalointi tai kuuluvat muihin polkuja, jotka toimivat synergistisesti prosessiin [2].

APC

min /+

hiirillä kätkeminen iturataa inaktivoiva mutaatio yhdessä

APC

alleeli kehittää useita suoliston adenoomien ja karsinoomien kolmen kuukauden iässä [4]. Tämä fenotyyppi tapahtuu seurauksena spontaanin mutaation jäljellä

Apc

alleelin (heterotsygoottisuuden menetys) ja aktivointi Wnt /β-kateniinin signalointireitin. Tämä hiiri malli on tullut kultakantaan suoliston syövän aloittamisesta.

Wnt /β-kateniinin reitin säätelee kykyä β-kateniinin proteiinin ajaa sääntelyn erityisiä kohdegeenien [5], [6]. Lyhyesti, in puuttuessa Wnt-signaali tai aktivoivat mutaatiot, β-kateniinin on läsnä vain sitoutuu E-kadheriinin solujen väliseen

vyöliitos

, kuten vapaan proteiini fosforyloituu nopeasti mukaan kaseiinikinaasin-Iβ ( CK-Iα) (Ser45) ja glykogeenisyntaasikinaasi-3 (GSK-3β) (Ser33, Ser37 ja Thr41) kanssa muodostaman kompleksin myös tuumorisuppressorigeenin proteiinien APC ja ak- siini. Fosforylaatio tarrat p-kateniinin varten ubikinaation ja hajoamista proteasomista [7]. Tällaisissa perusolosuhteissa DNA: han sitoutuneen T-solun tekijän /lymfaattisen tehostajana tekijä (TCF /LEF) proteiinien vuorovaikutuksessa transkription korepressoreiden estää kohdegeenin ilmentymisen tumassa. Sitovat Wnt-ligandien niiden solupintareseptorikomplekseihin (Frizzled-LRP) johtaa rekrytointi sytoplasmisen ak- siini, että solukalvon, aktivointi Dishevelled proteiinia ja muut ominaisuudet eivät ole vaikutuksia, jotka johtavat eston β-kateniinin fosforylaation. Tämä mahdollistaa β-kateniinin kerätä ja syöttää tumaan, missä se vaikuttaa TCF /LEF perheenjäseniä ja aiheuttaa aktivoitumisen niiden muuten tukahdutettua kohdegeenien [5], [7]. Wnt /β-kateniinin polku on tärkein liikkeellepaneva voima leviämisen epiteelisolujen paksusuolessa ja on tärkeää ylläpitämiseksi kantaisä osastojen [8], [9]. Kuitenkin, mutaatiot löytyy paksusuolensyöpä johtaa poikkeavaan aktivointi reitin ja indusoivat konstitutiivista ilmentämistä sen kohdegeenien (pääasiassa osallistuvat solujen proliferaation ja erilaistamattomuuden), jolloin muodostuu hyvänlaatuinen vielä pitkäikäisen adenoomia. Kertyminen geneettisiä ja epigeneettiset muutokset polttoaineiden syövän etenemiseen.

Monet epidemiologiset ja kokeelliset tutkimukset osoittavat, että D-vitamiini

3 (kolekalsiferoli), sen aktiivisin aineenvaihduntatuote 1α, 25-dihydroksi-D

3 (kalsitrioliksi , 1,25 (OH)

2D

3) ja useat analogit suojautua paksusuolisyövän [10] – [12]. Olemme raportoineet, että 1,25 (OH)

2D

3 estää proliferaatiota ja edistää epiteelisolujen erilaistumista ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa indusoimalla ilmaus E-kadheriinin ja vastavaikuttamalla Wnt /β-kateniinin reitin. Jälkimmäinen on seurausta kahdesta mekanismit: a) induktio suora sitoutuminen D-vitamiinin reseptorin (VDR) ja p-kateniinin, joka estää muodostumista transkriptionaalisesti aktiivisen β-kateniinin /TCF komplekseja, ja b) aiheuttaa β kateniinin tumasta ja relocalization solukalvolla

vyöliitos

seurauksena E-kadheriinin ilmentymisen lisääntyminen [13]. Lisäksi, 1,25 (OH)

2D

3 lisää ekspressiota DICKKOPF-1 (DKK1), erittyvä proteiini, joka inhiboi Wnt signalointia sen solukalvon reseptorit [14]. Olemme myös kuvattu, että ihmisen

VDR

geeni on välittömänä kohteena SNAIL1 ja SNAIL2 /SLUG transkriptio repressors, ja että VDR ilmaisun paksusuolen syöpäpotilaiden heikkenee myöhemmissä vaiheissa taudin liittyvät säätely näiden tekijöiden [15], [16]. Niinpä suuren SNAIL1 /2 ilmentymisen viljellyissä koolonkarsinoomasoluissa lisää β-kateniinin transkription aktiivisuutta tukahduta VDR ilmentyminen ja sen antagonistista aktiivisuutta Wnt /β-kateniinin signalointi [16], [17].

β-kateniinin on laaja valikoima dalmatialaistäpläisiä, joita ei todennäköisesti voida selittää pelkästään modulaatio TCF /LEF toimintaa. Näin ollen, β-kateniinin on hiljattain kuvattu sitoa useita transkriptiotekijät tumareseptorisuperperheen ja homeobox proteiinit [13], [18], [19]. Useimmissa tapauksissa β-kateniinin sitovia parantaa transkriptionaalista aktiivisuutta näiden tekijöiden ja vaikuttaa ilmentymistä vaihtoehtoisia tai täydentäviä sarjaa kohdegeenien osallistuvat solujen kohtalon päätöksiä pitkin kehitystä, kudoksen homeostaasiin, tai syöpä [19], [20]. Meidän alustava kuvaus suoran vuorovaikutuksen β-kateniinin kanssa VDR ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa on vahvistettu muissa solujärjestelmiin [21] – [24]. β-kateniinin /VDR vuorovaikutus liittyy aktivaattori toiminto-2 (AF-2) transaktivaatiodomeenin VDR ja C-terminaalisen domeenin β-kateniinin [21]. Hiiren iho, β-kateniinin /VDR ohjaa kohdegeenien, epiteelin kantasolujen kohtalo ja kasvainten kehittymiseen [20]. Tässä järjestelmässä, lisääntynyt ydinvoiman β-kateniinin edistänyt kasvain aloittamisesta kun VDR ligandien suojautua syöpää vähentämällä vahvuus Wnt /β-kateniinin signalointi [20]. Tämän mukaisesti, hoidossa

APC

min /+

hiiriä 1,25 (OH)

2D

3 tai analogeja vähentää kasvaimen kuormitusta [25] tai polyyppi numeron ja kuorma [ ,,,0],26].

on tärkeää korostaa, että taso β-kateniinin tumassa määritellä vahvuus Wnt-signaalin ja tämän seurauksena kohtaloa tai käyttäytymistä useita erilaisia ​​normaalien ja kasvainsolujen [5], [27]. Sen lisäksi, että aktivoivat mutaatiot Wnt /β-kateniinin reitin osat, muut geneettiset muutokset kuten mutaatiot

K-RAS

[28] tai aktivoitumista onkogeenisten reittejä kuten HGF /c-Met signalointi [29] parantaa ydin- p-kateniinin kerääntyminen aikana paksusuolen syövän etenemisessä. Tällaisessa skenaariossa aineet pystyvät vähentää β-kateniinin ydin- sisältöä ja siten vaimentaa Wnt /β-kateniinin signaali voitaisiin mahdollisesti käyttää syövän hoidossa, kunhan kasvainsolujen näyttää Wnt-reitin riippuvuus.

Tässä tutkimuksessa seurausten arvioimiseksi

VDR

puutos aloittamisesta ja kehittämisestä suoliston syövän vetämänä aktivoituminen Wnt /β-kateniinin reitin. Vaikutus

VDR

puuttuminen on analysoitu sekä

in vivo

ja

in vitro

: kasvaimissa syntyy

APC

min /+ VDR

– /-

hiiret ja viljellyissä ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, joissa

VDR

ilmentyminen tippuu alas avulla shRNA. Lisäksi olemme tutkineet vaikutusta VDR saatetaan käyttökuntoon VDR-negatiivinen ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa. Tuloksemme luoda suora yhteys VDR toiminta ja ydin- β-kateniinin tasoja, jotka on olennaisen tärkeää valvoa toimintaa Wnt /β-kateniinin signalointi paksusuolisyövän

in vivo

.

Tulokset

käyttäen käytettävissä

APC

min /+

ja

VDR

+/-

hiiret me syntyy sopiva risteykset

APC

min /+ VDR

+ /+, APC

min /+ VDR

+/-

ja

APC

min /+ VDR

– /-

eläimiä. Histologinen analyysi viiden kuukauden iässä osoitti, että

VDR

puutos ei vaikuttanut kokonaismäärä kasvainten

APC

min /+

hiirillä, joko ohutsuolessa tai paksusuolessa (Kuva 1a, 1b). Sen sijaan paksusuolen kasvaimista

APC

min /+ VDR

– /-

hiiret olivat huomattavasti suuremmat kuin

APC

min /+ VDR

+ /+

tai

APC

min /+ VDR

+/-

hiirillä (kuva 1c). Vaikka erilaisia ​​kooltaan, paksusuolen adenoomien ja karsinoomien oli histopatologisesti sama kaikissa hiirissä riippumatta niiden VDR asemasta (kuvio 1 d). Lisäksi määrä paksusuolen ACF oli korkeampi

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä kuin

APC

min /+ VDR

+ /+

tai

APC

min /+ VDR

+/-

hiirillä (kuva 2a).

kokonaismäärä (adenoomia ja karsinoomia) ohutsuolessa (a) tai paksusuolessa (b) on

APC

min /+ VDR

+ /+

,

APC

min /+ VDR

+/-

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä. Jokainen piste vastaa yhtä hiiren analysoitava ja vaakasuora viiva osoittaa keskimääräistä. (C) koko paksusuolen (adenoomia ja karsinoomia) alkaen

APC

min /+ VDR

+ /+

,

APC

min /+ VDR

+ /-

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä. Jokainen piste vastaa yhtä kasvain analysoitava ja vaakasuora viiva osoittaa keskimääräistä. P-arvo yksisuuntaista ANOVA näytetään. Tähdet osoittavat merkittäviä eroja ryhmien välillä, kun Bonferroni monivertailu testin jälkeen. (D) edustaja hematoksyliini /eosiinivärjäykset kuvia paksusuolikarsinoomat alkaen

APC

min /+ VDR

+ /+

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä. Mittakaava, 300 pm.

(a) kokonaismäärä paksusuolen ACF in

APC

min /+ VDR

+ /+

,

APC

min /+ VDR

+/-

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä. Jokainen piste vastaa yhtä hiiren analysoitava ja vaakasuora viiva osoittaa keskimääräistä. (B) ylempi paneeli, edustaja hematoksyliinillä /eosiinilla värjäys kuvia paksusuolen ACF in

APC

min /+ VDR

+ /+

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirissä. Arrowheads osoittavat ACF. Mittakaava, 50 pm. Lähi-paneelit, edustaja immunofluoresenssilla kuvat osoittavat β-kateniinin ilmaisun ja lokalisointiin paksusuolen ACF alkaen

APC

min /+ VDR

+ /+

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä. Arrowheads osoittavat ACF. Mittakaava, 100 pm. Ala paneelit ovat suurennuksella keski paneelit. Mittakaava, 50 pm. (C) kvantifiointi β-kateniinin ydinvoiman tasolla paksusuolen ACF alkaen

APC

min /+ VDR

+ /+

,

APC

min /+ VDR

+ /-

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä. Jokainen piste vastaa yhtä leesion analysoitava ja vaakasuora viiva osoittaa keskimääräistä. (D) kvantifiointi β-kateniinin ydinvoiman tasolla paksusuolen adenoomien ja karsinoomien välillä

APC

min /+ VDR

+ /+

,

APC

min /+ VDR

+/-

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä. Jokainen piste vastaa yhtä leesion analysoitava ja vaakasuora viiva osoittaa keskimääräistä. (A, c, d) p-arvot yksisuuntainen ANOVA on esitetty. Tähdet osoittavat merkittäviä eroja ryhmien välillä, kun Bonferroni monivertailu testin jälkeen.

Seuraavaksi arvioimme tilan Wnt-reitin aktivaation koolonin vammojen analysoimalla β-kateniinin ilme. Vaikka ACF in

APC

min /+ VDR

+ /+

,

APC

min /+ VDR

+/-

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiiret olivat erottamattomat hematoksyliinillä /eosiinilla (H /E) värjäystä, havaitsimme nettolisäystä ydin- ja soluliman β-kateniinin tasoilla täydellinen puuttuminen

VDR

(kuvio 2b). Kun taas β-kateniinin värjäys oli korkea ja varsin homogeeninen solujen välille ACF (kuva 2b), se oli hyvin vaihteleva karsinoomat kolmenlaisia ​​eläinten (kuva S1a). Tämä ilmiö on havaittu myös ihmisen ensisijainen paksusuolikarsinoomat (kuvio S1B), jossa taso ydin- β-kateniinin on heterogeeninen ja luultavasti määrittelee Tuumorigeenisuustutkimuksissa eri populaatioissa syöpäsolujen läsnä kasvain [29]. Tämä heterogeenisuus saattaa selittää, miksi tilastollisesti merkittävän kasvun ydin- β-kateniinin tason todettiin ACF on

APC

min /+ VDR

– /-

verrattuna

APC

min /+ VDR

+ /+

tai

APC

min /+ VDR

+/-

hiirillä (kuva 2c), mutta vain pieni suuntaus oli nähtävissä adenoomien ja karsinoomat (kuvio 2d).

Osoittaakseen välistä syy-yhteyttä

VDR

menetys ja lisääntyminen ydin- β-kateniinin, tutkimme SW480-ADH ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, joissa

VDR

oli tippuu alas avulla shRNA. Nämä solut satama useimmat geneettisiä poikkeavuuksia, jotka luonnehtivat kehittyneen paksusuolen syövät, kuten mutaation

APC

ja

TP53

tuumorisuppressorigeeneille, aktivointi

K-RAS

onkogeeni ja

c-MYC

vahvistus [13]. Yhteisymmärryksessä

in vivo

tuloksiin, voimakas lisääntyminen ydin- β-kateniinin pitoisuus havaittiin shVDR SW480-ADH soluja verrattuna shControl soluihin (kuvio 3a, 3b). Lisäksi

VDR

knock-down kumosi kapasiteetti 1,25 (OH)

2D

3 aiheuttavan E-kadheriinin ilmentymisen ja β-kateniinin siirtäminen tumasta plasmamembraanin läpi ( kuvio 3a). Myös

VDR

knock-down esti uudelleenjärjestelystä β-tubuliinin solun tukirangan ja muutoksen solun morfologiassa aiheuttama 1,25 (OH)

2D

3, joka johtaa muodostumista kompakti epithelioid saaret (kuva 3b).

edustaja immunofluoresenssilla kuvat osoittavat β-kateniinin ja E-kadheriinin (a) tai β-kateniinin ja β-tubuliinin (b) ilmaisun ja lokalisointiin SW480-ADH solut infektoitu lentivirukset ilmentävien shVDR tai shControl ja käsiteltiin 1,25 (OH)

2D

3 tai ajoneuvon 72 tuntia. Mittakaava, 20 pm.

halusi analysoida onko tason nostaminen ydinvoiman β-kateniinin käännetty vahvempi Wnt /β-kateniinin signalointi. Tätä varten tutkittiin β-kateniinin /TCF-riippuvaisen transkription paksusuolen syöpäsoluissa. shControl ja shVDR SW480-ADH-solut infektoitiin Lentiviruksiin koodaavan toimittaja eGFP proteiini valvonnassa seitsemän kopiota yksimielisyys TCF /LEF sitoutumiskohta (kuva 4a) [30]. Läsnäolo lentiviruksen konstrukti punainen fluoresoiva proteiini mCherry ohjaa konstitutiivinen promoottori saa tunnistaa infektoituneita soluja fluoresenssimikroskoopilla ja virtaussytometrialla. Samoin p-kateniinin värjäytymisen koolontuumoreissa, löysimme tiettyjä heterogeenisyys β-kateniinin /TCF aktiivisuus joukossa soluviljelmässä: muuttuja eGFP ilmentyminen yhtä infektoituneita soluja (kuvio 4b). Analyysi koko solupopulaation virtaussytometrialla osoitti, että osuus korkean eGFP-soluja oli parempi shVDR kuin shControl soluviljelmissä (kuvio 4c). Lisäksi shVDR solut oli merkittävästi suurempi eGFP signaali keskimäärin kuin shControl soluja (kuvio 4d). Olemme myös havainneet, että lasku eGFP keskittymisen aiheuttaman 1,25 (OH)

2D

3 shControl soluissa (vähentäminen prosenttiosuus korkea-eGFP solujen ja eGFP signaalin keskiarvo) oli vaimentunut shVDR soluissa ( Kuva 4c, 4d).

(a) kaavio 7xTCF /LEF-eGFP-SV40-mCherry lentiviraalinen konstruktia käytettiin infektoimaan shControl ja shVDR SW480-ADH soluissa. (B) edustaja faasikontrasti- ja fluoresenssi kuvat osoittavat ilmentymisen eGFP ja mCherry in SW480-ADH-solut infektoitiin 7xTCF /LEF-eGFP-SV40-mCherry vektori. Arrowheads osoittavat samalla tartunnan saaneiden solujen, jotka on vaihteleva ilmentyminen eGFP. Mittaviivat 20 um. (C) Virtaussytometrianalyysi eGFP ilmentymisen shControl ja shVDR SW480-ADH-solut infektoitiin (mCherry positiivinen) kanssa 7xTCF /LEF-eGFP-SV40-mCherry vektori ja käsiteltiin 1,25 (OH)

2D

3 tai ajoneuvon 96 tuntia. Solujen prosenttiosuus kussakin portti on merkitty. (D) määrän määrittäminen virtaussytometrialla tiedot osoittavat keskimäärin ilmaus eGFP infektoituneessa mCherry-positiivisia soluja. Tiedot vastaavat kolmen erillisen kokeen. P-arvo yksisuuntaista ANOVA näytetään. Tähdet osoittavat merkittäviä eroja ryhmien välillä, kun Bonferroni monivertailu testin jälkeen. (E) analyysi qRT-PCR

VDR

,

AXIN2

,

LEF1

ja

c-MYC

mRNA: n ekspression shControl ja shVDR SW480- ADH solut käsiteltiin 1,25 (OH)

2D

3 tai ajoneuvon 48 tuntia. Geometrinen keskiarvo ilmentymisen SDHA ja TBP siivous geenejä käytettiin RNA: n ilmentymisen normalisoinnin kuten on esitetty materiaalit ja menetelmät. -luvut Inhibition 1,25 (OH) 2D3 kohtelun kussakin solutyypissä. Tiedot vastaavat kolmen erillisen kokeen.

On tärkeää, että korkeus ydinvoiman β-kateniinin tasoja näkyi suurentunut ilmentyminen useiden β-kateniinin /TCF kohdegeenien: qRT-PCR-analyysi paljasti suurempia

AXIN2

,

LEF1

ja

c-MYC

mRNA shVDR kuin shControl soluissa (kuvio 4e). Lisäksi esto ilmentymisen β-kateniinin /TCF kohdegeenien 1,25 (OH)

2D

3 pelkistettiin shVDR soluissa (kuvio 4e). Vähentää VDR ilmentymisen shRNA analysoitiin myös qRT-PCR: llä (kuvio 4e) ja käännetään havaita proteiinin tasot ([31], ja tietoja ei ole esitetty). Kontrollina tutkittiin ekspressiota

CDH1

/E-kadheriinin ja

CYP24A1

näissä soluissa, kaksi 1,25 (OH)

2D

3 kohdegeenien. Induktio Molempien geenien rajusti inhiboitui shVDR soluissa (kuvio S2a).

Seuraavaksi laajentaneet tutkimuksia muiden ihmisen paksusuolen syövän solulinjat.

VDR

knock-down in HCT116 ja HT29 myös edistänyt kasvua ydin- β-kateniinin tasoja (kuvio S2b) ja aktivoituminen TCF /LEF-riippuvaisen transkription (kuvio S2C), mikä johtaa korkeampaan ilmaus β-kateniinin kohdegeenien

AXIN2

ja

DKK1

(kuvio S2D). Tällainen geeni asetus liitteenä on yleinen menetys epiteelin organisaation (kuvio S2b). Kuten odotettua, vähentäminen

VDR

ilmaisu tukossa kapasiteetti 1,25 (OH)

2D

3 aiheuttamaan sen kohdegeenin

CYP24A1

(kuvio S2D). Kuitenkin, ja päinvastoin tietoihin SW480-ADH soluja, 1,25 (OH)

2D

3 ei ollut vaikutusta β-kateniinin sijainti tai transkriptionaalista aktiivisuutta HCT116 ja HT29 (kuvio S2D ja tietoja ei ole esitetty) . Syynä voi olla, että nämä solut ilmentävät korkeaa E-kadheriinin ja siten β-kateniinin sijaitsee solukalvon puuttuessa 1,25 (OH)

2D

3.

ohimenevä ilmentyminen eksogeenisten villityypin VDR in VDR-negatiivinen ihmisen SW620 metastaattinen paksusuolen syöpäsoluissa vähensivät ydinvoiman β-kateniinin tasoja (kuva S3). Sitä vastoin, VDR- ΔAF2 ja VDR-L417S mutantit, jotka eivät kykene sitoutumaan β-kateniinin ja rekrytoida klassisen koaktivaattoreiden [21] ei ole muuta ydin- sisältöä β-kateniinin (kuvio S3). Samoin ilmaus VDR mutantti ei kyennyt sitoutumaan klassisen koaktivaattoreiden, mutta kykenevä sitomaan β-kateniinin (VDR-E420Q) [21] ei ollut vaikutusta β-kateniinin ydin- sisällön SW620-soluissa (kuvio S3).

havaittu ydin- β-kateniinin pitoisuus

VDR

knock-down ei ole seurausta vähentyneestä aktiivisuudesta kinaasien CK-Iα tai GSK-3β, koska taso β-kateniinin fosforylaation Ser45 tai Ser33 /Ser37 /Thr41 oli muuttumattomina shVDR SW480-ADH-solut (kuvio S4a). Koska β-kateniinin fosforylaation Ser552 ja Ser675 proteiinikinaasi A: n ja /tai AKT on ehdotettu edistämään β-kateniinin ydin- sijainti ja /tai transkriptionaalisen aktiivisuuden [32] – [34], analysoimme myös sitä mahdollisuutta, että nämä kinaasit osallistuvat in vaikutus VDR knock alaspäin β-kateniinin. Huomasimme, että β-kateniinin fosforylaation Ser552 ja Ser675 pienennettiin shVDR SW480-ADH-solut (kuva S4).

Seuraavaksi pyrimme vahvistamaan vaikutusta VDR vajauksen β-kateniinin kohdegeenien

in vivo

. Tätä varten me analysoitiin immunofluoresenssilla ja määrällisesti ekspressiotaso kahden β-kateniinin /TCF kohdegeenien (

CCND1 Twitter /sykliini D1 ja

Lef1

) paksusuolen ACF ja karsinoomat on

APC

min /+ VDR

+ /+

,

APC

min /+ VDR

+/-

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä. Näin ollen tietojen kanssa viljellyistä soluista, merkittävästi lisätä ilmentymistä sekä geenituotteiden havaittiin leesioita

APC

min /+ VDR

– /-

hiirissä (kuvio 5).

kvantifiointi sykliini D1 (a) ja Lef1 (d) proteiini ilmentyminen paksusuolen leesioita päässä

APC

min /+ VDR

+ /+

,

APC

min /+ VDR

+/-

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä. Jokainen piste vastaa yhtä leesion analysoitava ja vaakasuora viiva osoittaa keskimääräistä. P-arvot yksisuuntaista ANOVA näkyvät. Tähdet osoittavat merkittäviä eroja ryhmien välillä, kun Bonferroni monivertailu testin jälkeen. Edustavia immunofluoresenssilla kuvat osoittavat β-kateniinin ja sykliini D1 (b, c) tai β-kateniinin ja Lef1 (e, f) ilmentyminen ja lokalisointiin paksusuolen ACF (b, e) ja karsinoomien (c, f) alkaen

APC

min /+ VDR

+ /+

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä. Mittaviivat 50 pm (b, e) ja 200 um (c, f). Tähdet osoittavat epäspesifistä värjäytymistä.

Lopuksi olemme analysoineet erottelua ACF ja karsinoomien paksusuolessa läsnäolevat on

APC

min /+ VDR

+ /+

,

APC

min /+ VDR

+/-

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä. Vasta-aineet sytokeratiineja (pan-sytokeratiini) ja villin1 merkkiaineina epiteelisolujen erilaistumisen käytettiin (kuvio S5). ACF ilmaisi hyvin alhainen näiden proteiinien odotetusti kantaisä fenotyyppi asettamat korkeat Wnt /β-kateniinin signalointia (kuva 6a, 6b). Karsinoomissa ilmentymistä sekä markkereita oli heterogeeninen (kuvio 6c, 6d), joka yhtyy heterogeeninen ilmentymisen β-kateniinin aiemmin on kuvattu (kuvio S1a). Ei merkittäviä eroja ilmaus sytokeratiineja ja villin1 välillä ei havaittu vaurioita on

APC

min /+ VDR

+ /+

,

APC

min /+ VDR

+/-

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirissä, mikä viittaa siihen, että nämä kaksi differentiaatiomarkkerien menetetään varhaisessa vaiheessa paksusuolen kasvainten synnyssä, todennäköisesti seurauksena ensimmäisen aktivoinnin Wnt /β-kateniinin reitin.

edustaja immunofluoresenssilla kuvat osoittavat β-kateniinin ja villin1 (a, c) tai β-kateniinin ja pan-sytokeratiini (b, d) ilmaisun ja lokalisointiin paksusuolen ACF (a , b) ja karsinoomien (c, d) alkaen

APC

min /+ VDR

+ /+

ja

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä. Pisteviiva-linjat rajata ACF. Numerot osoittavat alueita eri mallia ilmentymisen analysoitu proteiinien saman kasvain: 1) korkea β-kateniinin, matala villin1 /sytokeratiineja; 2) alhainen β-kateniinin, korkea villin1 /sytokeratiineja. Mittaviivat 50 um (a, b) ja 200 um (c, d).

Keskustelu

taso ydin- β-kateniinin määrittelee vahvuus Wnt /β kateniinin signalointi ja seurauksena kohtalo ja fenotyypin monentyyppistä normaalien ja syöpäsolujen. Poikkeava aktivaatio Wnt /β-kateniinin signalointi muutosten vuoksi komponenttien koulutusjakson vastaa aloittamisesta Useimmat ihmisen paksusuolen syövät, jossa korostetaan valvoa ydin- β-kateniinin kerääntyminen [28], [29], [35] . Vaikka aloittamisen paksusuolen kasvaimen kehittymisen pidetään klonaalinen [36], paksusuolikarsinoomat näyttää pitkälti heterogeeninen ydin- β-kateniinin ilme. Tätä kutsutaan β-kateniinin paradoksi ja johtanut etsimään vaihtoehtoisia väyliä moduloimiseksi β-kateniinin sijainti ja toiminta. Niistä

K-RAS

mutaatio ja myofibroblasteja johdettuja HGF on äskettäin ehdotettu lisätä β-kateniinin ydin- sisältöä [28], [29].

Hyvin vähän tiedetään mekanismeja vähentää taso β-kateniinin tumassa. Olemme kuvanneet, että 1,25 (OH)

2D

3 ja useita vähemmän kalseemista analogit häiritsevät Wnt /β-kateniinin reitin sarjassa ihmisen paksusuolen syövän solulinjojen useita eri: ne lisäävät sitoutumisen VDR ja p-kateniinin haittaavat muodostumista β-kateniinin /TCF-kompleksit, ilmentymisen indusoimiseksi Wnt inhibiittorin DKK1, ja edistää siirtäminen β-kateniinin tumasta kohti solukalvon jossa se sitoutuu E-kadheriinin osoitteessa

adherens liittymissä

[13], [14]. Otaksuttu mekanismit Jälkimmäisen vaikutuksen kuuluu induktioon β-kateniinin tumasta tai eristää vasta syntetisoitu ja /tai soluliman β-kateniinin proteiinin E-kadheriinin, jonka ilmentymistä voimakkaasti indusoi 1,25 (OH)

2D

3. Toinen mekanismi, Wnt /β-kateniinin inhibitio paksusuolensyöpä on ehdottanut Kaler ja työtoverit .: 1,25 (OH)

2D

3 vähentää synteesiä ja erittymistä THP-1-makrofageissa interleukiini-1β, sytokiinia, joka aktivoi Wnt /β-kateniinin väylän koolonkarsinoomasoluissa kautta saarron β-kateniinin fosforylaation GSK-3β [37]. Kuitenkin toiminta kaikkien näiden solujen autonominen ja ei-solu-autonominen mekanismit

in vivo

jäi tuntemattomaksi.

Tässä tutkimuksessa tutkittiin,

VDR

puute muuttuu β kateniinin ydin- sisältö ja Wnt /β-kateniinin väylän yleisimmin käytetty eläinmalli paksusuolensyöpä,

APC

min /+

hiirillä. Tuloksemme osoittavat, että

VDR

puute

APC

min /+

hiirillä kasvaa ydinaseiden β-kateniinin tasoilla ja ilmaus Wnt /β-kateniinin kohdegeenien ja mukaisesti näiden vaikutusten , parantaa koko paksusuolen kasvain kuormitus. Johdonmukaisesti, koputtaa alas

VDR

mukaan shRNA ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa parantaa ydin- sisältö β-kateniinin, sen transkriptionaalisen aktiivisuuden, ja ilmaus Wnt /β-kateniinin kohdegeenien. Lisäksi ohimenevä palauttaminen villityypin VDR ilmentymistä VDR-negatiivinen ihmisen SW620 paksusuolen syöpäsoluissa vähenee ydin- β-kateniinin tasolla, kun taas VDR-ΔAF2, VDR-L417S tai VDR-E420Q mutantteja, kykene sitoutumaan klassisen koaktivaattoreiden ja aktivoida geenin transkription [21 ], ei. Kummallista, niiden joukossa vain VDR-E420Q pystyy sitomaan β-kateniinin [21] ja sen uudelleen ilmentymisen

VDR

– /- hiirissä pelastaa hiustenlähtö mutta ei riisitautia fenotyyppi [38]. Vaikuttaa siis että ydinvoima β-kateniinin tason ja toiminta riippuu kapasiteettia VDR rekrytoida klassisen transkription koaktivaattoreiden.

Tuloksemme osoittavat, että VDR knock-down in SW480-ADH soluja ei vaikuta β-kateniinin fosforylaatiota CK-Iα tai GSK-3β, poisheittäminen roolin VDR säännellä koko β-kateniinin kerääntyminen. Ottaa huomioon, että ydin- β-kateniinin nousee ilman VDR, koko solujen määrä β-kateniinin proteiinia ei muuttunut (kuvio S4a). Yllättäen olemme myös havainneet, että fosforylaatiota β-kateniinin at Ser552 ja Ser675 ehdotettu lisätä β-kateniinin transkriptionaalista aktiivisuutta on pienennetty shVDR SW480-ADH-soluja. Kuitenkin otaksuttu inhiboiva vaikutus, että väheneminen näiden fosforylaatiot voi olla β-kateniinin transkriptionaalisen aktiivisuuden näyttää overpassed vaikutuksesta VDR puutos lisätä β-kateniinin tumaansiirtymiseen. Kaiken kaikkiaan nämä tiedot viittaavat siihen, että VDR ei valvo β-kateniinin hajoamiseen mutta todennäköisesti suosii sen uudelleenjako solun tumassa.

Tuloksemme osoittavat uudenlainen

in vivo

funktiona VDR ratkaisevana modulaattori Wnt /β-kateniinin signaalin voimakkuuden paksusuolensyöpä. Havainto, että

VDR

puutos ei muuta määrää kasvaimia mutta lisää kasvain kuormitus tarkoittaa, että VDR ei estä alkuperäistä mutaatioita, jotka aiheuttavat varhainen aktivointi Wnt /β-kateniinin reitin, mutta se edullisesti on pitkän aikavälin suojaava vaikutus kasvaimen kasvua rajoittamalla vahvuus Wnt /β-kateniinin onkogeenisen signaalin. Yhtäpitävä tuloksemme, hyvin tuore raportti on osoittanut, että

APC

min /+ VDR

– /-

hiirillä esittää suurempia suoliston kasvaimia kuin

APC

min /+ VDR

+ /+

hiirillä, vaikka molekyylitason mekanismeista, tämä fenotyyppi ei tutkittu [39]. Konkordanssi kahden rinnakkaisen tutkimukset vahvistavat niiden keskeiset havainnot.

tulokset Tutkimuksemme ovat merkityksellisiä klinikalla, koska VDR ilmentyminen säädeltiin vähentävästi noin kaksi kolmasosaa kehittyneen paksusuolen kasvainten assosioituneiden säätelyä

SNAI1

ja

SNAI2

geenejä, jotka koodaavat SNAIL1 /SNAIL2 transkriptiorepresso- [15], [16], [40]. Kaikki pyrittiin minimoimaan eläinten kärsimyksiä. Mittakaava, 100 pm.