Krooninen sairaus

tiivistelmä

miR-17-92 klusterin MikroRNA on kohonnut peräsuolen syöpä, ja on kausaalinen rooli syövän kehittäminen. Kuudesta miR-17-92 klusterin jäsenet, miR-19a ja b erityisesti ovat keskeisiä edistäjiä syövän kehittymisen ja solujen lisääntymistä, kun taas alustava näyttö viittaa siihen, että miR-18a voivat toimia vastakohtana muille klusterin jäsenille pienentää solujen lisääntymistä. Se oli arveltu, että miR-18a voi olla homeostaattisesta toiminto auttaa sisältävän kasvaimia synnyttävän vaikutuksen koko miR-17-92 klusteri, ja että kohonnut miR-17-92 hankeryhmittymistä ilman vastaavaa lisäystä miR-18a voi edistää peräsuolen syövän etenemiseen. Kolorektaalisyövässä näytteitä ja vastaava normaali peräsuolen limakalvo, miR-18a näytetään alempi ilmaisee yleisesti kuin muut miR-17-92 klusterin jäseniä. miR-18a osoitettiin olevan vastakkaisen rooli muille miR-17-92 klusterin jäsenet, erityisesti avain kasvaimia synnyttävän miRNA, miR-19a ja b. Transfektio HCT116 ja LIM1215 peräsuolen syövän solulinjoissa miR-18a jäljittelee vähentynyt proliferaatio, kun taas miR-18a estäjä lisäsi jakautumista. miR-18a vastasi myös vähentämällä solujen vaeltamiseen, muuttamalla solujen morfologia, asiakkuutta G1 /S faasin solusyklin pysähtymisen, lisäämällä apoptoosin, ja tehostaa toimintaa proapoptoottinen agentti.

Cdc42

, välittäjänä PI3K koulutusjakson, tunnistettiin uutena miR-18a tavoite. Yli-ilmentymisen miR-18a alennetaan

Cdc42

ilmaisun ja lusiferaasianalyysissä vahvisti, että miR-18a suoraan kohdistuu 3’UTR

Cdc42

. miR-18a jäljittelee oli samanlainen vaikutus proliferaatioon kuin pieni molekyyli estäjä Cdc42. Esto

Cdc42

ilme on todennäköisesti keskeinen mekanismi, jolla miR-18a heikentää syöpäsolujen kasvua, joiden tavoite suojelija kokeilu paljastaa miR-18a vaikutteita leviämisen kautta suoraan estämällä

Cdc42

. Esto

CCND1

by miR-18a voi myös avustaa tässä kasvua vaimentava vaikutus. Homeostaattiseen toiminta miR-18a sisällä miR-17-92 klusteri peräsuolen syövän solut voidaan saavuttaa tukahduttamista

Cdc42

ja PI3K koulutusjakso.

Citation: Humphreys KJ, McKinnon RA Michael MZ (2014) miR-18a Estää

Cdc42

ja Toistaa Kasvain vaimennin rooli peräsuolen syövän solut. PLoS ONE 9 (11): e112288. doi: 10,1371 /journal.pone.0112288

Editor: Junming Yue, The University of Tennessee Health Science Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 29 kesäkuu 2014; Hyväksytty: 09 lokakuu 2014; Julkaistu: 07 marraskuu 2014

Copyright: © 2014 Humphreys et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki asiaankuuluvat tiedot ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: Tutkimuksen rahoittivat jonka Flinders Centre for Innovation in Cancer Research Grant. Tutkimus tuotettiin taloudellista ja muuta tukea Cancer neuvoston SA: n Beat Cancer Project puolesta sen rahoittajien ja valtion hallituksen Etelä-Australian kautta Department of Health. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Häiriöt normaalit miRNA ekspressiotasoja tapahtuu usein kolorektaalisyövässä (CRC) kehittäminen [1]. miRNA, jotka ovat pieniä ei-koodaavia RNA-sekvenssejä, voivat lähettää transkription säätelemään kohdegeenien sitoutumalla komplementaariseen kohde-mRNA: iden. Ne voivat pilkkoa täydentäviä mRNA: t, tai jos on epätäydellinen täydentävät, voi toimia läpi translaation esto ja transkripti epävakautta [2] – [4]. Vaikka ihmisen kasvaimista usein ominaista yleinen vika miRNA tuotanto ja globaali miRNA alassäätöä [5], [6], lukuisat tutkimukset ovat myös osoittaneet erityisiä miRNA olevan koholla CRC [1], [7]. Alentuneita tuumorisuppressorin miRNA tai yli-ilmentyminen onkogeenisen miRNA, edistää kasvaimen etenemistä muuttamalla geenin ilmentymisen ja vaikuttaa signalointireitteihin [8], [9]. Itse asiassa, jotkut miRNA on osoitettu olevan kuljettajat onkogeeninen prosessi, ja se on olennainen kasvaimen etenemiseen [10] – [13].

Yksi tällainen esimerkki miRNA, jossa kausaalinen rooli syövän kehittymisessä on miR -17-92 klusterin miRNA, joka on nimetty oncomir -1 johtuen sen onkogeeninen [14]. MIR-17-92 klusteri, joka koostuu miR-17, miR-18a, miR-19a, miR-20a, miR-19b, ja miR-92a, on usein koholla lymfoomien ja kiinteitä kasvaimia, mukaan lukien peräsuolen kasvaimet [1 ], [14] – [17]. Klusteri toimii aikana sekä normaalin kehityksen ja syövän syntyyn edistämään proliferaatiota ja angiogeneesiä, ja estää erilaistumista ja apoptoosia [11], [12]. miRNA MIR-17-92 klusteri on myös liittynyt invaasiota ja etäpesäkkeiden CRC solujen [18], ja huonommilla selviytymisen [19]. Klusteri on osoitettu koordinoimaan useita onkogeeniset reittejä, ja estämällä näiden reittien on terapeuttista potentiaalia syöpien aiheuttama miR-17-92 säätelyhäiriö [13].

kuudesta miR-17-92 klusterin jäsenet , miR-19a ja b erityisesti ovat keskeisiä edistäjiä syövän kehittymisen ja syöpäsolujen lisääntymistä [11], [12], [20]. CRC-soluissa, olemme aikaisemmin osoittaneet, että klusterin jäsenet, miR-19a ja b vastaavat yhä leviämisen [20]. Useat tutkimukset ovat myös osoittaneet, että miR-19a ja b ovat tarpeen ja pitkälti riittävä edistämään kasvaimia synnyttävän ominaisuudet klusterin lymfooma malleissa [11], [12].

In vivo

, miR-19 vaadittiin edistää lymphomagenesis käytettäessä Eμ-myc hiiren lymfooma malli [11], [12]. miR-19 over-ilmentyminen johti erittäin pahanlaatuisten varhain alkanut B lymfoomat, kun taas invaliditeettiin miR-19 biogeneesin hidasti kasvaimen puhkeamista, epätäydellinen penetrance, ja laajennettu elinkaari [12]. Sen jälkeen miR-17-92 deleetio lymfooman soluissa, uudelleen miR-19 yksinään jälleen kasvuun ja tukahdutti apoptoosin [11].

Toisin kuin pro-proliferatiivinen toimintaa miR-19, alustava näyttö viittaa siihen, että miR -18a voi toimia vastaan ​​muut klusterin jäsenet laskevan soluproliferaatioon [20]. miR-18a voi olla vähemmän koholla kuin muiden jäsenten miR-17-92 klusteri Kolorektaalituumorien [17], ja tämä suhteellinen kasvu muiden jäsenten miR-17-92 cluster voisi suosia lisääntyvän leviämisen. Tiedetään, että erilaiset posttranskriptionaalisella sääntelymekanismeja voivat johtaa eri yksittäisten klusterin jäsenten kanssa miR-18a ainoa jäsen klusterin vaatia hnRNPA1 käsittelyä [21]. Tertiaarinen rakenne taitettu pri-miR-17-92-transkripti voi myös edistää vähemmän tehokasta käsittelyä miR-18a [22], [23]. Me arveltu, että miR-18a voi olla homeostaattisesta toiminto auttaa sisältävän kasvaimia synnyttävän vaikutuksen koko miR-17-92 klusteri, ja että kohonnut miR-17-92 hankeryhmittymistä ilman vastaavaa lisäystä miR-18a voi edistää peräsuolen kasvain etenemistä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli selvittää tuumorisuppressorigeenin ominaisuudet miR-18a CRC solulinjoissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

HCT116 kolorektaalisyöpää soluja (ATCC, Manassas, VA, USA) pidettiin McCoyn 5A-Medium (modifioitu) (Invitrogen, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia (Bovogen Biologicals, Essendon, VIC, Australia). LIM1215 kolorektaalisyöpää-soluilla (ECACC, Salisbury, Wiltshire, Yhdistynyt kuningaskunta) ylläpidettiin Dulbeccon modifioidussa Eagle-kasvualustassa, joka sisälsi 10% naudan sikiön seerumia. Soluja kasvatettiin 37 ° C: ssa ja 5% CO

2, pidettiin 80% konfluenssiin, ja olivat mykoplasma ilmainen.

paksu- ja kudosnäytteiden

CRC näytteitä ja vastaavassa normaalissa paksusuolen ja peräsuolen limakalvon saatiin Flinders Tissue Bank (n = 30). Nämä näytteet kerättiin leikatut pois tuoreista kirurgisen resektion jälkeen etiikka hyväksynnän eteläisen Adelaide Clinical Tutkijavoimavarojen eettisen komitean ja kirjallinen suostumus potilailta. Erityisen tutkimuksen hyväksyntä tarkastella miRNA muutoksia tässä peräsuolen kudos saatiin eteläisen Adelaide Clinical Human Research eettisen komitean (hyväksymisnumero 204,13).

transfektoinneilla

Solulinjat olivat käänteisessä transfektoitu miRNA jäljittelee, miRNA estäjät, siRNA: t, plasmidi contructs, ja tavoite suojat käyttäen Lipofectamine 2000 (Invitrogen) mukaan valmistajan protokollaa, 24 ja 96 kuoppalevylle formaatteja (100 000 ja 20 000 solua per kuoppa, vastaavasti). Sillä matkivat kokeissa miR-18a, miR-19a ja b, ja negatiivinen kontrolli (NC) miRNA oligonukleotididuplekseilla (GenePharma, Shanghai, Kiina) käytettiin 20 nM kutakin. miR-18a ja NC lukittu nukleiinihappo (LNA) estäjät (Exiqon, Vedbaek, Tanska) (IDSs: 18a: 410101-00, NC: 199004-00) käytettiin 50 nM. Valmiiksi suunniteltu Mission siRNA varten

Cdc42

(solunjakautumisen sykli 42) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) (tunnukset: SASI_Hs01_00222990, SASI_Hs02_00332553) tai NC-siRNA (ID: SIC001) on käänteinen transfek- kokonaispitoisuus on 20 nM. Kotransfektiokokeissa suoritettiin käyttäen 200 ng plasmidi-DNA: ta (tiedot konstruktit alla) 50 nM miR-18a tai NC-miRNA jäljittelee. Muihin kotransfektiokokeissa suoritettiin 20 nM miR-18a tai NC-miRNA matkii ja miScript tavoite suojat (Qiagen, Valencia, CA), jotka on suunniteltu miR-18a ennustettu kohdegeenin

Cdc42

, tai negatiivinen kontrolli miScript tavoite suojus (ID: MTP0000002). Target suojat suunniteltiin kaksi potentiaalista miR-18a sitoutumiskohdat

Cdc42

3’UTR käyttäen Qiagen algoritmia, ja oli käänteinen transfek- suositellulla pitoisuutena 500 nM kohde suojelija. Tavoitteena suojus konteksti sekvenssin (alue 3’UTR reunustavien sitoutumiskohta) ensimmäisen kohdepaikan on

Cdc42

3’UTR oli 5’AATGAAGAAAAGTATTGCACCTTTGAAATGCACCAAATGA3 ”, ja toisen kohdepaikan on

Cdc42

3’UTR oli 5’GTTGAGGTAATCTTTCCCACCTTCCCAAACCTAATTCTTG3 ”. Muita tavoite suojat suunniteltiin yhden mahdollisten miR-18a sitoutumiskohdan

CCND1

3’UTR (konteksti järjestyksessä: 5’TAGATGTGTAACCTCTTCACCTTATTCATGGCTGAAGTCA3 ’), ja kokeita kuin

Cdc42

edellä . Soluja viljeltiin 24-48 tuntia transfektion jälkeen.

Suhteellinen kvantitointi reaaliaikaisen RT-PCR-

TRIzol reagenssia (Invitrogen) käytettiin hajottamaan viljellyt solut ja ihmisen kudosnäytteitä. Kokonais-RNA uutettiin mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. RNA kvantitoitiin käyttäen Nanodrop-8000 spektrofotometrillä (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE). miRNA ilmentymisen analyysi suoritettiin suhteellinen kvantitointi reaaliaikainen RT-PCR: llä käyttäen TaqMan miRNA määritykset (Applied Biosystems, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). cDNA syntetisoitiin 20 ng kokonais-RNA: sta käyttäen miRNA-spesifisiä alukkeita mukaan TaqMan miRNA-määritysmenetelmä, käyttäen 3,5 ui master mix ja 1,5 ui RT-aluketta 7,5 ul: n lopulliseen tilavuuteen. Reaaliaikainen PCR suoritettiin TaqMan-protokollaa käyttäen kolmena kappaleena 10 ui reaktioissa kunkin biologisen jäljitellä, mukaan lukien 1 ui käänteisen transkription tuotteiden, 0,5 ui miRNA-spesifinen aluke ja koetin määritysseoksen (määritys ID: miR-17: 002308, miR-18a: 002422, miR-19a: 000395, miR-20a: 000580, miR-19b: 000396, miR-92a: 000431), ja 1 x TaqMan Universal PCR Master Mix Ei AmpErase UNG (Applied Biosystems). Lämpökäsittelyyn suoritettiin käyttäen Roottorin Gene Q (Qiagen, Valencia, CA, USA). Tulokset normalisoitiin suhteessa endogeeniseen pieni ydin- RNA, RNU6B (määritys ID: 001093). Suhteellisten ekspressiotasojen laskettiin Ct-arvoja käytetään Qgene [24].

mRNA: n ekspression analyysiä, RNA oli DNaasi I käsitellään, ja cDNA syntetisoitiin 1 ug kokonais-RNA: sta käyttämällä M-MLV-käänteistranskriptaasia, RNaasi H: ta, josta on vähennetty (Promega, Madison, WI, USA) ja satunnaisia ​​heksameerialukkeita on 25 ui reaktiossa. Reaaliaikainen PCR suoritettiin Power SYBR Green-protokollan (Applied Biosystems) seuraavilla alukkeilla varten

Cdc42

: 5’ACGACCGCTGAGTTATCCAC3 ’(eteenpäin) ja 5’GGCACCCACTTTTCTTTCACG3 ”(taaksepäin) ja

CCND1

: 5’GATCAAGTGTGACCCGGACTG3 ’(eteenpäin) ja 5’CCTTGGGGTCCATGTTCTGC3 ”(taaksepäin), käyttäen kolmena kappaleena 20 ul reaktiot, kuten 2 ui käänteistranskriptiokierroksella tuotteen, 300 nM eteenpäin ja reverse-alukkeita, ja 1 x Virta SYBR Green master mix (Applied Biosystems). Tulokset normalisoitiin suhteessa endogeeniseen ohjaus

ACTB

(β-aktiini) tasolle käyttäen seuraavia alukkeita: 5’TTGCCGACAGGATGCAGAAG3 ’(eteenpäin) ja 5’GCCGATCCACACGGAGTACT3 ”(taaksepäin), ja ekspressiotasot lasketaan Qgene.

Western blot-analyysi

RIPA-puskuria käytettiin saamiseksi kokosolu-proteiinin uutteita, jotka kvantitoitiin käyttäen EZQ Protein kvantifiointi (Invitrogen). Proteiini uutteet SDS-PAGE käyttäen valmiiksi valettuja Mini-PROTEAN TGX Stain-Free geelit (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), ja elektro-blotattiin polyvinyylideenifluoridit kalvoja käyttämällä Trans-Blot Turbo siirtojärjestelmä ja Mini PVDF siirtopakkauksissa (Bio-Rad). Membraanit blokattiin 5% naudan seerumin albumiinia tai rasvatonta maitojauhetta TBS-T ennen yön yli inkubaatio kanin monoklonaalista anti-Cdc42 (11A11) (1:1000) (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA). Kanin monoklonaalista anti-GAPDH (glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi) (D16H11) (1:1000) (Cell Signalling Technology) käytettiin latauskontrollina. Toissijainen piparjuuriperoksidaasi-konjugoitua vuohen anti-kani-lgG (Immunopure, Thermo Scientific, Rockford, IL) käytettiin yhdessä tehostetun kemiluminesenssin (ECL) järjestelmä (SuperSignal West Pico, Rockford, IL, USA) visualisoida bändejä käyttäen ChemiDoc MP kuvantamisjärjestelmä (Bio-Rad). Densitometria tulokset normalisoitiin GAPDH tasolle.

Reaaliaikainen solujen kasvua analyysi

Solulisääntyminen mitattiin käyttäen xCELLigence RTCA DP väline (ACEA Biosciences, San Diego, CA, USA). Solut ympättiin 20 000 solua per kuoppa E-levyn kanssa ja viljelty asianmukaista hoitoja. Lisäksi transfektioihin, hoidot myös käyttää pienimolekyylisiä estäjä Cdc42 aktiivisuuden, ML141 (Sigma-Aldrich), annoksella 20 uM, tai DMSO ajoneuvon ohjaus [25], [26]. Kasvu mitattiin 30 minuutin välein yli 48-72 tuntia. XCELLigence järjestelmää käytettiin myös mittaamaan muuttoliikettä yli 24 tuntia käyttäen CIM-levy 16 soluihin ympätään seerumivapaassa yläkammiossa 30 000 kuoppaa kohti, ja 10% naudan sikiön seerumia käytetään houkutin on alaosaan. Incucyte Kinetic Imaging System (Essen BioScience, Ann Arbor, MI, USA) käytettiin täydentävänä leviämisen toimenpide. Solut ympättiin 100 000 solua per kuoppa 24-kuoppalevylle, ja kuvaamisen joka tunti yli 48 h, 9 kuvaa per kuoppa. Live-solujen vaihekontrasti kuvia käytettiin laskettaessa yhtymäkohta avulla Incucyte ohjelmistoa, ja antaa morfologia tietoja. Sen lisäksi, että elävien solujen kuvantamisen, solut myös kiinnitetty formaldehydillä 48 tuntia, ja solun tukirangan oli fluoresoivasti värjättiin Alexa Fluor 488 falloidiinia (Cell Signalling Technology) kautta sitoutumisen phalloidin F-aktiini, jossa solut kuvattiin käyttäen Olympus BX63 fluoresenssi mikroskooppi 20 × tavoite (Olympus, Center Valley, PA, USA).

Caspase apoptoosin määrityksiä

apoptoosi mitattiin 24 h käyttäen kaspaasi-glo 3/7 määritys ( Promega) valmistajan ohjeiden, jossa luminoiva verrannollinen signaali kaspaasi-3/7 aktiivisuutta. Incucyte myös ylimääräinen reaaliaikainen toimenpide; CellPlayer Caspase 3/7 reagenssia (Essen BioScience) lisättiin soluihin loppupitoisuuteen 5 uM, ja reaaliaikainen fluoresoiva kuvat otettiin joka tunti 24 tunnin aikana. Nämä kuvat laskemisessa käytettiin fluoresoivien solujen määrä käyttäen IncuCyte Object Counting v2.0 Analyysiohjelmisto. Apoptoosi seurattiin seuraavat transfektion miRNA jäljittelee kanssa tai ilman lisäkäsittelyä, jossa pro-apoptoottinen aineen natriumbutyraattia (Sigma-Aldrich), 2,5 mM: ssa 24 tuntia.

Virtaussytometria

Solut kerättiin trypsiini 48 h transfektion jälkeen, pestiin PBS: llä, ja kiinnitettiin 4% formaldehydiä 20 min jäissä inkuboinnin. Solut pestiin PBS: llä sitten uudelleen 0,2% Triton X-1% BSA: ta PBS-liuosta, ja inkuboitiin huoneen lämpötilassa 15 min ajan. Solut pestiin 1% saponiinia pesuliuoksella PBS: llä, sitten suspensoitiin uudelleen PBS /propidiumjodidia /RNaasi A ja inkuboitiin 30 minuuttia, minkä jälkeen FACS-analyysillä käyttämällä BD FACSCanto II -virtaussytometrillä (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) PI 680/40 suodatin.

miRNA tavoite ennustus

Ennakoitu miR-18a kohdegeenien saatiin käyttämällä miRwalk, joka kokoaa tietoja useista ennustaminen ohjelmista (DIANAmT, Miranda miRDB, miRWalk, PICTAR5 , PITA, RNA22, ja Targetscan) [27]. Geenit yhteinen kolmen tai useamman ennustusohjelmia analysoitiin Ingenuity Pathway Analysis (Ingenuity Systems, Redwood City, CA) tunnistaa osallistuvien geenien leviämisen ja solusyklikontrollin, ja ilmaistu peräsuolen soluissa.

plasmidikonstrukteja

Cdc42

3’UTR (NM_001791.3) monistettiin käyttäen seuraavia alukkeita: 5’CTCTCCAGAGCCCTTTCTGC3 ’(eteenpäin) ja 5’CAAAGAATTGAGACATGAGAAAGC3 ”(taaksepäin), käyttäen

PFU

DNA-polymeraasia (Promega) ja oligo-dT-alustettu cDNA. 3’UTR kloonattiin pGEM-T-Easy -vektoriin (Promega), alakloonattiin sitten psiCHECK-2-vektoriin (Promega) käyttäen

Notl

restriktiokohdat, ja sekvensoitiin. psiCHECK-2 sisältää Renillaa lusiferaasia ensisijaisena reportterigeenin, ja Firefly lusiferaasin sisäisenä plasmiditransfektiolla normalisointi toimittaja.

Cdc42

3’UTR kloonattiin monikloonausalueen sijaitsee alavirtaan Renilla translaation lopetuskodonin, jossa sitoutuminen miRNA että 3’UTR ennustettu johtaa pilkkominen ja sen jälkeen mRNA: n hajotus fuusio-transkriptin. Vähentynyt Renilla lusiferaasiaktiivisuus käytettiin indikaattorina miRNA toimintaa.

mutageneesi

mutageneesi suoritettiin käyttäen QuikChange Salama Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA ) mukaan valmistajan ohjeiden poistaa miR-18a siemen järjestyksessä sitoutumiskohdat

Cdc42

3’UTR. Alukkeet ensimmäisen kohdepaikan

Cdc42

3’UTR (asema 822-844 of NM_001791.3) olivat: 5’CACTGATAAATGAAGAAAAGTATTGTGAAATGCACCAAATGAATTGAGTT3 ’(eteenpäin) ja 5’AACTCAATTCATTTGGTGCATTTCACAATACTTTTCTTCATTTATCAGTG3 ”(reverse). Alukkeet toisen kohdepaikan

Cdc42

3’UTR (asema 1295-1317 of NM_001791.3) olivat: 5’AAAAATGTTGAGGTAATCTTTCCCCCAAACCTAATTCTTGTAGATG3 ’(eteenpäin) ja 5’CATCTACAAGAATTAGGTTTGGGGGAAAGATTACCTCAACATTTTT3 ”(reverse). Plasmidit valmistettiin vain ensimmäinen sivusto mutatoitu, vasta toinen sivuston mutatoitu, tai molempien sivustojen mutatoitu.

lusiferaasianalyysissä

jälkeen kotransfektion psiCHECK-2 plasmidirakenteet ja miRNA jäljittelee, lusiferaasi aktiivisuus mitattiin 24 tunnin kuluttua käyttäen Dual-Luciferase assay kit (Promega), mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Renilla lusiferaasiaktiivisuudeksi normalisoida Firefly lusiferaasiaktiivisuus saman plasmidin.

Tilastollinen

Tulokset esitettiin keskiarvona ± keskivirhe keskiarvon (SEM) vähintään kolmen biologinen rinnakkaista, jossa kuvaajat valmistettiin käyttämällä GraphPad Prism 6 (GraphPad Software Inc, La Jolla, CA). Tilastolliset analyysit suoritettiin käyttäen Studentin t-testiä, joiden P-arvo 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

miR-18a on alhaisemmat ilmaisee yleisesti verrattuna muihin miR-17-92 klusterin jäsenet peräsuolen soluissa

Human kudospankkia näytteitä tutkittaessa käytettiin miR-18a tasoa CRC ja normaali peräsuolen limakalvo, suhteessa tasoja muiden miR-17-92 klusteri miRNA. miR-17-92 cluster miRNA kvantitoitiin aikaisin (Dukes A) ja kehittynyt (Dukes C) CRC näytteitä, ja vastaavassa normaalissa peräsuolen limakalvo. miR-17-92 miRNA kohosivat CRC näytteistä (Dukes V: miR-17 P = 0,01, miR-18a P = 0,01, miR-19a P = 0,005, miR-20a P = 0,002, miR-19b P = 0,009, miR-92a P = 0,07; Dukes C: miR-17 P = 0,0003, miR-18a P = 0,0005, miR-19a P = 0,0009, miR-20a P 0,0001, miR-19b P = 0,001, miR-92a P = 0,0007) verrattuna vastaaviin normaaleihin kudoksiin, ja oli korkeampi ilmaisun Dukes C näytteistä (kuvio 1A ja 1B). miR-18a oli alhaisemmat ilmaisee yleisesti verrattuna muihin miR-17-92 klusterin jäseniä, sekä Dukes A ja C näytteiden ja sovitetussa normaalia kudosta (kuvio 1A ja 1B).

(A) miR -17-92 klusteri miRNA tasoilla Dukes A ja viereisen normaali kudosnäytteistä (B) miR-17-92 klusteri miRNA tasoilla Dukes C ja viereisen normaali kudosnäytteistä. Keskiarvo ± SEM 30 potilaalla, esitetään ja ilmaisun normalisoitu RNU6B. * P 0,05.

miR-18a moduloi peräsuolen syövän solujen kasvua ja kuolema

transfektio HCT116 CRC solujen miR-18a jäljittelee vähentänyt leviämisen yli 48 tunnin ajanjakson , verrattuna NC matkivat transfektoidut solut (P 0,0001) (kuvio 2A). Samanlainen antiproliferatiivinen vaikutus miR-18a havaittiin ylimääräinen CRC-solulinja, LIM1215 (P = 0,0009) (kuvio 2B). Transfektio HCT116-solujen kanssa miR-18a LNA miRNA estäjä oli vastakkaista vaikutusta, lisääntynyt leviämisen yli 48 tunnin ajanjakson verrattuna NC -estäjä transfektoiduissa soluissa (P = 0,03) (kuvio 2C). HCT116-solut, jotka on transfektoitu miR-18a jäljittelee näkyy vähentynyt kyky siirtää yli 24 h ajan, verrattuna NC matkivat transfektoidut solut (P = 0,004) (kuvio 2D).

Cell indeksi mittauksia käyttäen xCELLigence RTCA DP väline. (A) Leviämisen NC ja miR-18a matkivat transfektoitujen HCT116-soluissa yli 48 tuntia. (B) leviämisen NC ja miR-18a matkivat transfektoitujen LIM1215 soluissa yli 48 tuntia. (C) leviämisen NC ja miR-18a estäjä transfektoitujen HCT116-soluissa yli 48 tuntia. (D) muutto NC ja miR-18a matkivat transfektoitujen HCT116-solujen 24 tunnin aikana. Keskiarvo ± SEM 6 soluviljelmässä replikaatissa esitetään kullekin. * P 0,05.

Transfektio miR-18a jäljittelee esiintyi myös muuttaa solujen morfologia. Reaaliaikainen kuvia vallanneet 48 tunnin paljasti, että HCT116-solut transfektoitu miR-18a matkii olivat enemmän pyöristetty ja vähemmän tarttuu, joiden taso on alentunut yhtymäkohta (P 0,001) (kuvio 3A ja 3B). Lisääminen miR-19a ja b jäljittelee pitkälti päinvastaiseksi tätä vaikutusta. Solut, jotka on transfektoitu miR-19a ja b lisäksi miR-18a olivat lähempänä ulkonäöltään NC matkia transfektoituja soluja, joissa on enemmän laajennettu morfologia, lisäksi vastaavia konfluenssiin tasolle yli 48 h (P = 0,20); yhtymäkohdassa tasoa huomattavasti näissä soluissa verrattuna soluihin, jotka on transfektoitu miR-18a jäljittele yksinään (P 0,001) (kuvio 3A ja 3B). Immunofluoresenssianalyysi of aktiini komponentin solun tukirangan avulla Alexa Fluor 488 falloidiinia korosti myös muuttunut solu morfologian miR-18a matkivat transfektoitujen HCT116-solut, kuten monipuolisemman ulkonäön pienemmällä välistä adheesiota (kuvio 3C).

reaaliaikainen solu kuvien Incucyte väline. (A) Kuvat ovat NC, miR-18a matkivat ja miR-18a, 19a ja b matkivat transfektoituja soluja 48 tuntia transfektion jälkeen. (B) Confluence määrällisesti reaaliaikaisesta kuvia NC, miR-18a matkivat ja miR-18a, 19a ja b matkivat transfektoituja soluja 48 tuntia. Keskiarvo ± SEM 6 soluviljelmässä replikaatissa näkyy. * P 0,05. (C) Kuvat ovat (20 x) Alexa Fluor 488 falloidiinia fluoresenssivärjäys aktiinisytoskeletonin NC ja miR-18a matkivat transfektoiduissa soluissa 48 tuntia transfektion jälkeen.

apoptoosin mittaamiseksi, joka on kaspaasi 3/7 päätepisteen analyysi suoritettiin 24 tuntia transfektion jälkeen HCT116-soluissa. Transfektion miR-18a matkii nousi apoptoosin verrattuna NC matkivat transfektoiduissa soluissa (P = 0,04), kun taas kotransfektion miR-19a ja b jäljittelee vähennetään apoptoosin verrattuna miR-18a jäljittelee yksin tasolle samanlainen NC jäljittele transfektoitujen solut (P = 0,16) (kuvio 4A). Transfektion miR-19a ja b jäljittelee yksinään ei ollut vaikutusta apoptoosiin. Lisääminen miR-18a jäljittelee myös tehostettu toimintaa tunnetun proapoptoottisten agentti. HDAC-inhibiittorit, kuten butyraatti, on aikaisemmin osoitettu aiheuttavan apoptoosia CRC-soluissa [28] – [30]. Solut, jotka on transfektoitu miR-18a jäljittelee yhdessä 2,5 mM butyraattia hoito oli korkeampi apoptoosin 24 h verrattuna NC matkivat transfektoituja soluja käsiteltiin myös butyraattia (P = 0,001) (kuvio 4A). Jälleen transfektointi miR-19a ja b jäljittelee kanssa miR-18a jäljittelee pienentää tämän vaikutuksen, verrattuna miR-18a matkii yksin (P = 0,03), vaikka apoptoosin oli yhä korkeampi kuin NC matkii (P = 0,03) ( kuvio 4A). Vaikutus miR-18a apoptoosiin tutkittiin edelleen reaaliajassa käyttäen Incucyte järjestelmä ja fluoresoiva kaspaasi 3/7 määritys saada kuvia solujen apoptoosin. Kun HCT116 solu kuvat otetaan 24 h kuluttua butyraatti hoidon kvantifioitiin, oli huomattavasti enemmän fluoresoivia soluja kanssa miR-18a matkivat transfektio verrattuna NC matkivat transfektiosta soluissa ilman lääkehoitoa (P 0,001), ja soluissa käsiteltiin 2,5 mM butyraattia (P 0,001) (kuviot 4B ja 4D). Samanlainen vaikutus havaittiin LIM 1215 solut, joissa erot loisteputki solujen määrän välillä miR-18a matkivat ja NC matkivat transfektio päästä merkitys 48 h kuluttua butyraatti hoidon (P = 0,03 soluissa ilman lääkehoitoa; P = 0,02 käsitellyissä soluissa 2,5 mM butyraattia) (kuvio 4C).

(A) kaspaasi 3/7 luminesenssikoe NC, miR-18a matkivat, miR-19a ja b matkivat, ja miR-18a, 19a ja b matkivat transfektoidaan HCT116-solut 24 tunnin kuluttua butyraattia lisäksi. Keskiarvo ± SEM 3 soluviljelmässä replikaatissa näkyy. * P 0,05. (B ja D) kvantifiointi ja edustava reaaliaikainen fluoresoiva solu Kuvien Incucyte väline osoittaa apoptoosin NC ja miR-18a matkivat transfektoitujen HCT116-soluissa 24 tunnin kuluttua butyraattia lisäksi. Keskiarvo ± SEM 3 soluviljelmässä replikaatissa esitetään B. (C) kvantifiointi reaaliaikaisen loisteputki solu Kuvien Incucyte väline osoittaa apoptoosin NC ja miR-18a matkivat transfektoitujen LIM1215 soluja 48 tunnin kuluttua butyraattia lisäksi. Keskiarvo ± SEM 3 soluviljelmässä replikaatissa näkyy. (E) Virtaussytometrianalyysi NC, miR-18a matkivat ja miR-18a, 19a ja b matkivat transfektoidut HCT116-solut 48 tuntia transfektion jälkeen; kukin kuvaaja edustaa 3 soluviljelmässä replikoituu.

Virtaussytometria suoritettiin 48 tuntia transfektion jälkeen HCT116-solujen, ja osoitti myös kertyminen solujen meneillään solukuoleman tai apoptoosin miR-18a matkivat transfektoiduissa soluissa (kuvio 4E). MIR-18a jäljittelee osoitettiin indusoivan G1 /S faasin solusyklin pysähtymiseen. Lisäämällä miR-19a ja b jäljittelee alensivat solukuoleman ja solusyklin pysähtymisen kuin miR-18a matkivat yksinään (kuvio 4E).

ilmentäminen solusyklin kontrolli-geenin Cdc42 on vähentynyt miR-18a ja kasvoivat miR-19a ja b

Koska havainnot että miR-18a vähentää proliferaatio ja migraatio, muuttaa solun morfologia, lisää apoptoosin, ja indusoi solusyklin pysähtymisen, ennusti miR-18a tavoitteita tunnistettiin, jotka ovat mukana näissä soluprosesseihin. Niistä miR-18a ennustettu tavoitteet on solun jakautumisen syklin 42 (

Cdc42

), joka oli ennustettu useiden kohde-ennustus ohjelmia. Cdc42 kuuluu Rho perheen GTPaaseja, alaryhmä Ras superperheen pieniä GTPaaseja [31]. Aktivoinnin Cdc42 kykenee sitomaan erilaisia ​​efektoriproteiinit ja aloittaa lukuisia alavirran signalointireittejä, jotka ovat mukana solun tukirangan remodeling, solusyklin etenemisen, solun lisääntymistä, eloonjääntiä ja muuttoliike [32] – [37]. On olemassa useita transkriptivariantissa on

Cdc42

, jotka koodaavat kanoninen isoformi esiintyy useimmissa kudoksissa (isoformin 1), ja aivospesifisen isoformia (isoformin 2). 3’UTR transkriptien varten kanoninen isomuodon sisältää kaksi ennusti miR-18a sitoutumiskohtia, kun taas vaihtoehtoinen 3’UTR transkriptin aivoille isomuodon sisältää kaksi erilaista ennusti miR-18a sitoutumiskohtia. Jotta Tässä tutkimuksessa peräsuolen soluissa,

Cdc42

isoformin 1 tutkittiin.

transfektio HCT116 CRC solujen miR-18a matkii vähensi transkriptio tasot

Cdc42

verrattuna kanssa NC matkivat transfektoituja soluja 48 h, jolloin havaitaan reaaliaikaisen RT-PCR: llä (P 0,0001) (kuvio 5A). Yllättäen kotransfektoimalla miR-19a ja b jäljittelee yhdessä miR-18a jäljittelee tuotettu päinvastainen vaikutus, lisääntynyt

Cdc42

mRNA jotka olivat huomattavasti korkeammat kuin sekä NC matkivat solujen (P = 0,0006) ja miR-18a matkivat transfektoiduissa soluissa (P 0,0001) (kuvio 5A). Transfektio miR-18a-estäjä lisäsi transkriptin tasot

Cdc42

verrattuna NC matkivat transfektoituja soluja 48 h, jolloin havaitaan reaaliaikaisen RT-PCR: llä (P 0,005) (kuvio 5B).

(A)

Cdc42

mRNA tasot NC, miR-18a matkivat ja miR-18a, 19a ja b matkivat transfektoituja soluja 48 h transfektion jälkeen (b)

Cdc42

mRNA tasot NC ja miR-18a estäjä transfektoiduissa soluissa 48 tuntia transfektion jälkeen. Keskiarvo ± SEM 6 soluviljelmässä replikaatissa esitetään kunkin ja ilmaisun normalisoidaan ACTB. * P 0,05. (C ja D) Western blot Cdc42-proteiinin tasojen NC, miR-18a matkivat ja miR-18a, 19a ja b matkivat transfektoituja soluja 48 h transfektion jälkeen. Densitometrian kaaviossa nähdään keskiarvo ± SEM 3 soluviljelmässä replikoituu kullekin ja ilmaisun normalisoidaan GAPDH * P 0,05.

Western blot-analyysi osoitti, Cdc42 proteiinin tasot olivat myös merkitsevästi pienempi miR-18a matkivat transfektoituja soluja verrattuna NC matkivat transfektoituja soluja, 48 h (P = 0,02) (kuvio 5C ja 5D). Kotransfektoimalla miR-19a ja b jäljittelee kanssa miR-18a matkii lisääntynyt proteiinin tasot verrattuna miR-18a matkii yksin (P = 0,008), jossa tasot lähempänä NC matkivat transfektoiduissa soluissa (P 0,05) (kuvio 5C ja 5D).

miR-18a suoraan kohdistuu 3’UTR Cdc42

lusiferaasimäärityssysteamiä käytettiin määrittämään, että miR-18a suoraan kohdistettu

Cdc42

3 ’UTR. Dual-lusiferaasireportteri plasmidit, jossa on ehjä

Cdc42

3′-UTR, tai

Cdc42

3’UTRs mutatoitua ensimmäinen, toinen tai molemmat ennustettu miR-18a sitoutumiskohtia (kuvio 6A). HCT116-solut transfektoitiin kukin plasmidi, yhdessä miR-18a tai NC matkii ja Firefly ja Renilla lusiferaasin aktiivisuus mitattiin 24 tuntia. Väheneminen normalisoitu Renilla lusiferaasiaktiivisuudeksi käytettiin indikaattorina miR-18a sitova ja tukahduttaminen.