Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

levamisoli, imidatso (2,1-b) tiatsoli johdannainen, on raportoitu olevan mahdollinen antituumoriaine. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme tutkineet vaikutusmekanismi yksi äskettäin tunnistettu analogit, 4a (2-bentsyyli-6- (4′-fluorifenyyli) -5-tiosyanato-imidatso [2,1-b] [1] , [3], [4] tiadiatsoli).

Materiaalit ja menetelmät

ROS tuotanto ja ilmaisun eri apoptoottisten proteiinien mitattiin seuraavat 4a hoidon leukemiasolulinjoja. Kasvaimen eläinmalleja käytettiin vaikutuksen arvioimiseksi 4a verrattuna Levamisoli etenemiseen rinta- adenokarsinooma ja selviytymistä. Immunohistokemia ja western blotting tutkimukset suoritettiin ymmärtää mekanismia 4a toiminta sekä

ex vivo

ja

in vivo

.

Tulokset

Olemme määrittäneet IC

50 arvo 4a monissa leukemiasoluja ja rintasyövän solulinjoissa ja löysi CEM soluja herkin (IC

50 5 uM). Tulokset osoittivat, että 4 a käsittely johtaa kertyminen ROS. Western blot-analyysi osoitti ylössäätely proapoptoottisten proteiinien t-BID ja BAX, käsittelemällä 4a. Lisäksi annoksesta riippuvainen aktivaatio p53 yhdessä FAS, FAS-L, ja lohkaisu kaspaasin 8 viittaavat siihen, että se aiheuttaa kuoleman reseptorin välittämien apoptoottisen reitin CEM-soluissa. Vielä tärkeämpää on, havaitsimme vähentää kasvaimen kasvua ja merkittävää kasvua eloonjäämisessä, kun suun kautta 4a (20 mg /kg, kuusi annosta) hiirillä. Vertailun, 4a havaittiin olevan voimakkaampi kuin sen lähtöaineena analoginen levamisoli perustuu sekä

ex vivo

ja

in vivo

tutkimuksissa. Edelleen, immunohistokemia ja Western blotting tutkimukset osoittavat, että 4a hoito johti kumoamiseen kasvainsoluproliferaation ja aktivointi apoptoosin ulkoinen tie jopa eläinmalleissa.

Johtopäätös

Näin tuloksemme viittaavat siihen, että 4a voitaisiin käyttää voimakas kemoterapeuttinen aine.

Citation: Hegde M Kärki SS, Thomas E, Kumar S, Panjamurthy K, Ranganatha SR, et ai. (2012) Novel Levamisoli Johdannaissopimukset indusoi ulkoisen reaktiotien Apoptoosin syöpäsoluissa ja estää syövän etenemisen hiirissä. PLoS ONE 7 (9): e43632. doi: 10,1371 /journal.pone.0043632

Editor: Rafael Moreno-Sanchez, Instituto Nacional de Cardiologia, Meksiko

vastaanotettu: 13 helmikuu 2012; Hyväksytty: 23 heinäkuu 2012; Julkaistu: 10 syyskuu 2012

Copyright: © Hegde et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustusta Lady Tata Memorial Trust, Yhdistynyt kuningaskunta, ja Indian Institute of Science käynnistää avustusta SCR. Rahoittaja ei ollut roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistelua käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, että ei ole kilpailevia kiinnostusta.

Johdanto

Syöpä on vaikea sairaus hoitaa, ja vain hyvin harvat tehokkaita lääkkeitä on saatavilla. Kehittää uusia, tehokkaita, selektiivisiä ja vähemmän myrkyllisiä syövän terapeuttisia molekyylejä on ollut haastava tavoite. Ymmärtäminen molekyylimekanismin mukana syövät johtaa löytö uusien syöpälääkkeiden. Muutokset ekspressiotasot RNA: n ja proteiinien osalta johtuen eri mutaatioita on tutkittu monissa syövissä, mukaan lukien leukemia ja lymfooma [1] – [4]. Viime aikoina on ollut laajoja pyrkimyksiä luonnehtia mekanismi kromosomitranslokaation ja poistot johtaa leukemia ja lymfooma [5], [6]. Monet geenifuusioissa on myös tunnistettu eturauhassyövissä ja rintasyöpiä [7]. Eniten keskustelua proteiinit vastaavat leukemia ja lymfooma viime aikoina ovat rekombinaatioprosessin aktivoivat geenit (rätit, vastaava entsyymi-vasta monimuotoisuus) [5], [6] ja aktivoinnin aiheuttama deaminaasia (AID, vastaava entsyymi somaattinen hypermutaatio ja luokka kytkin rekombinaatio) [5], [8]. Kuitenkin entsyymejä kehittämisestä vastaaville geenifuusiosarjan ovat vielä tunnistettu.

Kahden viime vuosikymmenen aikana dramaattisen muutoksen syövän hoidossa paradigmoja. Esimerkiksi Imatinibi (Gleevac), huumeiden kehitetty nimenomaan vastaan ​​aktivoitua tyrosiinikinaasin krooninen myelooinen leukemia, on yksi tällainen merkittäviä edistysaskeleita [9]. Lisäksi monet muut yhdisteet on myös tunnistettu ja kliinisesti testattu. Vaikka menestys kliinisten tutkimusten tunnistaa uusia aineita ja hoitomuotoja on ollut merkittävä, nykyiset hoidot on monia rajoituksia. Tämä sisältää aiheuttamia sivuvaikutuksia huumeiden ja hankittu lääkeresistensseihin [10]. Näin ollen tarve kehittää tehokkaita syövän terapeuttisia aineita, joilla on hyvin määritelty farmakokineettisistä ominaisuuksista on suuri merkitys.

Tällä hetkellä on olemassa erilaisia ​​tapoja, joilla lääke on testattu sen tehokkuutta syöpälääke . Tässä suhteessa eri apoptoottisia reittejä on tutkittu laajasti monien yhdisteiden ymmärtää niiden tila sytotoksisuuden [11]. Solusyklin tarkastuspistettä aiheuttama pieniä molekyylejä on myös tutkittu [12], [13].

Levamisoli on immmunomodulaattoreina eri syöpäsoluissa lukien peräsuolen syöpä, rintasyöpä, melanooma ja leukemia [14]. Aikaisemmin on osoitettu, että se vaikuttaa solujen lisääntymistä eri syövistä [15], ja moduloi fosforylaatio liittyvät sekä solusyklin etenemisen ja apoptoosin. Tutkimukset ovat myös osoittaneet, että sitä voidaan käyttää anti-madon tartuntoja ja erilaisten autoimmuunisairauksien [16], [17]. Lisäksi on osoitettu, että levamisole on syövän vastaista aktiivisuutta yhdistettynä fluorourasiilin (5-FU) liitännäishoitona hoito kasvain-solmu-etäpesäke (TNM) vaiheen III (Dukes C) paksusuolisyöpä [18].

imidatso (2,1-b) tiatsoli johdannaisia ​​levamisoli on raportoitu mahdollisina kasvaimia estävinä aineina [19]. Myöhemmin, antituumorivaikutuksen 5-formyyli-6-arylimidazo- [2,1-b] -1,3,4-tiadiatsoli sulfonamideja on myös raportoitu [20]. Perustuen näihin lupaavia tuloksia, keksinnön mukaisesti syntetisoitiin sarja analogeja, jotka sisältävät fluoria 4-asemassa 6-fenyyli on imidatso [2,1-b] -1,3,4-tiadiatsoli ja tunnistaa 4a johtavana yhdiste [21]. Kuitenkin mekanismi, jolla se indusoi sytotoksisuutta ei ollut tiedossa. Sitä paitsi, se ei koskaan testattu eläinmalleilla sen vaikutus syövän etenemiseen. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme raportoivat, että 4a kykenee sen vaikutusta kasvaimen soluihin aktivoimalla ulkoinen tie apoptoosin. Olemme myös havainneet, että 4a estää etenemistä kasvain hiirillä tehokkaasti ja lisää käyttöikää merkittävästi.

Materiaalit ja menetelmät

Kemikaalit ja reagenssit

Kaikki käytetyt kemikaalit olevassa tutkimuksessa olivat analyyttistä laatua ja ostettiin Sigma-Aldrich, USA. Vasta-aineet saatiin Santa Cruz Biotechnology, USA.

synteesi 4a

synteesi ja karakterisointi 2-bentsyyli-6- (4′-fluorifenyyli) -5-tiosyanato-imidatso [2, 1-b] [1], [3], [4] tiadiatsoli, 4a on kuvattu aiemmin [21]. Levamisoli (tetramisoli-hydrokloridi, Cat. Nro L9756) ostettiin Sigma-Aldrich, USA.

Soluviljely

Ihmisen solulinjat, CEM (T-soluleukemia), K562 (krooninen myelooinen leukemia) REH (B-solu-leukemia) ja Nalm6 (B-solu-leukemia), viljeltiin RPMI 1640 (Sera Lab, UK), joka sisälsi 10% FBS: ää (Gibco BRL, USA), 100 U G-penisilliiniä /ml ja 100 ug streptomysiiniä /ml (Sigma-Aldrich, USA) 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% CO

2. EAC (rintasyöpä) solulinja hankittiin National Center for Cell Science, Pune ja kasvatettiin DMEM: ssä, joka sisälsi 10% FBS: ää, kuten edellä on kuvattu.

trypaanisinisen väriaineen ekskluusiomääritystä

vaikutus 4a elinkyvystä leukemiasolujen (CEM, K562, REH, Nalm6) ja rintasyöpä (EAC) solut määritettiin Trypan blue eksluusio määritys [22]. Soluja viljeltiin (0,75 x 10

5 solua /ml) 24 tuntia, ja yhdistettä lisättiin 1-100 uM määrittämään IC

50-arvo. DMSO käsitellyt solut käytettiin vehikkelikontrollina. Solut kerättiin välein 24 h viisi päivää ja elävien solujen lukumäärä määritettiin seuraavasti trypaanisininen värjäystä. Sillä levamisoli, vettä käytettiin vehikkelikontrollina. Mikäli EAC, kiinnittyvä solulinja, elinkelpoisuus mitattiin 48 ja 72 tunnin kuluttua hoidon 4a. Jokainen koe toistettiin vähintään kaksi kertaa ja virhepalkit laskettiin ja piirrettiin.

MTT-määritystä

MTT-määritys suoritettiin kuten aiemmin on kuvattu [23]. CEM, K562, REH tai Nalm6 soluja (0,75 x 10

5 solua /ml) käsiteltiin 4a (CEM ja REH soluja 1, 5, 10 ja 20 uM, sillä K562 1, 5, 10, 20, 40 ja 100 uM, sillä Nalm6, 1,5,10, 20, 40 uM), inkuboitiin 48 ja 72 tuntia ja suoritettiin MTT-määritys. Solut, joita käsiteltiin DMSO: ssa tai vettä käytettiin ajoneuvon ohjauslaitteet 4a, vastaavasti. Koe toistettiin vähintään kaksi riippumatonta kertaa, kukin kahtena reaktioita ja virhepalkkien osoitetaan.

LDH vapautumisen määrityksellä

LDH levittämisestä median seuraava 4a hoidon (1, 5, 10 ja 20 uM) on CEM-soluja jälkeen 48 ja 72 tuntia hoidon mitattiin käyttämällä vakioyhteyskäytäntöä [24]. Prosenttiosuus LDH: n vapautuminen laskettiin: LDH: n vapautuminen in media /(LDH: n vapautuminen in media + solunsisäinen LDH: n vapautuminen) x 100%.

Detection solunsisäisten ROS tuotanto virtaussytometrialla

taso kokonaistuotannosta solunsisäinen ROS tuotanto mitattiin käyttämällä solun läpäisevä fluoresoiva koetin 2,7-dichlorodihydro fluoreseiinidiasetaattia (H

2DCFDA) CEM ja REH soluihin [25]. CEM-soluja käsiteltiin 5 ja 10 uM 4a ja REH-solujen kanssa 10 uM 5, 10, 15, 30 ja 60 min, kerättiin, pestiin ja fluoresenssin intensiteetti analysoitiin virtaussytometrialla. Solut käsiteltiin H

2O

2 käytettiin positiivisena kontrollina korvausta kokeiluista.

Western blot-analyysi

Solulysaattia valmistettiin hoidon jälkeen 4a CEM (0 , 0,5, 1, ja 5 uM 48 h). Western-blottaus suoritettiin, kuten aiemmin on kuvattu [23]. Lyhyesti, -40 ug proteiinia näyte elektroforeesilla 8-12% SDS-PAGE, siirrettiin PVDF-kalvolle (Millipore, USA) ja tutkittiin vastaavan ensiö- ja biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineita. Ensisijainen käytetyt vasta-aineet olivat BCL2, BCL-XL, BAX, t-BID, p53, p-p53 [Ser 392], PUMA, AKT, Pakt [Ser 473], FAS, FAS-L, FADD, SMAC /DIABLO, kaspaasi -3, kaspaasi 8 ja sytokromi C blotit kehitettiin käyttäen kemiluminesenssi reagensseja (Immobilon ™ western, Millipore, Intia) ja skannataan geeli asiakirjajärjestelmä (LAS 3000, Fuji, Japani). Blotit stripattiin myöhemmin kohti vakioprotokolla ja uudelleen koetettiin anti-tubuliinin aineella [23].

erottaminen mitokondrioiden ja solulimafraktiot 4a käsiteltyjen CEM-soluja

CEM soluja käsiteltiin 5 uM 4a 48 tuntia, talteen ja käytetään eristämiseen mitokondrioiden ja solulimafraktiot käyttäen mitokondrion liuuttovälinepakkausta (IMGENEX, USA, Cat. No. 10082k) kohti valmistajan ohjeiden. DMSO käsiteltyjä soluja käytettiin kontrollina. Tuloksena fraktiot käytettiin western blot analyysiä vastaisesta sytokromi C Actin käytettiin latauskontrollina.

In vivo kokeita

Etiikka ja ohjausjärjestelmästä.

Hiiret ylläpidetään kohden periaatteita ja ohjeita eettisten komitean eläinten hoidosta Indian Institute of Science mukaisesti Intian kansallisen laki eläinten hoitoon ja käyttöön. Kokeellinen suunnittelu Tämän tutkimuksen hyväksyi Institutional Animal eettisen komitean (Ref. CAF /Etiikka /125/2007/560), Indian Institute of Science, Bangalore, Intia.

Eläimet

Swiss albinohiirten, ikä 6-8 viikkoa, paino 18-22 g ostettiin Keski eläimistä laitos, Indian Institute of Science (IISc), Bangalore, Intia ja ylläpidetään eläimen talossa, Biokemian, IISc. Eläimiä pidettiin polypropeeni häkkeihin ja edellyttäen standardi pellettiruokaa (Agro Corporation Pvt. Ltd., Intia) ja vettä mielin määrin. Standardi pellettiruokaa koostuu 21% proteiinia, 5% lipidejä, 4% raakakuitua, 8% tuhkaa, 1% kalsiumia, 0,6% fosforia, 3,4% glukoosia, 2% vitamiinia, ja 55% typpeä uutos (hiilihydraatteja). Hiiriä pidettiin kontrolloiduissa olosuhteissa lämpötilan ja kosteuden kanssa, 12 tunnin valo /pimeä-sykli.

valmistaminen Ehrlich askiittikarsinooma (EAC) soluja.

EAC solut kerättiin peritoneaaliontelosta ja kasvain luovuttajan hiiriä 20-22 g kehon painoa ja suspendoitiin steriiliin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS). Kiinteä määrä elinkelpoisia soluja (1 x 10

6 solua /22 g b. P-) istutettiin vatsaonteloon kunkin vastaanottajan hiiren ja annettiin lisääntyä. Kasvain solut vedettiin, laimennettiin suolaliuoksella, laskettiin ja ujutetaan (1 x 10

6 solua /eläin) oikeaan reiteen kudoksen koe-eläinten kehittämiseen kiinteiden kasvainten.

arviointi antituumorivaikutuksen 4a hiiren

tutkia ja vertailla antituumorivaikutuksen 4a, 32 Swiss albino-hiiret, joita käytetään tässä tutkimuksessa, (kaksi erää 16 eläimen ryhmään). Out of 16 hiiriä, neljä käytettiin käsittelemätöntä (normaali) kontrolli. Loput hiiriin injektoitiin EAC aiheuttavan kiinteä kasvain, ja jaettiin kolmeen ryhmään, joista kukin sisältää neljä eläintä kasvaimen ohjaus (ryhmä kaksi), Levamisoli käsiteltiin (ryhmä kolme) ja 4 a käsiteltiin (ryhmä neljä). Ryhmä kaksi sai vettä auton hallinnan ryhmä kolme sai suun kautta Levamisoli (20 mg /kg, b. Painosta) ja ryhmä neljä sai suun kautta 4a (6 annosta 20 mg /kg) joka vaihtoehtoisen päivä käyttäen mahalaukun gavages alkaen 12

päivänä injektion kasvainsolujen.

halkaisijat kehittää kasvain mitattiin tapauksessa ryhmä kaksi, kolme ja neljä eläintä käyttämällä noniusmittaharppia kerran viidessä päivässä. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa V = 0.5ab

2, jossa ”a” ja ”b” osoittaa pää- ja halkaisija, vastaavasti [26]. Lopussa 25

th ja 45

päivään mennessä koeajaksi, yksi eläin kustakin ryhmästä tapettiin katkaisemalla kaula ja kudosten normaalista (ryhmä yksi), kasvain (ryhmä kaksi), Levamisoli käsiteltiin (ryhmä kolme ) ja 4 a käsiteltiin (ryhmä neljä) eläimet kerätään ja tallennetaan.

tarkista pitkäikäisyys aiheuttama 4a kasvaimen hiirillä, 24 eläimet tutkittiin kaksi sisältävä erä 12 kpl. Out of 12, kuusi toimi kasvain ohjaus ja muut käsiteltiin 4a kuten edellä on selitetty. Prosenttiosuus keskimääräisen eliniän pidentyminen laskettiin ja verrattiin kontrollieläinten. Kuolema malli valvonnan ja 4a käsiteltyihin eläimiin nauhoitettiin% keskimääräisen eliniän pidentyminen laskettiin käyttäen kaavaa [(T-C) /C] x 100, jossa ”T” osoittaa, kuinka monta päivää 4a hoitoa saaneet eläimet elivät ja C ”ilmaisee päivien kasvaimen eläinten selvisi [26] – [28].

arviointi myrkyllisyydestä 4a normaaleissa hiirissä

Swiss Albino hiiriä hoidettiin 4a ja levamisoli (6 annosta, joka toinen päivä) ja sivuvaikutukset arvioitiin kahdella eri ajankohtina (20

th ja 50

päivänä). Out of 36 hiirillä, 18 kukin käytettiin 20

th ja 50

päivänä. Molemmissa tapauksissa, 6 eläintä toimi kontrollina, kun taas 6 käsiteltiin levamisoli (20 mg /kg) tai 4a (20 mg /kg). Ruumiinpaino Kunkin eläimen seurattiin koko kokeen ajan ja keskipaino laskettuna 20

th ja 50

päivänä valvontaa, 4a ja Levamisoli annettiin hiirille ja piirrettiin kanssa virhepalkkien. Jotta voitaisiin arvioida vaikutusta 4a ja Levamisoli fysiologisiin toimintoihin, verta kerättiin 20

th ja 50

päivänä kuten aiemmin on kuvattu [29]. Seerumi erotettiin ja maksan ja munuaisten toiminta suoritettiin kunkin eläimen, määrittää alkalisen fosfataasin (ALP), kreatiniinin, urean ja verenkuva suoritettiin käyttämällä plasman kuten aiemmin on kuvattu [29]. Arvot esitetään keskiarvona ± SEM.

Western blot-analyysi 4a käsitellyn kiinteän ja nestemäisen kasvainsolujen

Kiinteä tuumori kehitettiin kuten aiemmin on kuvattu [29]. Sen jälkeen 6 annosta 4a, kasvain kerättiin ja uute valmistettiin käyttäen RIPA puskuria menetelmällä [23]. Neste kasvain on kehitetty ruiskuttamalla EAC-soluja (2 x 10

6 solua) luovuttajalta hiirten vatsaonteloon koe-eläimille. Seuraavat EAC injektio (5

päivänä), eläimiä käsiteltiin 4a (20 mg /kg; 4 annosta joka vaihtoehtoisia päivää) ja EAC-solut eristettiin vatsaonteloon. Makrofagi linjan solut erotettiin tarttumattomat EAC solujen imemällä kevyesti, ja pestiin 1 x PBS: llä. Solujen elinkelpoisuus tarkistettiin käyttäen trypaanisinivärin syrjäytymisen määrityksessä ja 92% soluista havaittiin olevan elossa sekä kokeellisen ja ohjaa ryhmiä. EAC solut lyysattiin RIPA-puskuriin, uute valmistettiin, kuten aiemmin on kuvattu [30], ja käytettiin western blot -analyysiin.

Histologinen arviointi

kasvain ja maksan kudosten normaalin ja kokeellisen hiiriä otettiin talteen ja jalostettu kohti vakioprotokollia. Lyhyesti, kudokset upotettiin parafiini, leikattiin 5-10 um on rotaatiomikroskooppi (Leica Biosystems, Saksa) ja värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla [31], [32]. Brain kudokset kerätään, käsitellään ja värjättiin Luxol Fast Blue opiskelemaan demyelinaatio. Jokainen osa arvioitiin valomikroskopialla ja kuvat otettiin kiinni (Zeiss, Saksa).

immunohistokemiallinen (IHC) analyysi

Vasta-aineen värjäys suoritettiin formaliinilla, parafiiniin kudokset, jotka leikattiin jonka paksuus on 5 um. Objektilasit de-paraffinized käyttäen ksyleeniä, vedettömät ja käsiteltiin 3% H

2O

2 PBS: ssä. Antigeeni haku suoritettiin käyttäen 0,01% natrium-sitraattipuskuria seurasi estämällä PBST, joka sisälsi 0,1% BSA: ta ja 10% FBS. Ensisijainen vasta-inkubointi (Ki67, BID tai 53BP1) suoritettiin yön yli 4 ° C: ssa. Objektilasit pestiin ja niitä inkuboitiin biotinyloidun sekundaarisen vasta-aineen (1 h). Objektilasit pestiin sitten, inkuboitiin streptavidiini-HRP: tä (1:1000). Objektilasit pestiin jälleen (PBS, joka sisältää 0,1% Tween 20) ja väri kehitettiin käyttämällä DAB + H

2O

2, vastavärjättiin hematoksyliinillä ja asennettu DPX (Sigma-Aldrich, USA). Kuvat otettiin käyttäen valoa (Zeiss, Saksa). Muutos intensiteetissä vasta-aineen värjäyksen jälkeen, 4a hoidon määritettiin käyttäen ImageJ ohjelmisto [33].

Tilastollinen analyysi

Arvot ilmaistaan ​​keskiarvona ± SEM ohjaus- ja koenäytteiden ja tilastollinen analyysi suoritettiin käyttämällä Yksisuuntainen ANOVA seurasi Dunnettin testi ja jokainen arvo verrattiin ohjaus ja merkitys on mainittu. Tätä analyysiä varten GraphPad ohjelmisto prisma 5.1 käytettiin. Arvot pidettiin tilastollisesti merkitsevä, jos p-arvo oli yhtä suuri tai pienempi kuin 0,05.

Tulokset

4a aiheuttaa sytotoksisuuden syöpäsoluissa

Aiemmin samalla seulonta sarjan levamisoli johdannaisten tunnistimme 4a johtavana yhdistettä (Fig. 1A) [21]. Tässä tutkimuksessa olemme käyttäneet erilaisia ​​leukemiasolulinjoilla (CEM, K562, REH ja Nalm6) ja hiiret rintasyövän solulinjaa, Ehrlich askiittikarsinooma (EAC) arvioida sen mahdollisuuksia aiheuttaa sytotoksisuutta. Ensinnäkin, IC

50 4a CEM, K562, Nalm6 ja REH soluihin määritettiin käyttäen trypaanisininen ja MTT-määrityksissä (kuvio. 1). Solut käsiteltiin DMSO käytettiin auton ohjaus. Tulokset osoittivat, että 4a hoito vaikutti merkittävästi solujen elinkelpoisuuden pienemmillä pitoisuuksilla CEM, Nalm6 ja REH (Fig. 1 B, C). Mielenkiintoista, K562-solut osoittivat ainakin herkkyyttä 4a hoitoon (Fig. 1 B, C). Perustuen sekä trypaanisinistä ja MTT määrityksissä, IC

50-arvon arvioitiin olevan noin 5, 70, 10 ja 8 uM CEM, K562, Nalm6 ja REH soluja, vastaavasti 48 tunnin jälkeen 4a hoitoa. Mielenkiintoista on, verrattuna 4a, Levamisoli hoidon CEM-solut osoittivat vähemmän herkkyyttä (Fig. 2A, B). 4a näytteillä merkittäviä sytotoksisuuden EAC soluissa (IC

50, 33 uM), kun taas solut tunteeton Levamisoli kello Pitoisuusalueen testattuja (Fig. 2C, D). Edelleen, LDH määritys suoritettiin määritys soluvaurioita aiheuttama 4a CEM-soluja. Soluja käsiteltiin 4 a 48 ja 72 tuntia, vastaavasti, otettiin talteen ja altistettiin LDH mittaus. Tulokset osoittivat annoksesta riippuva nousu vapautumisen LDH (Fig. S1).

. Rakenne 4a. B. 4a aiheuttama sytotoksisuuden määritettynä trypansininen määrityksessä. CEM, K562, Nalm6 ja REH-soluja viljeltiin (0,75 x 10

5 solua /ml) ja sytotoksisuus mitattiin lisäämällä kasvavat pitoisuuden 4a esitetyllä tavalla. Solut laskettiin välein 24 h kunnes solut saavutetaan kiinteän faasin ja piirrettiin. DMSO käsitellyt solut käytettiin vehikkelikontrollina. Keskivirhe laskettiin perustuen vähintään kahden itsenäisen kokeen. C. Solujen proliferaation käyttäen MTT-määritystä lisäyksen jälkeen 4a CEM, K562, Nalm6, ja REH-soluja (48 ja 72 h). Esitetyt tulokset ovat vähintään kaksi erillistä koetta, jokainen tehtiin kaksoiskappaleet ja tulokset ilmaistaan% soluproliferaation. Kaikissa paneelit ”C” tarkoittaa DMSO käsitelty ajoneuvon hallinnan.

. Rakenne Levamisoli, vanhempien yhdiste 4a. B. Solujen proliferaation käyttämällä MTT-määritystä on CEM-soluja käsiteltiin Levamisoli tai 4a. Siinä tapauksessa, että levamisoli, käytetyt pitoisuudet olivat 1, 5, 10 ja 20 uM, kun se oli 10 uM 4a. Keskivirhe laskettiin kahdessa riippumattomassa kokeessa. C, D. sytotoksisuus 4a ja Levamisoli siitä EAC-soluissa mitattuna trypansininen määrityksessä. EAC soluja viljeltiin (0,75 x 10

5 solua /ml) ja käsiteltiin 1, 5, 10, 20 ja 40 uM 4a tai levamisoli. Solujen elinkelpoisuus määritettiin trypan blue määrityksellä 48 ja 72 tuntia. Keskivirhettä laskettiin kolmen erillisen kokeen.

4a indusoi solunsisäistä reaktiivisia happiradikaaleja (ROS) B

ylituotanto ROS lisäämisen jälkeen yhdiste on osoitus soluvasteen johtavan DNA-vaurioita ja apoptoosin. Olemme havainneet, että 4 a indusoi ROS tuotannon tapauksessa CEM (5 ja 10 uM) sekä REH (10 uM) soluihin 10 ja 15 min (Fig. 3 A, B, kuvio. S2). Lisäksi lisääntyminen inkubaation aikaa ei parantaa ROS tasolla. Solut, jotka käsitelty H

2O

2 käytettiin positiivisena kontrollina, kun taas DMSO: käsitellyt solut toimi ajoneuvon ohjaus (Fig. 3). Siten tulokset viittaavat siihen, että ROS tuotanto on välivaihe mukana 4a indusoidun sytotoksisuuden.

A, B CEM (A) ja REH soluissa (B) käsiteltiin 4 a (5 uM ja 10 uM, tässä järjestyksessä) eri ajankohtina käytettiin testaamiseen muodostumista solunsisäisten ROS virtaussytometrialla analyysi. Pitoisuus valittiin tutkimukseen perustui niiden IC

50-arvot. H

2O

2 käsiteltyjä soluja käytettiin positiivisena kontrollina, kun taas ainoastaan ​​soluja käytettiin negatiivisena kontrollina. DMSO käsitellyt solut käytettiin vehikkelikontrollina. Solupopulaatio osoittaa ROS osoitettiin yhdessä keskivirheen keskiarvon (n = 2).

4a moduloi ilmaus apoptoottisten proteiinien

Jotta tutkia mekanismia, jolla 4a indusoi solukuolemaa olemme tutkineet ekspressiotasoja eri apoptoottisten proteiinien seuraavat 4a hoitoon. CEM-soluja valittiin tutkimukseen, koska se osoitti suurinta herkkyyttä 4a. CEM-soluja käsiteltiin kasvavilla pitoisuuksilla 4a (0,5, 1 ja 5 uM, 48 h), solulysaatti valmistettiin ja käytettiin western blot tutkimuksia. Tulokset osoittivat, että 4 a käsittely johti huomattava nousu tasot p53 sekä fosfo-p53 (Fig. 4A). Koska p53 on tunnettu aktivaattori apoptoosin, testasimme ilmentyminen eri BCL2 perheen proteiineja, joilla on pro /antiapoptoottisten toiminnot (Fig. 4A, B). Vastaa meidän edellä olevista tuloksista, havaitsimme kasvu ekspression proapoptoottiset proteiinien PUMA, BAX, ja lohkaisu BID (Fig. 4A, B). Kiinnostavaa kyllä, myös havaittu säätelyä antiapoptoottisten proteiinien, BCL2 ja BCL-XL, erityisesti 0,5 ja 1 uM pitoisuudet (Fig. 4B). Edelleen, 4a hoito johti ilmentymisen lisääntyminen kuoleman-reseptorin signalointia proteiinien, FAS, FAS-L ja FADD, joka osoittaa, että sytotoksisuus indusoitiin 4a voidaan välittyy kuoleman reseptori välitteistä apoptoosia (Fig. 4C).

CEM solulysaatti valmistettiin seuraavat hoidon 4a (0, 0,5, 1 ja 5 uM 48 h). DMSO käsiteltyjä soluja käytettiin kontrollina (0 uM). Western blotting suoritettiin käyttäen tiettyjä ensisijainen ja toissijainen vasta-ilmaus (A) Phospho p53, p53, PUMA, phospho AKT, AKT (B) BCL2, BCL-XL, BAX ja t-BID; (C) FAS, FAS-L, FADD, ja SMAC /DIABLO (D) kaspaasi-3, kaspaasi-8 ja sytokromi C α-tubuliinin käytettiin latauskontrollina. Kvantifiointi taajuusalueiden kussakin blot esitetty vasemmassa paneelissa on esitetty palkki kaavion keskivirheen perustuu kaksi erillistä koetta seuraavien normalisoinnin vastaavan tubuliinin E. Release sytokromi C mitokondrioita hoidon jälkeen 4a. Mitokondrioiden sekä solulimafraktioita erotettiin CEM-soluja 48 tunnin kuluttua hoidon 4a (5 uM), DMSO käsiteltiin soluja käytettiin kontrollina (C), western-blottaus suoritettiin käyttäen anti-sytokromi C Actin käytettiin latauskontrollina .

PI3K /AKT reitin tiedetään aktivoida enemmistö T-ALL. On myös tunnettua, että sillä on kriittinen rooli valvoa selviytymisen ja apoptoosin. Lisääntyminen p-AKT siirtää solut kohti selviytymisen häiritsemällä p53 välittämää reitin apoptoosin. Siksi olimme kiinnostuneita tarkkailun tasoa AKT jälkeen yhdistettä hoidon. Tulokset osoittivat, ylössäätely AKT lisäyksen jälkeen 4a (Fig. 4A). Huolimatta tasojen nousu p-AKT, lääkkeen indusoima solukuolema, mikä viittaa siihen, että suhde proapoptoottiset ja antiapoptoottisten signaalit solussa hajotettiin.

SMAC /DIABLO on nisäkkään mitokondrioiden proteiini, joka toimii sääntely komponentin apoptoosin. Testasimme sen ilme kun 4a hoidon ja tulokset osoittivat voimistumista proteiinin ilmentymisen (Fig. 4C). Annoksesta riippuva nousu tason sytokromi C havaittiin myös (Fig. 4D) [34]. Olemme myös tarkistetaan sytokromin c vapautumiseen sytoplasmaan ja tulokset osoittivat selvä nousu tasolle sytosolin sytokromi C käsittelemällä 4a (Fig. 4E).

kaspaasi-8 on toinen proteiini aktivoituu aikana ulkoinen tie apoptoosin. Tulokset osoittivat pilkkominen kaspaasin 8 upon 4a hoitoon (Fig. 4D). Tämä vahvistaa edelleen aktivointi kuoleman reseptori välitteistä apoptoosia. Aktivoitu kaspaasi 8 pilkkoo myös prokaspaasi-3, ja tämän löydämme aktivaation prokaspaasi-3 kontrolleihin verrattuna, kun 4a hoito, joka annosriippuvaisesti (Fig. 4D).

4a hoito inhiboi syövän etenemisen hiirillä

EAC peräisin rinta adenokarsinooma on aggressiivinen ja nopeasti kasvava syöpä käytetään yleisesti vaikutuksen arvioimiseksi uusien pienten molekyylien syövän etenemiseen. Perustuu Pilottitutkimusten 20 mg /kg kehon painoa 4a käytetään hoitoon eläimillä kasvaimia (tuloksia ei ole esitetty). Sen jälkeen kun 12

päivänä EAC injektio (pieni koko kasvain oli näkyvissä), eläimet käsiteltiin kuusi annosta joka toinen päivä. Huomasimme, että hoito 4a eläimillä otetaan kasvaimen johti huomattavaan vähenemiseen kasvaimen koon verrattuna käsittelemättömän sekä Levamisoli kasvaimen eläimillä (20 mg /kg) (Fig. 5A). Olemme havainneet, että 80% hiiristä selvisi käsittelemällä 4a, kun taas 50% käsittelemättömistä kasvaimen hiiret olivat kuolleet välillä 30-40 päivää kasvaimen kehitystä (Fig. 5A, B ja tietoja ei ole esitetty). Silmin näkyvä ulkonäkö reiden sisältävän kudoksen kasvain, maksan ja pernan negatiivisen kontrollin, käsittelemätön kasvaimen ohjaus ja 4a-käsitellyistä hiiristä osoittivat suhteellista morfologinen ero (Fig. 5C ja tietoja ei näytetty).

Kiinteä kasvain indusoitiin Swiss albinohiirten ruiskuttamalla EAC soluja. Kuusi annokset 4a ja Levamisoli (20 mg /kg) kutakin annettiin kasvainta kantavaa hiirtä joka toinen päivä 12

päivänä EAC solun injektio. A. Vaikutus 4a ja Levamisoli kasvainten etenemiseen eri ajankohtina. Tiedot näytetään perustuu kahden itsenäisen erissä kokeita sisältävän neljä eläintä kussakin. Virhe palkit osoittavat SD riippumattomien kokeiden. B. Kaplan-Meier-eloonjäämiskäyrät käsiteltyjen hiirien 4a. Out of 24 kasvaimen aiheuttamaa Swiss Albino eläimet, 12 käsiteltiin 4a (20 mg /kg) ja eloonjäämisen piirrettiin käyrä, log-rank tilastollinen testi osoitti P 0,005 (**). Vuonna ohjaus tapauksessa Keskimääräinen elinaika havaittiin olevan 59 päivää ja jos 4a käsiteltyjen ole määritetty (arvo osoitti jopa 250 päivää). C. Gross ulkonäkö 4a käsitellyn ja käsittelemättömän kasvaimen hiiriä ja niiden valitut elimet 25

th hoitopäivänä. a. hiiri ei kasvain, b. hiiri, joissa kasvain, c. kasvain laakeri hiiri hoidon jälkeen 4a, d. reisikudos normaalin hiiren, e. kasvain, f. reisikudos käsitellyn hiiren, g. maksa normaalin hiiren, h. maksan kasvain hiiri, i. maksa peräisin 4a käsitelty hiiri, j. perna normaalin hiiren, k. perna hiiren kanssa kasvain, l. perna käsitellyn hiiren.

Vielä tärkeämpää on, olemme huomanneet, että käsittelemällä 4a, eläimiä kasvaimen osoitti merkittävää eroa eloonjäämisaste verrattuna käsittelemättömiin kasvaimen kontrolli (Fig. 5B). Vaikka ohjaus eläimet elivät vain enintään 70 päivää sen jälkeen, kun kasvaimen kehittymisen, suurin osa käsiteltyjen hiirten 4a elossa yli 250 päivää osoittaa ~ 4-kertainen nousu elinikää (Fig. 5B). Siksi meidän tulokset osoittavat, että 4a hoito vähensi kasvaimen kuormitus kasvaa ja elinikä eläimistä.

Histologinen arviointi toteutettiin myös kaksi eri ajankohtina (25

th ja 45

päivänä ) hoidon. Palasia kasvain kudoksen 25 päivää käsitelty hiiren osoitti monia hematoksyliinillä värjätään ytimet hieman sytoplasmista värjäytymistä ilmaisee aktiivinen solujen lisääntymistä, kun taas jos hallintalaitteiden, ei muita soluja kuin ytimet luustolihakset värjättiin (Fig. S3A). 4a kasvaimen kudokset osoittivat merkittävää vähenemistä lisääntyvien solujen (Kuva. S3A). Kudososat reiden jälkeen 45

päivänä hoidon osoitti vähäinen määrä jakautuvat solut ja olivat verrattavissa normaaleissa kudoksissa, kun taas lisääntyvät solut esiintyi runsaasti hiirillä kasvaimen, jossa ei hoitoa annettiin (Fig. S3A). Analysoida, 4a hoito ollut haitallista vaikutusta muihin kudoksiin, osat maksan analysoitiin hematoksyliinillä ja eosiinilla värjäys (Kuva. S3C, D). Tuloksemme osoittivat liikakasvu hepatosyyttien sekä kasvain ja 4a käsiteltyihin hiiriin. Kuitenkin palautettiin takaisin normaaliksi vain tapauksissa, joissa kasvain taantunut käsittelyn jälkeen yhdisteellä 4a, toisin kuin käsittelemätön hiiret jossa epäsäännöllinen hepatosyyttien havaittiin vielä (Fig. S3C, D).