Krooninen sairaus

tiivistelmä

kasvain mikroympäristölle on täynnä proteinaaseille. Koska anturi proteinaasien, proteinaasi aktivoitu reseptori 2 (PAR

2) näyttelee kriittistä roolia kasvainten synnyssä. Osoitimme, että PAR

2 ja sen aktivoimalla proteinaasi yhdessä ilmenivät eri koolonsyöpäsolulinjaa, mukaan lukien HT29. Inaktivoimalla proteinaasi tai knockdovvn PAR

2 merkittävästi paitsi lyhentää soluproliferaatiota in vitro, mutta esti myös kasvainten muodostumiseen HT29 in vivo. Lisäksi aktivointi PAR

2 edisti DNA-synteesiä ja voimistuvan sykliini D1 aktiivisuutta sekä transkription ja transkription jälkeisen tasolle. Lisätutkimukset osoittivat, että miRNA-34a välittämä PAR

2 aiheuttama sykliini D1 säätelyä. Esto miR-34a osittain luovuttu tukahduttaminen sykliini D1 aiheuttamien PAR

2 puutos. Lisäksi osoitimme, että TGF-β osaltaan sääntelyä miR-34a par

2. Lopuksi kolorektaalikarsinoomasta näytteitä, säätelyä PAR

2 ja downregulation miR-34a merkittävästi korreloivat laatu ja lymphomatic etäpesäke. Tutkimuksen tuloksiin sisältyy ensimmäistä näyttöä siitä, että miRNA välittää autokriinisella proteinaasi signalointia välittämä syöpäsolujen lisääntymistä.

Citation: Ma Y, Bao-Han W, Lv X, Su Y, Zhao X, Yin Y, et al. (2013) MicroRNA-34a välittää autokriininen signalointi PAR

2-aktivointi proteinaasi ja sen rooli Colonic Cancer Cell Proliferation. PLoS ONE 8 (8): e72383. doi: 10,1371 /journal.pone.0072383

Editor: Jun Sun, Rush University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 03 huhtikuu 2013; Hyväksytty: 09 heinäkuu 2013; Julkaistu: 26 elokuu 2013

Copyright: © 2013 Ma et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat rahoituksella 973 National Key Fundamental Research Program of China (https://www.973.gov.cn/AreaAppl.aspx) (2012CB967003) ja National Nature Science Foundation of China (http: //www.nsfc .gov.cn /Portal0 /default152.htm) (81172034, 91129717 ja 81201966). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Valmistuessa human Genome Project, yhteensä 553 geenien selityksin olla koodaavat proteinaasi [1]. Tunnistaminen proteinaasi aktivoitu reseptorit (PAR) paljastaa keskeinen rooli proteinaaseille, ei ainoastaan ​​proteiineja hajottavia entsyymejä, vaan myös mahdollisia reseptorin aktivaattoreita, jotka lähettävät solunulkoinen ärsykkeet solunsisäiseen signalointi tapahtumia. PAR on seitsemän transmembraani- sivuavia alueita G-proteiiniin kytkettyjen reseptorien (GPCR: t), jotka toimivat kohteina tiettyjen seriiniproteinaa-, kuten trombiinin ja trypsiinin. Proteolyyttisen niiden solunulkoisen aminopäässä luo uuden aminopäässä, joka toimii langallisen ligandin ja aktivoi reseptorin. Ainutlaatuinen aktivoitumismekanismi PAR tarjoaa uuden mekanismin, jolla mikroympäristölle vaikuttaa solujen käyttäytymiseen. Tähän mennessä neljä PAR perheenjäsenet on tunnistettu, PAR

1 PAR

4, jotka kaikki osuus yhtäläisyyksiä niiden rakennetta ja aktivoitumismekanismi [2]. PAR

2 on ainoa jäsen perhe, jota ei voida aktivoida trombiinilla. Tutkimukset in hiirien paljasti, että PAR

2 pelaa tärkeämpi rooli kasvainten muodostumiseen verrattuna muihin PAR [3].

PAR

2 ilmentyy laajalti elimistöön ja pelaa kriittinen rooleja eri tyyppisiä ihmisen syövän, mukaan lukien paksusuolen ja keuhkosyövän [4], [5]. PAR

2 edistää syövän etenemisen kautta erilaisia ​​mekanismeja, kuten solujen lisääntymisen, invaasiota ja etäpesäkkeiden. On osoitettu, että PAR

2 stimuloi soluproliferaatiota eri syöpäsoluissa ja muodostunut voimakas mitogeeninen tekijä eri syövissä [6] – [10]. Lisäksi tutkimukset osoittivat, että transaktivaation EGFR [7], MAPK: [9], ja integriini α

5β

1-riippuvaisen adheesion fibronektiiniin [10] voi välittää PAR

2-stimuloitujen solujen proliferaatiota. Kuitenkin molekyylitason mekanismeja, joilla PAR

2 säätelee solusyklin ovat vielä epäselviä.

Koska merkittävä osa microenvironment, proteinaasit edistää kasvainsoluproliferaation ja johtaa hallitsemattomaan solun kasvua. Osa proteinaasien pystyvät toimimaan endogeeninen aktivaattoreina PAR

2 in vivo. Lisäksi trypsiiniä, urokinaasi-plasminogeeniaktivaattorin (uPA) /plasmiini, FXa, FVIIa, kudoksen tekijät, matriptase ja kallikreiinien (KLKs) voidaan kaikki aktivoida PAR

2 [11]. Extra-haiman ilmentymä trypsiiniä on esitetty mahalaukun ja paksusuolen syöpiin [12], [13]. Pakko ilmentymisen trypsinogeeni lisää merkittävästi tuumorigeenisyyden mahalaukun syövän solujen nude-hiirissä [13]. Suora todisteet osoittavat, että trypsiini toimivat PAR

2 on erittäin voimakas kasvutekijä ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa [9].

Koska läsnäolo kaikkialla PAR

2, ja tuotanto proteinaasien kasvaimista olemassaolo autokriininen silmukan ei ole odottamatonta, erityisesti paksu- ja peräsuolen karsinoomat. Epänormaali ilmaus PAR

2 havaittiin maha-suolikanavan syöpien ja syövän solulinjoissa [14] – [16]. Expression of matriptase ja trypsiiniä havaittiin DLD-1 [17] ja HT29 paksusuolen syöpäsolulinjoissa [18]. Viimeksi KLK14 havaittiin ilmentyvän ja pystyä aktivoimaan PAR

2 koolonkarsinoomasoluissa [19]. On odotettavissa, että autokriinisen vuorovaikutus seriiniproteinaaseilla ja PAR

2 osallistuu syöpäsolujen lisääntyä paksusuolessa.

Tässä tutkimuksessa osoitamme, että autokriinisen toimia trypsiinin ja KLK14 edistää paksusuolen syöpäsolu leviämisen aktivoitumisen kautta PAR

2. Häiriöitä autokriinisen silmukka knockdovvn PAR

2 vähensi syöpäsolujen kasvua sekä in vitro että in vivo. Lisäksi osoitimme ensimmäistä kertaa, että miR-34a, joka kohdistuu sykliini D1, oli välttämätöntä PAR

2 aiheuttaman soluproliferaation.

Menetelmät ja materiaalit

Soluviljely ja Cell linjat

ihmisen koolonin epiteelisolulinja HT-29, Caco-2, HCT-116, RKO ja ihmisen keuhkojen A549-solulinja saatiin ATCC: ltä (Manassas, VA, USA). Soluja kasvatettiin Dulbeccon muokatussa Eaglen elatusaineessa /F12 (Hyclone), jota oli täydennetty 10% FBS: ää (Gibco).

Stable Transfektantti Cell Lines PAR

2 pudotus

ShRNA vektori pRFP- C-RS sisältää neljä erilaista PAR

2 erityisiä häiritsevät sekvenssit ja salattu sekvenssi hankittiin Origene Technologies. HT29-solut transfektoitiin yhtä shRNAs ja valittu puromysiinin (1 ug /ml). Kvantitatiivisen tosiaikaisen PCR (qRT-PCR) ja Western blot suoritettiin tarkistaa ilmaus PAR

2.

Kemikaalit ja reagenssit

estäjiä trypsiinin (Cat. No. T6522 ja T9128) ja aktinomysiini D ostettiin Sigma-Aldrich. Proteinaasinestäjä cocktail (Cat. No. 04 693 159 001) ja TGF-β ostettiin Roche ja R Cell Signaling Technology), PAR

2 (N-19, 1:1000; Santa Cruz Biotechnology) tai β-kateniinin (Cell Signaling Technology), jonka jälkeen inkuboitiin peroksidaasiin konjugoitua sekundaarista vasta-aineita (Cell Signaling Technology) on 1:10,000 laimennus 1 tunnin ajan. Signaali visualisoitiin ECL (Millipore).

RNA: n eristäminen, RT ja PCR

Yhteensä-RNA, joka on eristetty A549-solut, HT29 tai potilaan näytteitä käyttämällä TRIzol reagenssia (Invitrogen), oli käsitelty DNaasi I ja käänteistranskriboitiin käyttämällä transkriptio (Invitrogen) saada yhteensä cDNA malleina mRNA havaitsemista tai transkriptoidaan TaKaRa ™ microRNA transkriptio kit saada cDNA malleina microRNA havaitsemiseen.

Kaikki alukkeet käytetty kvantitatiivinen PCR hankittiin GeneCopoeia (Fulen Gen Co Ltd, Guangzhou, Kiina). Quantitative real-time PCR normalisoituivat GAPDH (glyseraldehydi-3-fosfaattidehydrogenaasi) tai U6 lauseke mRNA ja miRNA vastaavasti.

Alukkeet säännöllisen PCR trypsinogeenin, KLK14 ja PAR

2 olivat seuraavat: trysinogen sense, 5′-TACCTTTGTTGCAGCTGCTG-3 ’, ja anti-sense, 5′-CACCACCCACTGTTCGCTG-3′; KLK14 mielessä, 5′-CACTGCGGCCGCCCGATC; ja anti-sense, 5’-GGCAGGGCGCAGCGCTCC-3 ’; PAR

2 sense, 5′-TGAAGATTGCCTATCACATAC-3 ’ja anti-sense, 5’TGCATTATTTTCTGATTAAGAGCC-3’. Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina.

Luciferase Reporter Assay

Ohimenevä transfektio suoritettiin E2F-ajettu lusiferaasia reportterina transkriptionaalista aktiivisuutta. Transfektion aine Lipofectamine 2000 (Invitrogen) inkuboitiin DNA seerumittomassa elatusaineessa 30 min ajan ennen kuin se lisättiin soluihin. Soluja inkuboitiin transfektion monimutkainen 2 tuntia. Solulysaattien lusiferaasiaktiivisuus kerättiin 24 h transfektion jälkeen, ja soluja käsiteltiin PAR

2-AP: ssa 3 tuntia ennen korjuuta. Lusiferaasi määritykset suoritettiin Dual-lusiferaasianalyysissä Kit (Promega) ja tietoja normalisoidaan PTK-RL.

tuumorigeneesiä Nude hiiret

in vivo tutkimuksissa, 10

6 solut injektoitiin paljaisiin hiiriin ihon alle, ja kasvaimen kasvua seurattiin 3 viikkoa. Kaikki eläinten hoito oli mukaisesti institutionaalisten ohjeiden. Kasvaimen koko (

V

) laskettiin kahdesti viikossa toisella viikolla, kaavalla,

V

(mm

3) = 0,52 x (leveys)

2 × (pituus).

tilastollinen analyysi

Data esitetään keskiarvoina ± SEM. Vertailu 2 ryhmää tehtiin käyttäen ANOVA joko jälkikäteen Tukey testin tai post hoc Dunnettin testi. Vertailu 2-ryhmät tehtiin käyttämällä Studentin t-testiä parittomalle aineistolle. Siihen liittyvän arvon

p

0,05 pidettiin merkittävänä.

Tulokset

knockdovvn PAR

2 Estetty soluproliferaatiota HT29

tässä tutkimuksessa testasimme PAR

2 mRNA-tasoja erilaisissa koolonkarsinoomasoluissa lukien HT29, HCT116, Caco-2 ja RKO soluja. Yhdenmukaisia ​​aiempien raporttien [18], kaikki solut testattiin positiivisesti ilmentyminen PAR

2 (Kuva 1A). Endogeenistä PAR

2-aktivoivan proteinaaseille trypsinogeeniä ja KLK14 tutkittiin myös RT-PCR. KLK14 mRNA oli läsnä kaikissa ihmisen paksusuolen syöpäsoluissa analysoitiin, kun taas trypsinogeeniä ilmentyminen havaittiin vain Caco-2 ja HT29 solulinjoissa (kuvio 1A). Koska HT29 läsnä korkea ilmentyminen sekä trypsinogeenin ja KLK14, valitsimme tämän paksusuolikarsinooma-solulinjaa jatkotutkimuksiin.

. mRNA: n ilmentyminen PAR

2, trypsinogeeni, KLK14 mitattiin säännöllisesti PCR paksusuolen syöpäsolulinjoissa. B. Colonic syövän solut esikäsiteltiin trypsiinin (T9128 ja T6522) tai seriiniproteaasin (proteinaasinestäjä cocktail, PIC) ja solujen lisääntyminen mitattiin MTT-määrityksellä. C. mRNA ilmaus PAR

2 vakaissa transfektanttisoluilla (PAR

2-1 ja PAR

2-2) mitattiin reaaliaikainen PCR. HT29 RS edustaa ohjaus pysyvästi transfektoitujen solujen sekoitetun ohjattu RNA. Proteiini taso PAR

2 mitattiin Western Blot ja esitetty insertti. Vaikutusta PAR

2 pudotus soluproliferaatioon mitattiin (D) MTT-määrityksellä ja (E) pesäkkeiden muodostumista HT29. F. Solut (10

6) injektoitiin subkutaanisesti nude-hiiriin, kasvainten tilavuudet mitattiin kuten ja kasvainten painot määritettiin uhrauksia. *

p

0,05, **

p

0,01 Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. N = 3-6. Kaikki kokeet on toistettu ainakin 3 kertaa itsenäisesti.

onko PAR

2-proteinaasi autokriinisen silmukka on ratkaisevan tärkeää solujen lisääntymistä, käytimme kahta menetelmää murtaa autokriinisen silmukka. Ensimmäinen, toinen inhibiittoreita käytettiin salpaavat proteinaasi. Kaksi trypsiini-inhibiittorit (T6522 ja T9128) ja proteinaasi-inhibiittoriseoksen (PIC) levitettiin estää tunnettuja ja tuntemattomia seriiniproteinaasi, joka voidaan aktivoida PAR

2, ja ne kaikki merkittävästi estetty HT29-solujen lisääntymisen mitattuna MTT-määrityksellä ( kuvio 1 B). Toiseksi, PAR

2 ilmentyminen vakaasti tippuu alas HT29 (kuvio 1 C). MTT ja pesäkkeiden muodostumisen analyysi osoitti vastaavasti, että knockdovvn PAR

2 tukossa solujen lisääntymistä (kuvio 1 D) ja pesäkkeitä muodostavat kyky (kuvio 1 E) in vitro. Tärkeintä on, että pudotus PAR

2 HT29 vähensi merkittävästi kasvaimen kasvua nude-hiirissä (kuvio 1 F). Nämä tulokset osoittivat, että autokriinisen aktivointi PAR

2 sen aktivoimalla proteinaasi edistää paksusuolensyöpä soluproliferaatiota sekä in vitro että in vivo.

sykliini D1-E2F Pathway välitteisen PAR

2-välitteisen Cell Proliferation

Voit selvittää molekyylitason mekanismit vaikutusta PAR

2 aktivoinnin leviäminen, käytimme ihmisen keuhkokarsinooma johdettujen A549 epiteelisolujen linja, joka ilmentää PAR

2 muttei aktivoivan proteinaasi. BrdU merkintöjä määritys osoitti, että valikoiva PAR

2-aktivoiva peptidi (PAR

2-AP), mutta ei päinvastaisessa-sekvenssi peptidin (RP), indusoi merkittävää kasvua DNA-synteesiä (kuvio 2A). Lisäksi PAR

2 aktivointi kasvoi merkittävästi sykliini D1 sekä mRNA ja proteiini tasolla (kuvio 2B ja C). Nämä tulokset viittaavat siihen, että PAR

2 aktivointi edistää solujen jakso G1 /S tarkastuspiste.

A549-soluja käsiteltiin PAR

2 aktivoiva peptidi (PAR

2-AP, 50 uM) tai kääntää peptidi (PAR

2-RP) 24 tuntia. A. DNA-synteesi mitattiin BrdU merkintöjen assay.B. Tasot sykliini D1 ja sykliini E mRNA tunnistettiin PCR-käsittelyn jälkeen tai ilman PAR

2-AP. C. Proteiini taso sykliini D1 määritettiin Western blot. D. A549-soluja käsiteltiin PAR

2-AP (50 uM) 24 tunnin kuluttua ohimenevän transfektion E2F-lusiferaasi (1 ug /kuoppa). Data normalisoitiin jossa tk-RL ja esitetään prosenttiosuutena kontrolliryhmän. E. HT29-soluja käsiteltiin PIC (proteinaasinestäjä cocktail) tai T9128 (trypsiini-inhibiittori). DNA-synteesi mitattiin BrdU merkintöjen määritys. F. Protein (vasemmalla) ja mRNA (oikealla) tasoja sykliini D1 PAR

2 Knockout soluja mitattiin. *

p

0,05, ***

p

0,001 Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. N = 3-6. Kaikki kokeet on toistettu ainakin 3 kertaa itsenäisesti.

Yleisesti aktivointi sykliini /CDK kompleksi voi aiheuttaa hyperfosforylaatiota pRb joka johtaa E2F transkription aktivaation ja kierrä loppupään kohdegeenien, kuten kuten sykliini E. lusiferaasireportterista testi osoitti, että PAR

2-AP aktivointi PAR

2 koholla E2F transkriptioaktiviteettia (kuvio 2D), yhdessä samanaikaisen korkeus sykliini E mRNA: n ilmentymisen (kuvio 2B). Nämä tulokset osoittavat, että PAR

2 aktivointi edistää solujen lisääntymistä kautta sykliini D1 /E2F signalointi.

Lisäksi testasimme sykliini D1 on rooli PAR

2 auto-aktivaation HT29. Käsittely PIC tai trypsiininestäjää merkittävästi lakkautetaan DNA-synteesiin HT29 (kuvio 2E). Ilmaisu taso sykliini D1 PAR

2 Knockdown soluja myös vaimentua sekä proteiinin ja mRNA-tasot (kuvio 2F). Nämä havainnot viittaavat siihen, että sykliini D1 välittämä PAR

2 aiheuttaman soluproliferaation.

PAR

2 Säätelee sykliini D1 ilmentyminen klo Transkription ja Post-transkription tasot

Ymmärtää mekanismia joka PAR

2 aktivointi säätelee sykliini D1 ilmaisua, käytimme A549-solut, joilla ei ole autokriinisen silmukka. Ensimmäinen, A549-soluja esikäsiteltiin aktinomysiini D estää transkription. Inhibointi transkription täysin tukossa PAR

2-indusoidun sykliini D1 mRNA-tasolla (kuvio 3A), mutta ei proteiinin taso (kuvio 3B). Toisaalta, pudotus ja β-kateniinin, joka on keskeinen transkriptiotekijä induktioon sykliini D1, myös täysin tukossa sykliini D1 mRNA: n ilmentymisen (kuvio 3C). Nämä havainnot ehdottivat, että β-kateniinin välitteisen PAR

2-induced upregulation of sykliini D1 transkriptionaalisella tasolla. Kuitenkin knockdovvn β-kateniinin vaatimattomasti pienentää sykliini D1 proteiinitasolla (kuva 3D), mikä osoittaa, että sykliini D1 myös voimistuvan PAR

2 post-transkription tasolla.

A549-soluja esikäsiteltiin aktinomysiini D (2 ug /ml) 30 min ennen altistusta PAR

2-AP (50 uM) 24 tunnin ajan. (A) mRNA: ta ja (B) proteiini tasot sykliini D1 havaittiin reaaliaikaista PCR: llä ja Western Blot. siRNA kohdistaminen beeta-kateniinin transfektoitiin A549-solut 24 tuntia ennen hoidon PAR

2-AP. (C) mRNA: ta ja (D) proteiini tasot sykliini D1 havaittiin reaaliaikaista PCR: llä ja Western Blot, vastaavasti.

On raportoitu, että fosforylaatiota sykliini D1 on mukana sen hajoamista. Kuitenkin, ei ollut merkittävää muutosta fosfori-sykliini D1 jälkeen PAR

2 aktivointi (tuloksia ei esitetty).

miRNA Mediate PAR

2 aiheuttama sykliini D1 ilmentyminen

lisäksi proteiini muutokseen, MikroRNA (miRNA) ovat nousemassa tärkeitä säätelijöitä geeniekspression lohkaisemalla kohde-mRNA tai estämällä niiden käännös. Itse asiassa monet MikroRNA oli osoitettu säätelemään sykliini D1 ilmentyminen suoraan [21]. Sen määrittämiseksi, ovatko miRNA säädeltiin PAR

2, havaitsimme tasot miR-15a, miR-16, ja miR-34a PAR

2 Knockdown soluja ja PAR

2 aktivoitu soluja. Reaaliaikainen PCR osoitti, että taso miR-34a, mutta ei mir-15a ja miR-16, oli dramaattisesti koholla PAR

2 taintumisen HT29 (PAR

2-1 ja PAR

2-2 ) verrattuna sekoitetun RNA-ohjattu soluja (RS) (kuvio 4A). Lisäksi PAR

2 aktivointi vähensi miR-34a ilmentymisen A549-soluja (kuvio 4B). Sen testaamiseksi, miR-34a voidaan säädellä HT29-johdettu proteinaaseille, me nälkää HT29 3 h, 24 h ja 48 h kerääntyä PAR

2-aktivoivan proteinaaseille (trypsiinin ja KLK14) väliaineessa. Kvantitatiivinen PCR osoitti, että miR-34a ilmentymisen taso vaimentua ajan (kuvio 4C). Estäjä miR-34a, joka puolestaan ​​laskenut miR-34a (kuvio 4D, yläpaneeli) palautti osittain downregulation sykliini D1 PAR

2 taintumisen soluja (kuvio 4D, alempi paneeli). Yhdessä nämä tiedot viittaavat siihen, että miR-34a välitteisen PAR

2-induced upregulation of sykliini D1.

(A) Kokonais-RNA HT29, HT29 RS (salattu kontrolli-RNA) ja kaksi eri kloonia vakaa transfektanttisoluilla PAR

2 taintumisen (PAR

2-1 ja PAR

2-2) kerättiin. Tasot kohdennettujen miRNA mitattiin reaaliaikaista PCR. (B) A549-soluja käsiteltiin PAR

2-AP: ssa 24 tuntia. (C) HT29-soluja inkuboitiin DMEM /F-12-väliaineessa ilman FBS: ää eri osoittaman ajan. (D) transfektio miR-34a tai kontrollia RNA (c-RNA) kanssa Lipofectamin2000 osaksi HT-29-RS tai HT-29-PAR-2. Kolme päivää myöhemmin solut kerättiin analyysiä varten. Tasot miRNA mitattiin reaaliaikaista PCR ja normalisoitu U6. *

p

0,05, **

p

0,01 Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. N = 3-6.

TGF-β välitteisen PAR

2 liittyviä miRNA-34a Expression

Seuraava kysymys on, miten PAR

2 aktivointi säätelee lauseke Mir-34a. Hoidon ehdollinen väliaineen ohjaus HT29 (HT-29-RS) vähensi merkittävästi ekspressiotaso miR-34a, joka on voimistuvan pudotus PAR

2 HT29 (HT-29-PAR-2) (kuvio 5A). Koska TGF-β on raportoitu vähentävän ilmentymisen miR-34a hiljattain (39), rooli TGF-β PAR-2-liittyvät miR34a ekspressio testattiin. Ensinnäkin, olemme huomanneet, että TGF-β (5 ng /ml) pystyi alentamaan miR-34a ilmentymisen sekä PAR

2-puutteelliset HT29 (HT-29-PAR2) (kuvio 5B) ja A549-soluja (kuvio 5C). Tärkeintä on, ehtyminen TGF-β ehdollisesta keskipitkän HT-29-RS anti-TGFp-vasta-aine poisti inhiboivan vaikutuksen edellytyksenä väliaineen miR-34a ilmentymistä (kuvio 5D). Kaikki nämä korostettu sitä, että TGF-β välittämää säätelyssä miR-34a aiheuttama PAR

2 aktivointi.

(A) HT-29-RS tai HT-29-PAR-2-soluja käsiteltiin ehdollinen väliaine HT-29-RS-soluja (CM-RS) ja 3 päivää. (B) HT-29-PAR-2-soluja käsiteltiin TGF-β (5 ng /ml) 12 tuntia. (C) A549-soluja käsiteltiin TGF-β (5 ng /ml) 6 tuntia. (D) Ehdollinen väliaine HT-29-RS (CM-RS) inkuboitiin anti-TGF β-vasta-aineen ja proteiini A /G-agaroosia 4 ° C: ssa 2 tunnin ajan. Sentrifugin jälkeen, supernatantti (CM-RS-anti-TGF β) käytettiin hoitamaan HT-29-PAR-2 ​​solun 3 päivää. Sen jälkeen, kun erilaisia ​​hoitoja, kuten edellä on mainittu, solut kerättiin määritystä miR-34a reaaliaikaista PCR: llä. *

p

0,05, **

p

0,01 Kaikki tiedot esitetään keskiarvona ± SEM. N = 4-8.

Korrelaatio PAR

2, Trypsinogeeni, KLK14, sykliini D1 ja miR-34a Colon Cancer Näytteitä

perehtyä biologisen roolin PAR

2 autokriiniset signalointi ihmisen peräsuolen syövän synnyn, ekspressiotasot PAR

2 ja sen aktivoimalla proteinaasi mitattiin 30 pariksi ihmisen T3 peräsuolen syöpä (CRC) näytteet. Säännöllinen RT-PCR: ää käytettiin havaitsemaan mRNA: n ilmentymisen trypsinogeenin ja KLK14 CRC näytteiden ja osoitti, että lähes kaikki näytteet näihin PAR

2-aktivoivan proteinaasi (kuvio 6A). Seitsemänkymmentä prosenttia (21/30) ihmisen CRC näytteessä oli kohonnut trypsinogeeniä ilmentymistä tuumorikudoksissa verrattuna pariksi normaalin paksusuolen kudoksiin, kun taas normaaleissa kudoksissa osoitti lähes trypsinogeenin ilme. Reaaliaikainen PCR osoitti, että PAR

2 laajalti ilmentyy normaaleissa limakalvolla ja ensisijainen CRC näytteitä. Kuten kuviossa 6B, PAR

2 havaittiin olevan keskimäärin merkittävästi (

p

0,05) yli-ilmentyy CRC näytteissä korkeamman kehityksen asteen, kun taas CyclinD1 ja miR-34a ei todettu merkitsevää muutokset (kuvio 6B). Mielenkiintoista, korkeampi PAR

2, sykliini D1 ja alemman miR-34a merkittävästi korreloivat imusolmuke etäpesäke CRC näytteissä (kuvio 6C). Yhdessä nämä tiedot validoitu että autokriinisen silmukka PAR

2 ja sen aktivoiva proteinaasi voi edistää kasvainten kehittymiseen ja syövän invaasio ihmisen CRC näytteissä.

(A) ilmentyminen trypsinogeeniä ja KLK14 ihmisen CRC kasvainnäytteet (T) ja yhdistetty normaaliin kudokseen (N) mitattiin PCR. Aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina. MRNA ilmentyminen PAR

2, CCND1 ja taso miR-34a ihmisten CRC testattiin reaaliaikaista PCR. Niitä verrattiin mukaan (B) luokka tai (C) tilan imusolmuke etäpesäke. Tiedot on esitetty kannen muutos kasvaimen näytteen (T) pariksi normaalin kudoksen (N).

Keskustelu

MikroRNA (miRNA) endogeenisesti ilmaistaan ​​17-25 nukleotidin, ei-koodaavat RNA: t ja säädellä geeniekspressiota post-transkription tasolla. Koska ensimmäinen miRNA, lin-4, löydettiin vuonna 1993 [22], [23], noin 1000 miRNA on tunnistettu ihmisellä [24] ja ne voivat kohdistaa yli 30% kaikista geeneistä ja suurin osa geneettistä reittejä [25] , [26]. Viime vuosikymmenen aikana, miRNA ovat nousseet kriittinen sääntelyviranomaisten syöpä [27] ja ovat mukana kehittämässä erilaisia ​​syöpiä, kuten kolorektaalisyövän [28]. Lisääntyvä näyttö osoittaa, että tietty miRNA korreloivat sairauden vaiheessa, etäpesäke ja selviytymistä CRC. Tähän mennessä meillä on 118 miRNA jotka kaikki on tarkistettu ja niihin liittyy CRC kehittämiseen [29]. Jotkut miRNA toimivat kasvaimia estävä, kuten let7a, miR-34 a /b /c, miR-126, miR-143, miR-145, ja miR-200 perhe, kun taas jotkut niistä arvellaan olevan onkogeenistä, kuten kuten miR-17-92 klusteri, miR-21, ja miR-135.

Hallitsematon solujen lisääntyminen on ominaisuus syövän. Useita miRNA on tunnistettu, jotka säätelevät solusyklin. Osa miRNA edistää solujen lisääntymistä, kuten miR-125b [30], kun taas jotkut niistä aiheuttaa solusyklin pysähtymisen. Esimerkiksi, Let 7 on todettu olevan voimakas kasvua vaimentimen eri syöpäsoluissa [31], [32]. Kaksi liittyvien miRNA miR-143 ja miR-145 on todettu tukahduttaa kasvua osittain kohdentamalla ERK5 [33]. Trombiini on osoitettu stimuloivan solujen lisääntymistä kautta kasvua miR-222, joka voi estää p27 ilmentymistä [34]. Nykyinen tutkimus osoitti, että serimiproteinaasi aktivoitu PAR

2 ja kykeni myös vaikuttaa tasoon miRNA, joka toiminnallisesti välitteistä solujen kasvua syöpäsoluissa (kuva 7).

Koska avainsäätelijänä G1 /S tarkastuspiste, sykliini D1 voidaan kohdistaa eri miRNA. MiR-15a ja miR-16 usein poistetaan tai alassäädetty ja nämä tapahtumat korreloivat käänteisesti ilmaus sykliini D1 syövässä. Lisätutkimukset osoittivat, että sykliini D1 on suoraan säätelee miR-15a ja miR-16 [35]. Lisäksi sykliini D1 ilmentyminen voidaan säädellä miR-200B ja Let-7b kohdistamalla Rho perhe GTPaasina 3 (RND3) [36], [37]. Esillä olevassa tutkimuksessa, miR-15a ja miR-16 havaittiin. Kuitenkin, ei ollut merkittävää muutosta niiden ekspressiotasot jälkeen PAR

2 aktivaatio A549-soluja (kuvio 3F) tai sen jälkeen PAR

2 knowdown in HT29. Lisäksi ei ollut mitään merkittävää muutosta miR-200b ja Let-7b (tuloksia ei ole esitetty), eikä ollut mitään johdonmukaista muutosta ilmaisun kohdegeenin, RND3, määritettynä western blot ja lusiferaasireportterista määrityksessä 3 ’UTR of RND3 (tuloksia ei ole esitetty). On annettu ymmärtää, että miR-15a, miR-16 ja miR-200b eivät ole välittäjiä PAR

2-induced upregulation of sykliini D1.

MiR-34a kuuluu miR-34 perheessä, joka sisältää myös miR-34b ja miR-34c. Alhainen miR-34 on usein havaittu erilaisissa kasvaimissa, mukaan lukien CRC [38]. Inaktivointi endogeenisen miR-34a stimuloi solujen lisääntymistä ja inhiboi p53-riippuvaista apoptoosia kohdistamalla sykliini E2, sykliiniriippuvainen kinaasien 4/6 (CDK4 /6) [38]. Tutkimuksemme ovat osoittaneet, ensimmäistä kertaa, että miR-34a välitti autokriinisen silmukan PAR

2 ja sen aktivoimalla proteinaasi, jota tarvitaan ylläpitämään paksunsuolen syöpäsolujen lisääntymistä.

aktivointi ERK ja transaktivaation EGFR on osoitettu olevan osallisena proliferatiivinen vaikutus PAR

2 [7], [9]. Kuitenkin olevassa tutkimuksessa, ei estäjä ERK (PD98059 ja U0126) tai estäjä EGFR-tyrosiinikinaasi (AG1478) kykenivät estämään solujen proliferaatiota tai muutos miR-34a ilmentymisen HT29 ja A549-soluja (tietoja ei ole esitetty). Se merkitsi, että sääntely miR-34a ei ollut riippuvainen EGFR ja ERK-reitin jälkeen PAR

2 aktivaation syöpäsoluissa.

Äskettäin on raportoitu, että kohonneet TGF-β aktiivisuus tukahdutti ilmaus microRNA-34a maksakudosta [39]. Lisäksi PAR

2 aktivaation on osoitettu lisäävän TGF tuotanto hiirissä [40]. Siksi ei yllättynyt, että TGFli välittää tukahduttaminen miR-34a aiheuttama PAR

2 aktivoinnin nykyisessä tutkimuksessa. Lisäksi konstitutiivinen aktivointi PAR

2 johtuen autokriinisen silmukan PAR

2 ja sen aktivoivan proteinaasi voi osittain myötävaikuttaa alhainen miR-34a, joka on yhteinen eri syöpien, kuten paksusuolen syöpä.

Koska syntymässä roolit PAR

2 syövän, PAR

2 on tullut houkutteleva kohde syövän hoidossa. PAR

2 pääpiirteittäin ilmaistu syövän ja korreloi positiivisesti syövän etenemisen CRC. Vielä tärkeämpää on, PAR

2 aktivoitiin paitsi proteinaasit päässä microenvironment syövän, mutta myös, koska meidän tutkimus osoittaa, mukaan proteinaasit tuottama syöpäsoluja itseään. Kun lisäksi otetaan huomioon sääntelyn miRNA par

2 aktivointia, että olemme nyt kuvattu, laajempi vaikutus leviämisen odotetaan kohdistettuaan PAR

2 aktivaation syöpäsoluissa. Parannuttua PAR

2 antagonisteilla parhaillaan kehitteillä, PAR

2 on hyvä kohde syövän hoidossa tulevaisuudessa.

Kiitokset

Kiitämme professori Nathalie Rivard,