Krooninen sairaus

tiivistelmä

Colon syöpä on maligniteetti, joka kehittyy paksusuolen ja peräsuolen kudoksiin. Ennuste metastaattinen paksusuolen syöpä on edelleen huono, ja uudet hoitovaihtoehdot vähentämiseksi tarvitaan paksusuolensyöpä kuolleisuutta. Äskettäin solunsisäisiä cAMP-tasoja on ehdotettu vaikuttavan käyttäytymiseen syöpäsoluja. Kiehtovan, syklinen fosfatidihappo (CPA) ja sen rakenteelliset analogit estävät kasvua monissa syöpäsolun linjat, ja meidän aikaisempi työ on ehdottanut, että CPA kasvattaa cAMP-tuotantoa. (PDE) tyypin 3 isoformit PDE3A ja PDE3B ilmaistaan ​​pääasiassa sydän- kudoksessa ja rasvakudoksessa, vastaavasti. Lisäksi, solunsisäisten cAMP-tasojen on liittynyt kasvun esto paksusuolen syöpäsoluissa. Nämä havainnot viittaavat siihen, että CPA voitaisiin käyttää paksusuolen syövän hoidossa. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että CPA inhiboivat HT-29-soluja, jotka ilmentävät korkeita PDE3B, mutta ei kasvua DLD-1-solut, jotka ilmentävät alhaisia ​​PDE3B. Lisäksi CPA inhiboi fosforylaatiota Akt in HT-29-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Tuloksemme viittaavat siihen, että PDE3B ilmaisun ja solunsisäiset cAMP-tasot korreloivat leviämisen paksusuolen syöpäsoluja. Nämä havainnot osoittavat ensimmäistä kertaa, että CPA voi olla hyödyllinen molekyyli kohdennettuja terapiassa paksusuolensyöpä.

Citation: Tsukahara T, Matsuda Y, Haniu H (2013) Cyclic fosfatidihappoa stimuloi cAMP Tuotanto ja estää kasvua ihmisen koolonkarsinoomasoluissa. PLoS ONE 8 (11): e81139. doi: 10,1371 /journal.pone.0081139

Editor: Carl G. Maki, Rush University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 22 kesäkuu 2013; Hyväksytty: 18 lokakuu 2013; Julkaistu 25 marraskuuta 2013

Copyright: © 2013 Tsukahara et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat Apurahat-in-Aid tieteellisen tutkimuksen (C) 22591482 (TT) peräisin Japanista Society for Promotion of Science, Grant-in-Aid Takeda Science Foundation (TT), Astellas pohjan tutkimuksen aineenvaihduntahäiriöiden (TT) ja Nagano Society for Promotion of Science (TT). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Syklinen nukleotidi fosfodiesteraasi (PDE) on entsyymi, joka hajottaa fosfodiesterisidoksil- [1]. Ihmisillä, PDE: t on koodattu 21 PDE-geenit [1], jotka on jaettu 11 perhettä perustuen rakenteellinen samankaltaisuus, kuten proteiinisekvenssihomologiaan. PDE ovat joukko entsyymejä, jotka katkaisevat fosfodiesterisidoksen toisessa messenger cAMP, joka on keskeinen rooli soluvasteita erilaisiin solunulkoisen ärsykkeiden [2]. Solunsisäisiä cAMP-tasoja säädellään normaalisti tasapainoa toiminnan kahden entsyymejä, cAMP tuottavan entsyymejä (adenylaattisyklaasien) ja cAMP hajottavien entsyymien (PDE), mikä johtuu pääasiallisesti hormonien ja välittäjäaineiden [3] [4] . PDE3B tunnistettiin ihmisillä ja sen transkriptit on löydetty pääasiassa rasvakudoksessa [5], ja PDE3B on raportoitu olevan fosforyloitu ja aktivoituu vasteena insuliinin ja hormoneja, jotka lisäävät cAMP-tasoja [6].

Bioaktiiviset lipidien kuten syklinen fosfatidihappo (CPA) [7] [8] on esitetty lisäävän solujen cAMP-tasoja ja johtaa RhoA inaktivaatiomenetelmät hepatoomasolujen [9]. Aikaisemmin osoitimme, että CPA vähensi solunsisäisiä triglyseridipitoisuus ja esti PDE3B ilmaisun [8]. Lisäksi solunsisäisiä cAMP-tasoja 3T3-L1-solujen havaittiin kasvavan altistumisen jälkeen CPA. Nämä tulokset viittaavat siihen, CPA-PDE3B-cAMP-reitin on erityinen molekyylikohteena. Fosfolipaasi D2 (PLD2) tuottaa CPA alkaen lysofosfatidyylikoliinin (LPC), ja pieniannoksisen insuliinihoitoa solujen stimuloi PLD2 toimintaa ja lisää solunsisäisiä CPA tasolla [7].

Äskettäin PDE3 on ehdotettu avainasemassa in syöpäsoluinvaasiota ja soluliikkuvuus [10]. PDE3-inhibiittorit kuten silostatsoli esti kasvua pienisoluinen keuhkosyöpä soluihin [11], tunnistaa PDE3 kuin kohteena antiproliferatiivinen syövän hoidossa. Väheneminen PDE3B aktiivisuus liittyy nousu solunsisäisen cAMP-tasoja, joka aktivoi cAMP-riippuvaisen proteiinikinaasin A (PKA) [1]. Normaaleissa ihmisen soluissa, cAMP edistää proliferaatiota ja erilaistumista, mutta syöpäsoluissa, cAMP vaikuttaa leviämisen selvästi ja estää pohjapinta proliferaatiota tasolle huomattavasti kuin normaaleissa ihmisen soluissa [12]. Lisäksi korkeat solunsisäiset cAMP voidaan tehokkaasti vähentää in vitro syöpäsolujen kasvua [1].

Akt (proteiinikinaasi B) on osoitettu äskettäin vaimentamaan cAMP signalointi aktivoimalla PDE3B [13]. Koska sen löydön kuin esikasvaintekijän, seriini /treoniini-kinaasi Akt on tullut merkittävä painopiste huomiota, koska Akt säätelee erilaisia ​​solun prosesseja kriittisesti, kuten syövän etenemistä [14]. Syövän, Akt-aktiivisuutta on usein koholla, koska useita mekanismeja, mukaan lukien lakkaa toimimasta PTEN tuumorisuppressorigeenin [15]. Aktivoituna Akt voi fosforyloida useita loppupään osallistuvien molekyylien säätelyssä solujen lisääntymisen ja tukahduttaa apoptoosin [16]. Akt signalointi liittyy kasvaimen muodostumisen, ja akt-inhibiittoreita on kehitetty ohjaamaan syövän kasvua [14]. Kuitenkin paksusuolensyöpä, hoitovaihtoehdot ovat tällä hetkellä rajoitettu, koska nämä hoidot kielteisiä sydän- ja tromboottisia vaikutuksia [17]. Näin ollen muut signaalinvälitysreittien on otettava huomioon, että voidaan käyttää kehittämään uusia terapeuttisia strategioita kohdistaa paksusuolen syöpä. Kiehtovan CPA on raportoitu tuottaa anti-mitogeenisiä vaikutuksia ja estää syöpäsolujen invaasiota in vitro ja etäpesäkkeitä in vivo [18] [19].

Tutkimme ilmaisua PDE3 isomuotojen PDE3A ja 3B ihmisen paksusuolen syöpä solulinjat HT-29 ja DLD-1. Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (RT-PCR) ja western-blottauksella osoitti, että PDE3D oli ainoa PDE3 isoformin ilmaistuna molemmissa solulinjoissa. PDE3B mRNA: ta ja proteiinia ekspressoitiin korkeina tasoina HT-29-soluja ja havaitsimme, että PDE3B ekspressiotasoja korreloi paksusuolen syövän solujen proliferaatiota. Olemme havainneet, että CPA hoito koholla solunsisäisiä cAMP ja tukahdutti leviämisen HT-29-soluja. Lisäksi CPA esti Akt fosforylaation in HT-29-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Yhdessä nämä tulokset viittaavat siihen, että CPA-PDE3B-cAMP-reitin keskeisessä etenemisessä paksusuolensyöpä.

Materiaalit ja menetelmät

reagenssit

CPA (18: 1 ) hankittiin Avanti Polar Lipids Inc. (Alabaster, AL). Deksametasoni ostettiin Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Cilostazol, anti-PDE3B vasta-ainetta (sc-20793), ja anti-β-aktiini-vasta-aine (sc-47778) hankittiin Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Anti-Akt (# 9272) ja anti-Pakt S473 (9271S) ostettiin Cell Signaling Technology (Danvers, MA).

Soluviljely

Ihmisen paksusuolen syövän solulinjat HT-29, LOVO, ja Caco-2 saatiin American Type Culture Collection (Manassas, VS). DLD-1 ihmisen adenokarsinoomasolua saatiin Health Science Research Resources Bank (Osaka, Japani). Soluja kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM; Nacalai Tesque, Kioto, Japani) tai RPMI-1640-alustassa (Nacalai Tesque), joka sisälsi 10% (v /v) naudan sikiön seerumia (FBS), 100 U /ml penisilliiniä, 10 ug /ml streptomysiiniä, ja 2,5 ug /ml plasmocin

TM (Nacalai Tesque), 37 ° C: ssa kostutetussa inkubaattorissa 5% CO

2.

Western blot-analyysi

Solut ympättiin 6-kuoppaisille levyille (Iwaki, Tokio, Japani), tiheydellä 1 x 10

5 solua /kuoppa. Erilaisten käsittelyjen jälkeen (kuten on esitetty), solut hajotettiin jäillä 30 minuutin ajan solun lyysipuskuria (20 mM Tris-HCI [pH 7,4], 10% [v /v] glyseroli, 100 mM NaCl, 1% [v /v] Triton X-100, 1/100 proteaasiestäjäseostabletit [Sigma], 1 mM ditiotreitoli) ja sentrifugoitiin 16000 x

g

20 minuutin ajan 4 ° C: ssa. Supernatantit tallennetaan solulysaateista ja määritettiin proteiinipitoisuus käyttäen Bradford-menetelmällä (Bio-Rad Protein Assay Kit, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Solulysaatit eroteltiin sitten 5% -20% natriumdodekyylisulfaattia (SDS) -polyacrylamide geelit (e-PAGEL; ATTO, Tokio, Japani) ja sähköllä Immobilon-P -kalvoille (Millipore, Billerica, MA). Kalvot blokattiin 1 tunnin ajan Block Ace (DS Parma Biomedical Co Ltd, Osaka, Japani) ja inkuboitiin primaarisilla vasta-aineilla laimennettu TBS-T 5% Block Ace 12 tunnin ajan 4 ° C: ssa. Proteiinivyöhykkeet visualisoitiin käyttäen EzWestLumi plus (ATTO).

Quantitative reaaliaikainen PCR-analyysi

Solun kokonais-RNA valmistettiin käyttämällä NucleoSpin RNA II (Takara, Shiga, Japani), ja 0,5 ug kokonais RNA: ta käytettiin syntetisointiin cDNA kanssa ReverTra Ace qPCR RT Kit (Toyobo, Osaka, Japani) mukaan valmistajan suositusten. Mittasimme mRNA-tasot käyttäen ECO Real-Time PCR-järjestelmä (Illumina Inc., San Diego, CA) ja SYBR Green Realtime PCR Master Mix-Plus (Toyobo) seuraavin alukeparien käytetään reaktioissa: PDE3A, 5′- AAAGACAAGCTTGCTTGCTATTCCAAA-3 ’(F) ja 5′-GTGGAAGAAACTCGTCTCAACA-3′ (R); PDE3B, 5’-CCAGGTGTGCATCAAATTAGCA-3 ’(F) ja 5′-CAATGCCTTCTGTCCATCTCAA-3’ (R); 18S rRNA, 5’CAGCCACCCGAGATTGAGCA-3 ’(F) ja 5′-TAGTAGCGACGGGCGGTGTG-3’ (R). Kaikki PCR-reaktiot suoritettiin 10 ul: n tilavuudessa, käyttäen 48-kuoppaista PCR-levyt (Illumina). Pyöräily olosuhteet olivat 95 ° C: ssa 10 min (entsyymin aktivaatio), jota seurasi 40 sykliä 95 ° C 15 s, 55 ° C: ssa 15 s, ja 72 ° C: ssa 30 s. Monistuksen jälkeen näytteet lämmitettiin hitaasti 55 ° C: sta 95 ° C: seen ja fluoresenssi mitattiin jatkuvasti, jolloin saatiin sulamiskäyrä. Suhteellinen mRNA-tasot on laskettu käyttämällä kaavaa 2

-ΔΔCq, jossa ΔCq on ero kynnyksen aikana tietyn kohde-cDNA: n ja endogeenisen viite cDNA. Johtaminen kaavat ja validointitestejä on kuvattu Applied Biosystems User Bulletin nro 2.

mittaaminen solujen proliferaation

Solut ympättiin 96-kuoppaisille viljelylevyille (5 x 10

3 solua /kuoppa) ja inkuboitiin 24 tuntia. Solujen proliferaatio mitattiin käyttäen Cell Counting Kit-8 (Dojindo, Kumamoto, Japani): 10 ui Cell Counting Kit-8 lisättiin elatusaineeseen ja inkuboitiin 2 tunnin ajan inkubaattorissa 5% CO

2; määrä oranssin formatsaanin väriaine tuotettu laskettiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä mikrolevylukijalla (Awareness Technology, Inc., Palm City, FL).

syklisen nukleotidin fosfodiesteraasikokeella

rekombinanttisen PDE3B merkitty GST (BPS Bioscience Inc., San Diego, CA) määritettiin käyttäen syklisen nukleotidin PDE-määritys kit (Enzo Life Science, Farmindale, NY) 96-kuoppalevyillä ja mittaamalla absorbanssi aallonpituudella 620 nm spektrofotometrillä ; määritykset suoritettiin valmistajan protokollan.

vaikutus CPA solunsisäisiin cAMP tasolla

Soluja viljeltiin seerumittomassa väliaineessa, joka sisälsi CPA 60 min. Cellular cAMP-tasot mitattiin käyttämällä ELISA (cAMP Biotrak Enzyme immunoassay järjestelmä, Amersham Biosciences) 96-kuoppaisille levyille ja määrittämällä absorbanssi 450 nm: ssä spektrofotometrillä noudattamalla valmistajan ohjeita.

RNA-interferenssi

tukahdutetaan PDE3B ja Akt ilmaisun HT-29-solujen transfektoimalla solut pieniä häiritseviä RNA: ita (siRNA: t) kohdistaminen PDE3B ja Akt (Santa Cruz Biotechnology); Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) käytettiin transfektioissa. Solut maljattiin 6-kuoppaisille levyille (Iwaki) tiheydellä 5 x 10

4 solua /kuoppa DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää ja sitten transfektoitiin 100 pmol /ml mRNA-spesifisten siRNA: iden tai salattu (kontrolli) siRNA: t . Vähentäminen PDE3B ja Akt tasot vahvistettiin western blottauksella.

Tilastollinen

Opiskelijan

t

-testi käytettiin tilastollisessa vertailussa. Erot katsottiin merkitsevä

p

0,05 tasolla.

Tulokset

PDE3 isoformeja PDE3A ja PDE3B tiedetään ilmentyvän ihmisellä [1]. Arvioida toimintaa PDE3 ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa, käytimme 4 koolonsyöpäsolulinjoissa, HT-29, LOVO, DLD-1, ja Caco-2 (kuvio 1A), ja tutkitaan ilmentymistä PDE3B proteiinin näissä solulinjoissa . PDE3B ilmentyi suuria määriä HT-29 ja LOVO-solut.

neljä ihmisen paksusuolen syöpäsolulinjoissa (HT-29, LOVO, DLD-1, ja Caco-2-soluja) viljeltiin DMEM: ssä, jota on täydennetty 10 % FBS; proteiinin tasot analysoitiin käyttäen SDS-PAGE: lla ja Western blotting anti-PDE3B-vasta-aineen, ja proteiinijuovat visualisoitiin käyttämällä tehostettua kemiluminesenssi- reagenssia. Kukin kaista ladattiin 20 ug kokosolu-lysaattia. β-aktiini värjättiin latauskontrollina. (B) Reaaliaikainen PCR mittaus ilmentymisen PDE3A ja 3B-mRNA: iden ja 18S rRNA (sisäinen kontrolli) HT-29 ja DLD-1-solut (keskiarvo ± SEM, n = 3, ** p 0,01, Studentin

t

testi). (C) Reaaliaikainen PCR-analyysi (vasemmalla) ja western-blottauksella (oikea) verrata PDE3B ilmentymistä HT-29-solujen hoidon jälkeen CPA (1, 3, ja 10 uM) 60 min (keskiarvo ± SEM, n = 3 , ** p 0,01, Studentin

t

testi).

lisätutkimuksia, valitsimme yhden solun, joka ilmentää suuria määriä PDE3B, HT-29, ja yksi solu joka ilmentää alhainen PDE3B, DLD-1. Samaa mieltä proteiinin ilmentymisen tulokset, PDE3B mRNA oli myös läsnä korkeammilla tasoilla HT-29-soluissa kuin DLD-1-soluissa (kuvio 1 B). Sitä vastoin, PDE3A mRNA: ta ei havaittu kummassakaan solulinjoissa. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PDE3B on tärkeimmästä PDE-isoformi HT-29 ja DLD-1-soluissa. Testasimme vaikutus CPA ilmentymistä koskevat PDE3B mRNA ja proteiini HT-29-solut (kuvio 1 C), ja totesi, että CPA eivät vaikuttaneet PDE3B geenien ilmentymistä, mikä viittaa siihen, että CPA ei tuota sen vaikutuksia vähentämällä PDE3B ilmentyminen HT 29-soluja. Seuraavaksi tutkittiin, mikä vaikutus CPA on solunsisäisiä cAMP-tasoja in HT-29 ja DLD-1-soluissa. Vaikka cAMP voivat joko edistää tai estää proliferaatiota monissa solutyypeissä, useimmiten cAMP näyttää olevan antiproliferatiivisia. Hoidon CPA kasvanut cAMP-tasoja merkittävästi HT-29-soluissa, mutta ei DLD-1-soluissa (kuvio 2A). Edellä esitetyt tulokset osoittivat, että taso PDE3B ekspressio korreloi leviämisen mahdollisuudet paksusuolen syöpäsoluja. Mielenkiintoista, aika-kurssi kokeet osoittivat, että CPA hoito esti cAMP hydrolyysille PDE (kuvio 2B), mikä viittaa siihen, että esto PDE3 toimintaa CPA parantaa solunsisäisen cAMP: n kerääntymisen. Kuitenkin cAMP voi aiheuttaa sen antiproliferatiivinen vaikutus läpi erillisten mekanismien erilaisissa solulinjoissa.

Solunsisäiset cAMP tasot kulttuuri lysaatit mitattiin käyttäen cAMP Biotrak Entsyymi immuunimäärityssysteemissä. Silostatsolia (5 uM; Cilo) käytettiin positiivisena kontrollina. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM (n = 4), ** p 0,01. (B) ajan kuluessa CPA-riippuvaisen eston cAMP hydrolyysille PDE3B. PDE3B inkuboitiin cAMP ja 5′-nukleotidaasia kanssa tai ilman CPA (10 uM) 10-50 minuutin ajan; PDE-inhibiittorin IBMX (50 uM) käytettiin positiivisena kontrollina.

vaikutus CPA soluproliferaatioon määritettiin käyttäen kolorimetristä määritystä. Olemme havainneet, että CPA inhiboivat HT-29 ja LOVO-solut, mutta ei DLD-1 ja Caco-2-soluja (kuvio 3A), joka on alhaisempi endogeenisten tasojen PDE3B kuin HT-29 ja LOVO-solut [8]. Sen testaamiseksi PDE3B vaikuttaa leviämisen HT-29-solujen, PDE3B ilmentyminen, joka pudotettiin käyttämällä siRNA. PDE3B kohdistaminen siRNA tippuu alas PDE3B tehokkaasti, mikä näkyy western blottauksella anti-PDE3B vasta-aineella (kuvio 3B). Erityisesti 24 h kuluttua transfektoi- kanssa PDE3B-siRNA, leviämisen HT-29-solujen vähentynyt huomattavasti. Nämä tulokset osoittavat, että kaatamalla PDE3B estää niiden kasvun, HT-29-soluja.

Solut (1 x 10

5 solua /kuoppa) ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 24 h tai 48 h 37 ° C: ssa, 5% CO

2, jonka jälkeen 10 ui Cell Counting Kit-8 lisättiin väliaineeseen. Kun oli inkuboitu 2 tuntia lisää, määrä oranssi formatsaanin väriaineen tuotti määritettiin mittaamalla absorbanssi 450 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM (n = 4), ** p 0,01. (B) kaatamalla PDE3B ilmentymistä HT-29-soluja. Yhteensä proteiini uutettiin transfektoimattomista soluihin ja transfektoitujen solujen ohjaus siRNA tai PDE3B-spesifisiä siRNA ja analysoitiin western-blottauksella anti-PDE3B-vasta-aine; β-aktiini värjättiin kuten proteiini-latauskontrollina. (C) Solukasvun inhibitio seuraavasti PDE3B pudotus mitattiin käyttäen Cell Counting Kit-8. -Soluja (1 x 10

5 solua /kuoppa) ympättiin 6-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin 24 h 37 ° C: ssa, 5% CO

2, jonka jälkeen 10 ui Cell Counting Kit-8 ratkaisu lisättiin väliaineeseen. Kun oli inkuboitu 2 tuntia lisää, määrä oranssi formatsaanin väriaineen tuotti määritettiin hankkimalla absorbanssi 450 nm: ssä käyttäen mikrolevylukijaa. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM (n = 4), ** p 0,01.

tulokset viittaavat siihen, että PDE3B tasot korreloi solujen proliferaation hinnat, ja että vaikutus PDE3B riippuu solutyypistä. Seuraavaksi määritetään, onko CPA estää Akt fosforylaation in HT-29-solujen, koska monet vaikutukset cAMP välittyvät aktivoitumisen Akt [20] [21]. Akt liittyy kasvaimeen solujen selviytymistä, proliferaatiota, ja invasiivisuus [22] [23]. Sen varmistamiseksi, CPA myötävaikuttaa vaikutuksia Akt HT-29-solujen, testasimme kuinka CPA vaikuttaa Akt aktivointia. Esto Akt signalointi on liittynyt biologisten vaikutusten kemiallis-ennaltaehkäisevän yhdisteitä kuten epigallokatekiinigallaattia, joka selvästi estää Pakt tasot suoliston kasvaimet muuttamatta yhteensä Akt tasoa merkittävästi [24]. Akt aktivointi liittyy fosforylaation kaksi tähdettä, Thr308 aktivoinnissa silmukka ja Ser473: n C-terminaalinen hydrofobinen motiivin; fosforylaatio Ser473 on tutkittu laajalti Tuumorinäytteissä indikaattorina Akt-aktiivisuutta [25]. Ensin tutkitaan lähtötilanteen Akt Ser473 fosforylaation in HT-29-solujen ja löytänyt tämän sivuston Akt olevan konstitutiivisesti fosforyloitu (kuvio 4A). Lisäksi olemme selvitettävä, CPA esti Akt fosforylaation in HT-29-soluja. Tuloksemme osoittivat, että CPA estetty konstitutiivinen fosforylaatio Akt annoksesta riippuvalla tavalla (kuvio 4, A ja B), ja että tämä CPA-estoa Akt-fosforylaation kesti 120 min (kuvio 4C). Vaikka CPA on vakaa lipidejä ja 75% molekyyli voi pysyä ehjänä viljelyväliaineessa 24 h [19], Cpa voidaan muuntaa LPA avautuminen renkaan rakenteen CPA. Tämä nostaa esiin mahdollisuuden, että hydrolyyttinen lohkaisu syklisen fosfaatin rengas CPA mukaan fosfolipidin fosfa- HT-29-solujen johtaa muodostumista LPA, joka voi aktivoida Akt [26].

(A) Akt-fosforylaation HT 29-soluja käsiteltiin CPA (1, 3, ja 10 uM), NGF: n (50 ng /ml, positiivinen kontrolli), tai deksametasoni (Akt-inhibiittori, 25 uM). Fosforyloidun Akt (p-Akt) ja koko Akt havaittiin immunoblottauksella. (B) intensiteetit Akt kvantitoitiin, ja suhde fosforyloituu yhteensä Akt laskettiin. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM (n = 3), ** p 0,01. (C) HT-29-soluja käsiteltiin CPA (10 uM), ja lysaatit kerättiin 30, 60, 90, ja 120 min. Akt esto mitattiin tappio Ser473 fosforylaation. (D) kaatamalla Akt ilmentymistä HT-29-soluja. Yhteensä proteiini uutettiin transfektoimattomista soluihin ja transfektoitujen solujen ohjaus siRNA tai Akt-spesifisiä siRNA ja analysoitiin western-blottauksella anti-Akt-vasta-aine; β-aktiini värjättiin kuten proteiini-latauskontrollina. (E) Solunsisäiset cAMP tasoja HT-29 käsiteltiin 1, 3, tai 10 uM CPA 60 minuutin kuluttua Akt knockdown; cAMP-tasot määritettiin solulysaateista käyttäen cAMP Biotrak Enzyme immunoassay järjestelmään. Tiedot ilmaistaan ​​keskiarvoina ± SEM (n = 3), ** p 0.01.

Lisäksi mittasimme cAMP tasoja HT-29-solujen läsnä ollessa ja puuttuessa CPA jälkeen kaatamalla Akt; western blotting anti-Akt-vasta vahvisti, että Akt kohdistaminen siRNA pudotti Akt ilmaisun tehokkaasti HT-29-solut (kuvio 4D). Erityisesti CPA käsittely HT-29-solujen vähentynyt Akt tasoa ei lisätä cAMP tasoja merkitsevästi (kuvio 4E).

Keskustelu

lysofosfolipidi on jo pitkään tunnustettu fosfolipidiulkokalvon metaboliitti. Äskettäin, kuitenkin lysofosfolipidi on tullut ehdokkaaksi molekyyli diagnostisia ja farmakologisia tarkoituksia varten, ja LPA on raportoitu olevan voimakas indusoija syövän etenemisen eri tasoilla. Vaikka CPA on samanlainen kemiallisesti LPA, toiminnot CPA eroavat tai jopa päinvastainen kuin LPA. Esimerkiksi LPA stimuloi mutta CPA estää soluproliferaatiota ja syöpäsolujen invaasiota [19] [27] [9]. Lisäksi rauhansopimus voi tukahduttaa syövän invaasio ja nostaa solunsisäisiä cAMP-tasoja [27]. PDE3 entsyymit ovat yksi laajimmin tutkituista perheitä cAMP-hydrolysoimaan PDE, koska PDE3 entsyymit pelata useita rooleja fysiologisia ja patofysiologisia prosesseja syöpä [28]. Yhteydessä paksusuolen syöpä, PDE3-spesifinen estäjä cilostazol, jota on käytetty aiemmin sairastavien potilaiden hoitoon verisuonitukoksia käytettiin vaikutusten arvioimiseksi PDE3B estoa solujen kasvuun. Solujen lisääntymistä estävät cAMP läpi erilaisia ​​mekanismeja, jotka voivat aiheuttaa solusyklin pysähtymisen G1 ja apoptoosin [29]. Kuitenkin mekanismi, jonka avulla PDE3B osallistuu solunsisäiseen cAMP-tuotantoa vastauksena CPA on jäänyt epäselväksi. Teimme tämän tutkimuksen koolonsyöpäsoluja Hankintakohtaisten, joka oli aiemmin osoitettu lisätä solunsisäisiä cAMP-tasoja suoraan [8], funktio CPA joka viittaa myös anti-invasiivisia ominaisuuksia CPA [9]. Olemme havainneet, että CPA esti kasvua HT-29 ja LOVO-solut, jotka ilmentävät korkeita PDE3B, mutta ei kasvua DLD-1 ja Caco-2-soluihin, jotka ilmentävät alhaisia ​​PDE3B. Tukevat näitä havaintoja, CPA esti PDE3B aktiivisuutta soluissa, jotka ilmentävät suuria määriä PDE3B, ja siRNA-välitteinen tukahduttaminen PDE3B ilmaisun inhiboi solun kasvua. Nämä tulokset viittaavat siihen, että PDE3B säätelee solunsisäisiä cAMP-tasoja paksusuolen syöpäsoluissa, ja on osallisena syöpäsolujen kasvua. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että CPA inhiboi fosforylaatiota Akt in HT-29-solujen annoksesta riippuvalla tavalla. Akt säätelee useiden solun toimintoja kuten solujen eloonjäämistä ja lisääntymistä ja eri osa välittäjän aineenvaihduntaa. Neoplastisessa paksusuolen epiteelissä, Akt: n havaittiin olevan ei ainoastaan ​​ilmaista korkeammalla tasolla, mutta myös hyperactivated [30], ja tutkimukset kemialliset mallit ovat vahvistaneet, että Akt ylössäädellään alkuvaiheessa suoliston kasvaimien syntyyn. PDE3B ilmaisun ja solunsisäiset cAMP-tasot korreloivat leviämisen mahdollisuudet paksusuolen syöpäsoluja. Me tukee meidän havainnot käyttämällä siRNA analyysin ja osoittivat laskua pSer473-Akt hyvän korrelaatio asteen cAMP-tuotantoa ja downregulation Akt fosforylaation. Nämä tulokset viittaavat siihen, että Akt liittyvä signalointireitille on tiukasti sidoksissa CPA-PDE3B-cAMP-reitin ja siten osoituksena ensimmäistä kertaa, että CPA voi olla hyödyllinen molekyyli kohdennettuja terapiassa paksusuolensyöpä.

Johtopäätökset

havainnot osoittavat, että cAMP on ratkaiseva rooli esto paksusuolen syöpäsolujen kasvua CPA. Tutkimustulosten perusteella ehdotamme, että valaisemaan molekyylitason mekanismeja, joilla CPA indusoi cAMP: n tuotantoa estämällä PDE3B paksusuolen syöpäsoluissa voi tarjota arvokasta tietoa, joka auttaa selittämään, miten syöpäsolujen kasvua säädellään. Ymmärtäminen syöpäsolujen kasvua säädellään olisi puolestaan ​​auttaa purkaa molekyylitason mekanismeja syövän solujen invaasiota ja etäpesäkkeiden ja helpottaa analyysi signaalitransduktioreaktioteiden jotka johtavat solujen lisääntymistä. Vaikka lisätutkimuksia tarvitaan tutkimiseksi välistä ylikuulumista molekyylejä olemme kuvailleet tässä, tuloksemme yhdessä kannatettava mahdollista käyttöä CPA terapeuttisena yhdiste hoitoon paksusuolen syöpä.