Krooninen sairaus

tiivistelmä

biomarkkerit ratkaisemiseksi tarvitaan ylihoito joka tapahtuu useimpien eturauhassyöpäpotilaalla joka ei kuole taudin mutta saavat radikaalia hoitoa. Mahdollinen este biomarkkereiden löytö voi olla polyklonaalinen /multifokaalisen luonne eturauhasen kasvainten sekä solutyyppiä heterogeenisyys välillä potilaan näytteitä. Kasvain-vierekkäiset stroman (kasvain mikroympäristölle) vaikuttaa vähemmän geneettinen muutos ja saattaa siksi tuottaa johdonmukaisempia biomarkkereiden vastauksena kasvaimen aggressiivisuus. Tämän vuoksi vertasimme Affymetrix geeniekspressioprofiilien in strooman lähellä kasvain ja määritetty joukko 115 koetinsarjojen jolle ilmaisun tasot olivat merkitsevästi korreloivat aika-uusiutumisen. Vertasimme myös potilaita, jotka kemiallisesti uusiutunut pian eturauhasen ( 1 vuosi), ja potilaat, jotka eivät relapsiin ensimmäisten neljän vuoden kuluttua eturauhasen. Havaitsimme 131 ilmentyvät eri mikrosirujen koetinsarjojen näiden kahden ryhmän. 19 koetinsarjojen (15 geenit päällekkäin kahden geenin luettelot

p

0,0001). Olemme kehittäneet PAM-pohjainen luokittelija kouluttamalla näytteistä, jotka sisältävät strooman lähellä kasvain: 9 nopea uusiutuminen potilasnäytteillä ja 9 laiska potilaan näytteitä. Sitten testattiin luokittelija 47 eri näytettä, joka sisältää 90% tai enemmän strooman. Luokitin ennustettu riski potilaan asemaan, joiden keskimääräinen tarkkuus 87%. Tämä on ensimmäinen yleinen kasvain mikroympäristölle-pohjainen ennustetekijöiden luokittelija. Nämä tulokset osoittavat, että eturauhassyövän microenvironment osoittaa toistettavia muutoksia hyödyllisiä ennustettaessa tuloksia potilailla.

Citation: Jia Z, Rahmatpanah FB, Chen X, Lernhardt W, Wang Y, Xia X-Q, et ai. (2012) Expression muutokset Stroma Eturauhassyöpä Veikkaa Myöhemmät Relapse. PLoS ONE 7 (8): e41371. doi: 10,1371 /journal.pone.0041371

Editor: Tšad Creighton, Baylor College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: toukokuu 11, 2012; Hyväksytty: 20 Kesäkuu 2012; Julkaistu: 01 elokuu 2012

Copyright: © Jia et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat National Institutes of Health strategiakumppanit arviointijärjestö Cancer Allekirjoitukset (SPECS) konsortion avustus U01 CA1148102 ja National Cancer Institute Early Detection Research Network (EDRN) konsortion avustus U01 CA152738. Tätä työtä tuki myös University of California, Irvine tiedekunnan Urakehitys Award (ZJ), apurahan Chao Family Kattava Cancer Center, University of California, Irvine (ZJ ja DAM). Myös tämä tuettiin osittain puolustusministeriön congressionally Suunnatun Medical Research Programs myöntää W81XWH-08-1-0720, ja jonka University of California, Irvine Institute for Cancer Research Training Grant Fellowship (T32CA009054 National Cancer Institute) ( FR). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: MM ja DM ovat cofounders ja WL on toimitusjohtaja Proveri Inc. YW on työntekijä AltheaDx Inc. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Eturauhassyöpä on useimmin diagnosoitu miesten yleisin ja toiseksi suurin syy syöpäkuoleman miehillä Yhdysvalloissa [1]. Vuosittain Yhdysvalloissa on noin 230000 uutta tapausta eturauhassyövän ja noin 195.000 radikaali prostatectomies suoritetaan [2]. Kuitenkin jotkut potilaat saattavat pelastaa nämä hoidot, koska vain murto-osassa tapauksista kuolee tautiin, jos ne jätetään hoitamatta. Numero tarvitaan hoitoon pelastaa yhden elämän arvioitiin kahdessa tutkimuksessa oli 12-15 [3] ja jopa 48 [4]. Lukuisat nomogrammit ja niihin liittyvät ennustaminen menetelmiä on luotu perustuu kliinisiin muuttujiin aikaan diagnoosi mutta tähän mennessä tällaisia ​​välineitä, on saatu niukasti neuvoja siitä, mitkä potilaat satama aggressiivinen sairaus vaatii radikaalia hoitoa mahdollisesti seuraa adjuvanttihoito ja joissa potilaat saattavat soveltua tiukemmin aktiivinen valvontaohjelma [5] – [9].

Valtava on panostettu kehittämiseen biomarkkereita ennusteen eturauhassyövän painottaen ominaisuuksista kasvain epiteelin komponentti takautuva näytteissä. Kuitenkin vain harvat hyväksyttyjä ja kliinisesti käytetty biomarkkerit on kehitetty. Yksi este biomarkkereiden löytö voi olla solu-tyypin heterogeenisuus ja polyklonaalisen /multifokaalisen luonne kertynyt geneettisten muutosten aikaan diagnoosi [10] – [13]. Sen sijaan kasvaimen mikroympäris- näyttelyissä paljon rajallisempi mutaatioita ja heterotsygoottisuuden menetys (LOH) [14], mutta voi vastata paracrine signaaleja lähellä kasvain. On osoitettu, että mikroympäristö on valittu tapauksissa esiintyy selvä histologisia muutoksia kutsutaan ”reaktiivinen strooman” erottuva ilme profiileja, jotka korreloivat huonon lopputuloksen kanssa [15], [16]. Todellakin, olemme osoittaneet, että kasvaimeen liittyvät strooman piittaamatta alatyyppi on ainutlaatuiset ekspressioprofiileja verrattuna normaaliin strooman. Käytimme näitä geenin ilmentymisen muutoksia kehittää luokittelija, joka voi tarkasti määrittää läsnäolo kasvain eturauhassyövän tapauksissa, vaikka käytettyjen näytteiden analyysiä eivät sisällä tunnistettavissa kasvaimen [13]. Tämä lähestymistapa on kliininen potentiaalia ratkaista satojen tuhansien epäselvä koepaloja suoritetaan Yhdysvalloissa joka vuosi, mikä parantaa huomattavasti sairauksien hoidossa ja pelastaa ihmishenkiä. Samoin hyödyllistä diagnostista tietoa on saatu tutkimalla metylaatiostatuksen GSTP1 ja APC-geenien negatiivinen alkuperäiseen eturauhasen koepaloja [17]. Ero ilmaisun ja epigeneettisiä profiileja kasvaimeen liittyvien stroomaan verrattuna normaaliin strooman voi heijastaa strooman vasteita kasvainta paracrine tekijöitä sekä muita vaikutuksia. Jos laatu ja määrä tällaisten vastausten korreloi kliinisten tutkimusten tulosten kuten veltto tai aggressiivinen fenotyyppejä, niin strooman vastauksena lähellä kasvain saattaisi olla hyötyä johtuvat pääsääntöisesti varten ennustetta. Muut tutkijat ovat havainneet tällaisia ​​eroja rintasyövän [18]. Tässä tutkimuksessa testasimme tämä hypoteesi vertaamalla geeniekspressioprofiilien välillä strooman näytteiden joukossa potilailla, joiden tiedetään erilaisiin tuloksiin, riippumatta histologia, ja tunnistaa 115 koetinsarjojen jolle ilmaisun arvot ovat selvästi korreloi kertaa-to-uusiutumisen. Vertasimme myös ekspressioprofiileja välillä osajoukko stroomamääriin näytteitä potilaista, jotka uusiutuneen nopeasti ja strooman näytteitä potilaista, jotka eivät olleet uusiutunut jälkeen yli neljä vuotta. Havaitsimme 131 koetinsarjojen että oli muuttunut ilmaisuja. Oli 19 koetinsarjojen (15 ainutlaatuinen geenejä) yhteistä näiden kahden geenin luetteloita. Sitten saatu 15 geenin luokittelija. Yleinen tarkkuus oli 87%, kun luokittelija testattiin 47 itsenäistä testinäytteistä. Pathway analyysi ja Gene ontologia tutkimukset osoittivat, nämä 15 geenejä merkittävästi rikastettu geenejä, jotka osallistuvat apoptoosiin liittyvissä prosesseissa. Nämä tutkimukset tukevat sitä mahdollisuutta, että strooman on käytännöllinen riskinarvioinnin perusteella.

Materiaalit ja menetelmät

Eturauhassyöpä Potilasnäytteet ja Expression Analysis

tietomäärien GSE8218 ja GSE17951, jotka ovat julkisesti saatavilla Gene Expression Omnibus (GEO) tietokantaan perustuvat jälkeiseen eturauhasen pakastetut kudosnäytteistä saadaan tietoisen suostumuksen käyttämällä IRB-hyväksyttyjä ja Hippa-yhteensopiva protokollia. Kaikki kudokset kerättiin kirurgian ja saatettiin patologian nopeutettua tarkastelua, leikkely, ja snap jäädyttäminen nestetypessä. Kliiniset seurantatiedot oli sulavaa UCI SPECS ohjelmaa ja ylläpidetään relaatiotietokantaan. RNA ilmentämiseen analyysiä tehtiin suoraan kudosjääleikkeitä seuraavista leikkely MMA (optimaalinen leikkaus lämpötila yhdiste) lohkot valmistettiin jäädytettiin näytteiden avulla kryostaatti. Strooman välillä kasvain näytteet valmistettiin MMA upotettu kudos, joka oli kiinnitetty kryostaatissa etsaamalla välinen linja kasvain ja strooman leikkausveitsellä ja valmistamalla sitten jää- leikkeitä, jotka näkyvät kaksi kappaletta, joista yksi on kasvaimen vieressä strooman, kuten on kuvattu in [13]. Ennen täydellisyyteen tätä menetelmää, jotkut stroma valmistettiin käsin leikkely jäädytettyä kudosta veitsellä. Jotta vältettäisiin saastuminen, käsi vaatimalla väliin jää rako kasvain ja strooman 0,5-1,0 mm ja tuloksena strooman kutsutaan ”lähellä” strooman.

ilmentymisanalyysiä 50 mikrogrammaa (10 mikrogrammaa biopsiakudoksesta ) kokonais-RNA näytteitä käsiteltiin hybridisaation Affymetrix GeneChips (GSE17951: U133 Plus 2.0 alustaan ​​GSE8218: U133A platform). Näistä kaksi tiedostoa, jakaumat neljän pääasiallisen solutyyppejä [kasvain epiteelisolujen, stroomasoluilla, epiteelisolujen eturauhasen hyvänlaatuisen liikakasvun (BPH), ja epiteelisolut laajentuneet kystisen rauhaset] arvioitiin jopa neljä patologia, jonka arvioita laskettiin keskiarvo kuvatulla [19], [20].

Tiedosto GSE25136 (U133A platform), joka koostuu 79 kasvain tapauksissa ( 10% kasvainsoluja), oli itsenäisesti kehitetty ja käytetty Koepakettia. Solu-tyyppinen jakelu tämän tietojoukon arvioitiin käyttäen CellPred, joka on

in silico

mitoitusmenetelmästä kasvain prosenttiosuus näytteiden perusteella ilmaisun arvoja usean geenin allekirjoituksia, jotka ovat invariantti kasvaimen kirurgisen patologian parametrit Gleason ja vaiheen (saatavilla https://www.webarraydb.org/webarray/index.html) [20]. Huomaa, että solu-tyyppinen jakelu tietomäärien GSE8218 ja GSE17951 toimitti jopa 4 patologeja [19], kun taas solu-tyyppinen jakelu datajoukon GSE25136 arvioitiin

in silico

menetelmässä [20].

tilastolliset menetelmät

Normalisointi tehtiin useiden aineistoja käyttäen ~22,000 koetinsarjojen yhteistä kaikille Tietuekokonaisuudet. Ensinnäkin, tietokokonaisuus GSE8218 oli quantile-normalisoitu funktiolla ”normalizeQuantiles ’n Limma rutiini [21]. Kirjanpidon GSE17951 ja GSE25136 Sitten quantile-normalisoitu viittaamalla normalisoitu datajoukon GSE8218 käyttäen modifioitua toiminnon ”REFnormalizeQuantiles”, joka on saatavilla SPECS verkkosivuilla (https://www.pathology.uci.edu/faculty/mercola/UCISpecsHome. html) [22]. Limma paketin Bioconductor havaitsemiseen käytettiin differentiaalisesti ilmentyvien geenien. Prediction Analyysi mikrosirut (PAM [23]), toteutetaan R, käytettiin kehittää ilmaisu perustuva luokittelija koulutuksesta sarjaa ja levitetään sitten testi sarjaa ilman muita muutoksia.

Tulokset

Gene Expression Associated Risk

Kaksi menetelmiä käytettiin määrittämään geenien differentiaalisesti ilmaistut strooman korkean ja matalan riskin tapauksissa. Lyhyt tautivapaan elinajan (DFS) aika on yleisesti käytetty indikaattori aggressiivisuus [24] – [26]. Ensin määritellään aggressiivinen eturauhassyöpä tapauksia saaneista taudin pahenemiseen kuluessa 1 vuoden kuluttua eturauhasen, ja veltto (tai vähemmän aggressiivisia) tapauksissa ne potilaat, jotka joko uusiutunut viimeistään neljä vuotta leikkauksen jälkeen tai jotka eivät ole taudin uusiutumiseen ja oli ainakin 4 vuotta ”seurantatietoja käytettävissä. Näiden kriteerien perusteella tunnistimme 40 nopean uusiutumisen potilasnäytteillä sisälsi puhdasta strooman, jotka olivat lähellä kasvain ja 9 potilaan näytteitä veltto tauti sisälsi puhdasta strooman, jotka olivat lähellä kasvaimen tietojoukon GSE8218. Näistä paneelit me satunnaisesti valittua 8 nopea uusiutuminen potilaan näytteitä ja 7 veltto potilaan näytteitä koulutus asettaa ja verrataan ilmaisun profiilit näiden kahden ryhmän avulla Limma. Geenejä

p

arvojen 0,05 ja taita muutos 1,6 (joko säädelty tai alassäädetty), ja näitä käytettiin kehittämään PAM luokittelija. Tuloksena luokittelija myöhemmin testattiin potilas näytteet, joita ei ollut käytetty koulutukseen (32 nopea uusiutuminen potilasnäytteillä ja 2 veltto potilaan näytettä). Tämä prosessi toistettiin 1000 kertaa ja 3625 koetinsarjojen valittiin ainakin kerran ulos 1000 kertaa perustuvat kriteerit sekä

p

arvojen 0,05 ja taita muutos 1.6. Keskimääräinen herkkyys ja rajat validointiprosessin olivat 69% ja 82%, vastaavasti. Kaikkiaan 131 koetinsarjojen valittiin PAM peräti 500 kertaa ulos 1000 toistojen.

Toiseksi tunnistamiseksi koetinsarjojen liittyy laajempaan luokan riskiarvot, paikkatietoaineistolle GSE8218 taas oli käytetään tunnistamaan koetin asetetaan, jotka korreloivat tautivapaan elinajan ajan, mukaan lukien potilaat, jotka uusiutuneen yhdestä neljään vuotta leikkauksen. Data set GSE8218 sisältyy 49 puhtaasta stroomaa näytettä 49 potilasta, joille tehtiin eturauhassyövän uusiutumisen leikkauksen jälkeen. Huomaa, että 49 strooman käytetyt näytteet korrelaatioanalyysiä eivät ole identtisiä 49 strooman tapauksissa käyttää nopeina uusiutumisen

vs.

Veltto vertailu, jotka koostuvat 44 uusiutunut tapauksista (yhteistä tapauksissa käytetään korrelaatio analyysi) ja 5 ei uusiutunut tapauksissa. Analysoimme 49 strooman näytteitä uusiutumisen tapauksessa korrelaatio analyysi ja tunnistaa 115 DFS-liittyvä koetinsarjojen käyttämällä Pearsonin korrelaatio analyysiä korrelaatiokertoimet 0,46 ja liittyvät

p

arvojen 0,001). Pearsonin korrelaatiokertoimet näille 115 koetinsarjojen vaihtelevat -0,46–0,61 tai 0,46-0,69. Eri taudin etenemisen asiaa geenien, pidemmälle kuin todettu alussa ja lopussa uusiutumisen tapauksissa (131 geenit edellä) oletettiin paljastanut tässä geenissä tunnistamisen vaihe, koska mediaani-riskin tapaukset (uusiutumisen välinen aika 1 vuosi ja 4 vuotta) oli mukana.

oli 19 yhteistä koetinsarjojen välillä 131 koetinsarjojen tunnistettiin permutoitu PAM analyysin ja 115 koetinsarjojen tunnistettiin korrelaatioanalyysiin. Simulaatio Tutkimus osoitti, että mahdollisuus tarkkailla 19 päällekkäisiä satunnaisesti valittu 131 koetinsarjojen ja 115 koetin settejä perustuvat 22000 koetinsarjojen on 0,0001. Niinpä nämä 19 päällekkäisiä koetinsarjojen (luku on suurempi kuin random) edustavat merkittävää sopimus kahden ei-identtisten sarjaa tapauksessa käytetään erilaisia ​​analyysimenetelmiä. 19 yhteinen koetinsarjojen, joka edustaa 15 ainutlaatuisia geenejä, on lueteltu taulukossa 1. Esimerkki kuvaajia ilmaisuaan koetinsarjojen

vs.

DFS aika esitetään kuviossa S1.

luokitin kehitykseen ja testaukseen riippumattomien aineistoja.

19 päällekkäistä koetinsarjojen käytettiin kehittää luokittelija. 40 nopea uusiutuminen syöpä näytteet ensimmäisestä vaiheesta sisältävä strooman lähellä kasvain, valitsimme 9 näytteiden lyhin DFS ajat, joita yhdistää kaikkiin 9 sisältävien näytteiden strooman lähellä veltto kasvain muodostaa koulutusta asetettu. Käytimme 19 koetinsarjojen tunnistettu edellisessä vaiheessa PAM [23] syötetään kehittää luokittelija perustuen näihin 18 koulutusta näytteitä. Havaittu asema koulutus tapauksissa aggressiivinen tapauksessa tai veltto tapaus määritelty. Kaikki 19 koetinsarjojen jäivät PAM optimoimalla prosessi lopullisen koulutus tarkkuus 88,9% (taulukko 2).

lämpö kartta (kuva S2) esittää, että 194 geenit (yhdistelmä 131 koetinsarjojen tunnistetaan PAM analyysin ja 115 koetinsarjojen tunnistaa korrelaatioanalyysiä) oli selkeä profiilinsa välillä nopea uusiutuminen tapauksissa ja veltto tapauksia 18 koulutuksen strooman näytteitä. Tulivuori juoni (kuva S3) esittää, että jotkut koetinsarjojen on suuret kertaiseksi muutoksia ja alhaiset p-arvot. 115 koetinsarjojen on 19 koetinsarjojen (15 ainutlaatuinen geenejä) yhteistä 131 koetinsarjojen tunnistettiin päässä permutoitu PAM analyysi. Tulivuori juoni Kuvassa S3 havainnollistaa, että nämä 19 koetin sarjat ovat lupaavimpiin koetinsarjojen joka on suurin kertaiseksi muutoksia ja alin p-arvot.

Jotta objektiivinen testi ennustetekijöiden luokituksen 47 itsenäistä testinäytteet lukien 36 näytteet tietokokonaisuus GSE8218 ja 11 näytteitä tietokokonaisuus GSE17951 (ei käytetty koulutus) käytettiin testaukseen. Herkkyys on 88,1% ja spesifisyys 80% havaittiin saatiin keskimääräinen tarkkuus oli 87% (taulukko 2,

Test

). Yleinen positiivinen ennustearvo (PPV) ja negatiivinen ennustearvo (NPV) Testin perusteella 47 itsenäistä näytteet olivat 97,9% ja 44,4%, tässä järjestyksessä.

Jotta jatkaa kokeita, onko 15-geeni ennustetekijöiden luokittelija yleensä koskee koko kirjon tuloksia ja ei rajoitu erityiseen valittuun edunjättäminen valittu koulutukseen ensimmäisessä vaiheessa, testasimme 19 näytettä (ei sisälly koulutus) potilaista, jotka joko kärsinyt uusiutumisen välillä vuosi 1 ja vuosi 4 leikkauksen jälkeen tai ei taudin uusiutumiseen, mutta oli alle 4 vuoden seurantatiedot. Nämä 19 näytteet ovat 9 stroomaa näytteet lähellä kasvain ja 10 kasvain näytteissä (kasvain 10%). Kaplan-Meier-analyysi osoitti, että 15-geenin ennustetekijöiden luokittelija kahtia nämä epäselvä näytteet kahteen ryhmään merkittävästi selviä riskejä (

p

= 0,02). Nämä havainnot osoittivat, että yhdistelmä opetusmenetelmä, joka perustuu valitun edunjättäminen yhdessä korrelaatio menetelmä, joka hyödyntää täysimääräisesti käytettävissä valikoiman tautivapaan elinajan kertaa tuotti luokittelija sisältää tarkat tulokset, kun sitä sovelletaan riippumaton testi kohortin. Kaplan-Meier edustus testitulokset 47 koenäytteiden yhdessä testitulokset nämä 19 mediaani-riski strooman näytteet on esitetty kuvassa 1. Nämä tulokset saatiin todennäköisyydellä mahdollisuus erottaminen ennustetun luokitusten kanssa

p

= 0,0018.

mittaamiseksi merkitys 19 koetin asetetaan luokittelija, teimme kokeilun perustuu sarjaa geenien valitaan arpomalla. Me satunnaisesti valittu 19 koetinsarjojen keskuudesta 22283 koetinsarjojen ja reran koulutuksen ja kokeen, kuten edellä on kuvattu. Tämä satunnainen prosessi toistettiin 1000 kertaa. Keskiarvoja käyttöjärjestelmän ominaisuudet on annettu taulukossa 2. Vain 7% 1000 satunnainen luokittelijoiden ollut yhtä hyvin tai paremmin kuin ennustetekijöiden luokittelija.

Meillä on myös tarkastettava, onko luettuna kliininen tieto, kuten Gleason tulokset, kasvain vaiheessa ja ennen leikkausta PSA lisätään ennusteen arvioinnissa luokituksen tekijällä. Käytimme nämä kolme muuttujaa yhdessä 19 koetinsarjojen kuten PAM syöttö ja anna PAM valita paras ennakoivaa ominaisuuksia. Mikään näistä kolmesta muuttujista poimittiin PAM. Lisäksi olemme analysoineet 65 tapauksessa (18 koulutus tapauksissa ja 47 testitapaukset taulukossa 2) käyttämällä monimuuttuja Coxin suhteellista riskiregressioanalyysiä, jossa ikä, Gleason summa, TNM ja pre-op PSA verrataan ennuste tehdään meidän luokittelija. Vain luokittelija ennustaminen (

p

= 0,0005) ja TNM (

p

= 0,0383) olivat merkitsevästi yhteydessä selviytymistä. Tulos osoitti, että geeni allekirjoitus on paremmat ennustearvoa ja lisää ennustearvon tunnettuihin kliinisiä ja patologisia muuttujia.

Testi Stroma Näytteet Kaukana kasvain ja kasvain näytteet Low stroomamääriin

19 koetinsarjojen (15 geenit) muodostavat ennustetekijöiden allekirjoituksen spesifinen strooman lähellä kasvain. Tutkia, onko 15-geenin luokittelija laajennetaan strooman, joka on kaukana ensisijainen kasvain, testasimme luokittelija 9. veltto strooman näytteitä 8, jotka

kaukana

primaarikasvaimen, otettu alue contralateral että kasvainpaikkaa. Oikeellisuuden tai spesifisyys oli vain 11,1% (tuloksia ei ole esitetty). Niinpä kun peruskudos testattujen ulkopaikoilla on alhainen todennäköisyys sairastumatta kasvain paracrine tekijöistä, strooman vastaus edustaa ilmentyminen muuttuu näiden 15 geeneistä ei havaittu toisin tällaisia ​​muutoksia havaittavissa strooman lähellä kasvain. Voit tarkistaa, onko 15-geenin luokittelija oli herkkä suuria määriä kontaminoivia kasvain, testasimme sen 117 kasvain näytteissä ( 10% kasvainsolujen keskimäärin 48,5% kasvaimen komponentti) kolmessa tietokokonaisuuksia (GSE8218, GSE17951 ja GSE25136) joiden kokonaispituus tarkkuus 41%. Kuitenkin, kun luokittelija testattiin 9 näytettä, jotka sisältävät 10% kasvainsoluja, tarkkuus oli 89% (taulukko 2). Täten aiottuun kliiniseen käyttöön määrityksen, on tärkeää näyte stroma joka on lähellä mutta vapaa syöpäsolujen.

Funktioanalyysi varten luokitin Geenit

Analysoimme 19 koetin sarjaa (15 geenit) käyttäen DAVID bioinformatiikan työkalun [27]. 15 geenit merkittävästi rikastettu liittyviä geenejä apoptoosiin ja solukuolemaan (p 0,001 ja Benjamin pisteet 0,05) (taulukko 1, tummennetut ja /tai kursivoitu). Olemme edelleen analysoineet 194 geenit (yhdistelmä 131 koetinsarjojen tunnistetaan PAM analyysin ja 115 koetinsarjojen tunnistaa korrelaatio analyysi) käyttäen polku analyysi työkalun MetaCore (GeneGo Inc.). Suodatusjärjestelmä on MetaCore auttoi rajoittaa etsiä niitä geenejä, jotka on raportoitu tietyssä kudoksessa, esimerkiksi, eturauhasessa. Suodatettu geenejä käytetään rakentamaan signalointireittien. Tilastollisesti merkitsevä väyliä oli täytettävä FDR 0,05 ja useita geenejä ( 2) merkitsevästi liittyy biologiseen polkuja. Analysoida 194 geenit, käytimme ”sileän lihaksen + tauti biomarkkereiden” ja ”eturauhasen kasvaimet transkriptio” kuten suodatusta parametrit. Tulokset MetaCore reitin analyysi on esitetty taulukossa S1.

Keskustelu

Osoitimme aikaisemmin, että on olemassa satoja merkittäviä geeni-ilmentymisen muutoksia välillä kasvaimeen vierekkäisten strooman ja normaali strooman, joita käytettiin kehittämään strooman-erityisen korkean tarkkuuden Diagnostic luokitin läsnäolon havaitsemiseksi-of-kasvain, joka perustuu RNA: n ekspression strooman yksinään [13]. Nämä strooman ekspressiota muutokset ovat todennäköisesti johtuu reaktiosta strooman ja kasvain- paracrine välittäjiä sekä mahdollista ”kentän vaikutus”. Tässä me lisäksi oletettu, että voi olla ilmaisu eroja stroomaan veltto ja aggressiivisia kasvaimia, joita voitaisiin käyttää kliiniseen ennustetta. Jotta testata tätä hypoteesia, vertasimme geeniekspressioprofiilien välillä kasvaimeen vierekkäisten stroomaa näytteitä potilaista, jotka kokivat nopean uusiutumisen ja kasvaimen vieressä stroomaa näytteitä potilaista, jotka eivät ole kokeneet uusiutumisen tai joiden uusiutumisen kesti monta vuotta. 40 strooman näytteet nopea uusiutuminen ja 9 strooman näytteitä veltto tapausta alistettiin permutaatio prosessi tunnistaa ilmentyvät eri geenit. Jokaisessa 1000 toistojen /resample, käytimme 31% strooman näytteiden (8 ulos 40 nopea uusiutuminen strooman näytteitä ja 7 ulos 9 veltto strooman näytettä) koulutukseen ja käyttää loput strooman näytteitä. Mikä johtuu siitä, että meillä oli pieni määrä näytteitä koulutukseen, valitsimme pieni mutta samanlaisia ​​numeroita (8 ja 7) kutakin iterointia, jotta tilaa resampling (vuorotella analyysi). Etuja tämän järjestelmän ovat kolminkertaisiksi. Ensinnäkin se oli tarkka analyysi kussakin resample. Toiseksi, tällainen järjestelmä on vankka mahdollisille ”huonoja” näytteet koska huono näytteitä voidaan sulkea monin resample yhdistelmiä. Kolmanneksi, tällainen järjestelmä voi merkittävästi lisätä havaitsemisen pohja (yhteensä 3625 koettimet tunnistettiin 1000 resamples). Olemme kuitenkin vain valitut 131 koetinsarjojen jotka tunnistettiin yli 500 kertaa 1000 toistojen vähentää mahdollisuutta väärien tunnistusten. Havaitsimme myös 115 koetinsarjojen joista ekspressiotasoja kasvaimen läheisellä strooman merkittävästi korreloi tautivapaan elinajan kertaa potilaista, joille tehtiin taudin uusiutumisen. 19 yleiskoettimella sarjaa (15 ainutlaatuinen geenejä) näiden kahden merkittävän geeni luetteloita käytettiin kehittää PAM-pohjainen luokittelija, joka oli keskimäärin tarkkuus 87%, kun se testattiin 47 riippumatonta tuumorin vieressä strooman näytteitä.

Äskettäin on raportoitu, että rintasyövän tahansa joukko 100 geenien tai useamman valitun sattumanvaraisesti on 90% mahdollisuus merkittävästi liittyvän tuloksen, ja useimmat julkaistu allekirjoitukset eivät merkittävästi enemmän liittynyt lopputulokseen kuin satunnainen ennustajia [ ,,,0],28]. Ratkaistakseen tämän ongelman, me satunnaista luokittimet perustuu

saman

harjoitusnäytteet ja 1000 erilaista 19 koetinsarjojen valitaan sattumanvaraisesti ja testannut näitä satunnaisia ​​luokittelijoiden kanssa

saman

testinäytteiden kuten kokeissa käytettyjen 19-anturi asetetaan Prognostiset Stroma luokitin. Keskimäärin koetinsarjojen valitsemien PAM 1000 satunnaisesti sarjaa on 3,7 joiden oletetaan olevan melua. Eli mistään sattumanvaraisesti joukko 19 koetinsarjojen, pieni määrä koetinsarjojen olisi korreloi korkea /matala riskistatus sattumalta, mikä selittää, miksi keskimääräinen koulutus tarkkuutta satunnainen luokittelijoiden oli -70%. Kuitenkin nämä satunnainen luokittelijoiden eivät toimi itsenäistä testi sarjaa. Päinvastoin, 19 koetinsarjojen tunnistettiin sekä tiukka lähestymistapoja; siksi ne ovat mahdollisesti yleisiä ennustetekijöitä markkereita, jotka koskevat muita testi sarjaa. Vertailu suosi meidän 15-geenin (19 koetinsarjaa) luokittelija näinä luokittelijoiden syntyy käyttämällä satunnaisia ​​prosesseja (taulukko 2).

Useat geenit tunnistettu tästä luokittelija kehitykseen ei ole todettu muissa tutkimuksissa RNA ilmentymisen stroomaan eturauhasessa. Vertasimme yhteensä 227 koetinsarjojen tai 194 ainutlaatuinen geenejä tunnistettu täällä peruskudoksettoman erityisiä koetinsarjojen aikaisemmin tunnistettu kolmessa tutkimuksessa yhtä käyttökelpoisia diagnoosia. On 2 geenien yhteistä (PROM1, GPM6B) kanssa 339 koetinsarjojen käytetään kehittää diagnostisia luokittelija [13]; 3 geenit (SEL1L3, KRT19, ja KRT7) yhteistä 119 geenit ilmentyvät differentiaalisesti geenin Joesting

et al.

[29], ja 3 geenit (NKX3-1, TPD52, ja GALNT3) yhteistä 44-geenit, jotka ilmentyvät differentiaalisesti välillä kasvaimeen liittyvien strooman ja nontumor strooman 5 potilaista [30]. Nämä havainnot osoittavat, että ennustetekijöiden allekirjoitusten strooman ovat merkittävästi erilaisia ​​kuin diagnostisen allekirjoitusten strooman.

Tuoreessa tutkimuksessa genomin laajuinen LOH /alleelinen epätasapainosta (AI) skannaus DNA tehtiin tunnistamiseksi LOH /AI kuuma /kylmä paikkoja eturauhasen epiteelin tai eturauhasen strooman, tai molemmissa, joka tunnistaa 156-geeni liittyy ennusteeseen viittaavia fenotyypit lukien uusiutumisen [14]. Neljä geenit (C7, SLPI, HOXB13, PDCD10) on jaettu myös 194 strooman prognostisten geenien kanssa

p

arvo 0,08. Siten geenien ilmentyminen muutaman geenien me tunnistettu potentiaalisia ennusteen arvioinnissa voi olla muuttunut johtuen genotyypin muutoksia, ja ovat erityisen tulevien kiinnostusta, mutta useimmat geenit tunnistimme ei vielä näytä tällaista järjestöä.

osajoukko aggressiivisempi näytteitä tutkimuksessamme on reaktiivisia strooman, jonka on osoitettu korreloivan huonon lopputuloksen kanssa [15]. Niinpä verrattuna 194 stroma-ilmentyvien geenien, että meidän havaittiin korreloivan lopputulos 1150 geenejä, jotka ilmentyvät differentiaalisesti välillä ”reaktiivinen strooman” alaryhmä eturauhassyöpänäytteissä ja kaukana stroomaan samasta 17 potilasta [15]. Kymmenen geenit (RABEP1, ZNF263, MCCC2, SLC4A4, TP53, KPNA6, PTPRF, CDH1, SCNN1A, ja CD24) olivat yhteisiä tutkimusten välistä (

p

arvo = 0,1312, jonka simulointi-pohjainen testi). Toinen tuore tutkimus tunnistettu 36 ennustetekijöitä markkereita myös nimenomaan peräisin reaktiivinen stroomasta [16]. Lisäksi testinäytteet oli merkittävä kasvain läsnä, jää avoimeksi mahdollisuus, että jotkut geenit ilmentyvät differentiaalisesti välillä kasvain epiteelin korkean ja matalan riskin kasvain. Huolimatta näistä eroista koeasetelma, neljä geenejä (NKX3-1, FOLH1, AGR2, HOXB13) ovat yhteisiä kanssa 194 strooman prognostisten geenien kanssa

p

arvon 0,0001, mikä osoittaa merkittävää sopimusta. Lisäksi kaikki neljä geenituotteet ovat hyvin dokumentoituja diagnostisia tai prognostisia biomarkkereita eturauhassyövän [31] – [35]. Nämä geenit ovat erityisen kiinnostava tulevissa tutkimuksissa.

Analysoimme biologisten toimintojen ennustetekijöiden 19 koetinsarjojen (15 geenejä) (taulukko 1) käyttäen DAVID ja MetaCore ohjelmistoja. Tulokset osoittivat, että 7 tunnettujen geenien (GADD45B, CDKN1A, NLRP1, ErbB3, YWHAE, TNFSF10 ja EIF5A) liittyvät apoptoosin ja 6 tunnettujen geenien (CDKN1A, NLRP1, ErbB3, YWHAE, TNFSF10 ja EIF5A) liittyvät solukuolemaan, ja 6 yhteistä. Tämä on kiinnostava perustuu meidän spekulointia Kasvainten strooman dialogi, joka suosii syövän etenemiseen. Ehkä, aggressiivinen kasvaimet paracrine signaaleja aikaan mekanismi pakottaa ympäröivän strooman tehdään remontin ja /tai apoptoottisten prosessien helpottamiseksi kasvaimen kasvua ja invaasiota [36] sen jälkeen epiteelikasvaimet-mesenkymaalitransitioon [37], [38]. Evidence from itsenäisen kokeen molekyylitasolla tarvitaan tukemaan tätä hypoteesia.

edelleen analysoineet 194 geenit (yhdistelmä 131 koetinsarjojen tunnistetaan PAM analyysin ja 115 koetinsarjojen tunnistaa korrelaatioanalyysiin) käyttäen väylä ohjelmisto MetaCore. Tulos reitin analyysin avulla ”sileän lihaksen + tauti biomarkkeri” suodatusapuna parametri osoitti, että tämä joukko 194 geenien merkittävästi rikastettu liittyviä geenejä ”eturauhasen kasvaimet transkriptio”. Seitsemän liittyvien geenien tämän kuvauksen olivat NCOA3 (TRAM-1), c /EBP (CEBP), NR77 (NR4A1), NK31 (NKX3-1), P53 (TP53), KL5 (KL5), CEBPD. Lisäksi 3 geenit STAT1, ErbB3, P21 (CDKN1A) havaittiin olevan yhteydessä ”eturauhasen kasvaimet säätelyyn etenemisensä solusyklin ’ja 1-geeni STAT1 liittyy” eturauhasen kasvaimet tulehdusreaktiota. Pathway analyysin avulla ”sileän lihaksen + tauti” kuin suodatus parametri osoitti, että 67 194 geenien tiedetään merkittävästi liittyy eturauhasen sairauksiin ja 66 näistä 194 geenien tiedetään merkittävästi liittyvän eturauhasen kasvaimien (taulukko S1), josta 59 ovat yhteisiä joukossa kaksi luetteloa. Lisäksi suurin osa näistä 194 geenit liittyvät myös muissa syövissä, kuten paksusuolen ja peräsuolen kasvaimet, rinta- kasvaimet ja keuhkojen kasvaimet, joka osoittaa nämä geenit voidaan yleisesti osallisena syöpään liittyvät reitit. Reitti analyysi osoitti myös, että huomattava osa näistä 194 geenien vuorovaikutuksessa transkriptiotekijöitä, kuten P53, SP1, FOXO3A, AR, BCL6, STAT5A, STAT5B, C-Jun, Nrf2, myod ja STAT1, joka keskeisessä asemassa ovat syöpä kehittymistä ja etenemistä. Esimerkiksi transkriptiotekijän SP1 on toiminnallisesti liittynyt 94 geenit 194 geenistä (Kuva S4).