Krooninen sairaus

tiivistelmä

Background

Vähentämissäätely koodaavien geenien nukleosidiset kuljettajat ja lääkeainemetaboliaan vastaava oton ja metabolista aktivointia nukleosidin gemsitabiinin on yhteydessä hankittu kasvain vastustuskyky tätä ainetta. Hydralazine on osoitettu kääntää doksorubisiiniresistenssiä mallissa rintasyöpään. Täällä halusimme tutkia epigeneettiset mekanismit ovat vastuussa hankkimisesta vastustuskykyä gemsitabiinin ja jos hydralazine voisi palauttaa gemsitabiini herkkyyttä kohdunkaulan syöpäsoluja.

Menetelmät /Principal Havainnot

Kohdunkaulan syövän solulinja Calò solu linja viljeltiin, kun läsnä oli kasvavia konsentraatioita gemsitabiinia. Down-regulation

hENT1

dCK

geenien havaittiin resistenttien solujen (CaLoGR), joka ei liittynyt promoottori metylaatio. Hoito hydralazine päinvastainen gemsitabiinin kestävyys ja johti

hENT1

ja

dCK

geeni uudelleenaktivointi DNA- promoottori metylaatio riippumattomalla tavalla. Ei muutoksia HDAC kokonaisaktiivisuus eikä H3 ja H4 asetylointi nämä promoottorit havaittiin. ChIP analyysi osoitti H3K9m2 osoitteessa

hENT1

ja

dCK

geenin promoottorit, jotka korreloivat hyper-ilmentymä G9A histoni metyylitransferaasiestäjiä klo RNA ja proteiini tasolla resistentit solut. Hydralazine esti G9A metyylitransferaasin aktiivisuus in vitro ja ehtyminen G9A geenin iRNA palautettu gemsitabiinia herkkyys.

Johtopäätökset /merkitys

Tuloksemme osoittavat, että hankittu gemsitabiini vastus liittyy DNA promoottorin metylaation riippumaton

hENT1

ja

dCK

geeni alassäätö ja hyper-ilmentymä G9A metyylitransferaasi. Hydralazine palaa gemsitabiini resistenssin kohdunkaulan syöpäsolujen estämällä G9A histoni metyylitransferaasista.

Citation: Candelaria M, de la Cruz-Hernandez E, Taja-Chayeb L, Perez-Cardenas E, Trejo-Becerril C, Gonzalez- Fierro A, et al. (2012) DNA Metylointi-Independent Paluu gemsitabiinin Resistance by Hydralazine vuonna kohdunkaulan syövän solut. PLoS ONE 7 (3): e29181. doi: 10,1371 /journal.pone.0029181

Editor: Vladimir N. Uversky, University of South Florida College of Medicine, Yhdysvallat

vastaanotettu: 16 helmikuu 2011; Hyväksytty: 22 marraskuu 2011; Julkaistu: 12 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Myrna et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ osittain tukevat Psicofarma SA de CV Rahoittajat oli rooli tietojen keräämisessä, mutta ei tutkimuksen suunnittelu, tietojen analysointi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen. Ei ylimääräistä ulkoista rahoitusta saanut tätä tutkimusta.

Kilpailevat edut: ADG on saanut maksanut konsultointimenoista Psicofarma S.A. de C.V. kysymyksissä muita kuin niitä, jotka liittyvät tähän tutkimukseen. Tekijän Institution (National Autonomous University of Mexico) on patenttihakemuksia koskevat hydralatsiini. Tämä ei muuta tekijöiden noudattaminen kaikki PLoS ONE politiikan tietojen jakamista ja materiaaleja.

Johdanto

Gemsitabiini (2 ’, 2’-difluori- 2’deoxycytidine, dFdC) on analogi sytosiiniarabinosidin että erottavia farmakologiset ominaisuudet ja laaja antituumorivaikutuksen-spektrin aktiivisuus. Gemsitabiini on merkittävä kliininen aktiivisuus useita maligniteetteja mukaan lukien haima-, keuhko-, virtsarakko-, rinta-, munasarja- ja pään ja kaulan [1], [2]. Kohdunkaulan syövän gemsitabiini ja sisplatiinin ja säteily eloonjäämistä tuloksia verrattiin sisplatiiniin säteilyn sairaus on edennyt, ja kun käytetään sisplatiinin on yhtä tehokas kuin muut sisplatiini dupleteiksi vastaan ​​metastaattisen kohdunkaulan syövän [3].

Gemsitabiini n farmakologiset ominaisuudet ovat ainutlaatuisia että kaksi pääluokkaa geenit ovat välttämättömiä sen antituumorivaikutuksia ja kestävyys: kalvo transporter proteiinia koodaavan geenien, joiden tuotteet vastaavat huumeiden solunsisäisen oton, ja lääkeainemetaboliaan-koodaus geenit, jotka katalysoivat sen aktivaatio ja inaktivaatio [4]. Näin ollen näiden geenien ilmentymistä on avain kasvaimen vaste ja kestävyys gemsitabiinia. Useimmat solunsisäiset otto gemsitabiinin välittyy hENT1 (ihmisen ekvilibratiivisen nukleosidikuljettajan Transporter 1). Herkkyys nukleosidianalogeja kuten gemsitabiini

in vitro

ja hoitopaikassa on osoitettu korreloivan ilmentymisen tämän kuljettajaproteiinin taas hENT1-vajaiden solujen kestävät hyvin tämän nukleosidin [5] – [8]. Potilaat, joilla haiman ja keuhkosyöpä ilmentävät hENT1 on korkeampi hoitovaste ja pidempi eloonjäämismediaani jälkeen gemsitabiinin kuin potilailla, joilla on vähän tai ei ollenkaan hENT1 [9], [10]. Mitä gemsitabiinin aineenvaihdunta geenejä,

dCK

ilme on liittynyt gemsitabiinin herkkyys. Solulinjat valittiin vastustuskyky nukleosidianalogit ovat osoittaneet mutaatiostatuksesta inaktivaatio

dCK

ja

dCK

transfektion tuloksia resensitization solujen Ara-C ja gemsitabiinin [11] – [12]. Syöpäpotilailla pienempi ilmentyminen dCK liittyy lyhyempi elinaika [13], [14]. Toisaalta, difosforyloitunut gemsitabiini on ribonukleotidireduktaasin estäjä, joka on hetero- entsyymi koostuu kahdesta homodimeerien (RRM1 ja RMM2), joka on keskeinen synteesissä solunsisäisen deoksinukleotiditrifosfaatti [15]. Yli ilmaus RRM1 ja RRM2 on liittynyt gemsitabiinin vastus syöpäsolulinjoissa ja NSCLC [16], [17]. Sytidiinideaminaasia (CDA) katalysoi deamination sytidiinin, dexoycytidine, ja niiden analogit, kuten gemsitabiini kuitenkin rooliaan välittäjänä gemsitabiini vastus on kiistanalainen [18]. Nämä tiedot osoittavat selvästi, että pienentynyt tai ekspression puutteen dCK ja hENT1 ovat ratkaisevia gemsitabiini vastus kuitenkin johtavien mekanismien niiden transkription hiljentäminen on vielä määriteltävä. Aikaisemmat tutkimukset ovat osoittaneet, että metylaatio on

dCK

geeni on vastuussa sen hiljentäminen [19] kuitenkin; tämä jää osoitettava

hENT1

.

Hydralazine on pienimolekyylinen DNA demetyloivan agentti [20] tiedetään demetyloimiseksi geenin promoottorit ja aiheuttavan geenin uudelleenaktivointia in vitro [21] – [ ,,,0],24] ja in vivo [25]. Käytetään yhdessä histonideasetylaasi-inhibiittori valproiinihapon aktivoi geenien ilmentymistä syöpäpotilailla [26] – [28]. Lisäksi, hydralatsiini on osoitettu kääntää doksorubisiiniresistenssiä mallissa rintasyövän [29]. Koska suurin osa työstä gemsitabiinin vastus on tehty haimasyövän solulinjoissa ja tämä lääke on laajasti arvioitu kohdunkaulan syövän [30] halusimme tutkia epigeneettiset mekanismit ovat vastuussa hankkimisesta resistenssin tälle aineelle ja jos hydralazine voisi palauttaa gemsitabiini herkkyyttä kohdunkaulan syöpäsoluja. Tuloksemme osoittavat, että tässä mallissa, hydralazine kääntää gemsitabiini resistenssin DNA metylaatio riippumattomalla tavalla.

Tulokset

Kohdunkaulan syöpä solulinjoja tutkittiin perusilmennystä

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

geenit ja sitten niiden herkkyys gemsitabiinia arvioitiin. IC

50 SiHa- solulinjassa oli 1000 uM, ja se oli mielivaltaisesti pitää ensisijaisena kestävä. IC

50 muiden solulinjat olivat: 3,3 uM, 0,3 uM ja 0,1 uM calo, HeLa ja C33A-solut, vastaavasti (kuvio 1A). Kuten kuviossa 1B, pohjapinta geenien ilmentymistä koodaavien gemsitabiini liikenteen ja aineenvaihduntaa, joka säädettiin aktiini ja viitaten normaalin kohdunkaulan, vaihteli solulinjat ja suhde tasojen näiden geenien kanssa luontainen herkkyys /vastus asema gemsitabiini näissä solulinjoissa ei löytynyt.

. IC

50 gemsitabiinin varten HeLa, calo, SiHa ja C33A solut olivat 3,3 uM, 0,3 uM, 1000 uM ja 0,1 uM arvioituna kanssa kristalliviolettivärjäyksen määrityksessä. B. Basal ilmaus

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

geenejä arvioituna RT- PCR. Ei ollut mitään korrelaatiota IC

50 ja luontainen herkkyys /resistenssitilanteessa. Expression säädettiin ilmaisun normaalissa kohdunkaula.

Sen tutkimiseksi, induktio gemsitabiinin vastustuskyky liittyy muutoksiin ilmaus

hENT1

,

dCK

RRM1

,

RRM2

,

CDA

geenejä, Calò solut altistettiin kasvavia pitoisuuksia gemsitabiinin ja kun solut tulivat resistenttejä niitä käsiteltiin hydralatsiini eri aikoina ja pitoisuuksina . Kuvio 2A osoittaa, että viiden viikon jälkeen, Calò solut hankittu resistenssi tämän antimetaboliitti ja pystyivät kasvamaan 927 uM gemsitabiinin (280-kertainen konsentraatio). Vastus tila liittyi downregulation mukaan puolet

hENT1

ja

dCK

.

RRM1

ja

RRM2

geenit oli pieniä muutoksia taas

CDA

pienensi myös (kuvio 2B). Lisäksi kuva 2C esittää, että alaspäin säätely

hENT1

ja

dCK

geenejä toteutettiin vähitellen kuin vastus kehitetään. Hoito CaLoGR solujen hydralazine 2 uM 10 päivää, 10 uM ja 30 uM 5 päivän pystyi palauttaa gemsitabiinin vastus kuten kuvassa 2D. Vastaava IC

50s nämä hoidot olivat 1,7 uM, 2,7 uM ja 6,6 uM.

. Hankinnan jälkeen gemsitabiini vastus, IC

50 CaLoGR soluissa oli 927 uM (280-kertainen konsentraatio). B. ilmentäminen

hENT1

,

dCK

ja

CDA

vähenivät lähes puoleen, RRM1 ja RRM2 oli pieniä muutoksia. C. vähentäminen

hENT1

ja

dCK

geenejä toteutettiin vähitellen kuin vastus kehitetään. D. Hoito CaLoGR solujen hydralazine 2 uM 10 päivää, 10 uM ja 30 uM 5 päivän palautui gemsitabiini vastus. Vastaava IC

50s nämä hoidot olivat 1,7 uM, 2,7 uM ja 6,6 uM.

Voit selvittää, onko reversiossa vastus hydralazine joka on heikko DNA demetyloivan aine liitetään muutokset ilmaus

hENT1

ja

dCK

geenien RT-PCR näiden kahden geenin suoritettiin. Tulokset kuviossa 3A osoittaa, että odotetusti hydralatsiini johti uudelleen näiden geenien ilmentymistä kolmessa hoidossa olosuhteet arvioidaan. DNA-promoottorin hypermetylaatio on osoitettu hiljentämään geenejä kemoterapian resistenssin malleissa vuoksi metylaatiostatuksen nämä promoottorit arvioitiin MSP. Mielenkiintoista,

hENT1

ja

dCK

promoottorit osittain metyloituja jopa perus tilassa ja osoittanut mitään hypermetylaation että resistenttien CaLoGR solulinjassa. Hydralazine 2 uM, 10 uM tai 30 uM jättänyt demetyloimiseksi nämä promoottorit ovat osoituksena MSP kuvassa 3B. Voit vahvistaa havainto, kuusi itsenäistä kloonia (pohjapinta, kestävä ja käsiteltiin hydralazine) olivat bisulfiitin sekvensoitiin mutta ei demetylaatio havaittu CpG arvioitiin (Fig. 3C). Geeni uudelleenaktivointi siis ollut riippumaton sen demetyloivan vaikutuksen, mikä viittaa siihen, että muut epigeneettisellä mekanismit voisivat selittää saadaan säädeltyä ja aktivoida nämä geenit tässä mallissa. Sen vahvistamiseksi, että puute demetyloiva vaikutuksesta hydralatsiinin kun

dCK

ja

hENT1

ollut sen heikon demetyloivan kyky, kuvio 3D osoittaa, että samassa solulinjassa ja olosuhteet, geeni

DAPK

oli demetyloidaan hydralazine 2 uM 10 uM ja 30 uM.

. Hydralazine kolmessa testatuissa olosuhteissa (2 uM 10 päivää, 10 uM ja 30 uM 5 päivää) palautti näiden geenien ilmentymistä. B.

hENT1

,

dCK

geenit olivat osittain metyloitu basaalisesti ja promoottori metylaation eivät muutu resistenttien solujen eikä jälkeen hydralazine kohtelun arvioi MSP. C. kartat vetäjien nämä geenit osoittavat CpG-saarekkeiden tiheys ja jakelun sekä kantojen alukkeiden MSP, siru ja sekvensointi. Se osoittaa myös sekvensoimalla että CpG metylaatio ei muuttunut

dCK

ja

hENT1

geenit eivät nimittäin resistenttien solujen kumpikaan hoidetuilla hydralatsiini. Tyhjät ja täytetyt ympyrät edustavat demetyloitunut ja metyloituja CpG: t viidessä itsenäistä sequencences. D. Hydralazine pystyi demetyloimiseksi

DAPK

promoottorin calo solulinjassa.

lisäys histonideasetylaasiaktiivisuuden on osoitettu aiheuttavan geenien joissakin malleissa. Sen määrittämiseksi, onko tämä ilmiö osallistuu gemsitabiini vastarintaa kohdunkaulan syövästä deasetylaasi aktiivisuus mitattiin Calo soluissa käyttäen välineistöä, joka sisältää prototyyppi HDAC estäjä trikostatiini A positiivisena kontrollina. Kuvio 4A osoittaa, että ei muutoksia HDAC havaittiin; todella pieni lasku deasetylaasi aktiivisuuden havaittiin resistentit solut. Arviointi koko asetylointi H3 ja H4 in

hENT1

ja

dCK

geenin promoottorit Chip määrityksissä taas väheni H3 ja H4 asetylointi

hENT1

promoottori , lievää asetylaatiossa H3 havaittiin

dCK

promoottori eikä käännettä H4 asetylointi (kuva 4B). Nämä ilmeisesti päinvastainen tulokset vastustavat merkittävä rooli H3 ja H4 asetylointi selittää hiljentäminen näiden geenien tämän histonimodifikaation. Edelleen, valproiinihappo käsittely 1 mM 5 päivää ei aktivoida näiden geenien ilmentymistä ja kääntää gemsitabiinin vastus (ei esitetty).

. Yhteensä histonideasetylaasiaktiivisuutta eivät osoittaneet merkittäviä muutoksia välillä tyvi- ja resistentit solut, todella pieni väheneminen havaittiin resistenttien solujen arvioituna kanssa HDAC kit. B. yhteensä asetylaatio H3 ja H4 arvioituna Chip väheni H3 ja H4 asetylointi

hENT1

promoottori, lievää asetylaatioon H3 ja muutu H4 osoitteessa

dCK

promoottori.

päästääkseen paremmin osaksi epigeneettiset mekanismit

hENT1

ja

dCK

hiljentäminen tässä mallissa gemsitabiinin vastarintaa, histoni metylointi määritettiin. Metylointi H3K9 on tunnettu tukahduttava merkki kun metylaation H3K4 aktivoi, joten metylaation nämä lysiineihin arvioitiin ChIP analyysi pohjapinta tilassa, vuonna resistenttien solujen ja jälkeen hydralatsiini hoidon. Kuvio 5 osoittaa, että

hENT1

geeni, mitään muutoksia ei havaittu H3K4me3 metylaatio mutta H3K9me2 lievästi lisääntynyt resistenttien solujen ja laski sen jälkeen hydralatsiini hoidon. Mitä

dCK

geeni vähentynyt hieman H3K4me3 havaittiin resistenttien solujen jota ei ole muutettu hydralatsiini. Kuitenkin metylaation H3K9me2 lievästi kasvanut resistenttien solujen ja vähentää, kun hydralatsiini. Muutokset kaistalla intensiteetti normalisoitiin vastaan ​​niiden panos voimakkuutta. Koska DNA demetyloiva agentti 5-atsa-CdR on osoitettu vähentävän H3K9me2, käytimme MetaDrug ™ ohjelma paljastaa, onko hydralazine voi olla osallisena säätelyssä H3K9 metylaation. Kuten kuvassa 6, hydralazine saattaa vaikuttaa paitsi DNA-metylaation sytosiinin mutta voi myös olla mukana negatiiviseen säätelyyn H3K9 metylaation. Vahvista nämä ennustukset mRNA ilmaus

G9A

arvioitiin Calo soluissa qPCR. Tulokset osoittavat, että tämän geenin ilmentyminen lisääntyi resistenttien solujen taas hydralatsiini laskenut tason (kuvio 7A). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin Western blot, G9A proteiinin lisääntynyt resistenttien solujen ja laski sen jälkeen, hydralatsiini hoidon (kuvio 7B). Jotta voitaisiin edelleen tutkia G9A estävä kyky hydralatsiinilla, joka on H3K9 metyylitransferaasin

in vitro

eston määritys suoritettiin käyttäen

EpiQuik

™ histoni Metyylitransferaasiaktiivisuus /Inhibition Assay Kit (H3-K9). Hydralazine 2 uM ja 10 uM voimakkaasti alentunut H3K9 metylaatio (kuvio 7C). Vahvista biologista merkitystä tämän in vitro havainnon tyrmäyksellä on G9A geenin avulla, joka iRNA testi osoitti, että Transfektoituja Calò solut takaisin herkkyyttä hydralazine jota ei vielä muutettu, kun nämä solut myös käsiteltiin hydralatsiini (Fig. 8).

hENT1

geeni, mitään muutoksia ei havaittu H3K4m3 metylaatio mutta H3K9me2 lievästi lisääntynyt resistenttien solujen ja laski sen jälkeen hydralatsiini hoidon. Vuonna

dCK

geeni oli vähentynyt hieman H3K4me3 että resistenttien solujen jota ei ole muutettu hydralatsiini. Metylointi at H3K9me2 lievästi kasvanut resistenttien solujen ja vähentää, kun hydralatsiini. Muutokset kaistalla intensiteetti normalisoitiin vastaan ​​niiden tuloa.

MetaDrug ™ ohjelma ennusti, että hydralazine voivat vaikuttaa paitsi DNA-metylaation sytosiinin mutta voi myös olla mukana negatiiviseen säätelyyn H3K9 metyloinnin.

. Kvantitatiivinen RT-PCR

G9A

osoittaa, että resistenttien CaLoGR soluilla oli lisäystä verrattuna pohjapinta ja että hydralatsiini vähentää sen ilmentymistä (pohjapinta vs kestävä, p 0,05). B. Tällä proteiini tasolla, oli kasvu G9A että resistenttien solujen, jotka laskivat jälkeen hydralatsiini hoidon. C. H3K9 metyylitransferaasi

in vitro

eston määritys. Hydralazine 2 uM ja 10 uM voimakkaasti alentunut H3K9 metylaatio (käsittelemätön vs hydralazine, p 0,05).

. Estopitoisuudella gemsitabiinin Calo soluissa ei saavutettu. B. ehtyminen G9A palauttaa gemsitabiinin herkkyys (IC

50 10.3 uM). C. Ei muita muutoksia IC

50 nähtiin, kun hydralazine lisättiin G9A köyhdytettyä soluja. D. qPCR of G9A vahvistaa osittainen ehtyminen

G9A

messenger.

Keskustelu

Tämän tutkimuksen tulokset gemsitabiinin resistenssin kohdunkaulan syöpäsolujen ja sen reversion heikkoon DNA demetyloiva agentti hydralazine osoittavat, että resistenssin kehittyminen liittyy alas-säätely keskeisten geenien gemsitabiini n solunsisäisen ottoa ja aineenvaihduntaa,

hENT1

ja

dCK

. Kiinnostavaa kyllä, tämä alassäätöä ei johtunut geenin promoottori hypermetylaation osoituksena MSP ja bisulfiitti sekvensointi; kuitenkin, hydralazine pystyi aktivoida niiden ilmaisun ja palata gemsitabiinin vastarintaa. Nämä tiedot viittaavat siihen, että muut epigeneettisellä mekanismit toimivat hiljentää kemoterapian resistenssin geenejä ja että hydralazine on DNA: n metylaatio-riippumattomia vaikutuksia, todennäköisesti läpi vaikuttavat kielteisesti sääntelyn H3K9 Metylointia ennusti METADRUG ™ ohjelma.

Nämä havainnot ovat tärkeää saada lisää tietoa päälle mekanismeja kemoterapiaa lääkeresistenssin. Geenin toiminnan lopettamisesta DNA metylaatio oli ensimmäinen epigeneettiset mekanismi osoitettu suoraan mukana hankintaan kemoterapian resistenssin

in vitro

malleissa [31], [32] mutta koska tietämys epigeneettiset prosesseista on kehittyessä osallistunut muita epigenetic pelaajien kuten histonideasetylaasit sekä sinkki-ja NAD-riippuvainen sekä histoni metyylitransferaasit, histoni demethylases ja MikroRNA että inaktivointia liittyvien geenien kemoterapiaa herkkyys ja kestävyys on paljastanut [33] – [38]. Tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että tässä mallissa gemsitabiinin vastarinnan kohdunkaulan syövän, metylaation H3K9 voisi olla tärkein mekanismi hiljentäminen ilmaus

hENT1

ja

dCK

geenejä, jotka tasoittaa tietä edelleen testaus osallistumisen tämän histonimodifikaation muissa malleissa kemoterapian resistenssin. Tämän merkitystä havainnon kasvaa estäjinä G9A histoni metyylitransferaasit ollaan käytettävissä tutkimus [39].

Varhaiset tutkimukset ovat osoittaneet, että DNA: n metylaatio estäjien aiheuttamaa

dCK

uudelleen ilmentymistä CEM /dCK- soluihin [19] ja että puute ilmentymisen tämän avaimen geenin aktivoimiseksi useiden nukleosidianalogien kuten gemsitabiini tapahtuu promoottori metylaatio [40] – [43]. Toistaiseksi mikään muu epigeneettiset mekanismia hiljentäminen tämä geeni on kuvattu kemoterapian resistenssin malleissa. Samoin puute ilmaisu- ja alhainen hENT1 vahvasti korreloi vastustuskykyä gemsitabiinin ja muut nukleosidianalogit [6], [9], [10], [44]. Vaikka useat kalvo kuljettaja koodaus-geenejä, kuten hOAT3 (SLC22A8), liuenneen aineen kantaja perheen 5 iodidetransporter (SLC5A8), folaatinkuljettajaproteiinin (RFC), solun retinolia sitova proteiini 1, ja ihmisen Na + /I-symporter tunnetaan on alas säätelevät DNA: n metylaation ja aktivoida DNA metyylitransferaasi inhibiittorit [45] – [49], tässä emme pystyneet osoittamaan, että promoottori metylaation

hENT1

selittää sen havaittiin downregulation, mutta sen uudelleen aktivoituminen saavutettiin by hydralazine kautta DNA: n metylaatio riippumaton mekanismi mikä viittaa siihen, että todellakin

hENT1

on alas säätelee epigeneettisestä vaikutus todennäköisimmin kautta G9A histoni metyylitransferaasi välittämän H3K9 metylaatio.

Tästä huolimatta molemmat geenit sisältävät CpG-saarekkeiden niiden promoottorit [50], [51] ja että ainakin

dCK

geeni on johdonmukaisesti osoitettu, että sen promoottori metyloidaan resistenttien solujen [19], meidän malli ei ole korrelaatiota promoottori metylaatio näitä promoottoreita ja ilme. Kuitenkin demetyloiva vaikutus muiden geenien (

DAPK

) todistettiin, sulkematta pois että hydralazine ole demetyloivan vaikutusta. Nämä tiedot johtivat meidät etsiä muita epigeneettisellä mekanismeja, jotka voisivat selittää geenien. Ei yhtäpitävät histonideasetylaasi- eikä histoni asetylaatio näillä geenin promoottorit havaittiin sulje pois tätä histonimodifikaation kuin vaiennettu mekanismi näiden geenien tässä mallissa. Koska DNA metyylitransferaasi inhibiittori 5-atsa- CdR decitabine voi ilmetä vaihtoehtoisia toimintamekanismeja DNA metylaatio suhteen transkription reaktivaatio kuten histoni H3K9 demetylaatio sääntelyn alueilla vaiennettu geeni [52] teimme toimialalla METADRUG ™ ohjelma saada vihjeitä kiinni muita mahdollisia vaikutuksia hydralatsiinilla. Tuloksemme osoittivat, että todellakin hydralazine ennustetaan olevan osallisena negatiiviseen säätelyyn H3K9 metylaation. Tämä tulos johti meidät analysoimaan Chip analyysi muutoksilla H3K9me2 sekä

dCK

ja

hENT1

promoottoreista CaLoGR soluissa. Molemmat promoottorit sisältämät H3K9me2 käsittelemättömissä soluissa, hieman lisääntynyt kestävä tilassa, ja tämä hiljentäminen merkki osittain lievittää hydralatsiini. Meidän täytyy kuitenkin korostaa, että nämä muutokset tosin H3K9m2 vaikka johdonmukaisesti kolmessa erillisessä määrityksissä, olivat lieviä mikä selittyy sillä perusteella, että ainakin kahdeksan histoni metyylitransferaasit lukien G9A myös H3K9 niiden metyloinnin tavoite [52].

edelleen vahvistaa havainto, kvantitatiivinen RT-PCR osoitti, että ilmentyminen G9A on lisääntynyt resistenttien solujen verrattuna herkkien solujen ja tasojen teki lasku hoidon jälkeen hydralatsiini. Kuitenkin dramaattinen väheneminen proteiinitasolla tämän histoni metyylitransferaasi havaittiin Western blot että resistenttien solujen jälkeen hydralatsiini hoidon. Merkittävä, nämä tulokset ovat hyvin samanlaisia ​​kuin 5-atsa-CDR rintasyövän malli maspiini uudelleen ilmentymisen jossa vähennyksiä G9A histoni metyylitransferaasi proteiinin tasot eivät johdu vaikutuksia G9A geenien ilmentyminen [53]. Lisätukea tälle vaikutusta hydralatsiinin saatiin in vitro määrityksessä H3K9 metylaation osoittaa, että hydralazine inhiboi tämän histoni metyylitransferaasi. Biologinen merkitys Näiden havaintojen osoitettiin osoittamalla, että heikentävien G9A että resistenttien Calo solut johti takaisin herkkyys gemsitabiinin näiden solujen ja että korkeampi herkkyys gemsitabiinin ei saavutettu lisäämällä hydralazine että G9A köyhdytetyn solut väittämällä vastaan ​​

off-tavoite

vaikutus hydralatsiinilla.

on huomioitava, että METADRUG ™ ohjelmassa myös, että hydralazine voisi toimia positiivisesti säätelyssä H3K4 metyloitumistuotteita ei havaittu tutkimuksessamme kuitenkin tuoreet tiedot meidän ryhmä osoittavat, että useissa syöpäsolulinjoissa hoidon hydralatsiinilla ja valproiinihapon johtivat yli-ilmentyminen MIC A ja MIC B ligandeja, jotka oli liitetty kasvu H3K4 metylaatio näillä geenin promoottorit viittaa siihen, että hydralazine tällainen vaikutus tälle Histonimerkki [54].

Joko luontaisia ​​tai hankittuja lääkeresistenssi on monimutkainen ja pleiotrooppinen ilmiö ja muiden mahdollisten osallistuvien pelaajien gemsitabiini vastus tässä mallissa ei tutkittu tässä tutkimuksessa. Esiintymien, vaikka

RRM1

ja

RRM2

yli ilme on liittynyt lääkeresistenssin [55] ei tapahtunut merkittäviä muutoksia havaittiin näiden geenien tässä tutkimuksessa. Paradoksaalisesti CD-geeni alas säännelty resistenttien solujen huolimatta yli-ilmentyminen on jatkuvasti ollut osoittanut liittyvät vastustuskyvyn gemsitabiinin ja muut nukleosidianalogit [56]. Tämä havainto korostaa entisestään monimutkaisuutta lääkeresistenssin joka näyttää olevan geenin ja solun mallikohtaisia.

Tämän tutkimuksen tulokset ovat mahdollisesti on kliinistä merkitystä ainakin tähän malliin lääkeresistenssin. Gemsitabiini käytetään usein kohdunkaulan syöpä joko samanaikaisesti säteilylle tai yhdistelmänä sisplatiinin kanssa pitkälle edennyt [3]. Kehittynyt resistenssi tämä lääke saattaa olla vastuussa hoidon epäonnistumisen; siten, hydralazine saattaa estää kestävyys ja mahdollisesti lisätä tehoa gemsitabiinia. Lisäksi paljastamiseksi että H3K9 metylaatio voi johtaa kemoterapian resistenssin ansaitsee testaus muissa kokeellisissa malleissa.

Materiaalit ja menetelmät

Soluviljely

Kohdunkaulan syöpä solulinjoja HeLa , SiHa ja C33A saatiin ATCC: ltä. Calo solulinjaa ystävällisesti lahjoitti Dr. Monroyn-Garcia [57]. Solulinjoja viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% C0

2 DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (Gibco, Grand Island, NY).

Sytotoksisuusmääritykset

solut ympättiin 6-kuoppaisille mikrotiitterilevyille Falcon levyillä (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), 2 x 10

3-soluja /kuoppa 0,2 ml: aan täydellistä alustaa ja sitten käsiteltiin 24 tuntia gemsitabiinin kanssa pitoisuuksina välillä 1 × 10

-8 M 1 x 10

-4 M. sen jälkeen elatusaineessa, joka sisältää gemsitabiinin poistettiin ja lisättiin tuoretta väliainetta. 72 tunnin kuluttua väliaine aspiroitiin ja korvattiin 10 minuuttia 50 ui 0,75% kristalliviolettia 50% etanolia, 0,25% NaCl: a, ja 1,75% formaldehydiliuosta. Solut pestiin sitten vedellä, kuivattiin ilmassa, ja väriaine eluoitiin PBS: llä + 1%: ista duodecyl sulfaattia (SDS) liuos. Solujen elinkelpoisuus arvioitiin väriaineen absorbanssi mitataan aallonpituudella 570 nm automaattisella ELISA-lukijalla. Kaikki määritykset suoritettiin kolmena kappaleena. Sytotoksinen Jokaisen käsittelyn vaikutus ilmaistiin prosentteina solujen elinkelpoisuus suhteessa käsittelemättömiin kontrollisoluihin (prosenttiosuus kontrollista), ja se määritellään [A

570 nm käsiteltyjen solujen /A

570 nm ei-käsiteltyjen solujen] x 100.

induktio gemsitabiinin kestävyys ja hydralatsiini hoidon

calo solulinjaa viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% C0

2 DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (Gibco, Grand Island, NY). Lisääntyvä annokset gemsitabiinin (IC

30, IC

50, IC

80 ja lopuksi kaksi askelta IC

90 lisättiin viikottain aiheuttavan gemsitabiinia vastus. Sen jälkeen kun IC

90 kahdesti, sytotoksinen määritys toistettiin vahvistaa gemsitabiinia vastus.

gemsitabiini-induced resistenttejä Calò soluja (CaLoGR), viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% C0

2 DMEM: ssä, jota oli täydennetty 10% vasikan sikiön seerumia (Gibco, Grand Island, NY). sen jälkeen, hydralatsiini lisättiin 10 uM ja 30 uM 5 päivää ja 2 uM 10 päivää. sisältävä väliaine lääkeainetta täytetään päivittäin.

RT-PCR

RNA eristettiin solulinjoista standardimenetelmillä. sen jälkeen 5 ug RNA: ta käsiteltiin DNAasilla. Käänteinen transkriptio tehtiin käyttäen RNA-kit PCR Core Gene Amp

R (Applied Biosystems Roche) sen jälkeen, kun tarjoaja suositusten .

GAPDH

,

hENT1

,

dCK

,

RRM1

,

RRM2

,

CDA

geenejä monistettiin käyttäen seuraavia oligonukleotidialukkeita:

GAPDH

: S: 5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT-3 ’, AS: 5′-ATGGGTGGAATCATATTGGAAC-3’

hENT1

: S: 5’GCAAAGGAGAGGAGCCAAGA-3 ’ , AS: 5’CCCAACCAGTCAAAGATATTG-3 ’

dCK

: S: 5′-CGATCTGTGTATAGTGACAG-3′, AS: 5’GTTGGTTTTCAGTGTCCTATG-3 ’,

RRM1

: S: 5′-GCAGCTGAGAGAGGTGCTTT -3 ’, AS: 5′-CAGGATCCACACATCAGACA-3′, RRM2: S: 5’-GAGTTCCTCACTGAGGCC-3 ’, AS: 5′-TTAGAAGTCAGCATCCAAG-3’,

CDA

: S: 5 ’GTTGCCTTGTTCCCT TGTAA -3 ’, AS: 5′-TCTTGCTGCACTTCGGTATG-3’. PCR suoritettiin kokonaistilavuudessa 25 ui, joka sisälsi cDNA: ta, 20 pmol alukkeita, 200 uM dNTP: itä, 0,25 U Taq-polymeraasia, ja 1 x puskuria valmistajan toimittaman (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR aloitettiin denaturaatiovaiheen 94 ° C: ssa 5 min, jota seurasi 30 sykliä 94 ° C: ssa 35 sekuntia, 59 ° C: ssa 35 sekunnin ajan, ja 72 ° C 45 sekuntia; lopullinen pidennys suoritettiin 72 ° C: ssa 7 min. Tuotteet ajettiin elektroforeesilla 2% agaroosigeeleillä.

G9A

geenin ilmentyminen arvioitiin kvantitatiivisella RT-PCR: llä (iCycler iQ, Bio-Rad, Hercules, CA), käyttäen SYBR Green I väriainetta (Bio-Rad, Hercules, CA), käyttäen seuraavia alukkeita:

G9A

; Sense 5′-CTCCGCTGATTTTCGAGTGTAA-3 ’ja antisense 5′-GTCGAAGAGGTAAGAATCATCC-3’.

GUSB

(ihmisen beeta glukuronidaasi) spesifisiä alukkeita käytettiin endogeeninen kontrolli; sense 5′-CCTGTGACCTTCTGAGCAA-3 ’ja antisense 5′-AAACCCTGCAATGGTTTCTG-3’. PCR aloitettiin inkuboimalla 95 ° C: ssa 1 min, jota seurasi PCR-sykliä 35 s, 94 ° C: ssa, 35 s, 59 ° C: ssa, 50 s, 72 ° C: ssa, lopullinen pidennys 72 ° C: ssa 7 min. Määrä PCR-syklien määritettiin kokeellisesti. Tiedot analysoitiin käyttäen 2-ΔΔCT menetelmä ja raportoidaan kertainen muutos geenien ilmentyminen normalisoida endogeeninen kontrolli geeni (

GUSB

) ja suhteessa soluihin ilman hoitoa.

iRNA transfektioanalyysissä

Gemsitabiini hankittu resistentit solut ympättiin 24 microtitier Falcon (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ), 1,5 x 10

5-soluja /kuoppa 0,2 ml: n OptiMEM ja 24 tunnin jälkeen transfektoitiin lipofektamiinia ja

G9A

siRNA (Ambrion kissa # 439242). Negatiivinen kontrolli tehtiin lipofektamiini- RANiMAX sisältävien siRNA Scramble (Ambrion, kissa # 4390844). Soluja viljeltiin viljeltiin 37 ° C: ssa kostutetussa ilmakehässä, joka sisälsi 5% C0

2. 72 tunnin kuluttua väliaine imetään pois ja RNA uutettiin, sekä sytotoksisuusmääritys tehtiin.

Western blot-analyysi

Koko solu-uutteet valmistettiin lyysipuskurissa, joka sisälsi 50 mM tris-HCI, pH