Krooninen sairaus

tiivistelmä

stimuloiva NKG2D reseptori lymfosyytteihin edistää kasvaimen immuunivalvonnan kohdistamalla ligandien valikoivasti aiheuttama syöpäsoluihin. Etenevät kasvaimet vastapainoksi käyttämällä taktiikoita poistaa lymfosyyttien NKG2D. Tämä negatiivinen dynaaminen eskaloidaan kuten jotkut ihmisen syöpäsoluja co-opt ilmentymä NKG2D täydentää näin läsnäoloa sen ligandien autonominen stimulaatio onkogeenisten signalointi. Kliiniset yhdistys data tarkoita suhteita syöpäsolun NKG2D ja etäpesäkkeitä. Tässä osoitamme, että NKG2D edistää syöpäsolujen plastisuus induktion fenotyyppisten, molekyyli, ja toiminnallinen allekirjoitukset diagnostisia epiteelin-mesenkymaalitransitioon, ja varren kaltainen piirteet

kautta

induktion Sox9 keskeinen transkription säätelijä rintojen kantasolujen ylläpitoon. Nämä havainnot saadaan mallin rintasyöpäkohteisiin linjat ja vieraskudossiirteet olivat toisteta by

ex

vivo

syöpäsolujen ensisijainen invasiivisen rintasyövissä. Siten NKG2D voi olla kyky ajaa korkealla pahanlaatuisen piirteet taustalla etäpesäkkeitä.

Citation: Cai X, Dai Z, Reeves RS, Caballero-Benitez A, Duran KL, Delrow JJ, et al. (2014) autonominen stimulaatio Cancer Cell Plasticity Human NKG2D lymfosyyttien -reseptorin koekspressoidaan kanssa sen ligandien syöpäsoluihin. PLoS ONE 9 (10): e108942. doi: 10,1371 /journal.pone.0108942

Editor: Eric Vivier, INSERM- CNRS- Univ. Méditerranée, Ranska

vastaanotettu: toukokuu 16, 2014; Hyväksytty: 27 elokuu 2014; Julkaistu: 07 lokakuu 2014

Copyright: © 2014 Cai et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Data Saatavuus: Tällä kirjoittajat vahvistavat, että kaikki tiedot taustalla olevat havainnot ovat täysin saatavilla rajoituksetta. Kaikki oleelliset tiedot (paitsi microarray data – katso alla) ovat paperi- ja sen tukeminen Information tiedostoja. Microarray tiedot ovat saatavilla osoitteessa https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/alle liittymistä koodia GSE53961.

Rahoitus: Tätä työtä tukivat National Institutes of Health avustuksen P50 CA083636 ja National Institutes of Health apurahan R01 CA174470. Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

syöpäsolu plastisuus merkitsee kehitystä ominaisuuksien avulla syöpäsolujen irtoavan primäärikasvain, levittää ja laajentaa kloonaamalla kaukaisiin sivustoja. Tätä prosessia säätelee epiteelin-mesenkymaalitransitioon (EMT) ja toisiinsa hankinta regeneratiivisen syövän kantasolujen (CSC) attribuutteja [1], [2]. Tunnettu kuljettajat syöpäsolun plastisuus ovat heterotypic vihjeitä, kasvaimeen liittyvistä strooman ja /tai immuunijärjestelmän solut [1]. Olemme aiemmin tunnistettu epätyypillisen homotyyppisessä reseptori-ligandi-vuorovaikutuksen syöpäsoluja [3] ja osoittaa tässä, että tuloksena signalointi indusoi uudelleenohjelmoinnin kohti muuttavia ja varsi kaltaisia ​​valmiuksia.

reseptori mukana, NKG2D (luonnollinen tappaja ryhmä 2 jäsen D ), on aktivoiva lymfosyytti reseptorin pääasiassa NK-solujen ja CD8 T-solujen ja tunnetaan parhaiten välittävät immuunijärjestelmän valvonnan viruksen infektoimien ja pahanlaatuisten solujen [4]. Ihmisen NKG2D signaaleja

kautta of the DAP10 (DNAX-aktivoiva proteiini 10) sovitin, joka sitoo joko PI3K (fosfoinositidi 3-kinaasi) tai Grb2 (kasvutekijän reseptori sitoutunut proteiini 2), jolloin aktivointi PKB /AKT (proteiini kinaasi B) tai MAP (mitogeeniaktivoidut proteiini) kinaasireaktiosarjojen [5]. Ligandeja NKG2D ihmisillä kuuluvat MICA ja MICB (MHC-luokan I liittyvien ketjujen A ja B) sekä kuusi jäsentä ULBP (UL-16 sitova proteiini) perhe [6]. NKG2D ligandit ovat suurelta osin poissa pinnasta normaaleissa soluissa, mutta ne voidaan indusoida syövän synnyn-stressin vasteita syöpäsoluissa [7]. Tämä selektiivinen ligandin ilmentyminen mahdollistaa NK-solujen ja CD8 T-solujen kohdistaa syöpäsolujen ainakin kasvaimen varhaiseen vaiheita ennen immunosuppressiivisten taktiikka edistyy kasvainten tukahduttaa tämä käsivarsi immuunivasteen [4], [8].

lisäksi torjumaan immuunivaste, jotkut syöpäsolut yhteistyössä valitsevat NKG2D omaksi hyödykseen täydentäen läsnäolo sen ligandien itse stimulaatio tumorigeneesin [3]. Vaihtelevissa suhteissa rinta-, munasarja-, eturauhas- ja paksusuolen syöpäsoluissa ilmaista merkinanto- hallitsee NKG2D-DAP10 komplekseja, jotka aktivoivat PI3K-AKT-mTOR (nisäkkään rapamysiinin kohde) signalointia akselin ja loppupään efektoreja. Lisäksi kuten lymfosyytit, NKG2D-DAP10 stimuloi fosforylaatioon ERK (ekstrasellulaarisen signaali-säännelty kinaasin) ja JNK MAP kinaasireaktiosarjojen [3]. Patofysiologista merkitystä NKG2D-DAP10 signalointi tukee kliinisen yhdistys tutkimus, perustettiin positiivinen korrelaatioita prosenttiosuuksien syöpäsolujen pinta NKG2D ja kasvaimen koon ja levitä [3]. Nämä suhteet jatkettiin merkittäviä assosiaatioita imusolmuke etäpesäke, ja suuntaus korrelaatiot arvosanalla ja lymphovascular invaasio, mikä viittaa NKG2D-DAP10 vaikutuksia kasvainsolujen levittämiseen ja etäpesäkkeiden muodostumista [3]. Tässä tutkimuksessa käsitellään kapasiteetin NKG2D-DAP10 edistää syöpäsolujen plastisuus taustalla etäpesäkkeitä.

Tulokset

induktio EMT uudelleenohjelmointi ligandivaihdolla stimuloimalla NKG2D

epiteelituumori linjat tyypillisesti ilmaista NKG2D ligandeja mutta ovat joko negatiivisia niiden NKG2D-DAP10 reseptori tai, kuten MCF-7, BT-20, ja MDA-MB-453 rintasyövän linjat, tuskin positiivinen mikä heijastuu vähän siirtymiä virtaussytometrian profiilien ja hyvin alhainen NKG2D ja DAP10 mRNA ja proteiinin ilmentyminen (kuvio S1A ja S1B, myös katso kuva 2B ja kuviossa 2C viitteet 3 ja 9, vastaavasti). Tämä vähäisyys reseptorin tuumorilinjoja vastustaa suhteellinen runsaus, sekä mRNA ja proteiini ilmaisun positiivisia

ex

vivo

syöpäsolujen (Kuva S1C-E; katso myös kuvio 1 C -E viitaten 3). Testata käytettäessä

vitro

malli onko NKG2D indusoi EMT, me täten tutkittiin MCF-7-solut, jotka oli transfektoitu stabiilisti NKG2D-DAP10 (MCF-7-TF solut) johtaen pinnalla ilmaus tasoisena

ex

vivo

syöpäsolujen (vertaa kuvio S1C ja Kuva S1F). Faasikontrastimikroskopiassa, MCF-7-TF-soluissa todettiin morfologisia muutoksia verrattuna mock-transfektoituja ohjaus soluja, jotka osoittivat tiukasti ryhmitelty mukulakivi kaltaisia ​​muotoja. MCF-7-TF-solut, sen sijaan, näytetään fibroblastin kaltaisen morfologioita (kuvio 1A). Nämä muutokset johtuivat kohdunulkoinen ilmentymisen NKG2D-DAP10 kuin vanhempien fenotyyppi palautettiin yhdistelmä lentivirusta välittämän RNAi kohdistamista NKG2D MCF-7-TF-KO soluja (kuvio 1A, virtaussytometriseen profiilien näistä mallin linjojen katso kuva S1A ja S1F). Nämä havainnot viittaavat siihen, että ligandivälitteinen stimulaatiota NKG2D johti induktioon EMT, johon liittyy koordinoituja molekyyli- ja solutason muutokset johtavat menetykseen epiteelisolujen-soluadheesiota, napaisuus, ja solun tukirangan eheys, samanaikainen hankkiminen mesenkymaalisten proteiinin allekirjoituksia, kara-cell muotoja, ja invasiivisia ja muuttavien kyvyt [10], [11]. Diagnostinen EMT vähenevät ilmentymisen soluliitos liittyvän E-kadheriinin ja induktio N-kadheriinin ja tukirankaproteiinin väli hehkulampun vimentiinista. Immunofluoresenssimikroskopialla, MCF-7-TF soluilla, jotka muutokset epiteeli- ja mesenkymaalisten markkeriproteiinien, joka palautettiin RNAi kohdistaminen NKG2D (kuvio 1A). Vastaavia tuloksia saatiin immunoblot ja RT-PCR-profiloinnin (kuvio 1 B). Laajentaminen tietojen lisäksi markkeriproteiinien ja niiden vastaavien mRNA: iden, mukaan lukien epiteelin tiukka liitoskohtien zona occludens-1 (ZO-1) ja occludin, sytokeratiini 19 (CK19) ja musiinin 1 (MUC1), ja fibroblastit α-sileän lihaksen aktiini (α SMA), tuotti mukainen tulokset (kuvio 1A ja 1 B) [12]. EMT on johtamasta transkriptiotekijöitä, jotka sisältävät Snail1 /2, Twist1 /2, Zeb1 /2, ja LEF-1 [1]. Induktio mRNA: t kaikille nämä tekijät paitsi Zeb1 tallennettiin MCF-7-TF mutta ei MCF-7-TF-KO soluissa (kuvio 1 B). Esi-inkubointi MCF-7-TF solujen cocktail vasta-aineita asiaan NKG2D ligandeja inhiboivat kaikki tallennetut proteiini- ja mRNA: n muutoksia, mikä vahvistaa ligandin mukana (kuvio 1 B) [3]. Aikaisemmat tutkimus osoitti vaatimus solu-solu kontakti ligandivälitteinen stimulaatio NKG2D-DAP10 signalointi syöpäsoluissa [3]. Näin ollen, kuten nähdään virtaussytometrialla, osuudet pinta E-kadheriinin

– /N-kadheriinin

+ mesenkymaalisten MCF-7-TF-soluissa korreloi soluviljelmässä konfluenssiin (kuvio 1C).

(A) faasikontrastimikroskopialla osoittaa siirtymistä epiteelin ja fibroblastoidisolulinjaa muodot MCF-7-TF versus mock-transfektoituja ohjaus, ja fenotyypin palautuminen, jonka MCF-7-TF-KO soluja, jotka ilmentävät NKG2D RNAi. Immunofluoresenssimikroskopialla, MCF-7-TF-soluissa näyttää vähentyneen E-kadheriinin, ZO-1, occludin, ja MUC1, ja indusoitiin N-kadheriinin ja vimentiinin. (B) Vastaava immunoblottaus (yläpaneeli) ja RT-PCR (keskimmäinen paneeli) tiedot, mukaan lukien ylimääräiset CK19 ja α-SMA markkereita. Menetys epiteelin ja voitto mesenkymaalisten merkkiaineiden vaimenee, kun MCF-7-TF soluja esi-inkuboidaan vasta-cocktail NKG2D ligandeja. Pohja paneeli esittää EMT-liittyvä transkriptiotekijä RT-PCR profiilit MCF-7-TF ja ohjaus linjat ja vaimennus menetyksen ja voiton tapahtumia vasta-peittäminen NKG2D ligandien. (C) virtaussytometria MCF-7-johdetun linjat kasvanut alhainen tai korkea yhtymäkohta E-kadheriinin ja N-kadheriinin. Numerot neljännesten osoittavat solujen mittasuhteet prosenttia. Huomaa, että tämä havaitseminen on herkempi sitten käytetty menettely (A). (D) Esimerkkinopeuksia oli lisääntynyt

vitro

muuttoliikettä ja hyökkäystä MCF-7-TF versus valetransfektoidut negatiivinen kontrolli ja MCF-7-TF-KO soluissa. Läsnäolo antiligan- vasta-cocktail kumoaa liikkuvuutta voittoja. Numerot osoittavat solumäärää satunnaisesti valitun mikroskooppikentäs-. (E) Graafinen näyttö motiliteetti tietoja kuvaaviin pylväisiin keskimääräinen solujen määrä (+/- SD) johdettu kolmen erillisen kokeen kuhunkin neljään mikroskooppisen kentän laskee. Tähdellä merkitsevät

p

0,005. (F) Imaging of MCF-7-TF solumigraation verrokkiin linjat haavan paranemista määrityksissä faasikontrastimikroskopiassa ajan. (G) RT-PCR Snail1, Snail 2, ja Sox9 vanhempien, NKG2D vähennetty tai scrRNAi Transdusoimattomia MCF-7-soluissa.

(A) faasikontrastimikroskopiassa, MCF-7- TF solut siirtyvät epiteeli- morfologian altistuessaan estäjiä PI3K (LY294002) tai yleiseurooppalainen AKT (AKTV) muttei MEK1 /2 (U0126) tai JNK (SP600125). (B, C) Inhibition of PI3K tai AKT kääntää EMT proteiinimarkkeri ja transkriptiotekijä profiileja MCF-7-TF ja Dox-indusoidun MCF-10AT-TF-soluissa, on esitetty immunoblot-ja /tai RT-PCR: llä. (D, E) estäminen PI3K tai AKT vähentää vaeltavia ja invasiivisia toiminta MCF-7-TF ja Dox aiheuttama MCF-10AT-TF soluissa. Pylväät edustavat tarkoittaa solujen määrä (+/- SD) peräisin kolmesta itsenäisestä

vitro

maahanmuutto- ja invaasio kokeiluja kunkin neljän mikroskooppisen kentän laskee. Tähdellä merkitsevät

p

0,005.

EMT-liittyvä remontin solu-solu- ja solu-matriisi adheesio hankkii syöpäsolujen muuttavia ja invasiivisen valmiudet [10]. Testasimme lisätä liikkuvuutta MCF-7-TF solujen vakio määrityksissä pisteytys maahanmuuton mikrohuokoinen kalvo tai traversion käyttövalmista tyvikalvon (Matrigel). Vertaamalla MCF-7 valetransfektoidun ohjaus, nämä kokeet paljastivat noin kuusi- ja 12-kertainen nousu muuttavien ja invasiivisia toimintoja, vastaavasti, MCF-7-TF soluja, jotka tukahdutettiin vuonna NKG2D-köyhdytettyä MCF-7 -TF-KO soluissa (kuvio 1D ja 1E). Vaihtoehtoisen lähestymistavan, kaavi haavan sulkeminen konfluentteja yksisolukerroksissa MCF-7-TF ja ohjaus solujen kuvantaa faasikontrastimikroskopiaa. Kun taas MCF-7-TF soluissa saavutti täydellisen haavan sulkeutumisen 72 tunnin, vähän, jos ollenkaan muutoksia nähtiin negatiivisen kontrollin soluissa (kuvio 1 F). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset valmistunut

vitro

tutkimukset MCF-7-TF soluihin viittaa siihen, että NKG2D-DAP10 on kyky aktivoida syöpäsolun EMT.

MCF- 7 on luminal rintasyöpä linjassa epiteelin ominaisuuksia sekä joitakin konstitutiivista epiteelin ja mesenkymaalisten plastisuus, mikä on tyypillistä useimmille rintojen kasvainlinjojen [13], [14]. Siksi Snail1 ja Snail2 mRNA: t olivat havaittavissa korkea-sykli (36 kierrosta) RT-PCR transfektoimattomissa MCF-7 emosoluina (kuvio 1G). Yhdenmukainen joiden osallistuminen endogeenisen NKG2D in Snail1 /2 induktio, NKG2D ehtyminen MCF-7-NKG2D RNAi soluissa johti vähentäviä tai näiden selostukset verrattuna salattu RNAi ohjaus transduktanttien (MCF-7-scrRNAi soluista, kuvio 1G, sillä virtaussytometria profiilit näiden mallin linjojen katso kuva S1A ja S1G). Endogeeninen NKG2D voi siis periaatteessa olla valmiuksia edistää erilaistumista kohti mesenkymaaliset allekirjoitukset mutta nämä vaikutukset eivät tunkeutua ansiosta niukasti ilme. Näin ollen, läsnäolo tai puuttuminen endogeenisen NKG2D ilmentymisen rintasyövän linjat, kuten epiteelin MCF-7 (NKG2D

+) tai mesenkymaaliset SUM149PT (NKG2D

-), on unaligned niiden pääasiassa epiteelin versus mesenkymaaliset esityksiä [3 ], [9], [14], [15].

induktio syöpäsolun EMT on yleinen kapasiteetti NKG2D-DAP10

vahvistusta tärkeimmät havainnot monissa eri tuumorilinjoja, me testattu NKG2D-DAP10 transfektantteja SUM149PT rintasyövän [9], A375 melanooma [3], ja MDAH-2774 munasarjasyöpäsoluja, ja, yksityiskohtaisemmin MCF-10AT esiaste, rintarauhasen epiteelisolujen, jotka olivat yhdessä transdusoitu lentiviruksen konstrukteja doksisykliini (Dox) indusoitavissa NKG2D ja DAP10 ilmaisu (kuvio S2A ja S2B). Eroaa MCF-7-soluissa, kaikki nämä neljä riviä puuttuu endogeeninen NKG2D (kuvio S2A ja S2B) [3], [9], mutta jakaa kyky läpikäydä EMT [13], [16] – [19]. Kuten MCF-7-TF solujen signalointi taitoa ektooppisesti ilmaistu NKG2D-DAP10 on osoitettu, että SUM149PT-TF ja A375-TF linjat [3], [9], ja varmistettiin juuri muodostettujen MDAH-2774-TF ja MCF-10AT-TF soluissa immunoblottauksella havaitseminen phosphokinases

P

-Akt

S473 ja

P

-ERK1 /2

T202 /Y204 jälkeen anti-NKG2D-vasta silloittumisen ( Kuva S2C).

Kun kaikki neljä tuumorilinjoja, kohdunulkoinen NKG2D-DAP10 lauseke (konstitutiivisia tai Dox aiheuttama) painettu morfologisiin (näkyy vain MCF-10AT-TF solut), markkeriproteiinina ja transkription EMT allekirjoitukset tallennettu MCF-7-TF-soluja (kuvio S3A-D). Lisäksi virtaussytometria DOX aiheuttaman MCF-10AT-TF solujen pinnalla E-kadheriinin ja N-kadheriinin vahvisti, että aktivointi EMT oli solun lähi- ja siten oletettavasti ligandista riippuvaa (kuvio S3E). Kaikki tuumorilinjoja kanssa konstitutiivisia tai Dox aiheuttama kohdunulkoinen NKG2D-DAP10 ilmaisua näytteillä huomattavasti suurentunut

vitro

vaeltavia ja invasiivisia toimintoja (kuvio S3F).

Riippuvuus EMT uudelleenohjelmointi aktivoituessa PI3K-AKT

paikantaa NKG2D-DAP10 signalointi vaatimukset EMT aktivointia, MCF-7-TF ja Dox aiheuttama MCF-10AT-TF solut altistettiin farmakologisen estäjiä PI3K (LY294002), pan -AKT (AKT Inhibitor V), MAP-kinaasin kinaasi (MEK1 /2) ylävirtaan ERK (U0126), ja JNK (SP600125). Induktio kaikki aiemmat tutki EMT perustein morfologisia muutoksia (näkyy vain MCF-7-TF-solut), diagnostiset proteiinimarkkeri ja transkriptiotekijä allekirjoituksia, ja liikkuvuuteen, olivat riippuvaisia ​​PI3K-AKT signalointi akseli ilman näkyvää panosta ERK ja JNK (kuva 2A-E). Vuonna täydentävä lähestymistapa, NKG2D ilmennettiin MCF-10AT solujen transduktion yhdessä DAP10 mutatoitu joko sen PI3K /p85 (M88Q *) tai Grb2 (N87Q *) sitoutumiskohtaan [20]. Vahvistuksen jälkeen asianmukaisen ilmentymistä ja toimintaa variantin NKG2D-DAP10 komplekseja (kuvio 3A ja 3B), induktion testaus EMT parametrien selville riippuvuus rekrytointi PI3K /p85 mutta ei Grb2 (kuva 3C-E).

(A) immunosaostus (IP) ja immunoblot (IB) on NKG2D ja /tai DAP10 (N87Q * tai M88Q *) transdusoiduissa MCF-10AT soluihin (ylhäällä kaksi paneelia). Pohja kolme paneelit osoittavat ensisijaista havaitseminen DAP10 ja toisensa poissulkevia yhdistys sen N87Q * ja M88Q * variantteja p85 ja Grb2, vastaavasti. (B) Signaling toimivuus DAP10 N87Q * ja M88Q * variantteja. Huomaa, että ERK on alavirtaan PI3K. EGF lisättiin valvonnan aktivointi, DMSO liuotinkontrolli. (C, D) purku EMT proteiinia merkki ja transkriptio merkki profiileja ilmaus DAP10 (M88Q *) kanssa heikentynyt sitoutuminen p85, näkyy immunoblottauksella ja /tai RT-PCR. (E) DAP10 variantti M88Q * mutta ei N87Q * vähentää vaeltavia ja invasiivisia toiminta Dox aiheuttaman MCF-10AT solut, jotka ilmentävät kunkin NKG2D-DAP10 mutantti komplekseja. Pylväät edustavat keskiarvoa solujen määrä (+/- SD) peräisin kolmesta itsenäisestä

in vitro

maahanmuutto- ja invaasio kokeiluja kunkin neljän mikroskooppisen kentän laskee. Tähdellä tarkoittavat

p

0,005.

Association of NKG2D-DAP10 kanssa EMT allekirjoitukset

ex vivo

syöpäsoluja

Signaling pätevyyttä NKG2D-DAP10 reseptorin rintasyöpäsoluissa on dokumentoitu [3] ja vahvistettiin täällä kaksi rintasyöpänäytteistä (kuvio S1H). Vasta-aine-välitteinen reseptorin silloittuminen aiheuttama AKT fosforylaatio alavirtaan PI3K rintasyöpäsoluissa lajitellaan ilman CD45 (hematopoieettinen solu syrjäytyminen), ilmaus EpCAM (syöpäsolun osallisuus), ja NKG2D. Ulkonäkö fosfo-AKT (

P

-AKT) oli herkkä LY294002 ja siten riippuvainen PI3K. Sen varmistamiseksi biologista merkitystä NKG2D-DAP10 in EMT uudelleenohjelmointi, vasta eristetty solususpensioita 12 ensisijainen invasiivisen rintasyövän yksilöitä (kutsutaan BT1 BT12) tutkittiin multi-parametri pinta virtaussytometria CD45, EpCAM, NKG2D, ja E -cadherin

– /N-kadheriinin

+ EMT allekirjoitus. EpCAM on

bona fide

syöpäsolun markkeri vaikka downregulation saattaa esiintyä EMT [12], [21]. Todellakin, EpCAM ilmaisu joukossa CD45

– solupopulaatioiden oli heterogeeninen kaikissa paitsi yhdessä (BT8) 12 kasvainsolun suspensioita (kuvio 4A). Meillä on siis tutkittava CD45

-EpCAM

korkea ja CD45

-EpCAM

alhainen solujen erikseen pinta NKG2D ja E-kadheriinin /N-kadheriinin kuvioita. Vastaa meidän aiempia tuloksia [3], NKG2D

+ syöpäsolujen olivat läsnä kaikissa 12 rintasyöpänäytteistä vaihdellen 0,5 ja 27,8% (keskiarvo 9,7 +/- 9,1%) koko CD45

-EpCAM

korkea soluja (taulukko S1). EMT edustaa jatkumo epiteelin /mesenkymaalisten hybridi ja täysin siirtynyt mesenkymaalisten kaltainen valtioiden [10], [11], [21]. Perustuen meidän havaintojen mallin tuumorilinjoja, syöpäsolun NKG2D olisikin liittyvät sekä hybridi (E-kadheriinin

+ N-kadheriinin

+) ja edelleen eriytetty (E-kadheriinin

N-kadheriinin

+) fenotyypit. Vuonna 9 12 kasvainsolun suspensioita testattu (BT4 ja BT12), useimmat NKG2D

+ joukossa CD45

-EpCAM

korkea soluilla oli E-kadheriinin /N-kadheriinin kanssa yhteneviä joko osittain (E- kadheriinin

+ N-kadheriinin

+) tai enemmän edennyt (E-kadheriinin

N-kadheriinin

+) EMT (kuvio 4A ja 4B). Paitsi BT8, BT11 ja BT12 suspensiot, vinouttaa niitä kohtaan fenotyyppejä ei ilmennyt joukossa sovitetun NKG2D

– syöpäsoluja. Kolmessa tapauksessa (BT1, 2, ja 3), syöpäsolut ristiriitaisin tai mesenkymaalisten allekirjoitusta rajoittuu NKG2D

+ osajoukko mutta ei hallitseva (kuva 4B).

(A) Esimerkit (rinta syöpä yksilöt BT4 ja BT5) sekä Multiparametrimäärityksessä virtaussytometrialla dot havainnollistavat syöpäsolun gating perustuu ilman CD45 ja läsnäolo EpCAM (korkea tai matala) ja sen jälkeen näyttö E-kadheriinin /N-kadheriinin fenotyypit NKG2D

+ tai NKG2D

– syöpä solualaryhmiä. Numerot neljännesten osoittavat solujen mittasuhteet prosenttia. Quadrant portit perustuvat fluoresenssi-miinus-yksi isotyyppi Ig ohjaus värjäykset. (B, C) Graafinen näyttö saatujen tietojen 12 rintasyöpänäytteistä (BT1-BT12), jotka analysoitiin kuten (A). E

+ N

-, E

+ N

+, ja E

N

+ viittaavat E-kadheriinin ja N-kadheriinin tila. Värit vastaavat pistekuvaajan neljännesten (A). Katso varsinaisessa tekstissä lisäselvitystä.

NKG2D

+ solut myös huomattava joukossa CD45

-EpCAM

alhainen kasvainsolupopulaatioissa, joka käsittää 0,3 ja 59,3% (keskiarvo 12,6 + /- 18,9%) (taulukko S1). Kaikissa mutta BT1 näyte, NKG2D

+ CD45

-EpCAM

heikkoihin myös ensisijaisesti näkyvissä EMT fenotyyppejä. Erityisesti tietyissä näytteissä (BT3, BT5, BT6, ja BT12), osuudet mesenkymaalisten (E-kadheriinin

N-kadheriinin

+) solut olivat huomattavasti suuremmat joukossa NKG2D

+ CD45

– EpCAM

alhainen verrattuna NKG2D

+ CD45

-EpCAM

korkea soluja, mikä viittaa siihen, että EpCAM downregulation voi esiintyä myöhäisessä EMT prosessissa (kuvio 4B ja 4C). Kaiken kaikkiaan nämä havainnot vahvistivat tehdyt päätelmät mallin tuumorilinjoja, tukeva merkittävä rooli NKG2D luonnollisena aktivaattori EMT syövässä. Tämä vastaa sitä, että NKG2D

+ solut muodostivat aineellisen mittasuhteet kun kirjataan prosenttia koko hybridi ja mesenkymaalisten merkki profiili-positiivisia soluja (taulukko S1). Kaikki 12 kasvainsolun suspensiot sisälsivät vaihteleva määrä CD45

-EpCAM

– soluja, joista puuttui E-kadheriinin ja N-kadheriinin ja näin ei voitu sijoittaa tiettyyn soluun tyyppi. Lukuun ottamatta neljää kasvaimen yksilöt (BT2, BT3, BT11 ja BT12), NKG2D

+ solut olivat poissa joukossa populaatioissa.

NKG2D indusoi EMT kasvaimen xenotransplant malli

Täydentävät näyttöä rooli NKG2D vuonna EMT saatiin kasvaimista peräisin SUM149PT-TF tai negatiivisen kontrollin soluissa ortotooppisesti ksenosiirrettyjä osaksi utarerasvaa tyynyt NOD /SCID-hiiriin, malli kokeilu, joka oli tärkeä perustamisesta NKG2D rakentuvassa kasvainten muodostumiseen [9]. Suorempi

in vivo

näyttö ei ollut saavutettavissa sillä spontaanit tai karsinogeeni aiheuttamien syöpien hiirillä puuttuu NKG2D ilmaisun [3]. SUM149PT linja on fenotyypiltään heterogeeninen, kätkeminen huomattava subsets solujen mesenkymaalisten merkki profiilit [14]. Siten immunohistokemia voivat aiheuttaa vaikeuksia arviointeja EMT liittyvät muutokset. Tutkiminen ksenografti kasvain- solun suspensiot virtaussytometrialla altistuvat voimakkaasti lisääntynyt esityksiä hybridi /mesenkymaalisten fenotyyppejä kaikissa viidessä NKG2D

+ SUM149PT-TF vastakohtana NKG2D

– mock-ohjaus kasvaimia (kuvio 5). EMT-liittyvä muuttavien aktiivisuus ksenotransplantaatio SUM149PT-TF solujen saattanut osaltaan parantaa kasvainsolujen levittämisen havaittiin aiemmin tässä eläinmallissa [9].

Solususpensioita kasvaimista peräisin immuunivajaisiin hiiristä ortotooppisesti ksenosiirrettyjä rintasyöpä SUM149PT- TF soluja (ylempi pylväsdiagrammi) voimakkaasti vinoutunut kohti hybridi E-kadheriinin

+ /N-kadheriinin

+ ja edelleen siirtynyt E-kadheriinin

– /N-kadheriinin

+ fenotyyppejä verrattuna kontrolliin valetransfektoidun SUM149PT kasvainten (alempi pylväskaavio). E

+ N

-, E

+ N

+, ja E

N

+ viittaavat E-kadheriinin ja N-kadheriinin asema; Mid, hiiri tunnusnumero.

Koulutukseen stemness uudelleenohjelmointi tekijänä NKG2D

Lisäksi annetaan muuttavien kykyjä, EMT transkriptiotekijöiden Snail1 ja Twist säädellä pintamerkkiaine profiileja, jotka määrittävät rintasyöpä solupopulaatioiden rikastettiin solujen kantasolujen kaltaisia ​​ominaisuuksia [22] – [24]. Yhdenmukainen induktion Snail1 ja Twist, kohdunulkoinen NKG2D-DAP10 lauseke (konstitutiivisia tai Dox aiheuttama) liittyi rintasyöpään kantasolun CD24

– /CD44

+ profiili siirtymiä MCF-7-TF MCF-10AT-TF ja SUM149PT-TF linjat (kuvio 6A) [22], [25]. Kuitenkin vain pieni osa soluista CSC kaltainen fenotyyppejä täyttäisi toiminnalliset CSCS [2]. Merkityksellisempi EMT-stemness keskinäiset voi olla se, että EMT transkriptiotekijöitä, kuten Snail2 tai Zeb1 yhteistyössä erillinen geneettinen circuitries, myös säädellä toiminnallinen rintojen CSC valtiot [2], [26] – [28]. Microarray-geenin ilmentymisen profilointi, olemme määritelleet merkittävä induktion Sox9 transkriptiotekijän MCF-7-TF verrattuna mock-transfektoituja kontrollisoluja (ks microarray tietoja http: //www.ncbi.nlm.nih/geo/under liittyminen koodi GSE53961), joka on itsenäisesti vahvistaneet kvantitatiivisen RT-PCR: llä ja immunoblottaus (kuvio 6B ja 6C).

(A) Kahden värin virtaussytometrialla CD24 /CD44 kuviot transfektoitu stabiilisti MCF-7-TF ja SUM149PT-TF, ja Dox aiheuttama transdusoitujen MCF-10AT-TF soluissa (kaikki punaisella) verrattuna negatiivisiin kontrolleihin (näkyy sinisenä). Värilliset numerot neljännesten osoittavat vastaavia solun mittasuhteet prosenttia. Esitetyt tiedot edustavat kolmea koetta. (B) Kvantitatiivinen RT-PCR Sox9 MCF-7 ja MCF-10AT johdettu malli linjat. Kokeelliset tiedot pylväät edustavat taitettava kasvaa yli negatiivisten kontrollien tulokset vahvistetaan yksi. Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. Tähdellä merkitsevät

p

0,005. (C) Vastaavat immunoblot tiedot Sox9 ja aktiini valvontaa. (D) Faasikontrasti- micrographs mammospheres muodostaman MCF-7-TF ja aiheuttama MCF-10AT-TF verrattuna negatiivisen kontrollin linjat. Pylväsdiagrammi suorassa (harmaat palkit) tiivistää datan määrä organoids ( 100 um halkaisijaltaan) laskettiin kolmessa kolmen kuopan sarjaa kunkin ympätty 10

3 MCF-7-TF soluissa. Mustat palkit edustavat kokeita MCF-7-TF soluja samoissa olosuhteissa, kun läsnä on estäjiä PI3K (LY294002), pan-AKT (AKTV), MEK1 /2 (U0126) tai JNK (SP600125). Tiedot edustavat kolmen erillisen kokeen. DMSO toimii liuotinkontrolli. (E, F) Kuten (D), MCF-7-TF soluja, jotka ilmentävät Sox9 tai Snail2 RNAi tai scrRNAi valvontaa. (G) Faasikontrasti- micrographs mesenkymaalisten versus epiteelisolujen morfologioita solulinjojen esitetty (E, F). (H) Graafinen näyttö osuudet Sox9

+ /Snail2

+ solujen joukossa NKG2D positiivisia tai negatiivisia CD45

-EpCAM

+

ex vivo

rintasyövän soluja (yksilöt BT13 kohteeseen BT18) määritetään moni väri virtaussytometria.

Sox9 toimii yhteistoiminnallisesti Snail2 (Slug) ja vähemmässä määrin Snail1 master säätelijänä rintarauhasen kantasolujen tilassa [28]. Siten positiivisesti säätelemällä Sox9 lisäksi Snail2 ja Snail1 (katso kuvio 1 B), NKG2D voi olla kyky edistää toiminnallista kantasolun kaltaisia ​​ominaisuuksia. Tätä käsitystä tukivat kolmiulotteinen matrigeeliä organoidikappaleen kulttuureja ja klassiseen mammosphere määrityksissä. Molemmissa kokeissa, MCF-7-TF solut muodostivat lukuisia suuria ( 100 um) organoids taas valetransfektoiduista ohjaus- tai MCF-7-TF-KO-solujen tuottamat vasta muutaman solun klustereita, jotka olivat tyypillisesti pieniä (kuvio 6D). Kuten EMT uudelleenohjelmointi, organoidikappaleen muodostuminen riippui PI3K-AKT ilman näkyvää osallistumista ERK tai JNK (kuvio 6D). Vastaa näyttöä kapasiteetin NKG2D aiheuttaa Sox9 ja organoidikappaleen muodostuminen saatiin Dox-indusoidun MCF10AT-TF-solut (kuvio 6B-D).

Sox9 ja Snail2 ovat molemmat vaaditaan nisäepiteelisoluissa syöttää ja stabiilisti ylläpitää toiminnallista kantasolujen tilassa [28]. Niinpä RNAi-välitteinen ehtyminen Sox9, ja erikseen on Snail2, kumosi organoidikappaleen muodostumista MCF-7-TF mammosphere kulttuureissa [Kuva 6E ja 6F). Toisin Snail2, jonka uskotaan edistävän kantasolujen induktion

kautta

aktivoinnin EMT, vaikutukset Sox9 vuonna EMT uudelleenohjelmointi pidetään vähäinen [28]. Näin ollen, EMT liittyvät morfologiset muutokset MCF-7-TF-solut siis kumota RNAi-välitteinen väheneminen Snail2 mutta ei Sox9 (kuvio 6G).

määritellään tunnusmerkki korkeimman plastisuus syöpäsolujen on niiden tehokas kasvain aloittamisen yhteydessä ksenografti immuunipuutteisilla hiirillä. Aikaisemmassa hiirimallissa tutkimus osoitti lyhensi viiveet ja parannettu kasvain ilmaantuvuus kanssa ortotooppisesti istutetut MCF-7-TF versus ohjauslinjaa [9]. Nuo tulokset ovat yhdenmukaisia ​​NKG2D välittämää induktio Sox9 ja Snail2 ja hoitaja hankinta CSC kapasiteettia. Tämän induktion myös selityksen havaittu parantaa kasvaimen aloituksen transfektoimattomista MCF-7-soluissa, jotka ekspressoivat vähän endogeenista NKG2D (kuvio 1G, virtaussytometriaa profiilit vanhempien MCF-7, MCF-7-NKG2DRNAi, ja MCF-7-scrRNAi linjat katso kuva S1A ja S1G) [9]. Koetin on merkitystä ihmisen syövissä,

ex vivo

kasvainsoluja kuudesta ensisijainen invasiivisen rintasyövän yksilöitä (BT13 ja BT18) testattiin assosiaatiot NKG2D ja Sox9 ja Snail2 mukaan polykromaattiseksi virtaussytometrialla. Kaikissa kasvaimet, osuudet CD45

-EpCAM

+ solut koekspressoivat Sox9 ja Snail2 olivat huomattavasti suuremmat joukossa NKG2D

+ verrattuna NKG2D

– soluja (kuvio 6H). Kaiken kaikkiaan nämä tulokset tukevat tuumorigeenisia merkitys NKG2D

kautta

Sox9- ja Snail2 välittämä induktio CSC piirteitä.

Keskustelu

Korkea plastisuus syöpäsoluja pidetään suurin melunlähde kasvaimen levittäminen ja kiihtyvän seuraavia tavanomaisia ​​syöpähoidon [2], [29]. Tämä tutkimus osoittaa, että lisäjäsentä ilmentymä, ja signaloinnin, NKG2D syöpäsoluihin edistää syöpäsolujen plastisuus kanssa erilaistumista kohti mesenkymaalisten fenotyyppien ja levittämistä-mahdollistavat ja kasvaimen aloittamista kapasiteettia. Fysiologinen merkitys tukee kertaus EMT ja Sox9 allekirjoitukset äänitetty mallin tuumorilinjoja ensisijaisen invasiivisen rintasyöpiä. On todennäköistä, että rooli NKG2D kuljettajana on syöpäsolu plastisuus on laajasti sovellettavissa, joka ulottuu ainakin munasarja-, paksusuoli-, ja eturauhasen syöpä solujen [3].

merkityksellisyyttä EMT, ja päättely stemness uudelleenohjelmointi, ihmisen kasvainten kehittymiseen ei ole kiistaton [30]. Kuitenkin viime aikoina virtaussytometria-pohjainen mielenosoituksia verenkierrossa olevien kasvainsolujen kanssa epiteelin mesenkymaaliset tai hybridi allekirjoituksia, ja liittyy etäpesäkkeitä-aloittamisen kapasiteettia, olla suora todiste ihmisen syöpäsolu plastisuus ja sen patofysiologisia merkitys [21], [31]. Multi-parametrinen yksisoluiset analyysi

ex vivo

tuumorisolun suspensioita ulottuu tämän todisteita primaarisista rintasyövistä ja paljastaa, että sekoitettu epiteelin /mesenkymaalisten ja mesenkymaalisten kaltainen rintasyöpä solujen fenotyypit ovat yleisempiä ja oletettavasti monimutkaisempi luultu. Koska useimmat NKG2D

+ rintasyövän solupopulaatioiden Tutkittujen vinoutunut kohti hybridi ja mesenkymaalisten fenotyyppien ja edusti aineellisten mittasuhteet kaikkien solujen kanssa erilaistumisen vaiheissa NKG2D voi hyvin mahdollisesti olla merkittävä rooli EMT induktio.